專利名稱：一種蘋果屬植物蛋白質雙向電泳方法
技術領域：
本發明涉及一種蘋果屬植物蛋白質雙向電泳方法。
技術背景鐵是植物生長發育必須的微量元素之一，利用生物學技術解決植物的缺鐵問題 是一個行之有效的方法。小金海棠是全球第一個耐缺鐵的蘋果屬植物，研究小金海 棠抗逆反應機理對培育抗逆果樹品種顯的尤為重要。蛋白質組分析是研究植物抗逆 反應的重要技術手段，有助于研究植物的耐缺鐵機理。蛋白質雙向電泳是蛋白質組 分析中常用的技術方法，迄今為止還沒有適于蘋果屬植物的雙向電泳分析方法。這 是由于小金海棠植物體內富含多糖、酚類及核酸類物質，這些物質的存在對雙向電 泳的干擾很大，導致與蘋果屬植物相關的蛋白質組研究相對滯后。合適的蛋白樣品 制備方法、適宜的蛋白質上樣量和凝膠染色方法在蘋果屬植物蛋白質組分析中起重 要作用。 發明內容本發明的目的是提供一種蘋果屬植物蛋白質雙向電泳方法。 本發明提供的蘋果屬植物蛋白質雙向電泳方法，依次包括以下步驟1) 將蘋果屬植物材料在液氮中研碎后，向所述植物材料中加入-2(TC預冷的含 有10%的三氯乙酸和0.07%的e-巰基乙醇的丙酮溶液繼續研磨成勻漿，-2(TC下放 置l h，然后12000 rpm離心15 min，棄上清，保留沉淀；2) 向所述沉淀中加入所述沉淀的4倍體積的含有0.07%的巰基乙醇的丙 酮溶液，混勻后，放置于-20°C 1 h，然后12000 rpm離心15 min，棄上清，保留 沉淀；3) 重復步驟2) 6次，得到蘋果屬植物蛋白質；4) 對步驟3)的蘋果屬植物蛋白質先進行等電聚焦電泳，然后再沿其垂直方向 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；其中，所述等電聚焦電泳中，蛋白質上樣量為300 ug/170 mm膠條，所述聚丙 烯酰胺凝膠電泳中采用的染色方法是銀染；所述百分數均為質量百分含量。本發明的蘋果屬植物蛋白質雙向電泳方法，是從蛋白質的提取入手，改進了蛋白提取步驟中清洗沉淀的方法，使得后續的蛋白樣品在進行等電聚焦過程中在膠條 表面的褐色物質減少，有利于等電聚焦的順利進行。本發明的蛋白質雙向電泳方法適合于所有的蘋果屬植物，如小金海棠(#WMxz'a。yi/ e/ 57's)、 山定子(Afo/附6"ccflto(Z., Borkh)等。同時，本發明的蛋白質雙向電泳方法適合于蘋果屬植物的各個組織和器官的總 蛋白雙向電泳，如白色幼嫩初生根。木本的蘋果屬植物的總蛋白在進行雙向電泳，由于植物中核酸，酚類物質等含 量多，提取的蛋白中的雜質影響雙向電泳結果。本發明改進了清洗蛋白沉淀的方法、 確定了適合于蘋果屬植物的蛋白上樣量以及蛋白染色方法，解決了蘋果屬木本植物 中提取的蛋白質存在大量雜質的問題，有效減少了聚焦過程中吸附在膠條上的褐色 物質以及對雙向電泳結果產生干擾的技術問題，有利于后續的質譜分析鑒定蛋白。 本發明將在蘋果屬木本植物的蛋白質利用方面得到廣泛的應用。


圖1為小金海棠總蛋白質雙向電泳圖具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。 下面以小金海棠(ifeJ^ u'ao力'/j朋Ws)為例，闡明本發明的蘋果屬植物蛋白 質雙向電泳方法。實施例l、小金海棠(￥a7ws H'ao力'/3朋s&)的蛋白質雙向電泳 本發明的蛋白質雙向電泳包括樣品的制備，蛋白定量，雙向凝膠電泳，蛋白染色及膠圖像分析等步驟，具體方法如下1.樣品的制備1) 將小金海棠(勸7m xi朋力'/2e/7w;s^e/ 《/i朋《)(國家蘋果種質資源圃 中的編號為DGB0458)的幼嫩的白色初生根系2g，置于液氮中冰浴研磨至呈白色粉 末狀；2) 加入2 1111-20〔預冷的含有10%的三氯乙酸和0.07%的e-巰基乙醇的丙酮 溶液繼續研磨成勻漿，轉入離心管中，-2(TC下放置1 h，然后4'C 12000rpm離心 15min，棄上清；3) 向沉淀中加入4倍沉淀體積的含0.07% e-巰基乙醇的丙酮溶液充分渦旋， 放置于-20°C 1 h，然后4。C 12000rpm離心15min，棄上清；4)重復步驟3) 6次，然后凍干。2. 蛋白定量用Brandford法定量蛋白，然后分裝放入-80。C備用。3. 雙向凝膠電泳水化及第一向等電聚焦電泳參考B10-RAD公司儀器說明進行。pH5-8的17cm IPG 膠條(購自美國Bio-Rad公司，163-2011)分別在300y L的樣品混合液l、樣品混合 液2和樣品混合液3中水化12h;樣品混合液l、樣品混合液2和樣品混合液3的組分如 下樣品混合液l， 300uL水化液中含有300ug的步驟l中制備的總蛋白；樣品混合 液2， 300y L水化液中含有600ug的步驟l中制備的總蛋白；樣品混合液3， 300uL 水化液中含有1200ug的l中制備的總蛋白。上述水化液的組成如下7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4g/100ml表面活性劑Chaps， 65 mmol/L 二硫蘇 糖醇，0.2%(體積百分比)兩性電解質CA;接著進行第一向等電聚焦電泳，參數設置為250 V/0. 5 h， 1000 V/1 h， 10000 V/ 5 h， 10000 V/60000 VH， 500 V/1 h。等電聚焦結束后，膠條依次在平衡液I (6. 0 mol/L尿素，2 g/100 ml SDS， 0. 375 mol/L Tris-HC1 pH8. 8， 20 ml/100 ml 甘油，130 mmol/L二硫蘇糖醇)和平衡液II (6.0 mol/L尿素，2 g/100 ml SDS， 0.375 mol/L Tris-HC1 pH8. 8， 20 ml/100 ml甘油，135咖ol/L碘代乙酰胺)中 各平衡15 min。第二向的SDS-PAGE在美國BI0-RAD公司，164-5050垂直板電泳儀上進行，12% 分離膠濃度的不連續緩沖液系統，參數設置為起始電流5 mA/gel/17 cm，濃縮成一 條線后，加大電流為20 30 mA/gel/17 cm。4. 蛋白染色及凝膠圖像分析上樣量300 ug總蛋白的膠和上樣量600 ug總蛋白的膠用快速硝酸銀染色方 法染色，快速硝酸銀染色方法如下1) 將凝膠放入固定液(40ml/100ml乙醇，10 ml/100 ml乙酸)中固定30min2) 倒出固定液，加入致敏液(30 ral/100 ml乙醇，0. 2 g/100 ml硫代硫酸鈉， 6.8 g/100 ml乙酸鈉)致敏30 min3) 倒出致敏液，用蒸餾水洗凝膠3次，每次IO min4) 倒出蒸餾水，加入染色液(0.25 g/100 ml硝酸銀，0.04 ml/100 ml甲醛 原液)，染色20 min5) 倒出染色液，加入蒸鎦水洗2次，每次l min6) 將凝膠置于顯色液(2. 5g/100ml碳酸鈉，0.02 ml/100 ml甲醛原液)中， 見背景加深時終止顯色7) 倒出顯色液，加入終止液(1.46 g/100 ml EDTA)處理凝膠10 min，停止顯色8) 倒出終止液，蒸餾水洗洗凝膠3次，每次IO min。上樣量1200ug總蛋白的膠在考馬斯亮蘭染色液(用50 ml/100 ml甲醇，10 ml/100 ml乙酸，0.25 g/100 ml考馬斯亮藍R250)中染色過夜。然后使用脫色液 (5%乙酸，10%甲醇)溶液脫色，反復更換脫色液直至蛋白質點在背景上變得清晰。用Koda校準卡校正Image master Lab scan掃描儀，掃描時光學分辨率設為 300 dpi, ID SDS-PAGE膠用Lab scan軟件進行灰度掃描，雙向凝膠電泳的膠用 Unimagic scan軟件進行真彩色掃描后利用Image master 2DElite v5. 0軟件進行 分析。以上電泳實驗均重復3次。蛋白染色及凝膠圖像分析的結果表明，上樣量300 u g總蛋白的膠銀染后的圖 像中蛋白質分離較好且染色后出現的負染點少，如圖1A。而上樣量600ug總蛋白 的膠銀染后的圖像中盡管顯現出一些低豐度蛋白點，但由于上樣量的增大出現了負 染，嚴重影響了后續的圖像分析，如圖1B。上樣量1200"g總蛋白的膠用常規考馬 斯亮藍染色后的圖像中蛋白點有475個，如圖1C，明顯少于上樣量300ug總蛋白 的膠銀染圖像中的蛋白點。對于蛋白含量少的小金海棠根部總蛋白，在進行雙向電泳時盡管提高了上樣 量，但是用常規考馬斯亮藍染色，仍然不利于分離和顯示低豐度的蛋白。因此，小 金海棠根部總蛋白進行雙向電泳時適用硝酸銀染法，上樣量為300u g總蛋白。
權利要求
1. 一種蘋果屬植物蛋白質雙向電泳方法，依次包括以下步驟1)將蘋果屬植物材料在液氮中研碎后，向所述植物材料中加入-20℃預冷的含有10％的三氯乙酸和0.07％的β-巰基乙醇的丙酮溶液繼續研磨成勻漿，-20℃下放置1h，然后12000rpm離心15min，棄上清，保留沉淀；2)向所述沉淀中加入是所述沉淀的4倍體積的含有0.07％的β-巰基乙醇的丙酮溶液，混勻后，放置于-20℃1h，然后12000rpm離心15min，棄上清，保留沉淀；3)重復步驟2)6次，得到蘋果屬植物蛋白質；4)對步驟3)的蘋果屬植物蛋白質先進行等電聚焦電泳，然后再沿其垂直方向進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；所述等電聚焦電泳中，蛋白質上樣量為300ug/170mm膠條，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳中采用的染色方法是銀染；所述百分數均為質量百分含量。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述蘋果屬植物為小金海棠。
3、 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述蘋果屬植物材料為白色 幼嫩初生根。
全文摘要
本發明公開了一種蘋果屬植物蛋白質雙向電泳方法。該方法包括以下步驟1)將植物材料在液氮中研碎，加入-20℃預冷的含有10g/100ml的三氯乙酸和0。07ml/100ml的β-巰基乙醇的丙酮溶液繼續研磨成勻漿，-20℃放置1h，然后12000rpm離心15min，保留沉淀；2)向沉淀中加入4倍沉淀體積的含有0.07ml/100ml的β-巰基乙醇的丙酮溶液，混勻-20℃放置11，然后12000rpm離心15min，保留沉淀；3)重復步驟2)6次，得到總蛋白；4)對步驟3)的總蛋白進行等電聚焦電泳，蛋白質上樣量為300ug/170mm膠條，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結束后進行銀染。
文檔編號C07K1/00GK101260146SQ20081010485
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月24日 優先權日2008年4月24日
發明者李天忠, 憶 王, 王晶瑩, 許雪峰, 韓振海 申請人:中國農業大學