專利名稱：一種抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物農藥領域，具體涉及一種抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制 備方法和用途。
背景技術：
植物病毒病害種類繁多、分布廣泛，且防治困難，每年都給農業生產造成
嚴重損失(杜春梅等，2004)，是僅次于真菌的第二大類植物病害。煙草花葉病 毒(7bZ acco歷ossic i^ms1, TMV)為煙草花葉病毒屬(7b6柳ow'/7/s1 fr。〃/ ) 的模式種，自苗床至大田皆可發生，田間發病率一般在5 20%，幼苗期或大田 期感染損失可達30 50%，嚴重者絕收。
目前已有多類化學農藥在防治植物病毒病害方面應用，但其效果并不理想， 且隨著人們對生態環境的重視，化學農藥的發展和應用受到了限制。而生物農 藥由于其有效成分多為天然物質，施用后在自然界有其順暢的降解途徑，對環 境污染小、對人、畜毒性低等特點日益受到人們的青睞。
不同種類的外源抗病毒活性蛋白分別從植物、動物和微生物中得到分離。 1925年Duggar從美洲商陸(州j^c^3ccs J頂erica朋)中發現了具有抗植物病毒 的活性物質(Duggar， 1925)，食用真菌來源的抗植物病毒蛋白的發現要相對晚 一些，迄今從食用菌中分離純化出抗植物病毒蛋白還很少。1987年，由 Kobayashi等人首次報道了香菇(Ze/7"/ ^ 子實體中植物病毒侵染抑 制劑，即FBP(fruiting body protein, FBP)蛋白。孫慧等(2001年，2003年) 公開了一種抑制TMV侵染的楊樹菇(^rocj^es塔erite)蛋白AAVP (^rocWe aegen'ta antiviral protein, AAVP)。付鳴佳等(2003年)公開了一種抗TMV 侵染的金針菇(/^3順"^'/ a ^^;"/ m)蛋白，命名其為Zb蛋白。
黑平菇是平菇(Z^ei/ro"so5^e"ws)的一個菌種，生活力強，進行生料 或熟料栽培，栽培方法簡便、管理粗放，生長周期短、產量高。專利申請《一 種黑平菇提取物及其制備方法與應用》(申請號為200810223438.0)公開了一 種具有抗植物病毒作用的黑平菇蛋白提取物，但是沒有明確蛋白提取物中哪種活性物質具有抗植物病毒的作用，有待進一步的研究和探索。

發明內容
本發明目的在于提供一種抗植物病毒的黑平菇蛋白。 本發明另一目的在于提供上述黑平菇蛋白的制備方法。
本發明還一 目的是提供上述黑平菇蛋白在抗煙草花葉病毒病上的應用。 實現本發明的技術方案如下
本發明一種抗植物病毒的黑平菇蛋白，所述黑平菇蛋白來自黑平菇
(尸2e,o^9oWres^ ),其N端氨基酸序列為DAATGYRSVAYFVNWAIYGR (SEQ ID No:l)。
上述抗植物病毒的黑平菇蛋白，按照如下方法制備
(1) 將黑平菇菌絲干粉與PH7. 0 9. 0的磷酸緩沖液混合，在2 6。C浸提 1 3小時，離心，收集上清液，得黑平菇菌絲粗提液；
(2) 向所得黑平菇菌絲粗提液中加入硫酸鉸至飽和度為40%,于2 6。C放 置6 12小時，離心，收集上清液；
(3) 向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，于2 6"C放 置6 12小時，離心，收集沉淀，得黑平燕蛋白粗提物；
(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 pH6. 0 9. 0的PBS緩沖液將所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸餾水中透析8 16小時；
(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物經陰離子交換柱分離，用0. 5MNaCl洗脫 時收集洗脫峰；
(6) 收集的洗脫峰經30KD超濾管超濾，再經5000rpm離心超慮40min， 所得溶液中的物質即為黑平菇蛋白。
按照通用的命名方法，將上述所得黑平菇蛋白命名為PoAP (We"r^ZAs ostreattAS Antivirus Protein)。
上述黑平菇蛋白步驟(1)中所述的黑平菇菌絲干粉與磷酸緩沖液之間的混 合比例為lg: 10 20ml。
上述黑平菇蛋白步驟(1)中所述的磷酸緩沖液的pH值為8.0。
上述黑平菇蛋白步驟(1)、(2)或步驟(3)中所述的離心的速度為10000rpm。
上述黑平菇蛋白步驟(1)、 (2)或步驟(3)中所述的離心的時間為25min。
所述的黑平恭菌絲干粉可于市場上購買得到。
上述黑平菇蛋白的制備方法，包括如下步驟(1) 將黑平菇菌絲干粉與pH值為7. 0 9. 0的磷酸緩沖液的混合，在2 6。C浸提l 3小時，離心，收集上清液，得黑平菇菌絲粗提液；
(2) 向黑平菇菌絲粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，于2 6。C放置6 12小時，離心，收集上清液；
(3) 向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，于2 6。C放 置6 12小時，離心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；
(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 pH6. 0 9. 0的PBS緩沖液將所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸餾水中透析8 16小時；
(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物經陰離子交換柱分離，用0. 5MNaCl洗脫 時收集洗脫峰；
(6) 收集的洗脫峰經30KD超濾管超濾，再經5000rpm離心超慮40min， 所得溶液中的物質即為黑平菇蛋白。
上述制備方法步驟(1)中所述的黑平菇菌絲干粉的重量與磷酸緩沖液的混 合比例為lg: 10 20ml。
上述制備方法步驟(1)中所述的磷酸緩沖液的PH值為8.0。 上述制備方法步驟(1)、 (2)或步驟(3)中所述的離心的速度為10000rpm。 上述制備方法步驟(1)、 (2)或步驟(3)中所述的離心的時間為25min。 上述制備方法中如無特別說明，均為常規方法。
本發明黑平菇蛋白可用于防治植物病毒，如煙草花葉病毒等。具體方法為 將本發明黑平菇蛋白用水稀釋至蛋白總濃度為100 200ug/mL，噴施于3 4葉
、'本發明具有的優點和有益效果(1)本發明將抗植物病毒的黑平菇蛋白具 體為一種單一的蛋白，從為獲得該蛋白的氨基酸序列及其編碼基因提供了基礎，
進而為遺傳工程應用該蛋白提供了可能；(2)本發明黑平菇蛋白對植物病毒的 抑制效果好，如在黑平菇蛋白濃度為200ug/mL，噴施煙草72小時后，對煙草 花葉病毒的抑制率達到77. 49%; (3)本發明黑平菇蛋白為天然提取物，對人類 和環境均無害，使用安全；(4)本發明黑平菇蛋白制備方法簡單，原料易得， 成本較低，適于大規模的生產和應用。


圖1本發明黑平燕蛋白PoAP電泳鑒定圖譜；其中1為標準 子量，2為本 發明黑平菇蛋白。圖2a為用分子篩(Gel filtration)鑒定蛋白分子量的標準曲線圖， 其中A為牛血清白蛋白、B為雞卵清蛋白、C為胰蛋白酶。
圖2b為用分子篩(Gel filtration)鑒定黑平菇蛋白分子量的層析圖。
具體實施例方式
下述實施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中 所述的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。 實施例l本發明黑平菇蛋白的制備
按照如下方法進行
(1) 將黑平菇菌絲干粉(購于宜昌森源食用菌有限責任公司)2g與pH值 為8.0的磷酸緩沖液20mL的混合，在4'C浸提2小時，10000rpm離心25min;
棄沉淀，上清即為黑平菇菌絲粗提液。
(2) 向所得黑平燕菌絲粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，于4'C放置 8小時，然后在10000rpm下離心25rain，收集上清液。
(3) 向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，于4"C放置8 小時，10000rpm離心25min，收集沉淀得到黑平燕蛋白粗提物；
(4) 用0.03mol/L、 pH9. 0的PBS緩沖液將所得黑平菇蛋白粗提物溶解， 然后在1 3倍重量的重蒸餾水中透析12小時；
(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物經陰離子交換柱分離，用0. 5MNaCl洗脫 時收集洗脫峰；
(6) 收集的洗脫峰經30KD超濾管超濾，再經5000rpm離心超慮40min，
所得溶液中的物質即為黑平菇蛋白。
實施例2本發明黑平燕蛋白的制備
按照如下方法進行 (1 )將黑平菇菌絲千粉2g與pH值為7. 0的磷酸緩沖液20ml的混合，在4°C 浸提2小時，10000rpm離心25min，上清即為黑平菇菌絲粗提掖；
(2) 向所得黑平燕菌絲粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，于4"C放置 8小時，10000rpm離心25min，收集上清液；
(3) 向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，于4'C放置8 小時，10000rpm離心25min，收集沉淀得到黑平菇蛋白粗提物；
(4) 用0.01mol/L、 pH8.0的PBS緩沖液將所得黑平菇蛋白粗提物溶解，然后在2倍重量的重蒸餾水中透析16小時；
(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物經陰離子交換柱分離，用0. 5MNaCl洗脫時收集洗脫峰；
(6) 收集的洗脫峰經30KD超濾管超濾，再經5000rpm離心超慮40min，
所得溶液中的物質即為黑平菇蛋白。
實施例3本發明黑平燕蛋白的制備用下述方法提取
(1) 按黑平菇菌絲干粉的質量與pH值為9. 0的磷酸緩沖液的混合比例為lg: 20mL，在4。C浸提2小時，10000rpm離心25min，取上清液，得黑平菇的菌絲粗提液；
(2) 在所得黑平菇的菌絲粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，于4'C放置6小時，然后在10000rpm下離心25min，取上清液；
(3) 向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，于4。C放置6小時，然后在10000rpm下離心25rain，收集沉淀，得到黑平菇蛋白粗提物；
(4) 用0.02mol/L、 pH7. 0的PBS緩沖液將所得黑平菇蛋白粗提物溶解，然后在2倍重量的重蒸餾水中透析10小時；
(5) 透析后的黑平燕蛋白粗提物經陰離子交換柱分離，用0. 5MNaCl洗脫時收集洗脫峰；
(6) 收集的洗脫峰經30KD超濾管超濾，再經5000rpm離心超慮40min，
所得溶液中的物質即為黑平菇蛋白。
實施例4本發明黑平菇蛋白PoAP的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定按照如下方法進行
(1) 配制分離膠和濃縮膠按照通常的方法配制，分離膠濃度12% (每5mL凝膠中含1. 6mL去離子水，2. OmL 30%Acrylamide， 1. 3mL 1. 5M pH8. 8 Tris-HCl，50uL 10%SDS， 50uL 10%過硫酸銨，2uL TEMED)，濃縮膠濃度5% (每3mL凝膠中含2. lmL去離子水，0. 5mL 30%Acrylamide， 0. 38mL 1. 5M pH8. 8 Tris-HCl，30 uL 10%SDS， 30 uL 10%過硫酸銨，3uL TEMED)。
(2) 用微量進樣器取實施例l所制備的黑平菇蛋白，每孔進樣15yL。濃縮膠30V/cm，分離膠20V/cm,待指示劑距離凝膠底端lcm時停止電泳。
(3) 染色及脫色固定(30min) -致敏(30min)-水洗(3次，每次10min)-銀染(20min)-水洗(2次，每次lmin)-顯色(視情況而定)-終止(10min)-保存(1%冰醋酸中，4"C保存)。
結果(如圖1)電泳顯示只有一條蛋白條帶，無其他雜帶，說明實施例1中所得黑平菇蛋白為一種單一的蛋白質，通過遷移率計算本發明黑平菇蛋白
PoAP的分子量為32. 0kDa。
實施例5本發明黑平菇蛋白PoAP的凝膠層析測定按照如下方法進行
(1) 凝膠層析過程于4r進行，所用試劑均經過濾和脫氣處理。凝膠層析
采用S印hacrylTM S-200 (1. 6cmX60cm)預裝層析柱，去離子水充分平衡至280nm
紫外吸光值不再變化。
(2) 用實施例l所制備的黑平菇蛋白上樣，去離子水O. 5mL/min洗脫，280nm檢測其紫外吸光值。標準蛋白分別采用牛血清白蛋白(66.0kDa)、雞卵清蛋白
(44.28kDa)和胰蛋白酶(25.0kDa)(購于Merck公司)，以相同條件洗脫。分別記錄PoAP及標準蛋白的洗脫體積，繪制標準曲線，計算PoAP的分子量。
(3) 結果根據標準蛋白分子量和洗脫體積(牛血清白蛋白(66.0kDa)、雞卵清蛋白(44.28kDa)、胰蛋白酶(25,OkDa)和實施例1所制備的黑平菇蛋白的洗脫體積分別為32. 46mL、 37. 07mL、 109. 91mL和36. 95mL)繪制標準曲線
(見圖2a和圖2b)，得到回歸方程，通過黑平菇蛋白的洗脫體積計算出本發明黑平菇蛋白PoAP的分子量為34. 7kDa，結合其SDS-PAGE分子量，推測黑平菇蛋白PoAP為一個單亞基蛋白。
實施例6本發明黑平菇蛋白PoAP的N-端氨基酸序列測定按照如下方法進行
(1) 取出PVDF膜，用甲醇浸泡數秒鐘，然后放入CAPS電印跡緩沖液中。
(2) 取出實施例4所得的電泳凝膠，在CAPS緩沖液中浸泡5 10分鐘。
(3) 在50V恒壓條件下(100-170mA)于室溫下進行電印跡轉移2小時。
(4) 取出PVDF膜并用去離子水略為漂洗，用甲醇浸泡數秒鐘，然后進行染色。
(5) 考馬斯亮藍染色，可將0. 1%考馬斯亮藍R-250溶于40%甲醇/1%乙酸，染色30-50秒，用50%甲醇脫色，并用去離子水充分洗滌，然后將剪下待測序的條帶經北京大學生命科學中心進行N端氨基酸序列分析。
(6) 結果所測得本發明黑平菇蛋白PoAP的N端氨基酸序列為DAATGYRSVAYFV腿IYGR (SEQ ID No:l)。實施例7黑平菇蛋白PoAP抑制煙草花葉病毒試驗1、實驗步驟
1) 噴霧防治處理將實施例l得到的PoAP分別用水稀釋到不同的蛋白濃
度(見表l)，分別對三至四葉期的枯斑三生煙進行整株噴霧，每個處理三個重復，每個重復三株，每株三片葉子。同時用清水噴施于三至四葉期的枯斑三生
煙作為對照(CK)，設置三個重復，每個重復三株，每株三片葉子。
2) 病毒接種液的制備病毒來源為本研究室保存的TMV普通株系(以普通煙為寄主，活體保存)，其獲取方法是將感染煙草花葉病毒TMV普通株系的普通煙的葉片去除主脈，與pH8. 0的0. 01 mol/L的PBS按lg/20ml混合，每20mlPBS加0.015g金剛砂，將葉片充分研磨，得到接種液。
3) 接種將按步驟l)的方法噴霧72小時后得到的枯斑三生煙植株，用步驟2)得到的接種液進行摩擦接種(植病研究方法(第三版)，方中達，中國農業出版社)接種后立即用清水沖洗，于溫室中培養，培養條件為28。C光照12小時，18C無光照12小時，交替進行。
表1實施例1的PoAP蛋白抗TMV試驗結果
濃度ng/mL枯斑抑制率％平均值％方差分析標準偏差
重復一重復二重復三2523.2639.0232.9131.73b7.95
5028.3725.4049.1534.30b12.94
10055.4765.9154.0058.466.50
20065.9869.6561.9665.863.85
30049.7154.9861.5155.405.91
40056.4058.6970.1561.7437.37
4)抑制率計算接種72小時后觀察枯斑三生煙葉片產生枯斑數量，按下
式計算出枯斑抑制率。
X= (CK-Y) /CKX100 (式I)
式I中，X為枯斑抑制率，單位％; CK為清水對照葉片的平均枯斑個數，單位個；Y為經實施例l制備的PoAP誘導處理后葉片的平均枯斑個數，單
位個。
10結果從表1可以看出，本發明黑平菇蛋白PoAP有較高的抗TMV活性，效果 可達60%以上，其中PoAP在濃度》100Pg/mL時，其抗TMV活性較高，在此濃度 以上其抗TMV活性隨PoAP濃度變化不明顯。序列表 〈110>北京市農林科學院
〈120〉 一種抗植物病毒的黑平菇蛋白及其制備方法和用途 <160> 1
<170〉 Patentln version 3. 5 <210> 1 <211〉 20 <212> PRT
<213> Pleurotus ostreatus <400〉 1
Asp Ala Ala Thr Gly Tyr Arg Ser Val Ala Tyr Phe Val Asn Trp Ala 15 10 15
lie Tyr Gly Arg
20
權利要求
1、一種抗植物病毒的黑平菇蛋白，其特征在于所述的黑平菇蛋白來自黑平菇(Pleurotus ostreatus)，其N端氨基酸序列為DAATGYRSVAYFVNWAIYGR。
2、 按照權利要求l所述的黑平菇蛋白，按照如下方法制備(1) 將黑平燕菌絲干粉與pH值為7. 0 9. 0的磷酸緩沖液混合，在2 6°C 浸提1 3小時，離心，收集上清液，得黑平菇菌絲粗提液；(2) 向黑平菇菌絲粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40l于2 6'C放置6 12小時，離心，收集上清液；(3) 向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，于2 6。C放 置6 12小時，離心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 p服.0 9. 0的PBS緩沖液將所得黑平菇蛋白粗 提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸餾水中透析8 16小時；(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物經陰離子交換柱分離，用0. 5MNaCl洗脫 時收集洗脫峰；(6) 收集的洗脫峰經30KD超濾管超濾，再經5000rpm離心超慮40min， 所得溶液中的物質即為黑平菇蛋白。
3、 按照權利要求2所述的黑平菇蛋白，其特征在于其步驟(1)中所述的 黑平菇菌絲干粉的重量與磷酸緩沖液的混合比例為lg: 10 20ml。
4、 按照權利要求2或3所述的黑平菇蛋白，其特征在于其步驟(1)、 (2) 或步驟(3)中所述的離心的速度為10000rpm。
5、 按照權利要求4所述的黑平菇蛋白，其特征在于其步驟(1)、 (2)或 步驟(3)中所述的離心的時間為25min。
6、 權利要求1 5任一所述的黑平菇蛋白的制備方法，包括如下步驟-(1) 將黑平菇菌絲干粉與pH值為7. 0 9. 0的磷酸緩沖液的混合，在2 6"浸提1 3小時，離心，收集上清液，得黑平菇菌絲粗提液；(2) 向黑平凝菌絲粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，于2 6"放置6 12小時，離心，收集上清液；(3) 向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70°/。，于2 6"C放 置6 12小時，離心，收集沉淀，得黑平菇蛋白粗提物；(4) 用0. 01 0. 03mol/L、 p朋.0 9. 0的PBS緩沖液將所得黑平菇蛋白粗提物溶解，然后在1 3倍重量的重蒸餾水中透析8 16小時；(5) 透析后的黑平菇蛋白粗提物經陰離子交換柱分離，用0. 5MNaCl洗脫 時收集洗脫峰；(6) 收集的洗脫峰經30KD超濾管超濾，再經5000rpm離心超慮40min，所得溶液中的物質即為黑平菇蛋白。
7、 按照權利要求6所述的制備方法，其特征在于其步驟(1)中所述的黑 平菇菌絲干粉的重量與磷酸緩沖液的混合比例為lg: 10 20ml。
8、 按照權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于其步驟(1)、 (2)或 步驟(3)中所述的離心的速度為10000rpm。
9、 按照權利要求8所述的制備方法，其特征在于其步驟(1)、 (2)或步驟 (3)中所述的離心的時間為25min。
10、 權利要求1 5任一所述的黑平菇蛋白在防治煙草花葉病毒病上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種黑平菇蛋白PoAP及其制備方法，首先將黑平菇菌絲干粉在磷酸緩沖液中浸提1～3小時，離心，收集上清液；然后分別向所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為40％和70％，2～6℃放置6～12小時，離心，收集沉淀；用磷酸緩沖液溶解沉淀，接著用重蒸餾水進行透析；再經陰離子交換柱分離，用0.5M NaCl洗脫，收集洗脫峰；然后經30KD超濾管超濾，5000rpm離心超慮40min，所得溶液中的物質即為黑平菇蛋白。本發明黑平菇蛋白PoAP為單一蛋白，可進行遺傳工程應用；其次，對煙草花葉病毒抑制效果好；且為天然提取物，對人類和環境均無害；另外，黑平菇蛋白制備方法簡單，原料易得，成本較低。
文檔編號C07K7/08GK101665530SQ200910093038
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月25日 優先權日2009年9月25日
發明者紅 嚴, 劉建華, 瑩 周, 琳 朱, 李興紅, 燕繼曄 申請人:北京市農林科學院