專利名稱：使用notch途徑抑制劑治療癌癥的方法
使用NOTCH途徑抑制劑治療癌癥的方法發明背景 發明領域本發明總體上涉及癌癥，更具體地，涉及影響Notch途徑的試劑。發明背景 Notch基因編碼進化上保守的、大的、單次跨膜蛋白，該蛋白調節細胞命運決定。在 果蠅屬(Drosophila)、線蟲(Caenorhabditis elegans)和哺乳動物細胞培養的工作中顯 示，Notch通過2個下游途徑擔任DSL( δ、Serrate, Lag-2)家族配體的受體和信號。一個 下游途徑是通過轉錄因子CSL(CBF1、Hairless的抑制子、Lag-I)家族，另一個是通過胞漿 銜接蛋白Deltex。在哺乳動物中，Notch信號轉導途徑誘導4個受體(Notch 1-4)和5個 配體(δ-樣1、3和4&Jagged 1和2)。在這些基因中的突變導致人類的顯著的發育影響， 提示Notch信號轉導存在于多種遺傳性疾病(例如帶有皮質下梗死和白質腦病的腦常染色 體顯性動脈病(CADASIL)、Alagille綜合征和脊椎肋骨發育不全(SOTO))和癌癥(例如白 血病、皮膚癌、宮頸癌、肺癌、前列腺癌、神經母細胞瘤和乳腺癌)中。Notch信號轉導的負調控物包括Numb、SEL-IO和Su (dx)。相比之下，Sanpodo, Neuralized, Mind bomb、LNX、Siahl 和 Mdm2 是 Notch 信號轉導途徑的正調節物。Numb 是 含有PTB結構域的胞漿銜接蛋白，它通過與胞內結構域的相互作用擔任Notch的負調節物。 Numb-Notch聯合促進Notchl的泛素化。研究表明，Numb與E3連接酶Itch的細胞溶質的 HECT結構域相互作用，以及Numb和Itch協同作用促進Notchl的泛素化。另一方面，Numb 可通過改變Sanpodo的功能來抑制Notch信號轉導，Sanpodo是途徑的正調節物。Sandopo 編碼4次跨膜蛋白，它與細胞表面上的全長Notch受體物理上相互作用。Numb與Sanpodo 物理上相互作用，抑制Sanpodo的膜定位，從而阻止其與Notch聯合。哺乳動物的肌動蛋白 相關蛋白原肌球調節蛋白控制肌動蛋白絲的長度，它是Sanpodo的同源物。Numb和Sanpodo 是發育過程中Notch途徑的關鍵調節物。Deltex(Su(dx))的抑制物是另一個最初在果蠅屬中鑒定的蛋白，它擔任Notch信 號轉導途徑的負調節物。Su(dx)的過表達能阻斷內源性Notch信號轉導，導致異位的靜脈 分化，失去翼邊緣。相比之下，Su(dx)的下調顯示翼的靜脈縫隙與Notch過表達的表型相 似。Itch是Su(dx)的小鼠同源物，之所以這樣命名，是因為小鼠突變體顯示出隨同免疫缺 陷一起的瘙癢行為。與SEL-IO不同，Itch含有磷脂結合基序，基序將Itch對準胞漿膜，4 個Wff基序和HECT結構域，其起到E3泛素連接酶的作用。Itch通過其Wff基序結合到NI⑶ 的N-末端部分，并通過其HECT結構域促進OTCD泛素化。在哺乳動物細胞中，這種相互作 用下調Notch信號轉導。Notch信號轉導途徑可在乳腺的腫瘤發展中發揮作用的首次指征來自Czech II 小鼠中小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)Notch4基因的共有插入位點。這種插入導致截短的轉錄 物的表達，該轉錄物編碼Notch4的細胞內結構域，該蛋白的表達活化信號轉導途徑。特異 地在乳腺中表達該蛋白的轉基因小鼠顯示了 Notch信號轉導在腫瘤發展中的因果作用。這些轉基因小鼠在12個月內發生了乳腺腫瘤。而且，細胞培養實驗顯示Notchl或Notch4胞 內結構域的過表達轉化小鼠乳房上皮細胞系，從而導致軟瓊脂中無貼壁依賴的生長。Notch信號轉導在寬范圍的人乳腺癌中被異常地活化。這通過Numb的喪失和 Notchl胞內結構域(Ni⑶)的積聚以及靶基因Hesl和Heyl的上調最清楚地得到了證明， NI⑶由在Notch信號轉導期間全長蛋白的切割產生并轉換Notch信號。而且，途徑成分的 改變可證明是有用的預兆標記物。例如，Notchl和配體Jaggedl的升高的轉錄水平與不良 預后相關，Numb的蛋白體降解主要在高等級的腫瘤中見到。最后，由于抑制Notch信號轉 導途徑可逆轉乳腺癌細胞系轉化的表型，阻止原發腫瘤細胞的生長，所以Notch信號轉導 的增加在乳腺癌的病因學中發揮重要的作用。盡管改變的Notch信號轉導與包括癌癥在內的人類疾病相關，但是尚未發現 Notch實質上參與人類腫瘤的證據。在機制上，Numb起到腫瘤抑制因子的作用，因為它在 Numb-陰性腫瘤而非Numb-陽性腫瘤細胞中的異位表達抑制增殖。在Numb-陰性的腫瘤中 觀察到增加的Notch信號轉導，但是在實施Numb的表達后，Notch信號恢復到基態水平。 相反地，Numb沉默增加正常的乳腺細胞和Numb-陽性乳腺腫瘤中Notch信號轉導。Numb/ Notch的生物學拮抗作用與正常的乳腺實質的穩態相關。因此，就需要一種診斷和治療由 Notch途徑的異常信號轉導引起的癌癥的方法。
發明摘要本發明基于有創意的發現，即一些人類乳腺癌包含Notch途徑的上調。特別地，這 些癌癥特征在于具有增加的Notch信號轉導和降低的Numb表達，Numb為Notch途徑的負 調節物。 在一個實施方式中，本發明提供一種治療癌癥的方法，包括用圖3A或3B中顯示的 構建物接觸癌細胞。本發明的方法還包括用化學治療劑接觸癌細胞。在另一個實施方式中，本發明提供一種測定癌細胞對Notch途徑抑制劑的治療是 否有反應的方法，該方法包括測定細胞中Notch 1的水平，其中，與正常細胞中的Notch 1 水平相比，Notch 1的較高水平表示細胞對Notch途徑抑制劑的治療有反應。圖3A或3B顯 示了例證性的Notch途徑抑制劑。一方面，該方法包括進一步地測定細胞中Numb表達的水平，其中，與正常細胞中 的Numb水平相比，Numb表達的低水平表示細胞對Notch途徑抑制劑或增加細胞中Numb表 達的藥劑的治療有反應。本發明還提供圖3A和圖3B所示的特異的構建物。在另一個實施方式中，本發明提供一種治療癌癥的方法，包括用含有顯性負性 Mastermind同種型的構建物接觸癌細胞。一方面，癌癥是例如乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、前 列腺癌、肺癌、血癌或胰腺癌。在一個另外的實施方式中，還可以用化學治療劑接觸癌細胞。 在另一個實施方式中，可以用觸角核酸或蛋白接觸細胞。(觸角同源結構域是來自黑腹果蠅 生物體的序列特異的轉錄因子。該蛋白由觸角(antp)基因編碼。Antp是調節系統的成員， 它在生物體的前-后軸上給予細胞特異性位置。這樣，Antp輔助果蠅屬中胸節段的細胞發 育的控制。)(參見例子 Y.-Q. Qian 等，The Structure ofthe Antennapedia Homeodomain Determined by NMR Spectroscopy in Solution !Comparison With ProkaryoticRepressors, Cell 59:573(1989))。在另一個實施方式中，本發明提供治療癌癥的方法，包括用含有Numb同種型的構 建物接觸癌細胞。在一個另外的實施方式中，還可以用化學治療劑接觸癌細胞。在另一個 實施方式中，可以用觸角核酸或蛋白接觸細胞。在一個實施方式中，描述了測定癌細胞對Notch途徑抑制劑的治療是否有反應的 方法，該方法包括測定細胞中Notch 1的水平，其中，與正常細胞中的Notch 1水平相比， Notch 1的較高水平表示細胞對Notch途徑抑制劑的治療有反應。一方面，Notch途徑抑制 劑包括顯性負性Mastermind同種型。在另一個實施方式中，Notch途徑抑制劑包括Numb 同種型。在另一個實施方式中，該方法包括測定細胞中Numb表達的水平，其中，與正常細胞 中的Numb水平相比，Numb表達的低水平表示細胞對Notch途徑抑制劑的治療有細胞反應。 在一個另外的實施方式中，癌細胞是乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞或胰腺癌細胞。在本發明的另一個實施方式中，描述了監測治療患有癌癥或瀕臨患有癌癥危險的 受試者的治療計劃的方法，該方法包括測定一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的 活性或表達。一方面，涉及Notch信號轉導途徑的基因選自Jaggedl、Jagged2 S -樣4、E_鈣 粘著蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl、Hes5 或其組合。在一個實施方式中，描述了診斷患有癌癥或瀕臨患有癌癥危險的受試者的方法， 該方法包括測定一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達，其中，與正常 細胞的水平相比，一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達的改變被診斷 為受試者患有癌癥或瀕臨患有癌癥的危險。在另一個實施方式中，涉及該Notch途徑的基 因選自 Jaggedl、Jagged2 S -樣 4、E_ 鈣粘著蛋白、Numb、NICD Notch3、Heyl、Hes5 或其組
口 O在本發明的另一個實施方式中，描述了鑒定試劑的方法，該試劑調節一個或多個 涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達，該方法包括將測試試劑與顯示表達一個或 多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的細胞相接觸，并檢測一個或多個涉及Notch信號轉 導途徑的基因的活性或表達的變化，由此鑒定這種測試試劑為調節一個或多個涉及Notch 信號轉導途徑的基因的活性或表達的試劑。在一個實施方式中，涉及Notch信號轉導途徑 的基因選自 Jaggedl、Jagged2 S -樣 4、E-鈣粘著蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl、Hes5 或 其組合。在另一個實施方式中，細胞是癌細胞。一方面，癌細胞是乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、 結腸癌細胞或胰腺癌細胞。在一個實施方式中，試劑是化合物、蛋白質或核酸。在一個實施方式中，描述了將化合物遞送給細胞的方法，該方法包括將融合至觸 角或其功能部分的化合物接觸細胞。一方面，化合物是化學品、蛋白質或核酸，觸角足是核 酸或氨基酸序列。


圖1A是果蠅屬Notch受體和4個已知哺乳動物受體的圖示。圖1B描述了果蠅屬和哺乳動物Notch受體的跨膜DSL配體(Delta、Serrate、LAG 2)。圖1C是哺乳動物F3和接觸蛋白配體的示意結構。圖1D是CBF1依賴的Notch信號轉導途徑的示意圖。
圖2A是描述MCF7細胞在軟瓊脂中形成的集落的數量的條形圖，MCF7細胞為來自 親本、載體對照和MCF7/Numb轉染的細胞。圖2B是描述MCF7細胞在軟瓊脂中形成的集落的數量的條形圖，MCF7細胞為來自 親本、載體對照和MDA-MB231/Numb轉染的細胞。圖 3A 說明 pSecTagNC/ANTP/NUMB(SEQ ID NO. :1)。圖 3B 說明 pSecTagNC/ANTP/DN-MAML(SEQ ID NO. :2)。圖4是描述用ANTP/DN-MAML融合蛋白治療的動物的腫瘤體積(4A)和用ANTP/ DN-MAML融合蛋白治療后的動物存活(4B)的條形圖。詳細描述本發明基于Notch信號轉導途徑與癌癥相關的發現。調節Notch信號轉導途徑中 的蛋白的表達和/或活性能用于診斷和治療受試者的癌癥。果蠅屬Notch受體是大的、含有2703個氨基酸(aa)的單次跨膜的糖蛋白，它含有 幾個不同的結構域(圖1A)。Notch蛋白以異二聚體表達在細胞表面上，該異二聚體由非共 價地與胞內結構域連接的大的胞外結構域組成。胞外結構域由36個串聯的表皮生長因子 (EGF)樣的重復序列(每個大約38個aa)和3個富含半胱氨酸的Lmi2/Notch (LNR)重復序 列組成。Notch胞內結構域含有結合CSL轉錄因子的RAM23結構域；2個核定位序列(NLS1 和2)；蛋白-蛋白相互作用必需的7個串聯⑶ClO/錨蛋白(ANK)重復序列；Notch細胞因 子反應(NCR)區、轉錄活化結構域(TAD) ^PPEST (SEQ ID NO 7)(脯氨酸(P)、谷氨酰胺(E)、 絲氨酸(S)、蘇氨酸(T))序列。PEST序列是以快速降解的蛋白為特點的。有4個已知的哺乳動物Notch受體(Notch 1-4)(圖1A)。哺乳動物Notch 1和 Notch 2含有36個EGF樣重復序列，而Notch 3和Notch 4分別含有34個和29個EGF樣 重復序列。所有4個哺乳動物Notch受體都含有RAM、NLSl、ANK和PEST結構域。但是，只 在Notch 1和Notch 2中發現TAD，Notch 4缺少NLS2和NCR基序。Notch受體之間的最高 度同源性在錨蛋白重復序列內，而最高度的多樣性在C末端PEST系列內。哺乳動物Notch 1和Notch2蛋白被弗林樣轉化酶在轉運高爾基氏體(殘基1655)內切割(也被稱為SI切 割)；Notch 3和Notch 4可被同樣地切割。長的胞外結構域通過非共價的Ca2+依賴的相互 作用結合到跨膜結構域。異二聚體是細胞表面受體的主要形式。現已表明，EGF樣重復序 列11和12對Notch DSL配體與Notch相互作用是必需的(圖1A)。在果蠅屬，Delta和Serrate是Notch受體的主要配體。同Notch —樣，這些蛋白 是大的單次跨膜蛋白，在其胞外結構域內有數量不等的EGF樣重復序列。Delta和Serrate 分別含有9個和17個EGF樣重復序列。它們通過在N-末端的稱作DSL (Delta、Serrate, (果蠅屬)Lag_2(線蟲(C.elegans))區域的保守的富含半胱氨酸的結構域與Notch相互作 用。除了這些基序，Serrate在EGF樣重復序列和區分于Delta的跨膜結構域之間含有第三 個富含半胱氨酸(CR)的結構域。在哺乳動物中有5個Delta和Serrate同源物，Jaggedl 和2以及Delta-樣1、3和4(圖1B)。與Notch大的胞內結構域相比，DSL配體具有很短的 胞內結構域。最近顯示，F3/接觸蛋白和F3/接觸蛋白家族的成員NB_3在小鼠少突膠質細胞成 熟過程中充當另外的Notch配體(圖1C)。F3是屬于免疫球蛋白家族的糖基-磷脂酰肌醇 (GPI)連接的神經粘附分子。F3和接觸蛋白屬于一組含有N末端信號肽、連接至4個纖連蛋白III型重復序列的6個免疫球蛋白結構域和GPI錨定結構域的糖蛋白。與F3相比，接觸 蛋白具有另外的跨膜和短的胞漿結構域。已經顯示，F3和NB-3在小鼠Notchl受體的EGF 樣重復序列1-12和22-34內結合。 Notch受體在高爾基體中被弗林轉化酶切割，(稱作Sl切割的過程)，這導致了細 胞表面非共價連接的異二聚體Notch受體的表達(圖1D)。在缺少Notch配體的相互作用 時，Numb直接與Notch的胞漿結構域相互作用，抑制其切割。在這些條件下，CSL結合至少 4個輔阻遏物(SMRT、HDAC、SKIP和kyoT2)并抑制轉錄。隨著配體結合，發生2次連續的切 害I]。一次稱作S2切割，由ADAM蛋白酶TACE(腫瘤壞死因子α -轉化酶)介導，發生在靠近 跨膜結構域的1771aa處，另一次切割稱作S3切割，由Y -分泌酶在跨膜結構域內1744aa處 介導。這個S3切割釋放Notch的胞內結構域(Ni⑶)，允許其核轉位，并在核內結合CBFl， 通過置換4個輔阻遏物將其由轉錄抑制因子轉化成轉錄激活因子。與Mastermind(MAM)、 NI⑶和CBFl —起形成一個大的轉錄激活復合體，招募輔激活因子諸如p300。活化的CBFl 然后能夠轉錄其靶基因，靶基因包括發狀分裂相關增強子(Hairy of enhancer of split, Hes)和Hey家族的成員。其它的靶諸如p21 (角質形成細胞的靶點)是組織特異的。Numb 的穩定性是由E3連接酶諸如Mdm2、LNX和Shia調節的。在哺乳動物中，Notch信號轉導引起OTCD的切割，接著易位到細胞核并結合 CBFl (也稱作RBP-Jk)轉錄因子。這是Notch信號轉導途徑的初級的核效應物，而且這是雙 功能的。缺少NI⑶時，CBFl結合至少4個輔阻遏物，視網膜和甲狀腺激素受體的沉默介質 (SMRT)、組蛋白去乙酰化酶(HDACl)、KyoT2和Ski相互作用蛋白(SKIP)，并抑制轉錄(圖 1D)。相比之下，CBFl與NI⑶的RAM23和ANK重復序列的相互作用置換這些抑制因子，產 生轉錄激活因子復合體。核蛋白Mastermind樣(MAML)也與這個復合體相互作用，進一步 增加轉錄(圖1D)。但是，MAMLl的顯性負性(DN)形式由MAML末端的一個具有62個氨基 酸的肽組成，它特異地結合到CBF1/NI⑶轉錄復合體上，通過所有4個哺乳動物Notch受體 抑制Notch信號轉導的活化。在哺乳動物中，Notch和其DSL配體之間的相互作用包括Notch細胞外部分的EGF 樣重復序列11和12 (圖1D)。配體/受體相互作用引起Notch蛋白內2次另外的蛋白酶 切割，從細胞膜釋放NICD ；第一次切割發生在Sl位點Notch的成熟過程中。在細胞表面， 通過TNF-α轉化酶(TACE)和ADAM17金屬蛋白酶的蛋白酶切割(也稱為S2切割)發生 在胞外(殘基1711)，產生膜束縛片段(NEXT)。這是瞬時中間體，它通過Y-分泌酶(它 含有早老蛋白和呆蛋白)再次切割(S3切割)。這發生在跨膜結構域內(殘基1744)，并引 起NICD釋放到胞漿中。OTCD含有2個將其靶向細胞核的NLS結構域。在細胞核中，OTCD 的RAM和ANK結構域結合CBF1，與MAM聯合將CBFl由轉錄抑制因子轉化成轉錄激活因子。 NI⑶/CBF1/MAM復合體上調Notch信號轉導的初級靶基因的表達，這些靶基因包括基本的 螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄因子諸如split 1和5的發狀分裂相關增強子(Hesl和5)和 Hes相關轉錄因子1-3 (HRT1-3,也稱作Heyl-3)。所有的Hes成員共享C-末端YRPW(SEQ ID NO 6)四肽基序，該基序招募轉錄輔阻 遏物諸如Groucho，起到轉錄抑制物的作用。途徑的其它靶標是組織特異的，諸如p21和心 血管螺旋-環-螺旋因子1和2 (CHF1-2)，它們分別表達在角質形成細胞和心血管發育中。 除了活化Notch信號轉導，包括Numb和E3泛素連接酶SEL-IO和Itch在內的多個蛋白能通過促進Notch分子的泛素化和溶酶體降解終止Notch信號轉導。也已發現，CBF1和Notch 的錨蛋白重復序列或單純皰疹病毒(HSV)VP16的轉錄活性結構域之間的融合產生CBF1的 組成型活性形式。4 個哺乳動物 Notch 受體(Notch 1-4)和 5 個配體(Jaggedl 和 _2 ； S -樣 1、-3、 和-4)都含有跨膜結構域，這樣在鄰近細胞之間產生配體/受體信號轉導。配體-受體 的結合觸發、分泌酶依賴的切割，釋放Notch的胞內結構域到細胞核，促進與轉錄因子 CBF-1(也稱作RBP-Jk或CSL)的聯合。隨后的輔激活物、mastermind樣(MAML)蛋白的招募 促進下游效應物諸如轉錄因子的發狀分裂相關增強子(HES)和HES-相關阻遏蛋白(HERP) 家族的轉錄激活。在描述本發明的組合物和方法之前，應當理解的是本發明并不限于描述的特定的 組合物、方法和實驗條件，因為這樣的組合物、方法和條件可以改變。還應當理解的是，這里 用到的術語只為描述特定的實施方式，而非意圖是限制性的，因為本發明的范圍只由所附 的權利要求限定。如本說明書和所附權利要求所用，除非上下文明確指明，否則單數形式“一(a)”、 “一(an)”、“所述(the)”包括復數的指示物。因此，例如，提及“所述方法”包括一個或更多 的方法，和/或這里描述的類型的步驟，當閱讀本公開時，這對本領域技術人員是顯而易見 的。除非另有定義的，否則這里用到的所有技術和科學術語具有同本發明所屬領域的 普通技術人員通常理解的相同意義。盡管與這里描述的方法和材料相似或等同的任何方法 和材料能用于實施或測試本發明，但是現在描述的是優選的方法和材料。在此所用的術語“受試者”是指對其實施受試方法的任何個體或患者。雖然如本 領域技術人員所理解的，受試者可以是動物，但是通常受試者是人。這樣，其它的動物，包括 哺乳動物諸如嚙齒類動物(包括小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠)、貓、狗、兔子、包括牛、馬、山羊、 綿羊、豬等在內的農場動物和靈長類動物(包括猴子、黑猩猩、類人猿和大猩猩)也包括在 受試者的定義中。在此所用的“正常的細胞”或“正常的樣品”是指來自受試者的細胞或樣品，它們 與檢測的細胞都來自同一器官并且細胞類型相同。一方面，相應的正常細胞包括從健康個 體——未患癌癥——獲得的細胞樣品。這樣的相應的正常細胞可以但不必來自與提供檢測 的細胞的個體年齡相一致和/或性別相同的個體。在此所用的術語“樣品，，和“生物樣品，，是指適合本發明提供的方法的任何樣品。 細胞樣品可以是任何樣品，包括，例如從患有腫瘤的受試者的活組織檢查獲得的腫瘤樣品 或手術(例如去除和/或消脹腫瘤的手術操作)獲得的腫瘤樣品。這樣，在一個實施方式 中，本發明的生物樣品是組織樣品，例如活檢標本諸如針吸活組織檢查的樣品。例如，樣品 可包括血樣、尿樣、組織樣品或任何生物學流體。術語“細胞增殖性疾病”或“細胞的增殖性疾病”是指受影響的細胞的增殖能力與 未受影響的細胞的正常增殖能力不同的任何疾病。一個細胞增殖性疾病的例子是瘤形成。 惡性細胞(例如癌癥)的形成是多步驟過程的結果。術語“惡性”可以指不再處于正常細 胞生長控制下的腫瘤或造血系統疾病。在此所提到的術語“癌細胞”包括被在此所提到的任何一個癌性狀況困擾的細胞。術語“癌”是指由趨于侵入周圍組織并引起轉移的上皮細胞構成的惡性新生長。在此所描述的細胞增殖性疾病可以是贅生物(瘤)。這種贅生物是良性或惡性的。 術語“贅生物”是指細胞的新的、異常生長或較正常細胞增殖快的異常細胞的生長。贅生物 產生無結構的腫塊(腫瘤)，該腫塊(腫瘤)可能是良性或惡性的。術語“良性的”是指腫 瘤是非癌性的，例如它的細胞不增殖或侵入周圍組織。術語“遞送”或“給予”被定義為包括將本發明的化合物或藥物組合物提供給需要 治療的受試者的行為。這些術語包括腸道和局部給藥，通常通過注射，包括但不限于靜脈內 的、肌肉的、動脈內的、鞘內的、囊內的、眶內的、心內的、真皮內的、腹膜內的、經氣管的、皮 下的、表皮下的、關節內的、囊下的、蛛網膜下腔的、椎管內的和胸骨內的注射和輸注。這里用到的術語“蛋白質”是指至少2個共價結合的氨基酸，包括蛋白質、多肽、寡 肽和肽。蛋白質可由天然存在的氨基酸和肽鍵或合成的肽模擬結構構成。因此，這里所用 的“氨基酸”或“肽殘基”是天然存在的和合成的氨基酸。例如，為了本發明的目的，同型苯 丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被認為是氨基酸。“氨基酸”還包括亞氨基酸殘基諸如脯氨酸和 羥脯氨酸。側鏈可以是(R)或⑶構型。術語“融合蛋白”是指與另一個分子或化合物融合的蛋白。分子或化合物可以是 蛋白、化學品或核酸。這里使用的術語“核酸”指DNA、RNA、單鏈、雙鏈或三鏈及其任何化學修飾。實 際上核酸的任何修飾都被考慮。“核酸”可以是幾乎任何長度，長度從10、20、30、40、 50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、 1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10，000、15，000、 20，000,30, 000,40,000,50,000,75,000,100,000,150,000,200,000,500,000,1,000，000、 1，500, 000,2, 000, 000,5, 000, 000或甚至更多的堿基，直到全長的染色體DNA分子。對于分 析基因的表達的方法，從樣品中分離的核酸典型地是RNA。本發明基于有創意的發現，即一些癌癥顯示Notch途徑中的基因表達的異常水 平。例如，這些癌癥都具有升高水平的Notch和降低水平的Numb，Numb是Notch途徑的負 調節物。本發明提供一種治療癌癥的方法，該方法包括用融合蛋白諸如，例如圖3A或3B顯 示的構建物接觸癌細胞。本發明的方法進一步包括用化學治療劑接觸癌細胞。可以用任何方式給予藥劑，典型的是用于治療特定類型癌癥的藥劑或在促進藥劑 與靶腫瘤細胞接觸的條件下，并且如果適當的話，進入細胞。多核苷酸藥劑進入細胞，例如， 可通過將多核苷酸整合到能感染細胞的病毒載體中得以促進。如果不能得到對細胞類型特 異的病毒載體，可將載體進行修飾，使其表達對靶細胞上表達的配體(或受體)特異的受 體(或配體)，或可將載體包入到脂質體中，該脂質體也可被修飾成包括這樣的配體(或受 體)。可用多種方法將肽藥劑引入到細胞中，包括，例如通過對肽進行工程改造，使其含有蛋 白轉導結構域諸如人免疫缺陷病毒TAT蛋白轉導結構域，這能促進肽易位到細胞中。一般 地，將藥劑配制成適于給予受試者的組合物(例如藥物組合物)。如此配制的藥劑作為治療 遭受黑素瘤或非黑素瘤皮膚癌痛苦的受試者的藥物是有用的。因此，根據正被治療的癌癥 的類型，鑒定的藥劑將具有組織特異性的反應。候選藥劑包括數目眾多的化學類別，盡管典型地它們是有機分子，而且常常是分子量大于100小于約2500道爾頓的小的有機化合物(即小分子)。候選藥劑包括與蛋白質發生結構相互作用必需的官能團，特別是氫鍵合，而且典型地包括至少一個胺、羰基、羥基 或羧基基團，優選至少2個官能化學基團。候選藥劑經常包括環狀碳或雜環結構和/或芳 香或多芳香結構，它們被一個或多個上面提到的官能團取代。也在包括肽、糖類、脂肪酸類、 類固醇類、嘌呤類、嘧啶類、衍生物、結構類似物或其組合在內的生物分子中找到候選藥劑。可從包括合成的或天然的化合物庫的品種多樣的來源獲得候選藥劑。例如，可用 很多種方法隨機和定向地合成品種多樣的有機化合物和生物分子，包括隨機的寡核苷酸的 表達。可選地，已獲得或容易地產生了以細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物 的庫。此外，通過常規的化學、物理和生物學方法容易地修飾天然或合成產生的庫和化合 物。已知的藥理學藥劑可經受定向的或隨機的化學修飾，諸如酰化作用、烷化作用、酯化作 用、酰氨化作用來產生結構類似物。在另一個實施方式中，本發明提供一種測定癌細胞對Notch途徑抑制劑的治療是 否有反應的方法，該方法包括測定細胞中Notch 1的水平，其中，與正常細胞中的Notch 1 水平相比，Notch 1的較高水平預示著細胞對Notch途徑抑制劑的治療有反應。圖3A或3B 顯示了例證性的Notch途徑抑制劑。術語“抑制劑”、“激活劑”和“調節劑”用來指激活、抑制或調節分子。抑制劑是例 如結合、部分或全部阻斷活性、降低、阻止、延遲活化、滅活、減敏或下調Notch信號轉導途 徑的一個或多個基因的活性或表達的化合物。“激活劑”是增加、打開、活化、促進、增強活 化、敏化、激動或上調Notch信號轉導途徑的一個或多個基因的化合物。抑制劑、激活劑或 調節劑也包括Notch信號轉導途徑的一個或多個基因的遺傳上的修飾版本，例如活性改變 的版本、以及天然存在和合成的配體、底物、拮抗劑、激動劑、抗體、肽、環肽類、核酸、反義分 子、核酶、RNAi、小的化學分子等等。抑制劑可以是例如圖3A和3B以及4A和4B顯示的融 合蛋白ο在一個實施方式中，本發明的方法包括進一步地測定細胞中Numb表達的水平，其 中，與正常細胞中的Numb水平相比，Numb表達的低水平預示著細胞對Notch途徑抑制劑的 治療有反應。這里使用的術語“改善”或“治療”是由于執行的作用而使與癌癥相關的臨床體 征和/或癥狀被減輕。被監測的體征或癥狀是特定的癌癥的特征，熟練的臨床醫生對這些 體征或癥狀及監測體征和病癥的方法都非常了解。例如，熟練的臨床醫生知道可用典型地 用于特定腫瘤的診斷成像方法監測腫瘤的大小或生長速率(例如用超聲或核磁共振成像 (MRI)來監測腫瘤)。治療癌癥的所有方法可進一步包括將藥劑與藥學上可接受的載體締合的步驟，藥 學上可接受的載體構成一種或多種輔助成分。可用于配制給予受試者的藥劑的藥學上可接 受的載體是本領域熟知的，這些載體包括例如水溶液諸如水或生理緩沖鹽水或其他溶劑或 運載體諸如二醇類、甘油、油類諸如橄欖油或可注射的有機酯。藥學上可接受的載體可含有 生理學可接受的化合物，它們起例如，穩定和增加結合物的吸收的作用。這些生理學可接受 的化合物包括，例如碳水化合物諸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化劑諸如抗壞血酸或谷胱 甘肽、螯合劑、低分子量蛋白質或其它的穩定劑或賦形劑。本領域的技術人員知道，根據例 如治療劑的物理化學特性和組合物的給藥途徑選擇包括生理學可接受的化合物在內的藥學上可接受的載體，給藥途徑可以是例如經口的或胃腸外的諸如靜脈內的，通過注射、插管 或本領域人員知道的其它類似方法。藥學組合物也可含有第二(或更多的)化合物(一種 或多種)諸如診斷試劑、營養物質、毒素或治療劑，例如癌癥化療劑和/或維生素(一種或 多種)。含有本發明的藥劑的組合物的給藥途徑將部分地取決于分子的化學結構。例如， 當經口給予多肽和多核苷酸時，它們不是特別有用，因為它們能在消化道被降解。但是，化 學修飾多核苷酸和多肽例如以使它們分別對內源性核酸酶或蛋白酶的降解變得不敏感或 通過消化道更加可吸收的方法是本領域熟知的(參見，例如，Blondelle等，Trends Anal. Chem. 14 :83_92，1995 ；Ecker 和 Crook, BioTechnology, 13 :351_360，1995)。例如，肽試劑 可用D-氨基酸制備，或者可含有一個或多個基于肽模擬物的結構域——肽模擬物是模擬肽 結構域結構的有機分子；或者基于擬肽諸如插烯物擬肽的結構域。抑制劑是小的有機分子 諸如留體生物堿時，它能以在身體內期望的位置釋放活性劑的形式給藥，或通過注射到血 管中給藥，這樣抑制劑循環到靶細胞。實施本發明的方法時，給予的化合物或組合物的總量可以以單次劑量給予受試 者，或作為大丸藥(bolus)或通過輸注在相對短的時間段里給藥，或可以使用分次的治療 方案給藥，其中在延長的時間段里給予多次劑量。本領域技術人員將知道，調節Notch信號 轉導途徑中的一個或多個基因的活性或表達以治療受試者癌癥的藥劑的量取決于許多因 素，包括受試者的年齡和一般健康情況及給藥途徑和給予的治療的數目。考慮到這些因素， 技術人員將按需要調節特定的劑量。一般而言，最初，用I期或II期臨床試驗確定藥物組 合物的配制和給藥途徑和給藥頻率。本發明提供一種治療癌癥的方法，包括用含有顯性負性Mastermind同種型的構 建物接觸癌細胞。癌細胞可以是例如乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞或胰腺癌細胞。 還可用化學治療劑接觸癌細胞。此外，可用觸角足(Antermapedia，ANTP)接觸細胞。ANTP同源域是來自黑腹果蠅有機體的序列特異的轉錄因子。該蛋白由觸角 (antp)基因編碼。Antp是調節系統的成員，它在有機體的前-后軸上給細胞特異的位置。 這樣，Antp輔助果蠅屬中胸節段的細胞發育的控制。本發明還提供治療癌癥的方法，包括用含有Numb同種型的構建物接觸癌細胞。癌 細胞可以是例如乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞或胰腺癌細胞。還可用化學治療劑接 觸癌細胞。此外，可用觸角足(ANTP)接觸細胞。在一個實施方式中，描述了測定癌細胞對Notch途徑抑制劑的治療是否有反應的 方法，該方法包括測定細胞中Notch 1的水平，其中，與正常細胞中的Notch 1水平相比， Notch 1的較高水平預示著細胞對Notch途徑抑制劑的治療有反應。Notch途徑抑制劑可 以是例如顯性負性Mastermind同種型或Numb同種型。在另一個實施方式中，該方法包括 測定細胞中Numb表達的水平，其中，與正常細胞中的Numb水平相比，Numb表達的低水平預 示著細胞對Notch途徑抑制劑的治療有細胞反應。癌細胞可以是例如乳腺癌細胞、卵巢癌 細胞、結腸癌細胞或胰腺癌細胞。在本發明的另一個實施方式中，描述了監測治療患有癌癥或瀕臨患有癌癥危險的 受試者的治療計劃的方法，該方法包括測定一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的 活性或表達。涉及Notch信號轉導途徑的基因可以是例如Jaggedl、Jagged2 6 -樣4、E_鈣粘著蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl 或 Hes5。在一個實施方式中，描述了診斷患有癌癥或瀕臨患有癌癥危險的受試者的方法， 該方法包括測定一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達，其中，與正常 細胞相比，一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達的改變診斷出患有癌 癥或瀕臨患有癌癥危險的受試者。涉及Notch信號轉導途徑的基因可以是例如Jaggedl、 Jagged2 S -樣 4、E-鈣粘著蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl 或 Hes5。在本發明的另一個實施方式中，描述了鑒定一種試劑的方法，該試劑調節一個或 多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達，該方法包括將測試試劑與顯示表達一 個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的細胞相接觸，檢測一個或多個涉及Notch信號 轉導途徑的基因的活性或表達的變化，由此鑒定這種測試試劑是否是調節一個或多個涉 及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達的試劑。涉及Notch途徑的基因可以是例如 Jaggedl、Jagged2 S-樣 4、E-鈣粘著蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl 或 Hes5。細胞可以 是癌細胞，且可以是例如乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞或胰腺癌細胞。試劑可以是 例如化學化合物、蛋白質或核酸。本發明包括將化合物遞送給細胞的方法，該方法包括將融合至觸角足或其功能部 分的化合物接觸細胞。化合物可以是例如化學品、蛋白質或核酸。可通過離體例如在細胞培養基中或在固體載體上接觸細胞的樣品來實施本發明 的方法。替代地，或此外，可例如通過將癌細胞樣品移植到試驗動物(例如裸鼠)并給予試 驗動物測試試劑或組合物來體內實施本發明的方法。體內試驗的優點是可在活體動物中評 價測試試劑的效果，這樣更接近模擬臨床情況。由于體內試驗一般費用更高，在用體外方法 鑒定了 “線索”試劑(“leacTagent)后，體內試驗作為二次篩選可特別有用。當以高通量(或超高通量)的形式實施本發明的方法時，可在固體載體(例如微 孔板、硅晶片或載玻片)上進行，其中細胞樣品和/或感興趣的基因的位置便于每個相互之 間畫出輪廓(例如在孔中)。根據使用的特定載體，可使用這樣的方法平行檢測任何數量的 樣品(例如96、1024、10，000、100，000或更多)。樣品以陣列(例如確定的模式)放置的情 況下，通過樣品的位置(例如使用x_y軸)可確定陣列中的每個樣品，這樣為每個樣品提供 一個“地址”。使用可設定地址的陣列模式的優點是該方法可以全部或部分地自動化，這樣 細胞樣品、試劑、感興趣的基因等可在期望的時間被分配到特異的位置(或從特異的位置 去除)，可監測樣品(或等分試樣)，例如以獲得一個或多個與Notch信號轉導途徑相關的 基因的活性或表達。可與在此所描述的藥劑聯合使用的化學治療劑的例子包括但不限于抗癌藥諸如 柔紅霉素、更生霉素、多柔比星、博來霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法侖、環磷酰胺、 6_巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5_FUdR)、甲 氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、長春新堿、長春堿、依托泊甙、替尼泊甙、順鉬和二乙基己烯雌酚 (DES)。抗炎藥也可與在此所描述的藥劑聯合使用，包括但不限于非類固醇類抗炎藥和皮質 類固醇類，抗病毒藥，包括但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋，也可與本發 明的組合物和方法聯合使用。兩種或更多的結合的化合物可一起或依次使用。提供下面的例子來進一步說明本發明的優點和特點，但并不是要限制本發明的范 圍。雖然這些例子是可能使用的例子中典型的例子，但是可選擇地使用本領域技術人員知道的其它的操作、方法或技術。 實施例實施例1|H常人樣品和乳腺癌人樣品中Notch成分的檢測 本試驗是為了闡明人乳腺癌中Notch信號轉導的性質。為了 Notch表達分析，獲得 2個正常的(A和B)和20個乳腺癌樣品(組C、D、E、F、G)(表2. 1)。所有的樣品都伴有病 理學報告。根據在腫瘤中ER、PR、erbB2, EGFR的表達，乳腺癌樣品被分成5個組(表1，組 C、D、E、F、G)，這些基因與預后和臨床結果相關。此外，每組內，腫瘤具有各種類型(小葉的 或導管的)和等級(I、II、III)。I級腫瘤的細胞通常是分化良好的，而且多數時間具有正 常的結構和功能。II級乳腺腫瘤具有開始看上去異常的細胞。另一方面，III級乳腺腫瘤的 細胞通常是分化不良的或未分化的，不具有特化的結構，并且趨于更侵略性地生長和擴展。 在所有其它的乳腺癌類型中，帶有ER/PR陽性腫瘤的乳腺癌患者具有最好的預后和臨床結 果。70%的ER/ra陽性腫瘤對激素治療有反應，而不到10%的ER/ra陰性和大約40%的ER 陽性/PR陰性乳腺腫瘤有反應。ErbB2-陽性腫瘤是典型的侵略性癌，其臨床結果不好。具 有ErbB2-陽性腫瘤的患者的5年存活率只有40%，而具有ErbB2_陰性腫瘤的患者的5年 存活率超過80%。ER陰性、ErbB2-陽性患者預后很差，而且這種腫瘤類型的治療策略較任 何其它乳腺癌腫瘤類型的治療策略都少。已經顯示，erbB2/ER陽性腫瘤較ErbB2_陽性、ER 陰性腫瘤對激素治療具有更好的反應。在20個樣品中，13個是導管癌，7個是小葉癌。在 13個導管癌樣品中，1個是I級，4個是II級，6個是111級，1個是原位導管癌(DCIS)。任 何小葉癌樣品的等級是未知的。將22個樣品(2個正常的，20個發生腫瘤樣品)稱重，分成 2半進行蛋白質印跡分析和免疫組織學分析。正常乳腺樣品 乳腺癌樣品* 表2. 1乳腺組織樣品無ER或I3R表達，50% 中等的ER或I3R表達，100% 強的ER或PR表達，2+ 中等的erbB2表達，3+ 強的erbB2表達，2/3 中等的EGFR表達。小 葉的病變在小葉中發現，導管的病變在導管中發現，DCIS 原位導管癌。I級、II級和III 級分別指低度、中度和高度的核分化。N/A 未得到，-陰性的。此外，3個正常的(MCF-10A、MTSV1-7HB4A)和8個發生腫瘤的(Hs578T、 MDA-MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、MDA-MB231、SK-BR3、和 PMC42)人乳房上皮細胞系用于蛋 白質印跡分析。表2. 2顯示的是在3個正常MCF-10A、MTSV1-7HB4A和9個腫瘤Hs578T、 MDA-MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、MBA-MB231、SK BR3、PMC42 人乳房上皮細胞系中 ER、PR、 ErbB2和EGFR的表達。ER PR erbB2 EGFR 惡性 腫瘤發生MCF-10A -正常 沒有MTSV1-7 -正常 沒有
HB4AHs578TMDA MB468MCF7ZR75TCAL51MDA MB231SK BR3PMC42表2. 2乳房上皮細胞系.ER 雌二醇受體，PR 孕酮受體，EGFR 表皮生長因子受 體，+ :陽性，陰性，N/A:未得到為了確定是否Notch信號轉導在乳腺腫瘤內改變了，通過蛋白質印跡在2個正常 和20個乳腺癌組織樣品中分析了正常組織中檢測的Notch受體和配體的表達。此外，檢查 了 NI⑶蛋白水平和Numb的表達。Numb是與Notch的胞內結構域相互作用的胞漿銜接蛋 白。由于它是NICD活性的泛素化和下調所必需的，所以它起到途徑的負調節物的作用。與正常組織相比，Jagged2在7個ER+/PR+/erbB2_類別的腫瘤樣品的5個、7個 ER+/PR-/erbB2-類別的腫瘤樣品中的2個、3個ER+/erbB2+類別的腫瘤樣品的2個中被下 調，而在ER-/erbB2+和ER-/EGFR+樣品中保持不變。所有乳腺癌樣品中的Numb的表達都 被停止。相反，當與2個正常樣品相比時，所有乳腺癌樣品中的NI⑶的表達被上調。此外， 在幾個乳腺癌樣品中觀察到截短的、低分子量的NICD，這提示乳腺癌中Notch受體可能被 突變。通過對從ER+/ER+/erbB2-(Cl-C7)乳腺癌樣品、正常乳房組織樣品(A和B)、4個 導管癌和3個小葉癌提取的蛋白進行的蛋白質分析確定Jagged2的下調。樣品用SDS-PAGE 分離，并用Numb、切割的Notchl (NICD)、Notchl、Jagged2、S -樣4和E_鈣粘蛋白一抗探測。 與2個正常樣品相比，所有7個癌癥樣品中Numb被下調。相反，Notch的活化形式在所有7 個乳腺癌樣品中被上調。Jagged2在4個導管癌中的3個(C1、C3和C4)和3個小葉型乳腺 癌樣品中的2個(C5和C6)被下調。樣4在4個導管癌中的2個和所有3個小葉型乳 腺癌樣品中被下調。E-鈣粘蛋白在所有腫瘤樣品都被下調。在C2號樣品中有另外低分子 量形式的切割的Notch。在C2、C4、C6、和C7號樣品中有另外的低分子量形式的Jagged2。此外，對從ER+/PR-/erbB2-(Dl_D7)乳腺癌樣品提取的蛋白進行蛋白質分析。從2 個正常的(A和B)、4個導管型和3個小葉型ER+/PR-/erbB2-乳腺腫瘤樣品中分離全部的裂 解物，用 SDS-PAGE 分離蛋白質，并用 Numb、切割的 Notchl (NICD)、Notchl、Jagged2、S -樣 4和E-鈣粘蛋白一抗探測。與2個正常樣品相比，Numb在所有7個癌癥樣品中被下調。相 反，Notch的活化形式在所有7個樣品中被上調。Jagged2在4個導管癌中的3個和所有3 個小葉癌樣品中被下調。S-樣4在4個導管癌中的3個和所有3個小葉型腫瘤樣品中被 下調。E-鈣粘蛋白在4個導管癌中的2個和所有小葉型乳腺癌樣品中被下調。在D1和D2 號樣品中有另外低分子量形式的Jagged2。上皮細胞標記物Desmoplakin用于使每個樣品 內的上皮細胞標準化。
沒有
正常
管癌沒有
有 有 有 有 有 有 有
癌 癌
管癌
管癌
癌 癌
導 腺 腺 導 導 腺 腺 癌
+ +
+
+
+
N/A N/A N/A
+
+ +
N/A N/A
+
+ +
+
對從ER+/erbB2+(El-E3)、ER-/erbB2+(Fl)、ER-/EGFR+(G1 和 G2)乳腺癌樣品提 取的蛋白進行蛋白質分析。從2個正常的(A和B)、3個ER+/erbB2+、l個ER-/erbB2+和 2個ER-/EGFR+乳腺腫瘤樣品中提取全部的細胞裂解物，通過SDS-PAGE分離裂解物，并用 Numb、切割的Notchl (NICD)、Jagged2、δ -樣4和E-鈣粘蛋白一抗探測。與2個正常樣品 相比，Numb在所有7個癌癥樣品中被下調，而Notch的活化形式在所有7個乳腺癌樣品中 被上調。Jagged2在3個ER+/erbB2+癌癥樣品中的2個癌樣品中被下調。δ -樣4在所有 ER+/erbB2+樣品中被下調。E-鈣粘蛋白在7個樣品中的4個樣品中被下調。多個樣品中 存在有另外的切割的Notch和Jagged2的低分子量形式。上皮細胞標記物Desmoplakin用 于使每個樣品內的上皮細胞標準化。 在幾個乳腺癌樣品中觀察到截短的、低分子量的Jagged2。但是，還不清楚這種同 種型的關聯性。S-樣4的表達在正常樣品和乳腺癌樣品中是不同的，但是總的來說，當與 正常樣品相比時，它在乳腺癌樣品中被下調。E-鈣粘蛋白在若干個樣品中被下調。由于蛋白質分析不能區分上皮和間質組織，所以對上述乳房組織樣品進行了免疫 組化分析以確定Notchl過表達在腫瘤內的定位。通過乳房上皮細胞標記物Mucl鑒定的上 皮細胞內強的Notchl (Ni⑶)染色與Numb的下調相伴。此外，檢測到上皮細胞內強的Notch3 染色。Jaggedl和Jagged2的表達局限于上皮細胞。這些數據證明，Notch途徑在乳腺癌的 發展和進展中被上調。實施例2lH常和乳腺癌細胞系中Notch成分的檢測為了支持乳腺癌樣品的蛋白質印跡和免疫組化結果，對3個正常的(MCF-10A、 MTSV1-7 HB4A)和 8 個發生腫瘤的(Hs578T、MDA-MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、MDA-MB231、 SK-BR3和PMC42)人乳腺上皮細胞系進行了蛋白質印跡分析。其結果與從組織樣品中得到
的結果一致。用Numb、切割的 Notchl (NICD)、Notchl、Notch3、Jagged2、δ -樣 4、Ε-鈣粘蛋白、 Heyl和Hes5 —抗探測蛋白質印跡。與3個正常細胞系相比，Numb在所有9個癌細胞系 中被下調。相反，Notch的活化形式在所有9個癌細胞系中被上調。在5個腫瘤細胞系中 觀察到Notch活化形式的截短形式。此外，Hey2和Hes5的表達在所有乳腺癌細胞中被上 調，這證明了 NI⑶的積累與Notch信號轉導的增加相關。Notch3在9個細胞系中的6個 (Hs578T、MDA MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、SK BR3)中被上調，Jaggedl 在 9 個細胞系中的 7 個(Hs578T、MDA MB468、ZR75T、MDAMB231、SK BR3、MDA MB435、PMC42)中被上調。這些結果 共同表明，Notch信號轉導在所有分析的乳腺癌細胞系中被活化。相反，Jagged2在9個測 試的腫瘤細胞系中的7個中被下調，在多個腫瘤細胞系中檢測到了 Jagged2的較高分子量 形式。S-樣4在9個腫瘤細胞系中的3個(Hs578T、ZR75T、SK BR3)中被下調。E-鈣粘蛋 白在9個腫瘤細胞系中的5個(Hs578T、ZR75T、MDA MB23USK BR3、PMC42)中被下調。該分析的結果強烈地表明Notch信號轉導在乳腺癌的進展期間被增加。Notch信 號轉導途徑的成分在所有檢測的乳腺癌組織樣品和細胞系中被過表達。而且，負調節物 Numb的表達在所有分析的樣品中一致地被下調。但是，更重要的是看到的NI⑶的積累是 Notch信號轉導的直接生化指示。與此一致的是，在乳腺癌細胞系中靶基因Hes5和Heyl的 表達被上調。
在多個乳腺癌樣品和乳房上皮細胞系中還已經觀察到截短的NI⑶分子的積累。 在T細胞急性淋巴母細胞白血病中已檢測到相似的截短形式，現已表明這緣于突變，突變 產生了 Notchl的PEST序列內的移碼或早熟終止密碼子。由于PEST結構域含有對NI⑶降 解重要的序列，所以所得的Notchl蛋白更加穩定。結果，這些突變導致Notch信號轉導的 增加。在分析的人乳腺癌樣品中的截短的Notchl (NICD)分子的存在提示，在乳腺癌中可能 發生相似的活化突變。最后，對與預后標記物(PR、ER、erbB2、EGFR)相關的Notch表達的分析顯示，在 乳腺癌樣品或細胞系中均沒有顯著的相關性。該分析的結果提供了強有力的證據，這就是 Notch途徑在人乳腺癌中被改變。實施例3抑制Notch信號轉導逆轉人乳腺癌細胞系MDA-B231和MCF7的轉化表型來自乳腺癌患者和細胞系分析的結果顯示Notch信號轉導在所有分析的20個人 乳腺癌樣品和8個發生腫瘤的乳房上皮細胞系中被活化。為了確定Notch信號轉導的增加 是否參與腫瘤的發展，在2個不同的乳腺癌細胞系中通過過表達Numb來抑制Notch信號轉 導。本實驗選擇的2個細胞系是MDA-MB-231和MCF7。MDA-MB231細胞系來自不表達ER、 ra、EGFR和E-鈣粘蛋白但強烈地表達erbB2的腺癌(見表2)。也有報道，當它被注射到裸 鼠體內，它是高度轉移性的。相反，MCF7細胞系是ER、PR、E-鈣粘蛋白陽性和erbB2、EGFR 陰性的(見表2. 1)，它也來自腺癌，但是當它被注射到裸鼠體內時，不轉移。為了研究Numb在細胞轉化中的潛在的作用，產生了穩定表達Numb的MCF7和 MDA-MB231細胞系。用編碼Numb蛋白和攜帶新霉素抗性盒的pcDNA3. 1表達載體轉染這兩個 細胞系。用遺傳霉素挑選攜帶載體穩定整合的細胞。也產生了攜帶空pcDNA3. 1載體的MCF7 和MDA-MB231細胞系作為對照。蛋白質印跡鑒定，與親本細胞和載體對照細胞相比，MCF7/ Numb和MDA-MB231/Numb細胞系中Numb的表達水平升高了。Numb的過表達伴隨著NICD和 Heyl的下調。在MCF7/Numb細胞中還觀察到E-鈣粘蛋白的上調，但是在MDA_MB231/Numb 細胞中未觀察到。為了評價Numb對細胞形態學的影響，分析了親本細胞、載體對照細胞和MCF7/ Numb或MDA-MB231/Numb細胞。親本細胞和載體對照MCF7細胞顯示致瘤的、紡錘體樣的表 型。相反，MCF7/Numb細胞的表型變成了正常的上皮細胞鵝卵石樣的形態學。此外，與親本 細胞和載體對照細胞系的無組織生長相比，MCF7/Numb細胞在有組織的相互緊密接觸的細 胞島中生長。相反，MCF7/Numb細胞顯示與正常細胞系相似的鵝卵石樣上皮細胞形態學。這 種形態學上的改變提示MCF7/Numb細胞系已失去了其轉化的表型。但是，為了更嚴格地檢 測這種變化并檢測MDA-MB231/Numb細胞系，將這兩個細胞系鋪板到軟瓊脂上。與親本細胞 和載體對照細胞形成的集落數相比，MCF7/Numb和MDA-MB231/Numb細胞形成的集落數分別 降到5%和0% (圖2A和2B)。這個結果強有力地提示，在MCF7和MDA-MB231細胞中需要 Notch信號轉導來維持其轉化的表型。這些數據提示，Notch信號轉導的活化是乳房上皮細胞轉化的重要事件。在MCF7 細胞中，Numb對Notch途徑的失活上調E-鈣粘蛋白的表達，恢復正常上皮細胞的形態學。 這種形態學上的改變或許是由于粘附連接的恢復。MCF7/Numb和MDA_MB231/Numb細胞在軟 瓊脂中形成集落的能力降低，這提示Numb阻斷了這兩個細胞系的不依賴于貼壁的增殖。
另外，使用Numb減弱notch信號轉導途徑抑制免疫缺陷的裸鼠的腫瘤形成。將穩 定表達Numb或空載體的5X IO5細胞分別注射到免疫缺陷的裸鼠的右側腹或左側腹。只在 注射了表達空載體細胞的左側腹腫瘤生長得到支持，注射了表達Notch抑制劑Numb的細胞 的右側腹腫瘤生長得不到支持。實施例4抗Notch活化的Tr3和Tr4產物低生物膜通透性通常是抗癌多肽部分輸送的一個障礙并限制了抗癌多肽部分的 治療價值。肽越過生物膜的易位可不通過經典的胞吞途徑，而是通過好像不需能量的機制 的實證揭開了生物醫學研究的新的可能性。本發明的方法利用特洛伊肽觸角足(Trojan peptide Antenapedia(ANTP))的細 胞易位能力來治療癌癥。“特洛伊木馬”肽是小的蛋白或蛋白區域，另外被稱作蛋白轉導結 構域(PTDs)，具有以不依賴溫度、受體和轉運體的方式有效地穿越包括血腦屏障在內的生 物膜的能力。它們巨大的治療潛力在于這些肽能運載與其融合的任何藥物化合物(化學 品、蛋白質、DNA)，而不論其物理性質如何。果蠅屬同源異型轉錄因子ANTP就是一個這樣的 肽。ANTP同源結構域是來自黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)生物體的序列特異的 轉錄因子。這個蛋白由觸角足(antp)基因編碼。Antp是調節系統的成員，它在有機體的 前_后軸上給細胞特異的位置。因此，Antp輔助果蠅屬中胸節段的細胞發育的控制。同源異形盒結構域或同源結構域是通過螺旋_轉角-螺旋結構基序結合DNA的結 構域。含有同源異形盒結構域的蛋白質通常在發育中發揮作用，它們許多是序列特異的轉 錄因子。ANTP同源結構域為60個氨基酸殘基長，含有4個α螺旋。這種基序與在原核阻 遏蛋白中發現的基序相似。融合蛋白是遺傳改造的，由觸角足-Numb (Tr3產物)組成，檢測它體內靶向腫瘤細 胞的能力(圖3A)。SEQ ID N0. 1列出了 Tr3融合蛋白的序列。Numb序列單獨列在SEQ ID N0. 3 中。實施例5ANTP/DN-MAML的實驗室產生和特性Mastermind-樣(MAML)是一個富含谷氨酰胺的核蛋白，它是Notch信號轉導活化 所必需的。MAML是所有4個Notch受體的輔激活物。Mastermind與活化的Notch (NICD)的 胞內部分、轉錄因子CBFl和DNA形成復合體。這導致了 Notch靶基因Hes和Hey的活化， Hes和Hey構成轉錄抑制物家族。但是，能夠維持與復合體締合的MAML的截短形式以顯性 負性(DN)的形式發揮作用，并抑制Notch活化。DN-MAML由62個氨基酸扭結的α -螺旋組 成，它通過與CBFl和Notchl的錨蛋白重復序列相接觸形成穩定的三元復合體，但是它缺少 負責Notch活化的MAMLl的C-末端部分。構建了由ANTP/DN-MAML(TR4)組成的融合蛋白(圖 3B) (SEQ ID N0. 2)。檢測了 這個結構構建物介導核易位、抑制Notch信號轉導活化、在動物中的生物分布和靶向乳房 腫瘤的外_、中-和內核的能力。產生在細菌表達系統(大腸桿菌E Coli))中產生ANTP/DN-MAML融合蛋白。用含有融 合基因的載體轉化細菌表達株，誘導表達，裂解細菌。誘導后3小時ANTP/DN-MAML融合蛋白的表達為最大，達到2. 5mg/L培養物。在具有鹽酸胍和尿素的變性條件下，在鎳螯合瓊脂 糖柱上利用金屬親和層析分離融合蛋白產物。然后用Tris緩沖鹽水使融合蛋白產物再次 折疊，之后用PBS透析2次以獲得最終有功能的產物。不正確折疊的蛋白是無功能的，從溶 液中沉淀析出。獲得的最終產量是每升培養物0. 8-lmg活性化合物。配制和儲存融合蛋白以0. 25mg/mL的濃度在PBS中冷凍。使用之前，將融合蛋白濃縮10倍至 2. 5mg/mL。表征和檢測ANTP/DN-MAML 是一個 14. 18KDa 的融合蛋白a) 60個氨基酸的觸角足同源結構域，分子量為6. 6KDa (SWISSPR0T = P02833) (R K RGRQTYTRYQTLELEKEFHFNRYLTRRRRIEIAHALCLTE RQIKIWFQNRRMKWKKEN) (SEQ ID NO. 4)b) 62 個氨基酸的 DN/MAML 序列(SWISSPR0T = Q92585 (MAML1-HUMAN,氨基酸 13-74))，分子量為 6. 8KDa (LPRHSAVMERLRRRIELCRRHHSTCEAR YEAVSPERLELERQHTFALHQRCIQAKAKRAGKH) (SEQ ID NO. 5)c)用于純化的五組氨酸標記，分子量為0. 775KDa從親和柱純化的ANTP/DN-MAML融合蛋白部分通過SDS-PAGE檢測，用考馬斯亮藍 染色，并用抗五組氨酸抗體及過氧化物酶結合的抗體進行免疫印跡。實施例6ANTP/DN-MAML介導的核轉導為了測定ANTP/DN-MAML (TR4)融合蛋白的細胞定位，進行了人乳房上皮乳腺癌 MDA-MB231細胞的免疫染色。在37°C、含有10 %小牛血清的DMEM培養基(Dulbecco ‘ s modified Eagle' s medium)中培養MDA-MB231細胞至亞匯合。洗附著有細胞的蓋玻片， 將其與濃度為50 ii M的ANTP/DN-MAML純化的融合蛋白在無血清培養基中溫育2小時。洗 細胞3次，將細胞用4%的福爾馬林固定15分鐘。簡單洗滌后，將蓋玻片與封閉液、接下來 與抗His —抗和FITC結合的二抗溫育。用ZeissAxioscope 40熒光顯微鏡觀察熒光。結果顯示ANTP/DN-MAML在粘附細胞中有核定位。這種定位令人感興趣，因為人癌 癥乳房上皮細胞系MDA-MB231是較難轉染的細胞之一。實施例7ANTP/DN-MAML-介導的 Notch 抑制為了研究ANTP/DN-MAML抑制Notch信號轉導活化的潛在的作用，高度轉移的乳 房上皮細胞系MDA-MB231細胞系用ANTP/DN-MAML融合蛋白處理2個小時。用SDS緩沖液 從細胞中提取總蛋白。使用BCA蛋白分析試劑盒測定總蛋白的濃度。用5X樣品緩沖液 (250M Tris-HCl pH 6. 8、500mM 二硫蘇糖醇、10% SDS、0. 5%溴酚藍、50%甘油)稀釋總蛋 白(10-50g)，100°C加熱，用SDS-PAGE分析。在電泳緩沖液(25mM Tris HCl、250mM甘氨 酸、0.1% SDS)中進行電泳60分鐘或直到溴酚藍跑出凝膠。在冰冷的轉移緩沖液(39mM 甘氨酸、48mM Tris HC1)中100V電泳90分鐘將分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜。用在 山羊一抗中產生的抗小鼠IgG過氧化物酶(Sigma A9917)在封閉緩沖液中4°C過夜用一抗進行蛋白質印跡。在TBS-T緩沖液中洗硝酸纖維素膜4次，每次5分鐘。用封閉緩沖液以 1 10，000稀釋多克隆兔抗山羊的二抗，室溫溫育60分鐘，然后TBS-T緩沖液中洗4次，每 次5分鐘。用2ml Super Signalffest Pico化學熒光底物試劑(PIERCE)檢測特異性結合， 將信號捕獲在Kodak XAR-5膜上。在用ANTP/DN-MAML轉染的細胞中，ANTP/DN-MAML的表達伴隨有活化的 Notch(NICD)的下調，但在ANTP轉染的細胞或親本(未轉染的)細胞中則不這樣。在用 ANTP/DN-MAML融合蛋白處理的細胞中，Notch活化的下調發生，但在用ANTP單獨處理的細 胞中則不發生。這些結果表明，ANTP/DN-MAML可用于阻斷Notch活化。實施例8ANTP/DN-MAML 牛物分布為了測定觸角足是否能用于在體內遞送DN-MAML，通過尾靜脈給⑶1裸鼠靜脈內 注射4mg/kg的ANTP/DN-MAML融合蛋白。小鼠用磷酸鹽緩沖鹽水灌注5分鐘，注射后2小 時將其處死。通過蛋白質印跡分析來測定每個器官中ANTP/DN-MAML的表達。與注射PBS 的對照小鼠相比，來自ANTP/DN-MAML注射小鼠肝臟、腎臟、心臟、肺、脾臟和腦的組織樣品 展示了顯著的信號。令人感興趣地是，在動物的腦中也檢測到ANTP/DN-MAML，這提示ANTP/ DN-MAML能穿越血腦屏障。這樣，本發明的靶向遞送系統在將治療蛋白給予中樞神經系統中 可具有廣闊的應用。實施例9ANTP/DN-MAML穿誘乳房腫瘤的外、中和內核通過尾靜脈給用MDA-MB231人乳房上皮乳腺癌細胞系異種移植的CD1裸鼠注射純 化的ANTP/DN-MAML融合蛋白。用磷酸鹽緩沖鹽水灌注小鼠5分鐘，并在注射后2小時將其 處死。將腫瘤取出，在立體鏡下切開，分離腫瘤的外、中和內核。用蛋白質印跡測定腫瘤的 每個核中的ANTP/DN-MAML。在注射了 ANTP/DN-MAML的動物的腫瘤的外、中和內核中檢測到 了 ANTP/DN-MAML的表達，但在注射了 PBS的對照動物中則未檢測到。為了建立ANTP/DN-MAML在腫瘤內的定位，進行了上述乳腺癌樣品的免疫組化檢 查。觀察到乳腺癌細胞的核內有強的ANTP/DN-MAML染色。這些數據表明，ANTP/DN-MAML融 合蛋白介導體內的核定位。實施例10觸角足-顯性負性Mastermind引起的體內腫瘤減小在小鼠中建立乳腺癌異種移植物。將小鼠分成2組，每2天給小鼠注射作為對照 的PBS或4mg/kg ANTP/DN-MAML融合蛋白(n = 6每組)(圖4A)。用PBS處理的對照小鼠 快速發展出生長的腫瘤。20天后，將對照小鼠處死。32天后，用ANTP/DN-MAML處理的小鼠 的腫瘤體積沒有增大，這提示ANTP/DN-MAML阻止或抑制腫瘤生長(圖4B)。實施例11毒理學和免疫原性研究為研究ANTP/DN-MAML在腫瘤模型中的安全性、免疫原性和有效性，進行了下面的 體內試驗。免疫原性是對治療藥物產生免疫反應的量度。這與治療性蛋白藥物的使用相關， 因為抗藥抗體的發展可引起變態反應或過敏反應，藥物的有效性的減低和/或自身免疫的 誘導。
在免疫活性小鼠中研究ANTP/DN-MAML的免疫原性。用ANTP/DN-MAML (0. 2ml， 2. 5mg/ml)靜脈內免疫動物，不加佐劑，每天1次，共5天。在4個月的時間里每周采血一 次，用ELISA監測免疫反應。用PBS以1 10、1 100和1 1000稀釋血樣，用ELISA在 天然的ANTP/DN-MAML (50 u g/ml包被)上監測免疫反應，并用抗小鼠的抗體檢測。結果顯 示，在每周劑量為2. 5mg的免疫活性小鼠中，ANTP/DN-MAML并沒有引起免疫反應。這個劑 量相當于人中的100mg/kg。實施例12體內最大耐警劑量研究當小鼠達到12周齡時開始尾靜脈給予ANTP/DN-MAML。連續地監測小鼠低血糖休 克的征象或藥物副作用，如果體重減輕超過15%，就將小鼠處死。檢測從4mg/kg/天開始的 各種劑量。發現57mg/kg/天的ANTP/DN-MAML是最大耐受劑量。在這個劑量下，小鼠食欲 缺乏，體重減輕和血糖過低。注射后3天處死動物，終止試驗。實施例13卵巢癌、結腸癌和胰腺癌樽型結腸癌細胞中有高水平的Notch表達。給予帶有異種移植的Colo205腫瘤的雌性 裸鼠ANTP/DN-MAML。每隔一天給小鼠注射0. 2ml的4mg/ml ANTP/DN-MAML蛋白。這個劑量 相當于每個患者2g ANTP/DN-MAML融合蛋白。結果顯示，給予ANTP/DN-MAML降低了體內結 腸癌細胞的生長。盡管參考上述實施例描述了本發明，但是應理解的是各種修改和變化包含在本發 明的精神和范圍內。因此，本發明只受所附權利要求的限制。
權利要求
一種治療癌癥的方法，包括用圖3A(SEQ ID NO1)或3B(SEQ ID NO2)中顯示的構建物接觸癌細胞足夠的時間，使得所述構建物得到表達，從而治療所述癌癥。
2.權利要求1所述的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
3.權利要求1所述的方法，還包括用化學治療劑接觸所述癌細胞。
4.一種測定癌細胞對Notch途徑抑制劑治療的反應性的方法，包括測定細胞中的 Notch 1水平，其中，與正常細胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的較高水平表示細胞對 Notch途徑抑制劑治療有反應。
5.權利要求4所述的方法，其中圖3A或3B顯示了Notch途徑抑制劑。
6.權利要求4所述的方法，還包括測定細胞中Numb表達的水平，其中與正常細胞中的 Numb水平相比，Numb表達的低水平表示細胞對Notch途徑抑制劑治療有反應。
7.權利要求4所述的方法，其中所述癌細胞是乳腺癌細胞。
8.構建物，如圖3A或SEQID NO :1中所顯示。
9.構建物，如圖3B或SEQID NO :2中所顯示。
10.一種治療癌癥的方法，包括用顯性負Mastermind同種型或Numb同種型接觸癌細胞。
11.權利要求10所述的方法，其中所述癌癥是乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌、前列腺 癌、血癌或胰腺癌。
12.權利要求10所述的方法，還包括用化學治療劑接觸所述癌細胞。
13.權利要求10所述的方法，還包括用觸角足接觸所述細胞。
14.一種測定癌細胞對Notch途徑抑制劑的治療是否有反應的方法，該方法包括測定 細胞中的Notch 1水平，其中，與正常細胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的較高水平表 示細胞對Notch途徑抑制劑的治療有反應。
15.權利要求14所述的方法，其中所述Notch途徑抑制劑包括顯性負Mastermind同種 型或Numb同種型。
16.權利要求14所述的方法，還包括測定細胞中Numb表達的水平，其中，與正常細胞中 的Numb表達水平相比，Numb表達的低水平表示細胞對Notch途徑抑制劑的治療有反應。
17.權利要求14所述的方法，其中所述癌細胞是乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細 胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、造血細胞或胰腺癌細胞。
18.—種監測治療患有癌癥或處于患有癌癥危險的受試者的治療計劃的方法，該方法 包括測定一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達。
19.權利要求18所述的方法，其中所述涉及Notch信號轉導途徑的基因選自Jaggedl、 Jagged2 S -樣 4、E_ 鈣粘著蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl、Hes5 或其組合。
20.一種診斷患有癌癥或處于患癌癥危險的受試者的方法，該方法包括測定一個或多 個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達，其中，與正常細胞的水平相比，一個或多 個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達的改變診斷出患有癌癥或處于患癌癥危 險的受試者。
21.權利要求20所述的方法，其中所述涉及Notch途徑的基因選自Jaggedl、 Jagged2 S -樣 4、E_ 鈣粘著蛋白、Numb、NICD Notch 3、Heyl、Hes5 或其組合。
22.一種鑒定試劑的方法，該試劑調節一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達，該方法包括將測試試劑與顯示表達一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基 因的細胞相接觸，檢測一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達的變化， 由此鑒定所述測試試劑為調節一個或多個涉及Notch信號轉導途徑的基因的活性或表達 的試劑。
23.權利要求22所述的方法，其中所述涉及Notch信號轉導途徑的基因選自Jaggedl、 扭886(12 3-樣4』-鈣粘著蛋白、燦11113、肌0) Notch 3、Heyl、Hes5或其組合。
24.權利要求22所述的方法，其中所述細胞是癌細胞。
25.權利要求24所述的方法，其中所述癌細胞是乳腺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細 胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞、造血細胞或胰腺癌細胞。
26.權利要求22所述的方法，其中所述試劑是化學化合物、蛋白質或核酸。
27.權利要求26所述的方法，其中所述試劑是反義或RNAi分子。
28.一種將化合物遞送給細胞的方法，該方法包括用融合到觸角足或其功能部分的化 合物接觸所述細胞。
29.權利要求3或12所述的方法，其中所述化學治療劑選自柔紅霉素、更生霉素、多柔 比星、博來霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法侖、環磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌 呤、阿糖胞苷(CA)、5_氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、長春 新堿、長春堿、依托泊甙、替尼泊甙、順鉬或二乙基己烯雌酚(DES)或其組合。
全文摘要
本發明基于Notch信號轉導途徑與癌癥相關的發現。相應地，本發明提供了治療癌癥的方法和組合物。還提供了用于對受試者診斷和治療癌癥的調節Notch信號轉導途徑中的蛋白的表達和/或活性的方法。
文檔編號C07K14/435GK101878223SQ200880118402
公開日2010年11月3日 申請日期2008年10月6日 優先權日2007年10月5日
發明者S·斯蒂利亞諾 申請人:特洛伊科技有限公司