專利名稱：一種輔酶q10層析硅膠的在線再生方法
技術領域：
本發明涉及一種層析硅膠的再生方法，特別指一種輔酶QlO層析硅膠的在線再生 方法。
背景技術：
輔酶QlO (Ubiquinone, Coenzyme Q10, CoQlO)在氧化呼吸鏈中起傳遞電子和質子 的重要作用，是形成ATP的關鍵，具有保護和恢復生物膜結構的完整性、穩定膜電位和增強 免疫反應等作用，被廣泛應用于心力衰竭、冠心病、高血壓病、糖尿病、癌癥、艾滋病、急慢性 肝炎、帕金森癥等疾病的輔助性治療。目前，輔酶QlO獨立成分或復合成分的藥品超過100項。輔酶QlO在歐、美、日等國被廣泛用于食品、保健品和化妝品行業，由于其在體內 可直接參與代謝，無毒副作用，輔酶QlO的基礎研究和臨床研究在日本及歐洲國家已廣泛 深入地展開。近年研究發現輔酶QlO還可參與調控人類信號轉導、代謝以及蛋白轉運中相 關基因的表達，輔酶QlO的市場前景十分廣闊。國內外傳統的輔酶QlO生產方法主要有動植物組織提取法、化學合成法和微生物 發酵法三種。動植物組織提取法受限于原料中輔酶QlO的含量，提取的產量低、成本高；化 學合成法在合成時會發生順、反異構，得到各類異構體的混合物，需要分離，也增加了合成 成本，在化學合成時會加入一些有毒試劑，對純化獲得適用于臨床的產品也提出了更高的 要求；微生物發酵法是近年興起的新生產方法，由于微生物細胞易于大規模培養生長，產品 完全為天然的全反式構型，生物利用度高，而且相對于化學合成法安全、高效，產品中幾乎 無化學毒害物質殘留，易于分離純化，臨床療效較好，是最有開發前景的生產方法。微生物發酵法生產輔酶QlO的提純過程一般采用如下工藝發酵液經過過濾后， 濾渣干燥制粒，得到輔酶QlO菌粉，菌粉再用有機溶劑浸泡提取。提取液濃縮至一定含量后 上硅膠柱層析，采用石油醚、丙酮混合溶劑進行洗脫，洗脫液經減壓濃縮干，加無水乙醇結 晶，過濾烘干得到輔酶QlO結晶粗品。硅膠作為一種吸附劑具有很大的比表面積，它吸附力強，廣泛應用于醫藥、化工等 多種行業的柱層析分離提純。硅膠在柱層析過程中，會吸附一些強極性的雜質，堵塞顆粒孔 道，使其活性下降。硅膠的生產成本也比較高，且生產過程會污染環境。在輔酶QlO的提純過程中，柱層析工序所占成本超過50%，其中硅膠消耗及溶劑 損耗更是占據了主要成本，這使得輔酶QlO的生產成本居高不下。中國專利公開號CN 101445435A介紹了一種輔酶QlO清潔純化工藝將輔酶QlO 用有機溶劑溶解，應用高壓液相制備柱或中壓硅膠填充柱，以洗脫劑洗脫，分段收集，獲得 高純度的輔酶QlO產品。所述裝柱的硅膠經200 300°C高溫活化后重復使用10 200 次。其硅膠再生方法采用高溫活化方法，該方法能耗大，而且每次柱層析過程完成后均需將 硅膠從柱內拆下來，不但勞動強度大，而且還會造成溶劑揮發、產生靜電著火等安全問題， 溶劑損耗也大。高溫煅燒的方法雖能將硅膠內的有機雜質去除，但同時也會改變硅膠內部孔徑結構，造成硅膠吸附力下降。公開號CN 1110550C(煙草為原料制備輔酶QlO的方法)、CN101314782A (發酵生 產輔酶QlO的方法)、CN 101429108A (分離輔酶QlO的提純方法)、CN 1762958A (—種提高 輔酶QlO合成收率的方法)、CN 101111465A (制備純凈的或富集的輔酶QlO的方法)等專 利均有介紹輔酶QlO的柱層析工藝，但均未涉及到柱層析硅膠的重復使用方法。美國專利US2007/0025976A1公開了一種輔酶QlO的提純工藝，提到一種硅膠的再 生方法在室溫下用1倍柱體積的乙醇洗脫，然后用4 5倍柱體積的己烷在50°C下洗脫。公開號CN 101249416A(層析中性氧化鋁活化再利用方法)涉及一種吸附劑(層 析中性氧化鋁)再生(活化)的方法，該方法的再生過程包括熱水溶解、堿化洗凈、氯化更 新、脫水、熔燒、過濾和還原，步驟繁多，成本也高，因此不適合用在硅膠的活化再生。公開號CN 1724530A(—種連續中壓柱層析制備高純度EGCG的方法)公開一種 硅膠再生方法使用后的層析柱用酯溶劑再生，烴溶劑為平衡劑平衡，平衡后的層析柱可重 復使用，使用次數達30次以上。公開號CN 100552889C(—種連續中壓柱層析制備高純度 異癸十異戊二烯基醇的方法)提到一種硅膠再生方法梯度洗脫過程中烴溶劑和乙酸乙酯 的混合液再生柱子后，通入50 751熱隊吹干溶劑，層析柱可反復使用。“中壓硅膠柱層 析連續純化茶葉中EGCG及ECG的研究”(林產化學與工業第27卷第2期2007年4月)提 到一種層析柱的再生方法使用后的層析柱用乙酸乙酯再生，石油醚為平衡劑平衡，平衡后 的層析柱可重復使用。“層析用硅膠G再生的可行性及方法研究”(離子交換與吸附2007， 23(1) :82 87)提到一種硅膠的再生方法將使用過的層析用硅膠裝入層析柱中，抽實后 用3倍柱體積的甲醇沖洗柱子，然后以3倍柱體積的石油醚沖柱，最后用2倍柱體積的氯仿 洗柱就即可，再生后的硅膠用來分離苦豆子總生物堿，結果證明硅膠是可以經過再生而重 復使用的，可以作為工業分離介質應用于生物活性物質的大規模制備。“硅膠柱層析法純化 天然維生素E” (中國食品添加劑2008年03期)也介紹了一種層析柱的再生方法層析柱 用2倍床層體積的甲醇洗脫，再用3倍床層體積的流動相洗脫，重復進行5次層析分離，重 復性好，層析再生效果較好。以上專利或文獻有過硅膠柱的再生方法相關報道，但都是采用正向洗柱的方法， 硅膠重復使用的次數少。硅膠柱層析本身是一種正相層析，弱極性物質先被洗脫下來，強極 性雜質被吸附在柱頭上，若采用正向洗柱，強極性雜質被往下洗脫的過程中會再次污染沒 有吸附強極性雜質的硅膠，從而造成硅膠的使用次數大大減少。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種輔酶QlO層析硅膠的在線再生方法，此再生 方法可實現層析柱重復使用20次以上。每使用20次后，采用反方向雙氧水洗和熱水洗一 次，再拆下硅膠烘干活化至水分小于5%，重新裝柱即可恢復至新硅膠98%以上的水平。按 此洗柱方法，硅膠使用次數可達100次以上，大大降低層析硅膠的消耗。本發明要解決的技術問題由如下方案來實現一種輔酶QlO層析硅膠的在線再生 方法，其特征是經分離提純輔酶QlO后的硅膠層析柱，從柱底進乙酸乙酯、丙酮、丁酮、乙 醇幾種高極性溶劑中的一種進行反方向洗柱，除去強極性雜質，再從柱頂進石油醚、戊烷、 正己烷、庚烷幾種低極性溶劑中的一種進行正向平衡，洗柱及平衡溫度為20 50°C，流速為1/2 2倍柱體積/小時，洗柱及平衡后的層析柱再用于分離提純輔酶Q10，此方法可實 現層析柱重復使用20次以上，每使用20次后，采用反方向雙氧水洗和熱水洗一次，再拆下 硅膠于100°C 150°C下烘干活化至水分小于5%，重新裝柱即可恢復至新硅膠98%以上的 水平。本發明還包括如下方案所述洗柱是采用從柱底進高極性溶劑反方向洗，平衡是 從柱頂進低極性溶劑正向平衡。所述洗柱的高極性溶劑用量為1 5倍柱體積，平衡的低 極性溶劑用量為1 5倍柱體積。所述雙氧水濃度為3 20%，雙氧水洗和熱水洗的溫度 為50 100°C，用量為1 5倍柱體積。所述的雙氧水可以是酸性、中性或堿洗，調酸可以 采用鹽酸、硫酸或磷酸，調堿可以采用氫氧化鉀或氫氧化鈉。烘干可以是常壓烘干和減壓烘 干。本方法具體步驟如下(1)將硅膠裝入層析柱內，邊裝邊用橡皮錘敲擊柱體，使硅膠裝的緊密結實，裝完 柱后用低極性溶劑平衡2小時；(2)平衡后將輔酶QlO上樣液通過硅膠柱進行層析，采用洗脫劑進行洗脫得到輔 酶QlO洗脫液；(3)收集完輔酶QlO洗脫液后，從柱底進高極性溶劑進行反方向洗柱，再從柱頂進 低極性溶劑進行正向平衡；洗柱、平衡后的層析柱直接再用于輔酶QlO上樣液的層析；(4)層析柱每使用20次后，通過反方向雙氧水洗和熱水洗一次，再拆下硅膠于 100 150°C下烘干活化至水分小于5%，重新裝柱即可重復用于輔酶QlO的柱層析。步驟(1)所述硅膠層析柱柱內徑25 500mm，柱長300 5000mm，硅膠目數60 400目、水分小于5%，柱壓0. 1 2MPa ；步驟(2)所述的上樣液為用有機溶劑從輔酶QlO菌粉中提取的提取液，所述有機 溶劑可以是石油醚、戊烷、正己烷、庚烷中的一種，優選石油醚和正己烷；步驟(3)所述高極性溶劑可以是A類溶劑(乙酸乙酯、丙酮、丁酮、乙醇)中的單 獨一種或A類中的一種與B類(石油醚、戊烷、正己烷、庚烷)中的一種的混合溶劑，其中A 類中的一種比例> 50%，優選> 90%，最優選100% ；所述低極性溶劑可以是B類中的單獨 一種或B類中的一種與A類中的一種的混合溶劑，其中B類中的一種的比例大于90%，優選 > 98%，最優選 100% ；步驟(3)所述洗柱的高極性溶劑用量為1 5倍柱體積，優選3倍柱體積；平衡的 低極性溶劑用量為1 5倍柱體積，優選3倍柱體積；洗柱和平衡的溫度為20 50°C ；步驟(4)所述雙氧水的濃度為3 20 %，優選5%，用量為1 5倍柱體積；所述熱 水可以是自來水、軟水、去離子水，用量為1 5倍柱體積；雙氧水洗和熱水洗溫度為50 IOO0C ；步驟⑷所述雙氧水可以是酸性、中性、堿性，優選pH = 9 11 ；步驟(4)所述硅膠活化溫度為100 150°C，可以是常壓或減壓烘干，優選減壓烘 干，烘干后的硅膠水分控制< 5% ；層析收率計算方法分段收集含輔酶QlO的層析液，采用TLC檢測，合并合格的層 析液，取樣用HPLC檢測層析液中的輔酶QlO外標含量及面積歸一法含量，層析收率=(合 格的層析液體積X層析液外標含量)/(上樣液體積X上樣液含量)X 100% ；
硅膠重復使用效果判斷對比相同上樣量、洗脫劑、洗脫條件下，層析收率的高低， 當層析收率大于90%，則判斷為重復使用效果較好，當層析收率小于90%，則判斷為重復 使用效果變差。本發明的優點是1、本發明層析硅膠可重復使用100次以上，大大降低層析硅膠的消耗，從而降低 生產成本；2、采用柱內洗柱，實現連續生產，減少拆裝柱的次數，整個生產過程做到全封閉體 系，既減輕勞動強度，又減少溶劑揮發，達到清潔生產的目的；3、采用反方向洗柱技術，有效防止正向洗柱時吸附柱頭的強極性雜質再次污染其 他硅膠，大大提高了硅膠的使用次數；4、硅膠使用到一定次數后，針對輔酶QlO層析所吸附雜質的特點，采用雙氧水洗 和熱水洗，可有效清除有機溶劑難以洗脫掉的那部分強極性雜質，使硅膠恢復活性；5、拆柱前先用水洗過，柱內不殘留溶劑，防止由于溶劑存在引起拆柱時產生靜電 火花的危險，確保了生產的安全；6、采用在線洗柱替代傳統的鍋內攪拌洗滌，洗滌時溶劑濃度梯度大，大大提高洗 柱的效率。


圖1為本方法的工藝流程圖
具體實施例方式通過以下實施例來對本發明做進一步具體說明，但并不僅限于以下實施例中的工 藝參數范圍。實施例層析柱內徑400mm，柱長4000mm，硅膠200Kg(200 300目)，采用濕法裝柱，邊裝 邊用橡皮錘敲打柱體，使硅膠裝的緊密結實。裝完后的層析柱用石油醚平衡2小時。取300L輔酶QlO浸膏(采用石油醚從輔酶QlO菌粉中提取的濃縮物，含量30mg/ ml)，通過柱塞式計量泵上硅膠柱層析，上完樣后用石油醚/丙酮(20/1)混合溶劑進行洗 脫，TLC檢測收集輔酶QlO層析液，合并合格的層析液，取樣用HPLC檢測層析液中的輔酶 QlO含量，層析收率為95. 3%，層析液主峰HPLC面積歸一法含量為98. 12%。洗脫完輔酶QlO后的層析柱，從柱底泵入1500L的丙酮進行反方向洗柱至柱頂流 出液無色，再從柱頂泵入1500L的石油醚平衡層析柱。平衡后的層析柱重新用來進行輔 酶QlO浸膏的層析，按上述相同的上樣量、洗脫方式及收集方法，重復使用的層析收率為 94.8%，層析液主峰HPLC面積歸一法含量為98. 10%。按此洗柱方法和層析方法用該硅 膠層析柱連續重復使用，第20次層析收率為93. 8%，層析液主峰HPLC面積歸一法含量為 98. 07%。取上述使用過20次的硅膠層析柱，從柱底泵入預先用氫氧化鈉調節PH =10，濃度 為5%的雙氧水，溫度80°C，用量為2倍柱體積，再泵入2倍柱體積80°C熱水洗滌，洗完后用 N2將水壓干，拆下硅膠，置于150°C干燥器內抽真空烘干至硅膠水分小于5%。烘干后的硅膠呈灰白色，重新裝入層析柱進行第21次層析，層析收率為94. 5%，層析液主峰HPLC面積 歸一法含量為98. 08%。此后再用丙酮反方向洗柱、石油醚正向平衡后進行重復使用，每隔 20次采用雙氧水、熱水洗滌一次，使用至100次，按實施例的上樣量、洗脫方式及收集方法， 層析收率為92. 1 %，層析液主峰HPLC面積歸一法含量為98. 05%。對照例按實施例方法層析一次后的硅膠，從柱頂泵入3倍柱體積的丙酮進行正向洗柱至 柱底流出液無色，再從柱頂泵入3倍柱體積的石油醚平衡。平衡后的層析柱重新用來進行 輔酶QlO浸膏的層析，按同實施例的上樣量、洗脫方式及收集方法，層析收率為93. 8%，層 析液主峰HPLC面積歸一法含量為98. 10%。按此洗柱方法和層析方法用該硅膠層析柱連續 重復使用，第5次使用層析收率為83.2%，層析液主峰HPLC面積歸一法含量為98. 02 %，重 復使用效果變差。
權利要求
一種輔酶Q10層析硅膠的在線再生方法，其特征是經分離提純輔酶Q10后的硅膠層析柱，從柱底進乙酸乙酯、丙酮、丁酮、乙醇幾種高極性溶劑中的一種進行反方向洗柱，除去強極性雜質，再從柱頂進石油醚、戊烷、正己烷、庚烷幾種低極性溶劑中的一種進行正向平衡，洗柱及平衡溫度為20～50℃，流速為1/2～2倍柱體積/小時，洗柱及平衡后的層析柱再用于分離提純輔酶Q10，此方法可實現層析柱重復使用20次以上，每使用20次后，采用反方向雙氧水洗和熱水洗一次，再拆下硅膠于100℃～150℃下烘干活化至水分小于5％，重新裝柱即可恢復至新硅膠98％以上的水平。
2.按照權利要求1所述的一種輔酶QlO層析硅膠的在線再生方法，所述洗柱是采用從 柱底進高極性溶劑反方向洗，平衡是從柱頂進低極性溶劑正向平衡。
3.按照權利要求1所述的一種輔酶QlO層析硅膠的在線再生方法，所述洗柱的高極性 溶劑用量為1 5倍柱體積，平衡的低極性溶劑用量為1 5倍柱體積。
4.按照權利要求1所述的一種輔酶QlO層析硅膠的在線再生方法，所述雙氧水濃度為 3 20%，雙氧水洗和熱水洗的溫度為50 100°C，用量為1 5倍柱體積。
全文摘要
本發明公開了一種輔酶Q10層析硅膠的在線再生方法，主要步驟是經柱層析分離提純輔酶Q10后的硅膠柱，從柱底進高極性溶劑進行反方向洗柱，除去強極性雜質，再從柱頂進低極性溶劑進行正向平衡，平衡后的層析柱可再用于分離提純輔酶Q10，此再生方法可實現層析柱重復使用20次以上。每使用20次后，采用反方向雙氧水洗和熱水洗一次，再拆下硅膠于100℃～150℃下烘干活化至水分小于5％，重新裝柱即可恢復至新硅膠98％以上的水平。按此洗柱方法，硅膠使用次數可達100次以上，重復套用的層析效果良好，能達到安全環保的效果。
文檔編號C07C46/10GK101985102SQ20101053164
公開日2011年3月16日 申請日期2010年10月28日 優先權日2010年10月28日
發明者付志杰, 劉華英, 吳軼, 張斌, 王炳榮, 詹光煌 申請人:內蒙古金達威藥業有限公司;廈門金達威集團股份有限公司