專利名稱：單鏈fc多肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含一種或多種免疫球蛋白Fc結構域的單鏈多肽。本 發明具體涉及在所述多肽鏈內形成至少一個功能性Fc結構域的單鏈 Fc多肽。
背景技術：
免疫球蛋白是二價的Y形分子，其包含兩個相同的重鏈和兩個相 同的輕鏈。二硫鍵將重鏈和輕鏈對及兩個重鏈相連。每個鏈包括一個 序列變化并負責抗原結合的可變域，將重鏈和輕鏈中的所述可變域分 別稱為VH和VL結構域。每個鏈還包括至少一個恒定域。輕鏈中有一個 的恒定域(CL)，而重鏈中有至少3個(CJ、 CJ和Ch3),有時有四 個(Ch4)(取決于同種型)恒定域。人有五種不同類型或同種型的抗 體，包括IgA (其包括IgAl和IgA2) 、 IgD、 IgE、 IgG(其包括IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4亞類)和IgM。
抗體的Fc結構域通常包含每個鏈的至少兩個重鏈恒定區結構域， 其二聚化形成Fc結構域。Fc結構域負責提供抗體效應功能，包括決 定抗體半衰期和在體內的分布、固定補體和結合于細胞表面Fc受體的 能力。Fc結構域的性質使其成為有用的治療劑，并已將Fc結構域融 合于其它非抗體蛋白質，例如受體蛋白，例如依那西普。也可將Fc 結構域融合體用作研究試劑，"Fc標簽"，其有利于融合蛋白的檢測 和純化。此外，已對許多包含Fc結構域的替代性抗體結構進行了描述 (Dumont " ". ， 2006， Biodrugs， 20 (3) 151-160、 W02005001025、 WO2005077981、 WO2005017148,及Haydene"/. ， 1994, Therapeutic Immunology, 1， 3-15) 。 WO2005077981描述了其中各個鏈包含兩個 Fc結構域的抗體，即每個抗體鏈包含CH2 CH3 CH2 CH3的依次排列，且這些結構域二聚化形成兩個功能性Fc結構域，以提供增強的效應功 能。W02005017148和Hayden等人在之前描述了包含融合于半個Fc結 構域的單鏈Fv的單鏈多肽，即sc-Fv-CH2 CH3。這些多肽可兼以單體 或二聚體形式存在。
抗體的結合特異性使其成為有用的治療劑，然而，二價分子(例 如抗體)通常并非某些細胞表面抗原的合適的耙向制劑。二價結合可 導致靶細胞經歷共刺激、激活和/或抗原調整，從而為所述細胞提供了 逃避補體和由抗體Fc結構域募集的多種效應細胞的手段。作為代替， 為了靶向這類細胞表面抗原， 一般將抗體綴合于予細胞內化后將其殺 死的藥物或毒素上。
相反，由于不發生表面抗原的重新分布，及因此無共刺激作用和 內攝作用，所以一價抗體片段不引發抗原調整。因此可期望在這類片 段中保留抗體的所述天然效應功能，且由此繞開昂貴且耗時的結合于 藥物或毒素的工序。通過對兔IgG的溶蛋白性切割產生所述抗體片段 的一個實例(Glennie and Stevenson, 1982， Nature, 295， 712-713)。 所述片段僅包含一個Fab結合位點，但保留了完整的Fc結構域。通過 對兔IgG抗體A12異型變體的木瓜蛋白酶消化產生所述片段，所述變 體的一條鏈被糖基化，使所述鏈具有木瓜蛋白酶消化抗性，從而使可 保留一個Fab臂。已證實，所產生片段可比全IgG更有效激活補體介 導的細胞溶解。已通過對人IgG進行蛋白水解消化(Michaelsen and Natvig, Scand. J. Immunology, 1973， 2， 299-312; Michaelsen and Natvig， Scand. J. Immunology, 1972， 1， 255-268 )及通過化學切 割(Wines and Easterbrook-Smith， Molecular Immunology, 1991， 28， 8， 855-863 )得到類似片段。因為進行蛋白水解需進行長時間準 備，且產率低，所得產物為混合物，所以所述片段不適用于商業化生 產。
WO20050010125描述了包含兩個多肽鏈的雜化蛋白，其中第一多 肽鏈包含Fc區和生物活性分子，而第二多肽鏈包含Fc區，但無所述 第一鏈的所述生物活性分子。獨立制備兩條鏈，并使其相互二聚化或
7化學綴合。盡管如此可獲得理想的功能分子，但所述制備過程復雜， 且包括低產率的層析程序。
我們現已令人驚訝地發現制備作為單鏈多肽的功能性Fc結構域 是可能的。因此，本發明的多肽具有可大量通過重組方法制備，并可
而且，由于抗體恒定域在鏈內形成Fc結構域，從而本發明的多肽不易 于二聚化，因此正如所期望的，可避免二價結合結構域。

發明內容
因此，本發明提供包含兩個CH2結構域和兩個CH3結構域的單鏈 多肽，其特征在于所述CH2和CH3結構域在鏈內形成功能性Fc結構域。 本發明的單鏈多肽中的功能性Fc結構域不是通過兩條鏈的二聚化而 形成，即，兩個CH2結構域和兩個CH3結構域存在于單鏈中，并在單 鏈內形成功能性Fc結構域。因此，本發明提供包含兩個CH2結構域和 兩個CH3結構域的單鏈多肽，其特征在于所述CH2和CH3結構域在所 述鏈內形成功能性Fc結構域，而并非通過與另一多肽鏈二聚化形成。 因此，在本發明的單鏈多肽中，在多肽鏈內，第一CH2結構域與第二 CH2結構域二聚化，且第一 CH3結構域與第二 CH3結構域二聚化。
本文所用術語"功能性，，是指在單鏈多肽內形成Fc結構域以提供 一種或多種通常與Fc結構域有關的效應功能的能力，盡管也可將其它 功能整合入所述結構域中。效應功能的實例包括決定全身Fc多肽的半 衰期和/或分布、Fc多肽固定補體的能力，及Fc多肽結合細胞表面Fc 受體的能力。所述效應功能的實例包括但不限于，抗體依賴性細胞毒 性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)和補體依賴的細胞毒 性(CDC )。
本發明的Fc結構域包含四個或更多的恒定域，其可能源自任何合 適的物種和/或抗體類型。優選人源恒定域。人有五種不同類型或同種 型的抗體，包括IgA (其包括IgAl和IgA2) 、 IgD、 IgE、 IgG(其包 括IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4亞型)和IgM。根據所需效應功能，可使用任何合適的Fc結構域。本文所稱Fc結構域通常指IgA、 IgD和 IgG的最后兩個恒定區免疫球蛋白結構域(CH2和CH3 )，及IgE和IgM 的最后三個恒定區結構域(CH2、 CH3和CH4)，盡管在某些情況下無 需所有所述結構域，例如在IgE或IgM的情況下僅CH2和CH3結構域 即足夠。也可在單鏈Fc多肽內形成一個以上的Fc結構域，且所述Fc 結構域可源自相同或不同同種型。
通常根據Kabat等人設計的系統對抗體結構域中的殘基進行編 號。此系統在Kabat等人，1987 ， in Sequences of Proteins of Immunological Interest ， US Department of Health and Human Services, NIH， USA(以下"Kabat等人{參見上文}")中提出。除非 另有說明，在本說明書中使用所述編號系統。
在一個實施方案中，Fc結構域源自IgA，且所述單鏈 兩個Coc2結構域和兩個Coc3結構域。
在一個實施方案中，Fc結構域源自IgM，且所述單鏈 兩個Ciu2結構域、兩個Cju3結構域及兩個Cp4結構域
在一個實施方案中，Fc結構域源自IgD，且所述單鏈 兩個C 5 2結構域和兩個C 5 3結構域。
在一個實施方案中，Fc結構域源自IgE，且所述單鏈 兩個Ce2結構域、兩個Cs 3結構域及兩個Cs4結構域
本發明的Fc結構域優選源自IgG，且所述單鏈Fc多肽包含兩個C y2和兩個Cy3結構域。本發明中使用的IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4 的Cy2結構域的優選序列分別如SEQ ID NO: 2、 15、 28和41所示， 且本發明中使用的IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4的Cy 3結構域的優選序 列分別如SEQ ID NO: 3、 16、 29和42所示。
因此，在一個實施方案中，本發明提供包含兩個Cv2結構域和兩 個c y 3結構域的單鏈多肽，其特征在于所述c y 2和c y 3結構域在所 迷鏈內形成功能性Fc結構域，即在所述多肽鏈內第一 C y 2結構域與 第二 c y 2結構域二聚化，且第一 c y 3結構域與第二 c y 3結構域二聚 化。
Fc多肽包含 Fc多肽包含 Fc多肽包含 Fc多肽包含用于制備本發明的Fc結構域的恒定區結構域也可包括本文上迷 天然存在的恒定域的變體。所述變體可包含與野生型恒定域相比一個 或多個氨基酸變異。在一個實例中，本發明的Fc結構域包含至少一個 恒定域，其序列與野生型恒定域不同。所述變體恒定域可比野生型恒 定域長或短。所述變體恒定域優選與野生型恒定域至少具有50%的同 一性或相似性。本文所用術語"同一性"是指相比對序列的任何特定 位置的序列間氨基酸殘基相同。本文所用術語"相似性"是指相比對 序列的任何特定位置的序列間氨基酸殘基相似。例如，亮氨酸可被異 亮氨酸或纈氨酸替代。其它可通常被另一氨基酸替代的氨基酸包括但 不限于
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香側鏈的氨基酸)； —賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有堿性側鏈的氨基酸)； 一天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性側鏈的氨基酸)； 一天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側鏈的氨基酸)；及 -半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側鏈的氨基酸)。 可容易計算出同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology, Lesk， A. M, ， ed. ， Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. ， ed. ， Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parti, Griffin, A.M., and Griffin, H, G. ， eds. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje， G. ， Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. ， eds. ， M Stockton Press, New York, 1991)。在一個實例中，所述變體恒定域與野生型 恒定域具有至少60%的同一性或相似性，在另一實例中，所述變體恒 定域具有至少70%的同一性或相似性.在另一實例中，所述變體恒定 域具有至少80%同一性或相似性。在另一實例中，所述變體恒定域具 有至少90%同一性或相似性。在另一實例中，所述變體恒定域具有至 少95%同一性或相似性。
10在一個實施方案中，所述變體恒定域提供與野生型Fc結構域相當 的Fc效應功能。在一個實施方案中，所述變體恒定域提供提高的效應 功能。在一個實施方案中，所述變體恒定域提供改良的效應功能。在 一個實施方案中，所述Fc結構域不提供效應功能，但延長半衰期。在 一個實施方案中，所述Fc結構域與FcR結合，但不與Clq結合。在一 個實例中，所述Fc結構域與Clq結合，但不與FcR結合。
本領域已知許多Fc變體(參見例如，Idusogie eta/. ， Journal of Immunology, 2000， 164, 4178-4184 and Shields e"/., Journal of Biological Chemistry, 2001， 276， 9， 6591-6604 ) 。 WO2005077981 提供了 Fc變體的綜合目錄(具體見第80段)，將所述文獻通過引用 并入本文。
IgGl的Fc變體實例包括N314Q (或N297Q) 、 T318A (T299A)、 A349S ( A330S)與P350A (P331A) 、 L247A (L234A)與L248A (L235A) 或P348A (P329A)(在括號中的數字是EU編號)。而在IgG4的Fc 結構域中可使用S241P (S228P)突變(Angal W a/., Molecular Immunology, 1993， 30 (1)， 105-108 )。可使用本領域已知的常規
方法制備和檢測任何合適的變體。
將本發明的單鏈Fc多肽的CH2、 CH3和CH4結構域連接于單個多 肽鏈內，其中所述CH4結構域有時存在，從而它們仍可在鏈內形成功 能性Fc結構域。因此，可使用任何令適的氨基酸連接子連接這些恒定 域，只要其可使功能性Fc結構域于單鏈多肽內形成。可用作本發明的 連接子的合適的氨基酸包括，但不限于，小的柔性的氛基酸例如Gly、 Ser、 Ala和Thr。在一個實施方案中，所述連接子包含甘氨酸殘基， 或由甘氨酸殘基構成。在一個實施方案中，所述連接子包含絲氨酸殘 基，或由絲氨酸殘基構成。在一個實施方案中，所述連接子包含丙氨 酸殘基，或由丙氨酸殘基構成。在一個實施方案中，所述連接子包含 蘇氨酸殘基，或由蘇氨酸殘基構成。在一個實施方案中，所述連接子 包含甘氨酸和絲氨酸殘基，或由甘氨酸和絲氨酸殘基構成。在一個實 施方案中，所述連接子包含甘氨酸、絲氨酸和丙氨酸殘基，或由甘氨酸、絲氨酸和丙氨酸殘基構成。在一個實施方案中，所述連接子包含 甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸殘基，或由甘氨酸、絲氨酸、丙氨 酸和蘇氨酸殘基構成。為避免引起爭議，需知包括所有甘氨酸和/或絲 氨酸和/或丙氨酸和/或蘇氨酸殘基置換。在一個實例中，所述連接子
包含30-80%甘氨酸殘基和20-70%絲氨酸殘基，或由30-80%甘氨酸殘 基和20-70%絲氨酸殘基構成。在一個實例中，所述連接子包含35-50% 甘氨酸殘基、30-40%絲氨酸殘基、5-15%蘇氨酸殘基和10-20%丙氨酸 殘基，或由35-50%甘氨酸殘基、30-40%絲氨酸殘基、5-15%蘇氨酸殘 基和10-20%丙氨酸殘基構成。在一個實例中，所述氨基酸殘基隨機分 布于連接子內。合適的連接子的特定實例包括甘氨酸-絲氨酸聚合物， 包含例如諸如GS、 GSGGS、 GGGGS和GGGS序列的重復。
在一個實施方案中，本發明的單鏈多肽的Fc結構域包含兩個CH2 結構域和兩個CH3結構域。
在一個實施方案中，本發明提供包含兩個CH2結構域和兩個CH3 結構域的單鏈Fc多肽，其中在從N-至C-末端的序列中，將第一CH2 結構域于其C-末端連接到第一 CH3結構域的N-末端，且將所述第一 CH3結構域于其C-末端通過連接子連接到第二 CH2結構域的N-末端， 將所述第二 CH2結構域于C-末端連接到第二 CH3結構域的N-末端(如

圖1所示)。
在一個實施方案中，所述第一CH2結構域于其C-末端直接連接， 即基因融合到第一CH3結構域的N-末端。
在一個實施方案中，所迷第二CH2結構域于其C-末端直接連接， 即基因融合到第二CH3結構域的N-末端。
基因融合于CH3結構域的合適的CH2結構域的實例如SEQ ID NO: 5、 18、 31和44所示。
在一個實施方案中，使用連接子連接所述第一CH2結構域的C-末 端與所述第一 CH3結構域的N-末端。
在一個實施方案中，使用連接子連接所述第二CH2結構域的C-末 端與所述第二CH3結構域的N-末端。如果使用連接子連接下列結構域，(i)所述笫一 CH2結構域的 C-末端與所述第一 CH3結構域的N-末端和/或(ii)所述第二 CH2結 構域的C-末端與所述第二CH3結構域的N-末端，所述連接子需足夠長， 以使可在所述鏈內形成功能性Fc結構域。所述連接子一般僅幾個氨基 酸長，長度優選少于10個氨基酸。如果將連接子用于上述(i )和(ii )， 所述兩個連接子可相同或不同。所述連接子優選大致等長。
用于連接所述第一 CH3結構域的C-末端與所述第二 CH2結構域的 N-末端的連接子需足夠長，以使可在所述鏈內形成功能性Fc結構域， 即，所述連接子需足夠長，以使多肽鏈內的第一CH2結構域與第二CH2 結構域二聚化，且第一CH3結構域與第二CH3結構域二聚化。在一個 實施方案中，所述連接子長度約為30-100個氨基酸，在另一實施方案 中，所述連接子長度約為40-100個氨基酸。在一個實施方案中，所述 連接子長度約為40-90個氨基酸。在一個實施方案中，所述連接子長 度約為40-80個氨基酸，優選長度為40-70個氨基酸。已于上文中對 在這些連接子中使用的合適的氨基酸進行了描述。在一個實例中，所 述連接子包含35-50%甘氨酸殘基、30-40°/。絲氨酸殘基、5-15%蘇氨酸 殘基和10-20%丙氨酸殘基，或由35-50%甘氨酸殘基、30-40%絲氨酸殘 基、5-15%蘇氨酸殘基和10-20%丙氨酸殘基構成。在一個實例中，所 述氨基酸殘基隨機分布于連接子內。合適的連接子的實例如SEQ ID NO: 62所示。在一個實施方案中，所述連接子可優選于其C-末端包含 一個或多個半胱氨酸殘基。在一個實施方案中，所述連接子可于其C-末端包含抗體或其變體的全長或部分鉸鏈區序列，所述序列包含一個 或多個半胱氨酸殘基。本發明的連接子中使用的合適的鉸鏈序列的實 例見US5， 677， 425、 W09915549、 W09825971和WO2005003171,將所述 文獻通過引用并入本文。合適的鉸鏈的其他實例如SEQ ID N0: 53-57 所示。因此在一個實例中，SEQ ID NO: 62的連接子于其C-末端還包 含SEQ ID NO: 53-57所示的任一序列。在此實施方案中，所述連接子 長度約為30-130個氨基酸。在一個實施方案中，所述連接子長度約為 50-100個氨基酸。在一個實施方案中，所述連接子長度約為50-80個氨基酸。
在另 一個實施方案中，本發明提供包含兩個CH2結構域和兩個CH3 結構域的單鏈Fc多肽，其中在從N-至C-末端序列中，將第一CH2結 構域于其C-末端通過連接子連接到第二CH2結構域的N-末端，且將所 述第二 CH2結構域于其C-末端連接到第一 CH3結構域的N-末端，且將 所述第一 CH3結構域于其C-末端通過連接子連接到第二 CH3結構域的 N-末端(如圖2所示)。
在一個實施方案中，將所述第二CH2結構域于其C-末端基因融合 到所述第一 CH3結構域的N-末端。
在一個實施方案中，將所述第二CH2結構域的C-末端通過連接子 連接到所述第一 CH3結構域的N-末端。
如果使用連接子連接所述第二 CH2結構域的C-末端與所述第一 CH3結構域的N-末端，所述連接子需足夠長，以使可在所述鏈內形成 功能性Fc結構域。所述連接子一般僅幾個氨基酸長，長度優選少于 IO個氛基酸。
用于連接所述第一 CH2結構域的C-末端與所述第二 CH2結構域的 N-末端的連接子和用于連接所述第一 CH3結構域的C-末端與所述第二 CH3結構域的N-末端的連接子需足夠長，以使可在所述鏈內形成功能 性Fc結構域。所述兩個連接子的組成和/或長度可相同或不同。在一 個實施方案中，所述連接子中的一個或兩個的長度為15-50個氨基酸。 在一個實施方案中，所述連接子中的一個或兩個的長度為15-40個氨 基酸。在一個實施方案中，所迷連接子中的一個或兩個的長度為20-40 個氨基酸。在另一個實施方案中，所述連接子中的一個或兩個的長度 為20-35個氨基酸。已于上文中對在這些連接子中使用的合適的氨基 酸進行了描述。在一個實例中，所述連接子中的一個或兩個包含 50-80%的甘氨酸殘基和10-30%的絲氨酸殘基，或由50-80%的甘氨酸殘 基和10-30%的絲氨酸殘基構成。在一個實例中，氨基酸殘基隨機分布 于連接子內。在一個實例中，所述連接子包含序列(GGGGS)n,其中 n=3~8。在一個實施方案中，所述第一CH2結構域的C-末端與所述第
14二CH2結構域的N-末端之間的所述連接子包含序列(GGGGS)n，其中n二5 (SEQ ID NO: 63)。在一個實施方案中，所述第一 CH3結構域的C-末端與所述第二 CH3結構域的N-末端之間的所述連接子包含序列 (GGGGS)n，其中n=5 ( SEQ ID NO: 63)。
在一個實施方案中，所述第一CH2結構域和所述第二CH2結構域 之間的所述連接子優選于其C-末端包含一個或多個半胱氨酸殘基。在 一個實施方案中，所述連接子包含如上所述的全長或部分抗體鉸鏈序 列或其變體。因此，在一個實施方案中，所述第一CH2結構域的C-末 端與所述第二CH2結構域的N-末端之間的所述連接子含有SEQ ID N0: 63所示序列，還于其C-末端包含序列SEQ ID NO: 53-57所示的任一 鉸鏈序列。在所述實施方案中，所述第一CH2結構域的C-末端與所述 第二CH2結構域的N-末端之間的所述連接子長度為25-90個氨基酸。 在一個實施方案中，所述連接子長度為25-80個氨基酸。在一個實施 方案中，所述連接子長度為25-70個氨基酸。在一個實施方案中，所 述連接子長度為25-60個氨基酸。在一個實施方案中，所述連接子長 度為25-50個氨基酸。在一個實施方案中，所述連接子長度為25-40 個氨基酸。
在一個實施方案中，本發明的單鏈Fc多肽的Fc結構域包含兩個 CH2結構域、兩個CH3結構域及一個或兩個(優選兩個)CH4結構域。
在一個實施方案中，本發明提供包含兩個CH2結構域、兩個CH3 結構域和兩個CH4結構域的單鏈Fc多肽，其中在從N-至C-末端的序 列中，將第一 CH2結構域于其C-末端連接到第一 CH3結構域的N-末端， 將所述第一 CH3結構域于其C-末端連接到第一 CH4結構域的N-末端， 且將所述第一 CH4結構域于其C-末端通過連接子連接到第二 CH2結構 域的N-末端，并將所述第二 CH2結構域于其C-末端連接到笫二 CH3 結構域的N-末端，并將所述第二 CH3結構域于其C-末端連接到第二 CH4結構域的N-末端(見例如圖3a )。
在一個實施方案中，將下列結構域中的一種或多種直接連接，即 基因融合，(i)所述第一 CH2結構域的C-末端與所述第一 CH3結構
15域的N-末端，(ii )所述第二 CH2結構域的C-末端與所述第二 CH3 結構域的N-末端，(iii)所述笫一 CH3結構域的C-末端與所述第一 CH4結構域的N-末端，(iv )所述第二 CH3結構域的C-末端與所述第 二CH4結構域的N-末端。
在一個實施方案中，將下列結構域中的一種或多種通過連接子連 接，(v)所述第一CH2結構域的C-末端與所述第一CH3結構域的N-末端，(vi)所述第二CH2結構域的C-末端與所述第二CH3結構域的 N-末端，(vii )所述第一 CH3結構域的C-末端與所述第一 CH4結構 域的N-末端，(viii)所述第二CH3結構域的C-末端與所述第二CH4 結構域的N-末端。
如果在(v、 vi、 vii或viii)中任一連接間存在連接子，所述連 接子需足夠長，以使可在所述鏈內形成功能性Fc結構域。所述連接子 一般僅幾個氨基酸長。如果有一個以上的連接子，所述連接子可相同 或不同。所述連接子優選大致等長。
用于連接所述第一 CH4結構域的C-末端與所述第二 CH2結構域的 N-末端的連接子需足夠長，以使可在所述鏈內形成功能性Fc結構域。 在一個實施方案中，所述連接子長度約為50-IOO個氨基酸，在另一實 施方案中，所述連接子長度約為60-100個氨基酸。在一個實施方案中， 所述連接子長度約為70-100個氨基酸，優選長度為80-100個氨基酸。 已于上文中對在這些連接子中使用的合適的氨基酸進行了描述。在一 個實施方案中，所述連接子可優選于其C-末端包含一個或多個半胱氨 酸殘基。在一個實施方案中，所述連接子包含如上所述的全長或部分 抗體鉸鏈序列或其變體。
在另一實施方案中，本發明提供包含兩個CH2結構域、兩個CH3 結構域和兩個CH4結構域的單鏈Fc多肽，其中在從N-至C-末端的序 列中，將第一 CH2結構域于其C-末端通過連接子連接到第二 CH2結構 域的N-末端，且將所述第二 CH2結構域于其C-末端連接到第一 CH3 結構域的N-末端，且將所述第一 CH3結構域于其C-末端連接到第一 CH4結構域的N-末端，將所述第一 CH4結構域于其C-末端通過連接子連接到笫二 CH3結構域的N-末端，將所述第二 CH3結構域于其C-末端 連接到第二CH4結構域的N-末端(見例如圖3b)。
在一個實施方案中，將下列結構域中的一種或多種直接連接，即 基因融合，(i)所述第二CH2結構域的C-末端與所述第一CH3結構 域的N-末端，(ii)所述第一 CH3結構域的C-末端與第一 CH4結構域 的N-末端，(iii )所述第二 CH3結構域的C-末端與所述第二 CH4結 構域的N-末端。
在一個實施方案中，將下列結構域中的一種或多種通過連接子連 接，(i )所述第二 CH2結構域的C-末端與所述第一 CH3結構域的N-末端，(ii)所述第一CH3結構域的C-末端與所述第一CH4結構域的 N-末端，(iii )所述第二 CH3結構域的C-末端與所述第二 CH4結構 域的N-末端。
如果下列一種或多種結構域間存在連接子，(i )所述第二 CH2 結構域的C-末端與所述第一 CH3結構域的N-末端，(ii )所述第一 CH3結構域的C-末端與所述第一 CH4結構域的N-末端，(iii )所述 第二 CH3結構域的C-末端與所述第二 CH4結構域的N-末端，所述連接 子需足夠長，以使可在所述鏈內形成功能性Fc結構域。所述連接子一 般僅幾個氨基酸長。如果有一個以上的連接子，這些連接子可相同或 不同。所述連接子優選大致等長。
所述第一 CH2結構域的C-末端與所述第二 CH2結構域的N-末端之 間的所述連接子和所述第一 CH4結構域的C-末端與所述第二 CH3結構 域的N-末端之間的所述連接子需足夠長，以使可在所述鏈內形成功能 性Fc結構域。已于上文中對適用于這些連接子的氨基酸進行了描述。
所述第一 CH2結構域的C-末端與所述第二 CH2結構域的N-末端之 間的所述連接子通常長度為15-40個氨基酸。在另一實施方案中，所 述連接子長度為20-35個氨基酸。在一個實施方案中，所述第一CH2 結構域的C-末端與所述第二CH2結構域的N-末端之間的所述連接子包 含序列(GGGGS)n，其中n-5 ( SEQ ID NO: 63)。
在一個實施方案中，所述第一CH2結構域與所述第二CH2結構域之間的連接子優選于其c-末端包含一個或多個半胱氨酸殘基。在一個
實施方案中，所述連接子包含上述全長或部分抗體鉸鏈序列或其變體，
其可包含一個或多個半胱氨酸殘基。合適的鉸鏈序列包括SEQ ID NO: 53-57所示序列。
所述第一 CH4結構域的C-末端與所述第二 CH3結構域的N-末端之 間的所述連接子通常長度約為30-100個氨基酸，在另一實施方案中， 所述連接子長度約為40-100個氨基酸。在一個實施方案中，所述連接 子長度約為40-80個氨基酸，長度優選為40-70個氨基酸。合適的連 接子的實例如SEQ ID NO: 62所示。
在另一實施方案中，本發明提供包含兩個CH2結構域、兩個CH3 結構域和兩個CH4結構域的單鏈Fc多肽，其中在從N-至C-末端的序 列中，將第一 CH2結構域于其C-末端連接到第一 CH3結構域的N-末端， 且將所述第一 CH3結構域于其C-末端通過連接子連接到第二 CH2結構 域的N-末端，且將所述第二 CH2結構域于其C-末端連接到第二 CH3 結構域的N-末端，將所述第二 CH3結構域于其C-末端連接到第一 CH4 結構域的N-末端，將所述第一 CH4結構域于其C-末端通過連接子連接 到第二CIH結構域的N-末端(見例如圖lc)。
在一個實施方案中，將下列結構域中的一種或多種直接連接，即 基因融合，(i )所述第一 CH2結構域的C-末端與所迷第一 CH3結構 域的N-末端，(ii )所述第二 CH2結構域的C-末端與所述第二 CH3 結構域的N-末端，(iii)所述第二CH3結構域的C-末端與所述第一 CH4結構域的N-末端。
在一個實施方案中，將下列結構域中的一種或多種通過連接子連 接，(i)所述第一 CH2結構域的C-末端與所述第一 CH3結構域的N-末端，(ii)所述第二 CH2結構域的C-末端與所述第二 CH3結構域的 N-末端，(iii )所述第二 CH3結構域的C-末端與所述第一 CH4結構 域的N-末端。
如果下列一種或多種結構域間存在連接子，(i )所述第一 CH2 結構域的C-末端與所述第一 CH3結構域的N-末端，(ii )所述第二
18CH2結構域的C-末端與所述第二 CH3結構域的N-末端，(iii)所述 第二 CH3結構域的C-末端與所述第一 CH4結構域的N-末端，所述連接 子需足夠長，以使可在所述鏈內形成功能性Fc結構域。所述連接子一 般僅幾個氨基酸長。如果有一個以上的連接子，這些連接子可相同或 不同。所述連接子優選大致等長。
所述第一 CH3結構域的C-末端與所述第二 CH2結構域的N-末端之 間的所述連接子和所述第一CH4結構域的C-末端與所述第二CH4結構 域的N-末端之間的所述連接子需足夠長，以使可在所述鏈內形成功能 性Fc結構域。
所述第一 CH4結構域的C-末端與所述第二 CH4結構域的N-末端之 間的所述連接子通常長度為15-40個氨基酸。在另一實施方案中，所 述連接子長度為20-35個氨基酸。在一個實施方案中，所述第一CH4 結構域的C-末端與所述第二 CH4結構域的N-末端之間的所述連接子包 含序列(GGGGS)n,其中n-5 ( SEQ ID NO: 63)。
在一個實施方案中，所述第一CH3結構域的C-末端與所述第二 CH2 結構域的N-末端之間的所述連接子通常長度約為30-100個氨基酸， 在另一實施方案中，所述連接子長度約為40-100個氨基酸。在一個實 施方案中，所述連接子長度約為40-80個氨基酸，優選長度為40-70 個氨基酸。合適的連接子的實例如SEQ ID NO: 62所示。
在一個實施方案中，所述第一CH3結構域與所述第二CH2結構域 之間的連接子優選于其C-末端包含一個或多個半胱氨酸殘基。在一個 實施方案中，所述連接子包含上述全長或部分抗體鉸鏈序列或其變體， 其可包含一個或多個半胱氨酸殘基。合適的鉸鏈序列包括SEQ ID NO: 53-57。
在一個實施方案中，本發明的單鏈Fc多肽還包舍基因融合于所述 第一 CH2結構域的N-末端的氨基酸連接子。所述連接子可包含任何合 適的氨基酸，且可具有任何合適的長度。在一個實施方案中，所述連 接子包含一個或多個半胱氨酸殘基。在一個實施方案中，基因融合于 所述第一CH2結構域的N-末端的所述連接子包含如上所述全長或部分抗體鉸鏈序列或其變體。在一個實施方案中，所述連接子包含任一 SEQ ID NO: 53-57所示序列。在一個實施方案中，將存在于所述連接子中 的一個或多個半胱氨酸殘基通過二硫鍵連接到存在于下列連接子中的 一個或多個半胱氨酸殘基上(i)連接所述第一 CH3結構域的C-末 端與所述第二CH2結構域的N-末端的連接子(見例如圖la) ， (ii) 連接所述第一CH2結構域的C-末端與所述第二CH2結構域的N-末端的 連接子(見例如圖2a)，或(iii)連接所述第一CH4結構域的C-末 端與所述第二 CH2結構域的N-末端的連接子。
在另一實施方案中，融合于N-末端的所述連接子可包含抗體或其 變體的全長或部分鉸鏈區，其中一個或多個半胱氨酸被另 一氨基酸(優 選絲氨酸)替代。此類型的合適的連接子的實例如SEQ ID NO: 58-61 所示。
本發明的單鏈Fc多肽的實例分別如SEQ ID NO: 8-13、 21-26、 34-39和47-52的IgGl、 2、 3和4所示。IgGl序列的實例還見于圖6。 本發明也涵蓋上文所述序列的變體。在一個實例中，本發明提供包含 與SEQ ID NO: 8-13、 21-26、 34-39和47-52所示任一序列具有至少 7(^的同一性或相似性的序列的單鏈Fc多肽所。在另一實例中，本發 明的單鏈Fc多肽包含與SEQ ID NO: 8-13、 21-26、 34-39和47-52
所示任一序列具有至少8oy。的同一性或相似性的序列。在另一實例中，
本發明的單鏈Fc多肽包含與SEQ ID NO: 8-13、 21-26、 34-39和47-52 所示任一序列具有至少90%的同一性或相似性的序列。在另一實例中， 本發明的單鏈Fc多肽包含與SEQ ID NO: 8-13、 21-26、 34-39和47-52 所示任一序列具有至少95%或98°/ 的同一性或相似性的序列。
在一個實施方案中，本發明的單鏈Fc多肽還包含任選通過鉸鏈融 合至所述第一 CH2結構域的N-末端的CHI結構域。合適的CHI結構域 的實例如SEQ ID NO: 1、 14、 27和40所示。
本發明的單鏈Fc多肽可具有多種用途，包括治療、診斷和研究用 途。本發明的單鏈Fc多肽還優選包含一種或多種其他分子，可將其融 合于或連接到多肽的N和/或C-末端和/或其他位置。這類分子包括，但不限于，核酸、小分子、碳水化合物、蛋白質和肽類，包括例如受
體蛋白、抗體和抗體片段。可任選將所述單鏈Fc多肽通過連接子(氨基酸或化學物質)，根據本領域已知的任何合適的方法，包括例如，化學綴合、化學交聯或基因融合，連接到另一分子。在一個實施方案中，所述單鏈Fc多肽于其N-末端包含含有半胱氨酸的連接子(例如抗體鉸鏈)，且將這些游離半胱氨酸之一用作另一分子(優選后述生物活性分子)的結合位點。
在一個實施方案中，將本發明的單鏈Fc多肽用作Fc標簽(例如用于輔助蛋白質純化和/或蛋白質檢測)。因此，在一個實施方案中，所述單鏈Fc多肽還于其N-末端包含全長或部分另一蛋白質。不同于目前可獲得的Fc融合物，這類Fc融合物益不二聚化，從而確保所述融合蛋白保持單體。在某些應用中，希望例如在純化之后可除去Fc結構域，可將所迷單鏈Fc多肽通過可切割的連接子連接到另一蛋白
質。 、
在一個實施方案中，將本發明的單鏈Fc多肽于其N和/或C-末端
連接到生物活性分子。所述生物活性分子可為任何蛋白質或其他合適的分子，包括核酸、小分子、碳水化合物、受體蛋白或免疫球蛋白。一些生物活性分子的實例包括酶類、抗體片段、結構域抗體、單鏈抗體、適體、微體、基于蛋白質支架的結合劑(見例如NygrenandUhlen，1997， Current Opinion in Structural Biology, 7， 463-469)、versabodies、 avimers、 adnectins、 anticalins、 phylomers、適體、環肽、肽類、抗病毒劑、止血劑及細胞因子和生長因子(例如EPO、RANTES)，白細胞介素(例如IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、IL-8、 IL-12、 IL-13、 IL-16或IL-17)，干擾素(例如干擾素oc、干擾素P或干擾素Y)，腫瘤壞死因子-oc、腫瘤壞死因子-p，集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)。
在一個實施方案中，所述生物活性分子使本發明的單鏈Fc多肽與期望的靶(例如靶蛋白)相接觸。在一個實施方案中，所述生物活性分子結合于期望的靶蛋白。在一個實例中，所述靶蛋白是細胞結合性
21蛋白，例如在細胞(例如細菌細胞、酵母細胞、T-細胞、內皮細胞或腫瘤細胞)上的細胞表面蛋白，或其可為可溶性蛋白質。把蛋白也可為任何醫學相關蛋白質，例如在疾病或感染期間上調的那些蛋白質，例如受體和/或其相應的配體。細胞表面蛋白的具體實例包括粘附分子，例如整聯蛋白(例如pl整聯蛋白)，例如VLA-4、 E-選擇蛋白、P選擇蛋白或L-選擇蛋白、CD2、 CD3、 CD4、 CD5、 CD7、 CD8、 CDlla、CDllb、 CD18、 CD19、 CD20、 CD23、 CD25、 CD33、 CD38、 CD40、 CD45、CDW52、 CD69、 CD134 (0X40) 、 ICOS、 BCMP7、 CD137、 CD27L、 CD28、CD40L、 CTLA-4、 CD22、 CDCP1、 DPCR1、 DPCR1、 dudulin2、 FLJ20584、FLJ40787、 HEK2、 KIAA0634、 KIAA0659、 KIAA1246、 KIAA1455、 LTBP2、LTK、 MAL2、 MRP2、類連接素2 ( nectin-like2 ) 、 NKCC1、 PTK7、 RAIG1、TCAM1、 SC6、 BCMPIOI、 BCMP84、 BCMPll、 DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂球蛋白(HMFG1和2) 、 I類MHC和II類MHC抗原和VEGF,及其受體(如果合適)。
在一個實施方案中，所述靶蛋白是可溶性蛋白。可溶性蛋白包括白細胞介素(例如IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-8、 IL-12、IL-13、 IL-16或IL-17)，病毒蛋白(例如呼吸道合胞病毒或巨細胞病毒蛋白)、免疫球蛋白(例如IgE)、千擾素(例如千擾素ot、干擾素P或干擾素Y)，腫瘤壞死因子-cc、腫瘤壞死因子-P，集落刺激因子(例如G-CSF或GM-CSF)及血小板衍生生長因子(例如PDGF-oc ，和PDGF- P )及其受體(如果合適)。
在一個實施方案中，可使用本發明的單鏈Fc多肽功能性改變有生物活性分子結合的特定蛋白質的活性。例如，單鏈Fc多肽可中和、拮抗或激動蛋白質的活性。在一個實施方案中，所述單鏈Fc多肽通過生物活性分子結合到細胞而例如通過補體介導的細胞毒性殺死細胞。
在一個實施方案中，所述生物活性分子是單價結合結構域，具體而言，是單價蛋白(例如受體或其片段，或免疫球蛋白或其片段)。
在一個實施方案中，所述生物活性分子是可在細胞表面或在細胞內天然表達的受體。合適的受體的實例包括，但不限于，病毒受體、細胞因子受體、生長因子受體、激素受體和細菌受體。本文所用術語"受體"也可包括這類受體的合適的片段，其實例包括受體的胞外域。
在一個實例中，所述受體是人gpl30受體或其細胞因子結合片段，例如結構域l、 2和/或3。在一個實例中，所述生物活性分子包含gp130受體的結構域1或其片段。在一個實例中，所述生物活性分子包含SEQID NO: 91的氨基酸1-125。在一個實例中，所述生物活性分子包含gpl30受體的結構域2和結構域3。在一個實例中，所述生物活性分子包含gpl30受體的結構域l、結構域2和結構域3。本文所用術語"受體"也可包括天然存在的受體的經修飾形式，包括例如氨基酸替代、添加或刪除。在一個實例中，可產生單鏈形式的包含兩個鏈的受體，并連接到本發明的單鏈Fc多肽上。在一個實例中，所述受體可包含T細胞受體(TCR )的a和P鏈的全部或部分胞外域。優選將這些a和p胞外域通過合適的連接子連接到單鏈中，再將所述連接子連接到本發明的單鏈Fc多肽上。
所述單價結合蛋白優選是抗體片段。合適的抗體片段的實例包括但不限于，scFv、 Fab、 Fab'、 VHH、 Fv、 VK、 VH、 V入、以上任何的表位結合片段。合適的抗體片段的實例包括Adair and Lawson， 2005.Therapeutic antibodies.Z rug Z es/^WeF/e^ -，,廁-"7、 WO2005003169、 WO2005O03170和WO2005003171中所述的那些。
在本發明中使用的抗體片段可源自免疫球蛋白分子的任何類型(例如IgG、 IgE、 IgM、 IgD或IgA)或亞類，并可獲自任何物種，包
括例如小鼠、大鼠、鯊魚、兔、豬、倉鼠、駱駝、美洲駝羊、山羊或人。
在一個實施方案中，所述抗體片段是單克隆的、人化的和/或嵌合的抗體片段。
人化抗體是具有來自非人物種的一種或多種互補決定區(CDR )和來自人免疫球蛋白分子的框架區的抗體分子，所述框架區任選包含來自非人物種的一種或多種供體殘基(參見例如US 5, 585, 089 )。使用遺傳工程方法加工嵌合抗體，使其輕鏈和重鏈基因由屬于不同物種的免疫球蛋白基因節段構成。所述重鏈和輕鏈恒定區優選是人的，而可變區優選源自另一物種。
可根據本領域已知的任何方法制備單克隆抗體，例如雜交瘤技術
(Kohler & Milstein， W"ure， 1975， 256， 495-497 )、三源雜交瘤技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor W W., //z/麵o/c^ 7b齡，1983， 4， 72 )和EBV-雜交瘤技術(Cole ef a/. ， "MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy", pp. 77-96， Alan R. Liss， Inc.,1985)。
也可通過任何其他合適的方法獲得抗體，例如在Babcook， J."a人'戶艦艇厶蹈，1996， 93 (15)， 7843-7848， W092/02551、 W02004/051268和WO2004/106377中所述。
可使用任何合適的酶切和/或消化技術(例如通過用胃蛋白酶處理)從任何全抗體(尤其是全單克隆抗體)獲得在本發明中使用的抗體片段。或可通過使用重組DNA技術制備抗體片段，所述技術包括編碼抗體可變區和/或恒定區的DNA的操作和再表達。可使用標準分子生物技術根據需要修飾、添加或刪除氨基酸或結構域。本文所用術語"可變"和"恒定"區還涵蓋對可變區或恒定區進行的任何修飾。
本領域熟知產生和制備抗體和抗體片段的方法(參見例如，Boss"a/., US 4, 816, 397; Cabilly"a/" US 6,331,415; Shrader "W0 92/02551; Ward e"/,' 1989， Nature, 341， 544; Orlandie"/., 1989, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 86， 3833; Riechmami "s/. ， 1988, Nature, 322， 323; Bird "s/.， 1988， Science, 242，423; Queen W a/., US 5, 585, 089; Adair， WO91/09967; Mountainand Adair, 1992， Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10， 1-142; Ve簡e"/., 1998， Journal of Immunological Methods, 216, 165-181)。
在本發明中使用的抗體片段可具有包含一個或多個半胱氨酸的天然或經修飾的鉸鏈區。天然鉸鏈區是通常與抗體分子的CH1結構域結合的鉸鏈區。經修飾的鉸鏈區是長度和/或構成與天然鉸鏈區不同的任
24何鉸鏈。這類鉸鏈可包括來自其他物種的鉸鏈區，例如人、小鼠、大 鼠、兔、鯊魚、豬、倉鼠、駱駝、美洲駝羊或山羊的鉸鏈區。其他經
修飾的鉸鏈區可包含源自不同類或亞類抗體的來自Ch1結構域的完整 的鉸鏈區。因此，可將例如Y 1類的CJ結構域連接到Y 4類的鉸鏈區。 所述經修飾的鉸鏈區還可包含部分天然鉸鏈或重復單元，其中每個重 復子的單元源自天然鉸鏈區。另外，還可通過將一個或多個半胱氨酸 或其他殘基轉換為中性殘基(例如絲氨酸或丙氨酸)，或通過將適當 位置的殘基轉換成為半胱氨酸殘基來修飾天然的鉸鏈區。通過這類方 法，可增加或減少鉸鏈區中的半胱氨酸殘基數。可完全合成其他經修 飾的鉸鏈區，且可設計為具有所需特性，例如長度、半胱氨酸組成和 柔性。
許多經修飾的鉸鏈區在例如US5， 677， 425、W09915549、W09825971 和WO2005003171中已有描述，將這些文獻通過引用并入本文。在一個 實例中，在本發明中使用的蛋白質是具有天然或經修飾的鉸鏈區的 Fab'片段。
在一個實例中，可在本發明的抗體片段中設計一個或多個半胱氨 酸，例如以產生暴露于表面的半胱氨酸(US 5，219， 996 )。因此，通 過使用合適的基因工程技術，可改變抗體片段中的半胱氨酸數，以提 供特異性位點(例如用于結合效應分子)數。
在一個實施方案中，本發明的單鏈-Fc多肽還包含抗體片段。
在一個實施方案中，所述抗體片段是單鏈-Fv多肽。在一個實施 方案中，本發明的單鏈-Fc多肽還包括單鏈Fv多肽。在一個實施方案 中，將sc-Fv的VH結構域的C-末端任選通過上述連接子之一基因融 合到所述第一CH2結構域的N-末端。在一個實施方案中，將sc-Fv的 VL結構域的C-末端任選通過上述連接子之一基因融合到所述第一 CH2 結構域的N-末端。
在一個實施方案中，所述生物活性分子是Fab或Fab'(參見例如 圖1)。在一個實施方案中，本發明的單鏈-Fc多肽還包含抗體Fab 或Fab'片段。在一個實施方案中，將Fab或Fab'的VH-CH1的C-末端基因融合到本發明的單鏈Fc多肽的N-末端。在此實施方案中，將Fab 或Fab'的VH-CL鏈通過二硫鍵(優選天然的鏈間二硫鍵)連接到VH-CH1 鏈。在一個實施方案中，將所述Fab或Fab'的VL-CL鏈的C-末端基因 融合到本發明的單鏈Fc多肽的N-末端。在此實施方案中，將Fab或 Fab'的VH-CH1鏈通過二硫鍵(優選天然的鏈間二硫鍵)連接到VL-CL 鏈。
本發明的單鏈Fc多肽可有一種或多種效應分子與之結合。可通過 任何合適的方法(例如通過化學綴合或基因融合)結合效應分子。
本文所用術語"效應分子"包括例如，抗腫瘤藥劑、藥物、毒素 類(例如細菌或植物來源的酶活性毒素及其片段，例如荒麻毒素及其 片段)、生物活性蛋白(例如酶)、其他抗體或抗體片段、合成的或 天然存在的聚合體、核酸及其片段(例如DM、 RNA及其片段)、放射 性核素(尤其是放射性碘化物、放射性同位素)、金屬螯合物、納米 粒子和報告基因(例如熒光化合物或可通過NMR或ESR光鐠檢測的化 合物)。效應分子可包括單個效應分子，或兩個或更多這類分子連接 形成的單體，可根據本發明的方法將所述分子與蛋白質結合。
具體的抗腫瘤劑包括細胞毒性和細胞抑制劑，例如烷化劑，例如 氮芥(例如苯丁酸氮芥、美法侖、氮芥、環磷酰胺或尿嘧啶氮芥)及 其衍生物、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酸胺、白消安或順鉑； 抗代謝藥，例如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、巰噪呤、 硫鳥噪呤、氟乙酸或氟代檸檬酸；抗生素，例如博來霉素(例如博來 霉素硫酸鹽)、多柔比星、柔紅審素、絲裂霉素(例如絲裂霉素C)、 放線菌素(例如更生霉素)、普卡霉素、加利車霉素及其衍生物、或 埃斯波霉素及其衍生物；有絲分裂抑制劑，例如依托泊甙、長春新堿 或長春堿及其衍生物；生物堿類，例如橢圓玫瑰樹堿；多元醇，例如 紫杉薛酯-I或紫杉薛酯-II;激素類，例如雄激素(例如，屈他雄酮 或睪內酯)、孕激素(例如，醋酸甲地孕酮或醋酸曱羥孕酮)、雌激 素(例如，二甲基己烯雌酚二磷酸酯、聚磷酸雌二醇或磷酸雌二醇氮 芥)或抗雌激素類(例如，他莫昔芬)；蒽醌類，例如米托蒽醌；尿素類，例如羥基脲；肼類，例如丙卡巴肼；或咪唑類，例如達卡巴喚。 金屬螯合物包括配位數2-8的二價或三價正電荷金屬的螯合物。 這類金屬的具體實例包括锝(Tc)、錸(Re)、鈷(Co)、銅(Cu)、 金(Au)、銀(Ag)、鉛(Pb)、鉍(Bi)、銦(In)、鎵(Ga)、 釔(Y )、鋱(Tb)、釓(Gd)和鈧(Sc )。通常，所述金屬優選是放 射性核素。具體的放射性核素包括"Tc、 186Re、 188Re、 58Co、 6°Co、 67Cu、 195Au、 199Au、 11DAg、 2°3Pb、 2°6Bi、 2°7Bi、 mIn、 "Ga、 68Ga、 88Y、 9°Y、 16°Tb、 "3Gd和"Sc。
螯合金屬可為例如被任何合適的多配位(polyadentate)螯合劑 (例如非環或環狀聚胺、聚醚(例如，冠醚及其衍生物)、聚酰胺、 p卜啉及碳環衍生物)螯合的上述類型的金屬之一。
通常，螯合劑的類型取決于所使用的金屬。然而，本發明的綴合 物中的螯合劑的一個特別有用的基團是非環和環狀聚胺(尤其是聚氛 基羧酸，例如二乙烯三胺五乙酸及其衍生物)和大環胺(例如環三氮 雜和四氮雜衍生物(例如國際專利說明書No. WO 92/22583中所述)) 及聚酰胺類(尤其是脫鐵氨及其衍生物)。
其他效應分子包括其他的蛋白質、肽和酶。待選酶包括，但不限 于，蛋白水解酶、水解酶、裂合酶、異構酶、轉移酶。待選蛋白、多 肽和肽包括，但不限于，免疫球蛋白、白蛋白、毒素(例如相思豆毒 蛋白、蓖麻蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素)、蛋白質(例如胰 島素)、腫瘤壞死因子、oc-干擾素、P-千擾素、神經生長因子、血 小板衍生生長因子或組織纖溶酶原激活劑、血栓形成劑或抗-血管生成 劑(例如血管生成抑制因子或內皮他汀)，或生物反應調節劑(例如 淋巴因子)、白介素-l(IL-I)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、 粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子 (G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子。
其他效應分子可包括用于例如診斷的可檢測物質。可檢測物質的 實例包括各種酶、輔基、熒光材料、發光材料、生物發光材料、放射 性核素、正電子發射金屬(用于正電子成像術)、和非放射性順磁金
27屬離子。有關可綴合于用于診斷的抗體的金屬離子見美國專利No. 4, 741,900。合適的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、e-半乳糖 苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基包括鏈霉抗生物素、抗生物素蛋白 和生物素；合適的熒光材料包括傘形酮、熒光素、若丹明紅、若丹明 綠、B—藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、別藻藍蛋白、德克薩斯紅、太平洋藍 (Pacific blue) 、 Marina blue、俄勒岡綠和Alexa Fluor系列350、 405、 430、 488、 500、 514、 532、 546、 555、 568、 594、 610、 633、 647、 660、 680、 700和750;合適的發光材料包括魯米諾；合適的生 物發光材料包括螢光素酶、螢光素和水母熒光素；合適的放射性核素 包括1251、 1311、 min和"Tc。
用作效應分子的合成的或天然存在的聚合物包括，例如任選取代 的直鏈或支鏈的聚烯烴、聚亞烯烴或聚氧烯聚合物，或支鏈或非支鏈 多糖(例如同質或雜多糖，例如乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖、淀粉或糖 原。可能存在于上述合成的聚合物中的具體可選擇的取代基包括一個 或多個幾基、甲基或甲氧基。合成聚合物的具體實例包括任選取代的 直鏈或支鏈的聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生 物，尤其是任選取代的聚(乙二醇)，例如曱氧基聚(乙二醇)或其 衍生物。
本文所用"衍生物"意在包括反應性衍生物，例如巰基-選擇性反 應基團，例如ot-鹵代羧酸或酯(例如碘乙酰胺)、二酰亞胺(例如順 丁烯二酰亞胺、乙烯基砜或順丁烯二酰亞胺二硫化物等)。可將反應 基團直接或通過連接子部分連接到聚合物。這類基團的殘基在某些情 況下形成作為蛋白質和聚合物之間的連接基團的部分產物。
可將一種或多種其他的結構域或生物活性分子基因融合或綴合到 單鏈多肽的C-末端。
在一個實施方案中，所述單鏈Fc多肽還包含融合于所述單鏈Fc 多肽的C-末端的跨膜結構域。所述跨膜結構域使所述單鏈Fc多肽可 在細胞表面表達。因此，可根據待選細胞類型使用適當的跨膜結構域。 已描述了許多不同的跨膜結構域，參見例如WO97/23613、WO99/00494、
28W099/57268、 WO00/63374和WO00/63373。合適的跨膜結構域的其他 實例包括可使具有其的免疫球蛋白在B細胞表面表達的天然跨膜結構 域，參見例如SEQIDNO: 65、 68、 71、 74、 77、 80、 83和86所示序 列。在一個實施方案中，將所述跨膜結構域通過連接子連接到所述單 鏈Fc多肽的C-末端。在一個實施方案中，所述連接子是天然連接子， 具有所述連接子的免疫球蛋白在B細胞表面表達，參見例如SEQ ID NO: 64、 67、 70、 73、 76、 79、 82和85所示序列。
在一個實施方案中，本發明提供還包含跨膜結構域和一個或多個 信號轉導結構域的單鏈Fc多肽。在一個實施方案中，本發明提供還包 含跨膜結構域的單鏈Fc多肽，將所述跨膜結構域任選通過連接子融合 到所述多肽的C-末端，將所述結構域于其C-末端再融合到一個或多個 信號轉導結構域。合適的信號轉導結構域是本領域眾所周知的，可選 擇適合的信號轉導結構域和跨膜結構域，以在表達單鏈Fc的細胞中得 到期望的表達和/或信號轉導。
在一個實例中，所述胞內結構域是天然的胞內結構域，具有其的 免疫球蛋白在B細胞表面表達，參見例如SEQ ID NO: 66、 69、 72、 75、 78、 81、 84和87所示序列。
合適的信號轉導結構域的實例在W097/23613 、 W099/00494 、 麗9/57268、 WO00/63372、 WO00/63374、 WO00/63373、 WO01/32709、 WO01/32866、 WO01/32867、 WO02/33101和WO2004/039840中已有描述。
在一個實施方案中，如果單鏈Fc多肽還包含融合于其N-末端的 如上所述的生物分子，則可將所述單鏈Fc多肽用作嵌合受體蛋白。這 類單鏈Fc多肽因不在細胞表面二聚化，所以具有可避免在無配體結合 的情況下發生不恰當的信號轉導的優點。
本發明還提供編碼本發明的任一單鏈Fc多肽的分離的DNA序列。 本發明的DNA序列可包含合成的DNA (例如通過化學加工產生的)、 cDNA、基因組DM或其任意組合。
可通過本領域技術人員熟知的方法獲得編碼本發明的單鏈Fc多 肽的DNA序列。例如，可根據需要從確定的DNA序列或基于相應的氨基酸序列合成編碼部分或全長抗體Fc結構域的DNA序列。本領域技術 人員容易獲得編碼抗體Fc恒定域的DNA，且容易根據其已知的氨基酸 序列合成所述DNA。
可使用分子生物標準技術制備編碼本發明的單鏈Fc多肽的DNA 序列。可通過完全或部分使用寡核苷酸合成技術合成所需DNA序列。 可適當使用定向誘變和聚合酶鏈式反應(PCR)技術。
本發明還涉及包含本發明的一種或多種DNA序列的栽體的克隆或 表達。因此，本發明提供包含編碼本發明的單鏈Fc多肽的一種或多種 DNA序列的克隆或表達載體。在一個實施方案中，所述克隆或表達載 體包含單個的DNA序列，編碼整個單鏈Fc多肽和任選的全部或部分生 物活性分子，例如scFv或Vhh。在另一個實施方案中，所述克隆或表 達載體包含兩個DNA序列，例如編碼所述單鏈Fc多肽和生物活性分子 的一條鏈(例如VH-CH1)的第一 DNA序列和編碼生物活性分子結構域 的第二鏈(例如VL-CL)的第二 DNA序列。本發明的載體優選包含合 適的前導序列，例如抗體前導序列。
本領域技術人員熟知構建載體的通用方法、轉染方法和培養方法。 在這方面，可參考"Current Protocols in Molecular Biology", 1999， F. M. A,bel (ed)， Wiley Interscience， New York和由冷泉港出 版社出版的Maniatis Manual。
本發明還提供包含一種或多種克隆或表達載體的宿主細胞，所述 栽體包含編碼本發明的單鏈Fc多肽的一種或多種DNA序列。可使用任 何合適的宿主細胞/載體系統來表達編碼本發明的單鏈Fc多肽的DNA 序列。可使用細菌(例如大腸桿菌)和其他微生物系統，也可使用真 核生物(例如哺乳動物)宿主細胞表達系統。合適的哺乳動物宿主細 胞包括NS0、 CH0、骨髄瘤或雜交瘤細胞。
本發明還提供制備本發明的單鏈Fc多肽的方法，包括在適當的條 件下培養含有本發明的載體的宿主細胞，并分離單鏈Fc多肽，其中所 述適當的培養條件指適于編碼本發明的單鏈Fc多肽的DNA表達蛋白質 的條件。
30單鏈Fc多肽可僅包含單獨的鏈，其中所述單獨的鏈單獨表達，或 作為基因融合于生物活性分子，僅需使用單獨的多肽編碼序列轉染宿 主細胞，例如scFvscFc。為了制備包含含有兩個或多個鏈的生物活性 分子的單鏈Fc多肽，可用兩個或多個栽體轉染所述細胞系，其中第一 載體編碼融合于生物活性分子的第一鏈的單鏈Fc多肽(例如VH-CHl )， 第二栽體編碼融合于生物活性分子的第二鏈的單鏈Fc多肽(例如 VL-CL)。也可使用單個載體，所述栽體包括編碼所述生物活性分子的 兩條鏈的序列，將其中一條鏈融合于單鏈Fc多肽。
一旦產生本發明的單鏈Fc多肽，可根據需要使用本領域公知的任 何合適的方法對其進行純化，所述方法包括，例如層析技術，例如離 子交換、尺寸排阻、蛋白A或疏水相互作用層析。
可通過本領域公知的常規方法(例如尺寸排阻層析和非還原性 SDS-PAGE)確定單鏈Fc多肽的大小。可使用這類技術確定scFc未二 聚化。如果檢測到二聚物，則可使用如上所述的常規層析技術將單體 的單鏈Fc多肽從二聚物中純化出來。
可根據所需效應功能，使用本領域公知的任何合適的方法(包括 實施例中所述方法)確定本發明的單鏈Fc多肽的功能。合適的測定方 法包括Fc受體結合測定、補體結合性測定、共刺激測定、細胞殺傷測 定、細胞毒性測定和細胞抑制測定。此外，可使用本領域公知的合適
的藥代動力學方法測量半衰期。
而且，如果生物活性分子結合于表面蛋白，并將單鏈Fc多肽靶向 所述表面表達的蛋白質，也可使用其他的功能性測定，例如細胞殺傷 測定(例如，補體介導的細胞毒性測定)。因此，本領域技術人員可 容易進行合適的功能性測定以確定是否獲得所需功能。
可將本發明的單鏈Fc多肽用于疾病的治療和/或預防。因此，本 發明還提供包含本發明的單鏈Fc多肽與一種或多種的藥物可接受的 賦形劑、稀釋劑或栽體的組合的藥物或診斷組合物。因此，提供本發 明的單鏈Fc多肽在制備藥物中的用途。通常提供的所述組合物為包括 藥物可接受的載體的無菌的部分藥物組合物。本發明的藥物組合物還包含藥物可接受的佐劑。
本發明還提供用于制備藥物或診斷或研究試劑組合物的方法，包
括加入本發明的單鏈Fc多肽，并將其與一種或多種藥物可接受的賦形 劑、稀釋劑或栽體混合，
所述單鏈Fc多肽可為所述藥物或診斷組合物中的單一活性成分， 或可伴有其他活性成分，包括例如其他抗體或非抗體成分，包括例如 抗炎劑和化療劑。
所述藥物組合物優選包含治療有效量的本發明的單鏈Fc多肽。本 文所用術語"治療有效量"指治療、改善或預防靶向疾病或病癥，或 呈現可檢測的治療或預防效果所需的治療劑的量。可在細胞培養物或 動物模型(通常在嚙齒類、兔、狗、豬或靈長類)中初步評估任何單 鏈Fc多肽的治療有效量。也可使用動物模型確定合適的施用濃度范圍 和給藥途徑。然后可使用這類信息確定給人施藥的有效劑量和途徑。
予人受試者的精確的治療有效量取決于疾病狀態的嚴重度、所迷 受試者的一般健康、年齡、體重和性別、飲食、給藥時間和頻率、藥 物的組合、反應敏感度及對治療的耐受性/反應性。可根據常規試驗及 臨床醫生的判斷確定所述量。治療有效量通常為0. 01mg/kg-50mg/kg， 優選0. lmg/kg-20mg/kg。藥物組合物可為每劑含有預定量的本發明的 活性劑的單元劑型，以方便使用。
可將組合物單獨施用于患者，或將其與其他制劑、藥物或激素聯 合(例如，同時、依次或獨立)施用。
本發明的單鏈Fc多肽的施用劑量取決于待治療病征的特性、炎癥 程度、及是將抗體分子用于預防，還是用于治療既患病征。
給藥頻率取決于所述單鏈Fc多肽的半衰期及其效果的持續時間。 如果單鏈Fc多肽的半衰期短(例如2-10小時)，則可需要每日給藥 一次或多次。而如果單鏈Fc多肽的半衰期長(例如2-15日)，則可 僅需每日給藥一次、每周給藥一次、或甚至每1或2個月給藥一次。
藥物可接受的載體本身不應該誘導有害于接受所述組合物的個體 的抗體產生，且不應該有毒。合適的載體可為大而代謝緩慢的大分子，例如蛋白質、多肽、脂質體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、 氨基酸共聚物及無活性的病毒粒子。
可使用藥物可接受的鹽，例如無機酸鹽(例如鹽酸鹽、氬溴酸鹽、 磷酸鹽和硫酸鹽)或有機酸鹽(例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯 甲酸鹽)。
在治療組合物中的藥物可接受的載體還可含有液體，例如水、鹽 水、甘油和乙醇。此外，所述組合物中可含有輔助物質，例如濕潤劑
或乳化劑或pH緩沖物質。可使用所述載體將藥物組合物制成用于患者 攝入的片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、骨劑和懸液。
優選的給藥形式包括適于經腸胃外給藥的形式，例如通過注射或 輸注，例如通過快速濃注或連續輸注。用于注射或輸注的產品可取含 油或含水載體中的懸液、溶液或乳液形式，其可含配方劑，例如懸浮 劑、防腐劑、穩定劑和/或分散劑。另外，所述單鏈Fc多肽也可為干 燥形式，可于使用前用合適的無菌液重配。
一旦配成，可將本發明的組合物直接施用于受試者。待治療的受 試者可為動物。然而，所述組合物優選適于給人受試者施用。
可通過多種途徑施用本發明的藥物組合物，包括，但不限于，口 服、經肺、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、透皮 (transdermal )、經皮膚(transcutaneous )(例如，見W0 98/20734 )、 皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。也可 使用皮下注射器和噴霧器施用本發明的藥物組合物。通常將所述治療 組合物制成溶液或懸液形式的可注射劑。也可制成適于于注射前溶解 或懸浮于液體載體的固體劑型。
通常通過皮下、腹膜內、靜脈內或肌肉內、或遞送至組織的細胞 間隙的注射實現組合物的直接遞送。也可將組合物施用于傷口。可根 據單劑量方案或多劑量方案進行藥物處理。
所述組合物中的活性成分可為單鏈Fc多肽。所以其易于在消化道 內降解。因此，如果要通過消化道途徑施用所述組合物，所述組合物 需含有保護所述單鏈Fc多肽免于降解，但一旦被消化道吸收則釋放所述單鏈Fc多肽的物質。
有關藥物可接受的栽體的全面討論見Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, NJ. 1991),
也可通過使用基因治療施用本發明的單鏈Fc多肽。為了達到此目 的，將在恰當的DNA組分控制下的編碼所述單鏈Fc多肽的DNA序列導 入患者，從而使所述DNA序列表達所述單鏈Fc多肽，并使表達出的多 肽原位組裝。也可用所述單鏈Fc多肽離體轉染合適的細胞(例如T 細胞)。有關離體轉染的合適的方法的實例見WO2004/039840。
本發明還提供用于治療或預防病理性紊亂的單鏈Fc多肽，所述病 理性紊亂選自(病毒、細菌、真菌和寄生蟲)感染、與感染有關的 內毒素性休克、關節炎、風濕性關節炎、哮喘、骨盆炎性疾病、阿爾 茨海默爾病、克羅恩病、佩羅尼氏病、腹腔疾病、膽嚢疾病、藏毛病、 腹膜炎、銀屑病、脈管炎、外科粘連、中風、I型糖尿病、萊姆關節 炎、腦膜腦炎、免疫介導的中樞和外周神經系統的炎性紊亂(例如多 發性硬化和格-巴二氏綜合征)、其他自體免疫疾病、胰腺炎、創傷(手 術)、移植物抗宿主病、移植排斥、癌癥(固體腫瘤例如黑色素瘤、 肝母細胞瘤、肉瘤、鱗狀細胞癌、移行細胞癌、卵巢癌，及惡性血液 病，尤其是急性髄系白血病、慢性髄系白血病、胃癌和結腸癌)、心 臟病(包括局部缺血疾病，例如心肌梗塞及動脈粥樣硬化)、血管內 凝血、骨再吸收、骨質疏松、牙周炎和低胃酸癥(hypochlorhydia)。
本發明優選提供用于控制炎性疾病和癌癥的單鏈Fc多肽。可優選 將所述單鏈Fc多肽用于減少炎性過程或癌癥，或用于預防炎性過程或 癌癥。
附圖簡述
以下將通過實施例描述本發明，其中參考
圖1 (a) - (c):本發明的單鏈Fc多肽的三個實例的示意圖， 其包含抗體Fab片段，其中連接子連接所述第一 CH3結構域的C-末端 與所述第二CH2結構域的N-末端。
34圖2 (a) - (c):單鏈Fc多肽的三個實例的示意圖，其包含抗 體Fab片段，其中連接子連接所述第一 CH2結構域的C-末端與所述第 二CH2結構域的N-末端，且另一連接子連接所述第一CH3結構域的C-末端與所述第二 CH3結構域的N-末端。
圖3 (a) - (c):單鏈Fc多肽的三個實例的示意圖，其包含抗 體Fab片段，其中
(a) 連接子連接所述第一 CH4結構域的C-末端與所述第二 CH2 結構域的N-末端。
(b) 第一連接子連接所述第一 CH2結構域的C-末端與所述第二 CH2結構域的N-末端，第二連接子連接所述第二 CH2結構域的C-末端 與所述第一 CH3結構域的N-末端，且第三連接子連接所述第一 CH4結 構域的C-末端與所述第二 CH3結構域的N-末端。
(c) 第一連接子連接所述第一 CH3結構域的C-末端與所述第二 CH2結構域的N-末端，第二連接子連接所述第二 CH3結構域的C-末端 與所述第一 CH4結構域的N-末端，且第三連接子連接所述第一 CH4結 構域的C-末端與所述第二 CH4結構域的N-末端。
圖4a和4b:顯示所述單鏈Fc多肽結合在NSO細胞表面重組表達 的抗原(圖4a)，且結合在活化的T細胞表面天然表達的抗原(圖4b)。
圖5a和b:顯示所迷單鏈Fc多肽在補體存在下誘導NSO細胞的 細胞毒性的能力(a)，且在缺少補體時無此能力(b)。
圖5c和5d:顯示所述單鏈Fc多肽誘導活化的T細胞的補體依賴 性細胞毒性的能力。
圖6:源自IgGl的單鏈Fc多肽的序列實例
以斜體表示鉸鏈序列，并給連接子加下劃線。
(a) 如在圖1 (a)中所示形式
(b) 如在圖1 (b)中所示形式
(c) 如在圖1 (c)中所示形式
(d) 如在圖2(a)中所示形式
(e) 如在圖2(b)中所示形式
35(f )如在圖2 (c)中所示形式
實施例
實施例1
設計于其N-末端包含生物活性分子的三個鼠單鏈Fc多肽，其中 所述生物活性分子是抗體Fab片段。所述Fab片段的可變區源自鼠抗 體Mox46，其結合細胞表面蛋白抗原。所述Fc結構域源自鼠IgG2a， 這些結構域的三個不同版本顯示如下。給連接子序列加了下劃線。以 斜體表示鉸鏈序列，且以斜體并加下劃線表示其中構成部分連接子的 序列。
版本1 SEQ ID NO: 88 (如在圖2b中所示形式)。在CH1和CH2 之間的鉸鏈中的半胱氨酸已被絲氨酸替代。
五尸/ GP7IKPS尸尸^尸APNLLGGPSWIFPPKIKDVLMISLSPIVTCWVDVSED
CKVNNKDLPAPIERTISKPKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPNLLG
NTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSR
VEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 版本2 SEQ ID NO: 89 (如在圖2a中所示形式)
36五iV G^rJKPCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCWVDVSEDDPDV
KTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKN群ERNSYSCSWHEGLHNH
MYSKLRVEKKNWVE讓YSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
版本3 SEQ ID NO: 90 (如在圖la中所示形式)。連接子包含 截短的鉸鏈"PCP"。
五/^GP77i^PC尸APNLLGGPSVFIFPPK:iKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDV
DIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKN群ERNSYSC SWHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGSSTASGSGSGGSGTAGSSGGAGSSGGST
taggsasgsgstgsgtggassggasgasg/y:papnllggpsvfifppkikdvl
SALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAP1ERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPE EEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEJPVLDSDGSYF MYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
合成了編碼各個單鏈Fc多肽的DNA，于其N-末端具有相同的生物 活性分子，即來自抗體MOX46的VHCH1結構域。
使用抗體前導序列(來自小鼠抗體B72. 3(Whittle " "， ， 1987， Protein Eng. 1 (6) 499-505 ))在HEK293細胞(人胚腎上皮細胞系) 內在pVAX載體(Invitrogen)中表達包含以上版本l、 2和3的單鏈 Fc多肽。在相同細胞但不同的栽體中產生M0X46Fab片段的VLCL鏈。 使用蛋白A純化所得單鏈Fc多肽。
實施例2:抗原結合
比較單鏈Fc多肽(版本1和3 )與在鼠IgGl框架和無關IgG中表達的相同抗體可變區(來自M0X46抗體)結合抗原的能力。將于其 表面表達抗原的重組NSO細胞(5xl05)與lOOjul單鏈Fc多肽于4 n孵育30分鐘。對照是M0PC21,用5 jLig/ml所述M0PC21的1/3稀釋 液進行滴定。用M0X46 IgG和單鏈Fc多肽構建體的1/3稀釋液進行滴 定。用含有5%FCS和0.1°/。疊氮鈉的Dulbecco's PBS洗細胞兩次，然 后加入以1/250稀釋的100 jul抗小鼠重鏈和輕鏈的PE標記的
(Jackson)抗體，于4t:孵育30分鐘。再洗細胞一次，之后通過流 式細胞計數分析。
與MOX46 IgG—樣，所檢測的兩種單鏈Fc多肽構建體均結合抗原
(1.1和3. 1)。無關的對照不結合所述抗原。見圖4a。
也使用上述方法，但使用活化的原代T細胞代替重組NSO細胞， 檢測單鏈Fc多肽(版本1、 2和3)結合抗原的能力，所述T細胞于 其表面天然表達所述抗原。如下產生活化的原代T細胞將1 x 106D011 脾細胞用200ng/ml卵清蛋白肽323-329培養3天，洗滌細胞，再重懸 于兩倍體積的培養基中培養2天。然后通過陰性分離所述CD4 T細胞
來純化活化的細胞。
與MOX46IgG—樣，三種單鏈Fc構建體均結合抗原。無關的對照 不結合所述抗原。見圖4b。
實施例3: Fc受體結合
通過BIAcore測定了單鏈Fc版本1和3結合Fc受體CD" ( Fc y RII)和CD32 (FcyRI)的能力。用氨基偶聯化學法將CD64和CD32 分別固定(每個約1000RU)于標準CM5 Biacore芯片的流動細胞2和 3上。將流動細胞1設定為參照流動細胞，以檢查背景結合。然后將 所述單鏈Fc蛋白注入覆蓋所述芯片的序列中，以檢查結合活性。運行 未稀釋及以1: 2和1: 5稀釋的全部樣品。所有樣品均無顯著的背景結 合。
發現所述單鏈Fc的版本1和3均兼結合CD64和CD32。 實施例4:使用重組NSO細胞測定補體依賴性細胞毒性的實驗 檢測了單鏈Fc版本1和3引起與其結合的細胞的補體依賴性細胞毒性的能力。
將于其表面表達所述相關抗原的重組NS0系(5xl06)細胞/ml 培養基與50ji 1/ml仔兔補體(Serotec C12CA)混合。于使用前，用 2ml水冷的組織培養級蒸餾水重配所述補體溶液。于重配1小時之內 使用，并于使用前置于水上保存。所檢測制劑的濃度為2jug/ml，將 其一式兩份平板接種于96孔板(Costar)中，每孔100)al體系。于 每孔加入100 ia 1的細胞/補體混合物，并將平板于37X:孵育4小時。 通過FACS，根據對碘化丙啶(PI)活體染色的攝取評估細胞毒性。用 蒸餾水制備20mg/mlPI儲液(分子探針P-1304MP),然后用RPMI1640 稀釋，至每孔終濃度3jLig/ml。將細胞于室溫下、避光孵育IO分鐘后， 通過流式細胞術進行分析。
圖5a (有補體)和圖5b (無補體)顯示所述單鏈Fc多肽的兩種 版本1和3 (1. 1和3. 1)都誘導補體依賴性細胞毒性。
實施例5:使用活化的T細胞進行補體依賴性細胞毒性測定 (i )檢測了單鏈Fc版本1、 2和3引起活化的T細胞的補體依賴 性細胞毒性的能力，所述活化的T細胞于其表面表達與MOX46抗體結 合的抗原。除使用活化的原代T細胞代替NSO細胞外，所用方法如實 施例4所述，如實施例2中所述產生所述活化的T細胞。
如下計算細胞的特異性溶解％:
在試驗條件下的PI陽性細胞％ -背景的PI陽性細胞％ /最大PI 陽性細胞％ (溶解緩沖液)—背景PI陽性細胞％
發現所述單鏈Fc多肽的三個版本均誘導補體依賴性細胞毒性(圖 5c)。
(ii)使用鼠Fc區產生IgGl和IgG2a形式的包含抗體Fab片段 的另一羊鏈Fc多肽(版本3)，所述Fab片段源自鼠抗體，4"，其 結合不同細胞表面蛋白抗原。檢測了這些scFc蛋白質引起活化的T 細胞的補體依賴性細胞毒性的能力，所述活化的T細胞于其表面表達 與495抗體結合的抗原。除使用如實施例2中所述產生的活化的原代 T細胞外，所用方法如實施例4中所述。圖5d清楚地表明，如所預期的一樣，僅單鏈Fc的IgG2a形式和 全抗體495的IgG2b形式可誘導補體依賴性細胞毒性。IgGl形式不能 誘導補體依賴性細胞毒性。
實施例6:受體-scFc融合
使用圖la所示的單鏈Fc形式將人gpl30受體結構域1克隆為單 鏈Fc (小鼠y1)融合蛋白。所述融合蛋白的序列顯示如下。 Gpl30結構域l scFc融合蛋白(SEQ ID NO: 91)
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以粗體顯示的序列代表gpl30受體結構域l (SEQIDNO: 91的氨 基酸1-125)。給連接子序列加了下劃線。以斜體表示鉸鏈序列，且 以斜體并加下劃線表示其中構成部分連接子的序列。在gpl30結構域 1的C-末端與所述第一鉸鏈序列之間的序列"SSA"是為克隆目引入必 要的Xhol限制性位點所需的氨基酸。
使用pVAX栽體和B72. 3小鼠信號序列使所述構建體在哺乳動物細 胞系統(CH0L761)中瞬時表達。使用產生的scFc蛋白進行蛋白質印 跡，并將抗-小鼠Fc HHP (Jackson 115-035-071 )及生物素化的多克 隆抗gpl30 (R&D BAF228 )用作探針檢測印跡，用strep-HRP顯示。 在蛋白質印跡上檢測對應于gpl30結構域1融合蛋白的預期大小的蛋 白質。之前欲單獨表達gpl30結構域1或將其與與之連接的his標簽 一起表達的嘗試未獲成功。將gpl30結構域1與單鏈Fc多肽融合可使 gpl30結構域l表達。
需知實施例僅為說明本發明，而非意在限制，可在下述權利要求
40的范圍內對細節進行修改。本發明各個實施方案的優選特征對于各個 其他實施方案而言是在細節上做了必要的修正。將在本說明書中引用 的全部出版物(包括但不限于專利和專利申請)通過引用并入本文， 如同聲明將各個單獨的出版物特別且單獨通過引用并入本文。
4權利要求
1.包含兩個CH2結構域和兩個CH3結構域的單鏈Fc多肽，其特征在于所述CH2和CH3結構域在所述多肽鏈內形成功能性Fc結構域。
2. 權利要求1的單鏈Fc多肽，其中在所述多肽鏈內，第一CH2 結構域與第二 CH2結構域二聚化，且第一 CH3結構域與第二 CH3結構 域二聚化。
3. 權利要求2的多肽，其中，在從N-至C-末端的序列中，將第 一 CH2結構域于其C-末端任選通過連接子連接到第一 CH3結構域的N-末端，且將所述第一 CH3結構域于其C-末端通過連接子連接到第二 CH2 結構域的N-末端，將所述第二CH2結構域于其C-末端任選通過連接子 連接到所述第二 CH3結構域的N-末端。
4. 權利要求2的多肽，其中，在從N-至C-末端的序列中，將第 一 CH2結構域于其C-末端通過連接子連接到第二 CH2結構域的N-末 端，且將所述第二 CH2結構域于其C-末端任選通過連接子連接到第一 CH3結構域的N-末端，和將所述第一 CH3結構域于其C-末端通過連接 子連接到第二 CH3結構域的N-末端。
5. 權利要求2的多肽，其還包含兩個彼此二聚化的CH4結構域。
6. 權利要求3的多肽，其中所述第一 CH3結構域的C-末端與所 述第二 CH2結構域的N-末端之間的所述連接子長度為30-130個氨基
7. 權利要求4的多肽，其中所述第一 CH2結構域的C-末端與所 迷第二 CH2結構域的N-末端之間的所述連接子長度為15-90個氨基 酸。
8. 權利要求4的多肽，其中所述第一 CH3結構域的C-末端與所 述第二 CH3結構域的N-末端之間的所述連接子長度為15-50個氨基
9. 權利要求6-9中任一項的多肽，其中所述連接子包含選自甘氨 酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸中的一種或多種氨基酸。
10. 權利要求6的多肽，其中所述連接子包含SEQ ID NO: 62所 示序列。
11. 權利要求7的多肽，其中所述連接子包含SEQ ID NO: 63所 示序列。
12. 權利要求8的多肽，其中所述連接子包含SEQ ID NO: 63所 示序列。
13. 權利要求6-12中任一項的多肽，其中所述連接子包含一個或 多個半胱氨酸殘基。
14. 權利要求6-13中任一項的多肽，其中所述連接子包含全長或 部分抗體鉸鏈序列或經修飾的抗體鉸鏈序列。
15. 權利要求14的多肽，其中所迷連接子包含選自SEQ ID NO: 53、 SEQ ID NO: 54、 SEQ ID NO: 55、 SEQ ID NO: 56、 SEQ ID NO: 57、 SEQ ID NO: 58、 SEQ ID NO: 59、 SEQ ID NO: 60或SEQ ID NO: 61所示序列的抗體鉸鏈序列。
16. 權利要求6的多肽，其中所述連接子包含SEQ ID NO: 62和 SEQ ID NO: 53所示序列。
17. 權利要求7的多肽，其中所述連接子包含SEQ ID NO: 63和 SEQ ID NO: 53所示序列。
18. 權利要求1-17中任一項的多肽，其中每個CH2結構域包含 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 41 所示序列。
19. 權利要求1-18中任一項的多肽，其中每個CH3結構域包含 SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 42 所示序列。
20. 權利要求1-17中任一項的多肽，其中每個CH2結構域與在權 利要求18中給出的序列具有至少80%同一性或相似性，且每個CH3結 構域與在權利要求19中給出的序列具有至少80%同一性或相似性。
21. 權利要求1-20中任一項的多肽，其中第二 CH3結構域的C-末端，或如果存在CH4結構域，第二CH4結構域的C末端，任選地經由接頭被連接于跨膜結構域。
22. 權利要求21的多肽，其中將所述跨膜結構域的C-末端任選通過連接子連接到信號轉導結構域的N-末端。
23. 權利要求1-22中任一項的單鏈Fc多肽，將其連接到一種或多種生物活性分子。
24. 權利要求23的單鏈Fc多肽，其中所述生物活性分子選自藥物、碳水化合物、受體或抗體片段。
25. 權利要求23或24的單鏈Fc多肽，其中將生物活性分子連接到所述單鏈Fc多肽的所述第一CH2結構域的N-末端。
26. 權利要求25的單鏈Fc多肽，其中所述生物活性分子和所述單鏈Fc多肽通過長度為1-100個氨基酸的肽連接子相連。
27. 權利要求26的單鏈Fc多肽，其中所述連接子包含半胱氨酸殘基。
28. 權利要求26或27的單鏈Fc多肽，其中所述連接子包含選自SEQ ID NO: 53、 SEQ ID NO: 54、 SEQ ID NO: 55、 SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、 SEQ ID NO: 58、 SEQ ID NO: 59、 SEQ ID NO: 60或SEQ ID NO: 61所示序列的抗體鉸鏈序列。
29. 權利要求1-28中任一項的單鏈Fc多肽，包含SEQ ID NO: 8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO21、 SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO25、 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO36、 SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO47、 SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO51或SEQ ID NO:52所示序列。
30.權利要求1-28中任一項的單鏈Fc多肽，其包含與在權利要求29中給出的任一序列具有至少80%同一性或相似性的序列。
31. 權利要求23-30中任一項的單鏈Fc多肽，其中所述生物活性分子包含抗體片段。
32. 權利要求31的單鏈Fc多肽，其中所述抗體片段選自VHH、VH、 VL、 VH-CH1、 VL-CL、 Fab、 Fab'或scFv。
33. 權利要求32的單鏈Fc多肽，其中所述抗體片段是Fab，且 將所述Fab的VH-CH1鏈的C-末端基因融合到單鏈Fc多肽的N-末端， 且將所述Fab的VL-CL鏈通過二硫鍵連接到VH-CH1鏈。
34. 權利要求23-30中任一項的單鏈Fc多肽，其中所述生物活性 分子包含人gpl30受體的一個或多個結構域或其片段。
35. 權利要求34的單鏈Fc多肽，其包含人gpl30受體的結構域 l或其片段。
36. 權利要求1-35中任一項的單鏈Fc多肽，其上結合了一種或 多種效應分子。
37. 分離的DNA序列，其編碼權利要求1-36中任一項的單鏈Fc 多肽。
38. 克隆或表達栽體，其包含一種或多種權利要求37的DNA序列。
39. 宿主細胞，其包含一種或多種權利要求38的克隆或表達載體。
40. 用于制備權利要求1-36中任一項的單鏈Fc多肽的方法，包 括培養權利要求39的宿主細胞并分離所述單鏈Fc多肽。
41. 藥物組合物，包含權利要求1-36中任一項的單鏈Fc多肽，其與一種或多種藥物可接受的賦形劑、稀釋劑或栽體組合。
42. 權利要求41的藥物組合物，另外包含其他的活性成分。
全文摘要
本發明涉及包含一種或多種免疫球蛋白Fc結構域的單鏈多肽。本發明具體涉及在所述多肽鏈內形成至少一個功能性Fc結構域的單鏈Fc多肽。
文檔編號C07K16/00GK101495510SQ200780027807
公開日2009年7月29日 申請日期2007年7月24日 優先權日2006年7月25日
發明者A·D·G·勞森, P·E·史蒂芬斯 申請人:Ucb醫藥有限公司