專利名稱：：用于胞內釋放藥理活性化合物的用作陽離子脂質的l－肉堿或烷酰基l－肉堿的酯的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一類新的L-肉堿和酰基L-肉堿的酯以及它們作為適于幫助藥理活性化合物的胞內釋放、促進它們的跨膜轉運或促進它們與特定細胞膜位點(受體)的相互作用的陽離子脂質的用途。本發明還涉及作為上述新化合物用于相同目的的L-肉堿和酰基L-肉堿的其他已知酯。術語“胞內釋放”在本文中的意思是指用天然來源或經過修飾賦予了治療活性的多核苷酸或質粒進行細胞轉染(基因釋放)，或者將藥物或免疫原性肽摻入到細胞中。
背景技術：
：許多藥理活性物質，諸如象多肽和蛋白質或藥物一般需要穿透到細胞中通過以亞細胞或分子水平影響細胞功能而發揮它們的作用。對于這些分子來說，細胞膜構成了選擇性不透屏障。細胞膜事實上履行保護功能，阻止可能的毒性物質進入，但也阻止了具有治療活性的化合物通過。細胞膜的復合組成包括磷脂、糖脂和蛋白質；其功能受到細胞漿組分如Ca++及其他離子、ATP、微絲、微管、酶和、與Ca++鍵合的蛋白質的影響。不同的細胞類型顯示的選擇性和它們之間的選擇性是由于細胞的結構和細胞漿組分之間的相互作用和對外界信號的反應造成的。通過將復合物中的物質與再現天然來源的膜脂質組分的脂質制劑結合可以克服細胞膜的屏障效應。這些脂質可以與膜融合并釋放與其結合的物質使之進入細胞。這些脂質復合物不僅能通過與膜融合的方式促進細胞內的轉移，也能降低細胞膜與欲穿透細胞膜進入細胞的分子之間的電荷排斥力。兩性脂質，如膜磷脂，在水性系統中形成脂質小囊或脂質體。脂質體是一種小囊，其中水性體積被一或多層由脂質分子-通常為磷脂-組成的膜完全包裹。磷脂有一個親水的頭和一對碳鏈(疏水性的尾)，它是生物膜的主要組分。在水溶液中，疏水性的尾自動排斥水，而此時親水性頭與介質相互作用，自然形成有不同直徑的小囊的群體。脂質體一般是兩性離子，中性或陰離子。這些小囊可以作為藥物、小分子、蛋白質、核苷酸和質粒的載體。近年來，已廣泛使用陽離子脂質體向細胞中轉移遺傳物質，它是一類由合成脂質制備的帶正電荷的小囊。DNA的陰性電荷可以與陽離子脂質體相互作用，形成穩定的DNA-脂質體復合物。此技術的簡單性和通用性使脂質體成為一種在人的基因療法中輸送基因的重要的載體。現在，用于基因療法和NIH重組顧問委員會(NIHRecombinantAdvisoryCommittee)批準的多數載體包括病毒的和合成的系統。病毒感染包括一系列復雜的機制以能夠感染特定的細胞并攜帶DNA進入細胞核。基因療法使用病毒載體的原理基于用對療效編碼的基因替換病毒基因，而不消除病毒顆粒感染細胞的能力。病毒療法受到免疫、細胞病變和基因重組等病毒因素(viralelements)的限制。非常希望在病毒療法中使用陽離子脂質。這些載體與生物來源的相比具有非常大的潛力，因為它們更安全、低毒并能夠結合大體積的基因。然而，與生物載體相比，它們的細胞內基因轉錄產率較低。需牢記的是，這種轉染體系的應用是在研究的初級階段。陽離子脂質在DNA-脂質復合物的形成、細胞與復合物的相互作用、與細胞膜的融合、在細胞內釋放DNA和轉錄等過程中起非常重要的作用。脂質體的體內(in-vivo)應用有重要的例子。病毒療法的第一個臨床試驗是通過引入一個含有人脂質體復合的HLA-B7基因表達載體用于治療黑素瘤。另一個重要的應用涉及脂質體復合的表達載體SV40C-FTR通過經肺途徑或鼻腔噴霧給藥治療肺泡纖維變性。其他包括在癌癥的基因療法中使用脂質體的臨床試驗正在進展中。在陽離子脂質的結構中通常鑒別四個構成因素帶正電的陽離子頭，間隔區，錨狀脂質(theanchorlipid)和連接鍵。陽離子頭導致陽離子脂質體和DNA之間、DNA-脂質體復合物和細胞膜及細胞的其他組分之間的相互作用。它含有一個或多個可以被取代的陽離子基團(決定于電荷數目)。間隔區是分子中分隔陽離子頭和疏水性尾的部分，并且它確保陽離子頭與DNA磷脂的陰離子電荷之間的最佳的接觸。錨狀脂質是分子的非極性烴部分，并決定雙脂質層的物理性質，如其剛性和與膜脂質的交換速率。″連接鍵″表示烴鏈和分子的其他部分之間的鍵。此鍵決定了陽離子脂質的化學穩定性和生物降解能力。近年來脂質體在化妝品領域的應用穩定增長。脂質體在此領域的成功是由于皮膚對這些化合物是非常耐受的。它們既作為活性成分的載體，也作為促進活性成分吸收的化合物。在制備和使用脂質體方面的科技和專利參考文獻是非常豐富的，然而僅有少量的參考文獻記載了肉堿衍生物在基因釋放中的應用，對于藥物的傳遞，沒有涉及制備即使極少地相似于本發明的化合物的已知技術的文獻可供利用。專利申請EP0279887記載了肉堿載體的應用，如磷脂酰基肉堿，可選地與其他磷脂和脂質(膽固醇、磷脂酰基膽堿、磷脂酰基絲氨酸)組成混合物，制備脂質體。在關于制備脂質體的例子中，與普萘洛爾結合制備了磷脂酰基肉堿脂質體，普萘洛爾是一種已知具有抗高血壓、抗心絞痛和抗心律失常活性的藥物。此處使用肉堿衍生物是基于肉堿顯著的心肌向性。此向性使脂質體能避免被肝代謝而不能到達所需的靶部位。磷脂酰基肉堿的存在也使脂質體能夠口服，因為它能對抗腸內的脂酶。在《醫藥化學雜志》1998，6月18日；41(13)2207-15記載了一些用于基因釋放的L-肉堿的酯，但并未記載或提示它們作為藥物釋放的有用藥劑。WO96/39193記載了新的靶藥物制劑，其目的在于通過肉堿-酰基肉堿移位酶系統進入線粒體，但未提示它們是制備脂質體的有用藥劑。EP559625B1記載了一些有選擇性的胃腸道肌松弛活性的L-肉堿和酰基L-肉堿的酯。近年來分子生物學家已鑒定了一些導致人類遺傳疾病的染色體水平的缺損。現代醫學的一個重要方面涉及用基因療法方案治療由遺傳基因導致的疾病。如已提及的，陽離子脂質體廣泛用于在細胞內傳遞藥物活性化合物，促進跨膜輸送或促進其與特定的細胞膜位點(受體)的相互作用。這些載體與源于生物的載體相比具有非常大的潛力，因為它們更安全、低毒并且也能結合大體積的基因。然而，與生物載體相比，它們的細胞內基因轉錄產率較低。此外，由常規的陽離子脂質介導的基因轉移需要質粒DNA和陽離子脂質保持分離，恰在基因轉移之前使其混合。使多核苷酸復合物穩定的嘗試迄今為止是失敗的，未能產生令人鼓舞的結果；實際上，它們僅在短的時間內保持穩定。在基因療法或基因釋放和藥物釋放領域，已認識到非常需要穩定、可再生的位點-特異性系統，它在一個適當的時間周期后也具有活性。已發現在促進細胞內的藥理學活性化合物在細胞內傳送方面具有強大活性的一類陽離子脂質含有新的L-肉堿和酰基L-肉堿的酯。這些新化合物是穩定和高選擇性的，因為它們在到達靶器官時具有位點特異性。此特性使它們能特別有效地將活性物質直接傳遞到活性物質可以發揮其藥理學活性的部位。
發明內容此處記載的本發明的化合物是有通式(I)的化合物其中n是1-3的整數；R是氫或直鏈或分支的、有2-6個碳原子的烷酰基；R1和R2，可以相同或不同，代表有3-20個碳原子的飽和或不飽和直鏈酰基；并且X-是藥學可接受的酸的陰離子。R的例子是乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和異戊酰基。R1和R2的例子是己酰基、十一烷酰基、肉豆蔻酰基、棕櫚酰基或油酰基。本發明優選的化合物如-L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST770)；-乙酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST771)；-丙酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST772)；-異丁酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3二棕櫚酰基甘油的酯(ST773)；-異戊酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST774)；-L-肉堿溴化物與1，3-二己酰基-2-羥基十六烷基甘油的酯(ST810)；-乙酰基L-肉堿溴化物與1，3-二己酰基-2-羥基乙酰基甘油的酯(ST809)；-丙酰基L-肉堿溴化物與1，3-二己酰基-2-羥基乙酰基甘油的酯(ST808)。藥理學上可以接受的酸的陰離子是指任何不導致不需要的毒性或副作用升高的酸的陰離子。這些酸是藥理學家和藥學領域的技術人員熟知的。這些陰離子的例子不僅限于以下列出的種類氯；溴；碘；門冬氨酸根；酸式門冬氨酸根；檸檬酸根；酸式檸檬酸根；酒石酸根；酸式酒石酸根；磷酸根；酸式磷酸根；延胡索酸根；酸式延胡索酸根；甘油磷酸根；葡萄糖磷酸根；乳酸根；順丁烯二酸根；酸式順丁烯二酸根；粘酸根；乳清酸根；草酸根；酸式草酸根；硫酸根；酸式硫酸根；三氯醋酸根；三氟醋酸根；甲磺酸根；雙羥萘酸根和酸式雙羥萘酸根。以脂質體形式存在的式(I)化合物，作為在基因療法中傳遞天然來源的或經修飾的質粒或核苷酸的藥劑，或為作為疫苗的肽或蛋白質編碼，或用于下列藥物的基因釋放，例如，抗癌劑，抗病毒劑，抗細菌劑，抗真菌劑，抗原生動物劑，用于治療心血管系統疾病的藥物，免疫原性肽和其他用于治療的藥物。通過本領域普通技術人員熟知的常規技術制備含有式(I)化合物的脂質體；見AllenT.M.Drugs56，747-56(1998)的例子。也可以用脂質體技術實踐中熟知的其他組分制備本發明的脂質體。在本發明的一個實施例中，脂質體可以含有助性脂質，此術語在本領域是可以理解的。助性脂質例如膽固醇，1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰基膽堿或二油酰磷脂酰基膽堿。本發明的脂質體適于以組合物形式存在。在屬于傳遞藥理學活性化合物的實施方案中，組合物理解為藥劑學上的種類，可選地含有藥學上可接受的載體和/或賦型劑。脂質體形式的式(I)化合物，也可以用于制備化妝品組合物，脂質體本身可以作為化妝品活性劑，也可以用于輸送化妝品活性物質，如水合劑、營養素、面部清潔劑、抗皺劑、抗蜂窩炎劑和抗拉伸紋劑(anti-stretch-markagents)。含有式(I)化合物的脂質體可以通過口服、腸道外、肌內、靜脈注射、皮下、經皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。本發明也涉及另外具有通式(II)的陽離子脂質，它們已知用于不同的用途(見上述EP559625)。根據本發明，式(II)化合物是L-肉堿的酯，用于制備在藥物釋放方面具有潛在活性的脂質體，它與上述式(I)化合物相比，在到達靶器官方面表現出穩定性和選擇性的特點。同樣有益的性質適用于化妝品。這些化合物具有通式(II)其中R3是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個碳原子的酰基鏈；R4是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個碳原子的烷基鏈；并且X-是藥理學可接受的酸的陰離子。R3優選的例子是壬酰基、十二烷酰基、肉豆蔻酰基、棕櫚酰基、硬脂酰基或油酰基。R4優選的例子是壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。本發明記載的特定的式(II)化合物的例子是-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯(ST983)；-硬脂酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯(ST1055)；-硬脂酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1351)；-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1379)；-肉豆蔻酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1380)；-棕櫚酰L-肉堿溴化物十六烷基酯(ST1390)；-油基(oleyl)L-肉堿氯化物油基酯(ST1392)。上述《醫藥化學雜志》1998年6月18日；41(13)2207-15記載了一些式(II)化合物，即ST1380、ST1390和ST1392，作為制備用于細胞轉染的具有治療活性的脂質體的有用藥劑，但未記載作為制備用于輸送藥物的脂質體的有用藥劑。制藥領域具有一般經驗的技術人員清楚地知道在制備脂質體-藥物復合物方面面臨的困難；實際上，不能預測一個用于傳遞基因的脂質體是否能用于傳遞藥物，這需要克服許多困難以得到能與藥物復合并將其優先釋放到需要發揮治療作用的器官的脂質體。脂質體形式的式(II)化合物，是有用的藥物釋放劑，可以輸送藥物如抗癌劑、抗血管生成劑、抗病毒劑、抗細菌劑、抗真菌劑、抗原生動物劑，或用于治療心血管疾病的藥物，或免疫原性肽，和其他用于治療的藥物。脂質體形式的式(II)化合物，也可以用于制備化妝品組合物，脂質體本身可以作為化妝品活性劑，也可以用于輸送化妝品活性物質，如水合劑、營養素、面部清潔劑、抗皺劑、抗蜂窩炎劑和抗拉伸紋劑(anti-stretch-markagents)。在含有式(II)化合物的脂質體中，所述的脂質體可選地含有助性脂質。含有式(II)化合物的脂質體可以通過口服、腸道外、肌內、靜脈內、皮下、透皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。本發明也涉及另外具有通式(III)的陽離子脂質，它們已知用于不同的用途(見上述EP559625)。根據本發明，式(III)化合物是L-肉堿的酯，用于制備在促進藥物釋放方面具有潛在活性的脂質體，它與上述式(I)化合物相比，在到達靶器官方面表現出穩定性和選擇性的特點。這些化合物具有通式(III)其中R5是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個碳原子的酰基鏈；R6是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個碳原子的烷基鏈；X-是藥理學可接受的酸的陰離子，具有如下限制條件當R5是硬脂酰基時，R6不是硬脂基，當R5是油酰基時，R6不是硬脂基，當R5是棕櫚酰基時，R6不是棕櫚基，當R5是肉豆蔻酰基時，R6不是肉豆蔻基，當R5是月桂酰基時，R6不是月桂基，當R5是油酰基時，R6不是油基。《醫藥化學雜志》1988，41，2207-2215公開了僅用于基因釋放的放棄保護的脂質體形式的化合物。R5優選的例子是壬酰基、十二烷酰基、肉豆蔻酰基、棕櫚酰基、硬脂酰基或油酰基。R6優選的例子是壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。本發明式(III)化合物的優選的例子是-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯(ST983)；-硬脂酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯(ST1055)；-硬脂酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1351)；-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1379)。式(III)化合物作為在基因療法中傳遞天然來源的或經修飾的質粒或核苷酸的藥劑，或為作為疫苗的肽或蛋白質編碼。式(III)化合物可以通過口服、腸道外、肌內、靜脈內、皮下、透皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。在以下反應簡圖中表示了制備本發明式(I)化合物的過程，它表示此簡圖用于所有通式(I)化合物。由于所有必需的試劑都是市售的或已公開在文獻中，并且反應條件通常適用于本發明任何變化的全部范圍，如果在常識范圍內可以正常地滿足需求，技術人員可以容易地得到R、R1和R2代表的所有的基團。參考以上反應流程1，以下說明本申請的式(I)化合物的制備方法。例1丙酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST772)a)制備1，3-二羥基丙-2-酮1，3-二棕櫚酸酯(1)在0℃(外部溫度)在無水氮氣流中將二羥基丙酮(7g；0.078mol)溶解在300mL無水氯仿中。向得到的溶液中滴加棕櫚酰氯(44g；0.16mol)和無水吡啶(15mL)。將溫度已上升至環境溫度的所得混合物攪拌24小時。按以下順序萃取混合物用0.5％鹽酸的水溶液300mL、5％碳酸氫鈉的水溶液300mL，最后用300mL水。用無水硫酸鈉使分離出的有機相脫水，用纖維素濾器過濾并濃縮至干，得到粗產物(1)。從500mL乙醇中結晶得到純品。得到30.4g產品(1)。產率73％熔點＝80-81℃H1NMR(CDCl3)0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；4.7(4H，s，-OCCH2-).b)制備1，2，3-三羥基丙烷-1，3-二棕櫚酸酯(2)將水(7.5mL)緩慢加到產品(1)(5g，9mmol)中，攪拌使之溶解在四氫呋喃(125mL)和甲苯(25mL)中。將所得的白色乳狀懸浮液的溫度調至5℃(外部溫度)，分次加入硼氫化鈉(500mg；13mmol)。在5℃將懸浮液保持攪拌30分鐘。然后緩慢加入冰醋酸直至不再有剩余的硼氫化鈉分解產生泡沫，最終得到一種溶液。向溶液中加入氯仿(100mL)，形成兩相系統。分離底層含有CHCI3的有機相，按以下順序萃取用水(25mL)，碳酸氫鈉(10％水溶液25mL)和水(25mL)。用硫酸鈉使含有(2)的有機相脫水，過濾并濃縮至干，得到一種蠟狀產物。用丙酮使蠟狀產物結晶得到產品(2)。得到4.8g產品(2)。產率94％。熔點＝71-72℃H1NMR(CDCl3)0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；4.2(5H，m，-CHCH2O-).c)制備1，3-二棕櫚酰-2-溴乙酰基甘油(3)在0℃和攪拌的條件下將產品(2)(2.5g；4.4mmol)溶解在無水氯仿(50mL)中(外部溫度)。向得到的溶液中緩慢加入吡啶(0.42ml)并滴加3ml含有溴代乙酰氯(0.43mL；5.2mmol)的氯仿溶液。將反應混合物在0℃保持30分鐘(外部溫度)，并在環境溫度下保持30分鐘。然后按以下順序處理反應混合物鹽酸的1％水溶液(約50mL)，碳酸氫鈉的5％水溶液(約50mL)和水。用丙酮結晶純化產物(3)，然后使反應混合物脫水(用硫酸鈉)并濃縮至干。得到2.5g產品。產率89％。熔點＝46-47℃H1NMR(CDCl3)0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；3.9(2H，s，-OCH2COO-)4.2-4.4(5H，m，-CHCH2O-)；5.25(1H，m，CHCH2O-).。d)制備L-丙酰基肉堿溴化物與2-羥乙酰-1，3-二棕櫚酰甘油的酯(4)將預先在40℃真空干燥的L-丙酰基肉堿內鹽(0.95g，4.4mmol)懸浮在無水二甲基甲酰胺中(約20mL)。將產物(3)(3g，4.7mmol)分次小部分加入懸浮液中。將懸浮液緩慢加熱到38℃并保持此條件直至得到一種溶液。10分鐘后，使溶液達到0℃，保持30分鐘。得到一種沉淀，過濾，用乙酸乙酯洗滌并溶解在氯仿(100mL)中。將所得乳狀溶液(30mL)通過硅藻土過濾并濃縮。向后一溶液中加入己烷(100mL)，將得到的產品(4)的沉淀物過濾并在35℃真空干燥。得到3.19g標題化合物。產率80％。熔點＝127-128℃[α]25D＝-3.9(C＝1％氯仿)C47H88BrNO10的元素分析<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="859">C％H％N％Br％計算值62.239.781.548.81實測值62.7310.150.798.77</table></tables>H1NMR(CDCl3)0.9-0.95(6H，t，CH3CH2CH2-)；1.1-1.2(3H，t，CH3CH2CO)；1.2-1.4(24H，m，CH2n＝24)；1.5-1.6(4H，m，-OCCH2CH2-)；2.3-2.4(4H，t，-OCCH2CH2-)；2.4-2.45(4H，d.d.，-CHCH2O-)；2.95(2H，d，-CH2COOCH2COO-)；3.5(9H，s，N(CH3)3)；4.2(4H，m，-CH2OCOCH2-)；4.35(2H，m，-CH2N-)；4，65(2H，d，d，-OCH2CO-)；5.25(1H，m，-OCH2CHCH2O-)；5.75(1H，m，-CHCH2N-).例2-7按與上述實施例相同的方法制備下述化合物-L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST770)；-乙酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST771)；-異丁酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3二棕櫚酰基甘油的酯(ST773)；-異戊酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST774)；-L-肉堿溴化物與1，3-二己酰基-2-羥基乙酰基甘油的酯(ST810)；-乙酰基L-肉堿溴化物與1，3-二己酰基-2-羥基乙酰基甘油的酯(ST809)；-丙酰基L-肉堿溴化物與1，3-二己酰基-2-羥基乙酰基甘油的酯(ST808)；此處記載的本發明的一個優選的實施方案包括制備有抗癌藥物的脂質體，尤其是作為喜樹堿的載體的脂質體，如WO97/31003記載的。在一個進一步優選的實施方案中，本發明提供了具有通式(IV)的傳遞喜樹堿的脂質體其中R7是-C(R11)＝N-O(n)R10基團，其中R10是氫，或是直鏈或分支的C1-C5烷基或C1-C5烯基基團，或一個C3-C10環烷基基團，或一個直鏈或分支的(C3-C10)環烷基(C1-C5)烷基基團，或一個C6-C14芳基，或一個直鏈或分支的(C6-C14)芳基-C1-C5)烷基基團，或雜環或直鏈或分支的雜環-(C1-C5)烷基基團，所述的雜環基團含有至少一個選自氮原子和/或氧和/或硫的雜原子，氮原子可選地被(C1-C5)烷基基團取代；所述的烷基、烯基、環烷基、芳基、芳基-烷基、雜環或雜環-烷基基團可選地被其它基團取代，這些基團選自鹵素、羥基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR12R13，其中R12和R13可以相同或不同，它們可以是氫、直鏈或分支的(C1-C5)烷基、-COOH基團或其藥學上可接受的一種酯；或-CONR14R15基團，其中R14和R15，可以相同或不同，是氫、直鏈或分支的(C1-C5)烷基；或R10是C6-C10芳酰基，可選地被一或多個下述基團取代鹵素，羥基，直鏈或分支的C1-C5烷基，直鏈或分支的C1-C5烷氧基，苯基，氰基，硝基，-NR16R17，其中R16和R17，可以相同或不同，是氫，直鏈或分支的C1-C5烷基；R10是聚氨基烷基殘基；或R10是葡萄糖殘基；n是0或1；R11是氫，直鏈或分支的C1-C5烷基，直鏈或分支的C1-C5烯基，C3-C10環烷基，直鏈或分支的(C3-C10)環烷基-(C1-C5)烷基，C6-C14芳基，直鏈或分支的(C6-C14)芳基-(C1-C5)烷基；R8和R9，可以相同或不同，是氫、羥基、直鏈或分支的C1-C5烷氧基；它們的N1-氧化物，單一異構體，特別是-C(R11)＝N-O(n)R10基團的順反異構體，其可能的旋光對映體，非對映異構體和相關的混合物，它們的藥學可接受的鹽及其活性代謝物。1999年3月9日申請的歐洲專利申請99830124.6記載了式(IV)化合物。至于式(IV)化合物，其中n是1，R10的定義如上，芳酰基除外，可以從喜樹堿7-醛(式IVa，R11氫)或喜樹堿7-酮(式IVa，R11不是氫)制備這些化合物。其中R7是-C(R11)＝O基團，R11的定義如式(IV)，R8和R9的定義如式(IV)。式(IVa)化合物與式(Va)化合物R10O-NH2反應，其中R10如上所述，產生式(I)化合物，其中R7是-C(R11)＝N-O-R10基團，R10的定義如式(IV)，芳酰基除外。可以用本領域技術人員已知的常規方法進行此反應，此過程包括肟的正常生成。優選地，喜樹堿7-醛或7-酮與羥胺的比例應在1∶3-3∶1的范圍內。也可以使用相關的羥胺鹽。在有堿存在的條件下進行此反應，如無機堿，例如碳酸鉀，或一種有機堿，如三乙胺或或二氮雜雙環壬烷，使用極性溶劑，優選甲醇或乙醇，在從室溫至溶劑沸點溫度范圍內的溫度進行反應，可選地有脫水劑存在，如鈉或鎂的硫酸鹽，分子篩。如果需要，也可以在有催化劑如Lewis酸的條件下進行此反應。或者，可以從喜樹堿7-醛的肟(按Sawada等在《化學與藥學通報》39，2574(1991)記載的方法得到)，或喜樹堿7-酮的肟，或從相應的7-酰基喜樹堿，通過與一個R10-X鹵化物反應制備上述化合物，其中X優選碘，在極性溶劑如四氫呋喃或乙醇中，和在有堿如氫化鈉或碳酸鉀存在的條件下進行此反應。至于式(IV)化合物，其中n是1，R10是芳酰基，定義如式(IV)中所述，可以從喜樹堿7-肟制備這些化合物，在以上段落記載了其制備方法，用R10-COCl酰基氯化物，在極性溶劑中，在有堿存在的條件下，優選吡啶，或直接在吡啶中進行反應，方法如Cho等在《有機化學雜志》62，2230(1997)所記載。至于式(IV)化合物，其中n是0，并且R10的定義如上，芳酰基除外，可以從喜樹堿7-醛(式IVa，R11氫)或喜樹堿7-酮(式IVa，R11不是氫)制備此化合物。其中R7是-C(R11)＝O基團，R11如式(IV)的定義，R8和R9的定義如式(IV)中所定義。式(IVa)化合物與式(Vb)化合物R10-NH2反應，其中R10的定義如上，產生式(IV)化合物，其中R7是-C(R11)＝N-R10基團，R10的定義如式(IV)中所定義，芳酰基除外。可以用藥學領域技術人員已知的常規方法進行此反應，此過程包括正常形成亞胺。優選地，喜樹堿7-醛或7-酮與亞胺的摩爾比應在1∶3-3∶1的范圍。也可以使用相關的胺鹽。在有堿存在的條件下進行此反應，如一種無機堿，例如碳酸鉀，或一種有機堿，如三乙胺或二氮雜雙環壬烷，使用極性溶劑，優選甲醇或乙醇，在從室溫至溶劑沸點溫度范圍內的溫度進行反應，可選地有脫水劑存在，如鈉或鎂的硫酸鹽，分子篩。如果需要，也可以在有催化劑如Lewis酸的條件下進行此反應，如Moretti和Torre在《合成》，1970，141，或Kobayashi等在《Synlett》1977，115記載的。歐洲專利申請EP0056692和上述Sawada等在《化學與藥學通報》39，2574(1991)發表的文章記載了喜樹堿7-醛和喜樹堿7-肟。按已知的異芳香氮氧化法制備式(IV)化合物的N1氧化物，優選用醋酸或三氟醋酸和過氧化氫進行氧化，或通過與有機過氧化酸反應而進行(A.Albini和S.Pietra，《雜環N-氧化物》，CRC，1991).關于R10的不同的意義，在不同的式V試劑中有所不同，這些試劑可以由市售得到，或可以按文獻記載的方法制備，本領域的專家可以借助這些文獻，補充他們所擁有的此領域的知識。用文獻記載的常規方法可以得到藥學上可接受的鹽，這不需要進一步的描述。例87-芐氧基亞氨甲基喜樹堿(CPT172)500mg(1.33mmol)7-甲酰基喜樹堿溶解在100ml乙醇中。加入15ml吡啶和638mg(4mmol)O-芐基羥胺鹽酸鹽。將溶液回流5小時。真空蒸發溶劑，在硅膠上用快速色譜法(flashchromatography)純化得到的殘余物，洗脫劑為己烷與乙酸乙酯4∶6的混合物。產率65％熔點200-205℃。得到的產品含有順式和反式異構體比例為8∶2的混合物(異構體ARf0.32；異構體B，Rf0.19，使用Merck60F254硅膠；洗脫劑己烷∶乙酸乙酯為3∶7)。HPLC用安裝四元泵(quaternarypump)的儀器進行此分析(HP1050)，使用Rheodyne注射器(20μl回路)和二極管陣列檢測器(HP1050)，使用HPLC-ChemStation程序進行驅動。在200-600nm范圍內得到光譜，并在360和400nm記錄色譜。使用有RP18預柱的C18反向色譜柱(RaininC18；25×0.4cm，Varian)。線性洗脫梯度進行分析，從乙腈∶水＝30∶70開始在20分鐘內達到乙腈100％，流速為1ml/分鐘。保留時間為異構體B12.51分鐘，異構體A為14.48分鐘。1H-NMR(300MHz；DMSO-d6)δ0.88(t，H3-18A+H3-18B)，1.878m，(H2-19A+H2-19B)，5.18(s，H2-5B)，5.21(8s，H2-PhB)，5.30(H2-PhA)，5.40(s，H2-5A)，5.45(s，H2-17A+H2-17B)，6.53(s，-OHA+-OHB)，7.3-7.6(m，ArA+ArB+H-14A+H-14B)，7.75(m，H-11A+H-11B)，7.85-7-95(m，H-10A+H-10B)，7.98(dd，H-12B)，8.18-8.27(m，H-12A+H9-B)，8.45(s，CH＝NB)，8.59(dd，H-9A)，9.38(s，CH＝NA).Massm/z481(M+100)374(30)330(70)300(30)273(20)243(20)91(34).例97-丁氧基亞氨基甲基喜樹堿(CPT184)將400mg(1.06mmol)7-甲酰基喜樹堿溶解在80ml乙醇中。加入12ml砒啶和400mg(3.18mmol)O-t-丁基羥胺鹽酸鹽。溶液回流4小時。真空蒸發溶劑，在硅膠上用快速色譜法(flashchromatography)純化得到的殘余物，洗脫劑為己烷與乙酸乙酯4∶6的混合物。得到322mg(0.72mmol)黃色固體。產率68％熔點250℃。得到的產品含有順式和反式異構體比例為約8∶2的混合物(異構體ARf0.31；異構體B，Rf0.24，Merck60F254硅膠；洗脫劑己烷∶乙酸乙酯為3∶7)。HPLC用安裝四元泵的儀器進行此分析(HP1050)，使用Rheodyne注射器(20μl回路)和二極管陣列檢測器(HP1050)，使用HPLC-ChemStation程序進行驅動。在200-600nm范圍內得到光譜，并在360和400nm記錄色譜。使用有RP18預柱的C18反向色譜柱(RaininC18；25×0.4cm，Varian)。線性洗脫梯度進行分析，從乙腈∶水＝30∶70開始在20分鐘內達到乙腈100％，流速為1ml/分鐘。保留時間為異構體B12.92分鐘，異構體A為14.61分鐘。1H-NMR(300MHz；DMSO-d6)δ0.88(t，H3-18A+H3-18B)，1.30(s，t-but.B)，1.47(s，t-but.A)，1.87(m，H2-19A+H2-19B)，5.18(s，H2-5B)，5.37(H2-5A)，5.42(s，H2-17A+H2-17B)，6.54(s，-OHA+-OHB)，7.35(sH-14A)，7.36(s，H-14B)7.69-7.83(m，H-11A+H-11B)，7.85-7.98(m，H-10A+H-10B)，8.07(dd，H-9B)，8.16-8.27(m，H-9A+H-12B)8.40(s，CHB)，8.62(dd，H-12A)，9.31(s，CHA).Massm/z448(M+28)391(40)374(100)362(40)330(34)57(17).制備脂質體本發明的化合物可以用來制備多層脂質體(MLV)和單層脂質體(SUV)，可以是干粉狀或水溶液中的懸浮物。用本發明的化合物，如例1-7所制備的，按以下方法制備脂質體。將適宜量的化合物溶解在氯仿中；在旋轉蒸發器中將溶液真空濃縮至干，直至得到一層脂質膜。在高真空度下干燥脂質膜直至除去最后的殘余溶劑，然后將脂質膜溶解在叔丁醇或水中。將溶液冷凍干燥，得到一種柔軟的干燥粉末。用適宜量的水溶液將粉末水化，得到所用化合物的脂質體，然后與多核苷酸或所需的藥物復合。另一種制備脂質體的方法包括將一個脂質膜吸附在一個適宜的惰性載體如山梨醇、甘露醇或其他藥學可接受的碳水化物上，此脂質膜中包含一種溶解在溶劑中的本發明的化合物。將此混合物真空干燥，得到一種固體，在使用之前它可以方便而快速地水化。干燥粉末形式的制劑呈現長期穩定性方面的改善，并且易于使用。另外，可以按以下步驟用本發明的化合物制備干粉狀的與DNA或所需藥物復合的脂質體。將本發明的化合物溶解在叔丁醇或水中；將得到的溶液與DNA或所需藥物混合，將混合物冷凍干燥，得到一種柔軟的干燥粉末狀的復合物，我們將其定義為前脂質體-DNA或前脂質體-藥物。可以用得到的粉末(前脂質體)制備通過氣霧劑形式給藥的藥物組合物，或當其與水或適宜的緩沖溶液重組時，可以經胃腸外或口服給藥。也可以用上述方法通過將脂質膜吸附在惰性載體如山梨醇、甘露醇或其他碳水化物上，得到固體形式的與DNA或藥物復合的脂質體。測試脂質體的形成按以下步驟，使用水溶性染料，用比色法測定脂質體的形成。得到一種水溶性染料偶氮胂III的水溶液(m.w.＝776.37；2.3mg/mL)。用此溶液替代水以水化用上述方法得到的脂質膜。用水將一份含有包裹染料的脂質體的懸浮液稀釋100倍。使用2mL此脂質體懸浮液在660nm得到第一光學密度讀數；與定義為空白的相同的樣品進行比較得到讀數。將200μlCaCl2溶液(15mg/mL；100mM)加入第一樣品中，在660nm以空白為背景測定光密度，向其中加入200μl水。將所得的吸收值作為讀數2。向樣品中加入100μl三硝基甲苯X-100(5％v/v；0.26％終濃度)溶液，向空白中加入200μl水；在660nm得到的對應于光密度值的讀數定義為讀數3。用以下公式計算被包裹的染料的百分數被包裹染料的百分數提供了一個脂質體形成的測定尺度，其平均值為40％；用激光散射法檢測脂質體的體積，得到陽性結果。制備脂質體的實施例制備以下形式的棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯(ST983)a)冷凍干燥粉末在100mL燒瓶中將65mg，0.11mmol棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。蒸發溶液直至得到脂質膜，將其真空干燥3小時。將得到的產物溶解在叔丁醇中，用液氮將此溶液快速冷卻至-70℃并冷凍干燥24小時。得到海綿狀柔軟白色固體。b)吸附的粉末將143mg，0.231mmol棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在10mL氯仿中。將得到的溶液以小部分分次倒入含有750mg山梨醇的100mL燒瓶中。加完各部分氯仿溶液后，快速蒸發氯仿。將得到的固體真空干燥3小時。得到893mg白色固體產物。使用前，用適當體積的水將產物快速水化得到一等滲的溶液。c)MLV懸浮液在一100ML燒瓶中，將65mg，0.11mmol棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。將得到的溶液蒸發直至得到脂質膜，將其真空干燥3小時。在30℃用10mL水將脂質膜水化3小時，得到MLV懸浮液。將MLV懸浮液適當稀釋，與多核苷酸或藥物復合，進行生物測定。e)SUV懸浮液在100mL燒瓶中，將65mg，0.11mmol棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。將得到的溶液蒸發直至得到一脂質膜，將其真空干燥3小時。在30℃，用10mL水將得到的脂質膜水化3小時，得到MLV懸浮液。用孔徑為200nm的聚碳酸酯濾器將MLV懸浮液過濾10次。將如此得到的單層脂質體懸浮液與多核苷酸或藥物復合并進行生物測定。f)測定脂質體的物理穩定性用周期為30天的比濁法測定脂質體懸浮液的物理穩定性。每間隔一定時間，在600nm測定每個將被測試的懸浮液的吸收度。被測制劑在0時測得的平均吸收值保持不變。在考察期間內被考察的分子呈現一致的值。可以通過將本發明的化合物與助性脂質如膽固醇、1-棕櫚酰基-2-油酰基磷脂酰基膽堿(POPC)或二油基磷脂酰基膽堿(DOPE)結合制備MLV和SUV脂質體懸浮液。化合物與助性脂質結合以得到具有更穩定膜的脂質體。以下在記載脂質體制備的部分，給出了一個制備例，其中本發明的化合物與助性脂質如膽固醇或POPC結合。制備傳遞藥物的脂質體的實施例例10制備紫杉醇-ST983MLV脂質體(1∶40)將20mg，0.0234mmol紫杉醇和556mg，0.9417mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個脂質膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿，將20mL叔丁醇加入脂質膜中，將得到的溶液分成19份，立即用液氮將其在-70℃冷凍24小時。每份固體含有紫杉醇(1.05mg)和ST983(29.2mg)。為得到最終的脂質體懸浮液，在使用時將冷凍干燥產物用水(450μL)或其他鹽溶液水合，攪拌10分鐘，靜置30分鐘以完成膨脹(水合)過程。得到了MLV脂質體。測定制劑的物理穩定性用比濁法測定脂質體懸浮液的物理穩定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時間驅動曲線)記錄，溫度為20℃，測定時間為20小時。記錄了用于指示制劑穩定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現象。測定制劑中紫杉醇的化學穩定性用HPLC法測定紫杉醇的化學穩定性。色譜條件如下色譜柱μBondapackC-18洗脫劑乙腈∶水70∶30檢測器UV-VIS227nm流速1mL/分鐘保留時間4.5分鐘針對標準品，測得的紫杉醇的濃度為2.13mg/mL。被包裹的紫杉醇的濃度為98％。例11制備紫杉醇-ST983SUV脂質體將20mg，0.0234mmol紫杉醇和556mg，0.9417mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個脂質膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿，將20mL叔丁醇加入脂質膜中，將得到的溶液分成19份，立即用液氮將其在-70℃冷凍24小時。每份固體含有紫杉醇(1.05mg)和ST983(29.2mg)。為得到最終的SUV脂質體懸浮液，在0℃將已用PBS溶液(1mL)水合的冷凍干燥產物聲處理20分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測定制劑的物理穩定性。用比濁法測定脂質體懸浮液的物理穩定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時間驅動曲線)記錄，溫度為20℃，測定時間為20小時。記錄了用于指示制劑穩定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現象。測定制劑中紫杉醇的化學穩定性用HPLC法測定紫杉醇的化學穩定性。色譜條件如下色譜柱μBondapackC-18Eluent乙腈∶水70∶30檢測器UV-VIS227nm流速1mL/分鐘保留時間4.5分鐘對SUV脂質體懸浮液的HPLC分析產生與在同樣條件下相應的MLV脂質體懸浮液相同的結果，被包裹的紫杉醇的百分率為98％.24小時后重復進行HPLC分析，除紫杉醇峰外，沒有新峰出現，顯示了活性成分的穩定性。例12制備紫杉醇-ST983-膽固醇脂質體(1∶15)制備這些類型的脂質體以得到具有穩定膜的復合物。將6mg，0.0101mmol紫杉醇，62.2mg，0.105mmolST983和40mg膽固醇溶解在10mL氯仿中。濃縮所得溶液直至在燒瓶表面得到一個脂質膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將6.3mL叔丁醇加入脂質膜中，將得到的溶液分成5份，立即用液氮將其在-70℃冷凍24小時。每份固體含有紫杉醇(1.2mg)和ST983(12.44mg)和膽固醇(8mg)。為得到最終的脂質體懸浮液，在使用時將冷凍干燥產物用水(1000μL)或其他鹽溶液水合，攪拌10分鐘并靜置30分鐘以完成膨脹(水合)過程。得到MLV脂質體。測定制劑的物理穩定性用比濁法測定脂質體懸浮液的物理穩定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時間驅動曲線)記錄，溫度為20℃，測定時間為6小時。記錄了用于指示制劑穩定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現象。例13制備紫杉醇-ST772SUV脂質體(1∶70)將20mg，0.0234mmol紫杉醇和1485mg，1.638mmolST772溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個脂質膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將20mL叔丁醇加入脂質膜中。為得到澄清的溶液，必須將其加熱到60℃。立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時。為得到最終的SUV脂質體懸浮液，將已用PBS溶液(20mL)水合的冷凍干燥產物在0℃聲處理20分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測定制劑的物理穩定性。用比濁法測定制劑的物理穩定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時間驅動曲線)記錄，溫度為20℃，測定時間為6小時。記錄了用于指示制劑穩定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現象。例14制備CPT83-ST983MLV脂質體(1∶40)將6.3mg，0.0168mmolCPT83(7-腈喜樹堿，記載于WO97/31003)和400mg，0.667mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個脂質膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質膜中，將得到的溶液細分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時。每份固體含有CPT83(0.525mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的脂質體懸浮液，在使用時將冷凍干燥產品用水(1000μL)或其它鹽溶液水合，并攪拌10分鐘。得到MLV脂質體。測定制劑的物理穩定性。用比濁法測定制劑的物理穩定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時間驅動曲線)記錄，溫度為20℃，測定時間為20小時。記錄了用于指示制劑穩定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現象。測定制劑中CPT83的化學穩定性用HPLC法測定CPT83的化學穩定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時間4.033分鐘針對標準品測得的CPT83濃度為0.502mg/mL。被包裹的CPT83百分率為99％。例15制備CPT83-ST983SUV脂質體(1∶40)將6.3mg，0.0168mmolCPT83和400mg，0.667mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個脂質膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質膜中，將得到的溶液細分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時。每份固體含有CPT83(0.525mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的SUV脂質體懸浮液，將冷凍干燥產品用水(1000L)水合，并在0℃聲處理40分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測定制劑中CPT83的化學穩定性用HPLC法測定CPT83的化學穩定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時間4.033分鐘針對標準品測得的CPT83濃度為0.3mg/mL。被包裹的CPT83的百分率為59％。在24小時后重復進行HPLC分析，除CPT83峰外未顯示新的峰，表明了化合物的穩定性。測定制劑的物理穩定性用比濁法測定制劑的物理穩定性，使用在600nm測定的TDC(TimeDriveCurve時間驅動曲線)記錄，溫度為20℃，測定時間為20小時。記錄了用于指示制劑穩定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現象。例16制備CPT184-ST983MLV脂質體(1∶40)將7.29mg，0.0168mmolCPT184和400mg，0.677mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個脂質膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質膜中，將得到的溶液細分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時。每份固體含有CPT184(0.607mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的脂質體懸浮液，將冷凍干燥產品用水(1000μL)或其它鹽溶液水合，并攪拌10分鐘。得到MLV脂質體。測定制劑的物理穩定性用比濁法測定制劑的物理穩定性，使用在600nm測定的TDC(TimeDriveCurve時間驅動曲線)記錄，溫度為20℃，測定時間為20小時。記錄了用于指示制劑穩定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現象。測定制劑中CPT184的化學穩定性用HPLC法測定CPT184的化學穩定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時間25.5分鐘針對標準品，測得CPT184濃度為0.600mg/mL。包裹的CPT184百分率為99％。例17制備CPT184-ST983SUV脂質體(1∶40)將7.29mg，0.0168mmolCPT184和400mg，0.667mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個脂質膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質膜中，將得到的溶液細分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時。每份固體含有CPT184(0.607mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的SUV脂質體懸浮液，將冷凍干燥產品用水(1000L)水合，并在0℃聲處理40分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測定制劑中CPT184的化學穩定性用HPLC法測定CPT184的化學穩定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時間25.5分鐘針對標準品測得的CPT184濃度為0.36mg/mL。被包裹的CPT184的百分率為70％。在24小時后重復進行HPLC分析，除CPT184峰外未顯示新的峰，表明了活性成分的穩定性。測定制劑的物理穩定性用比濁法測定制劑的物理穩定性，使用在600nm測定的TDC(TimeDriveCurve時間驅動曲線)記錄，溫度為20℃，測定時間為20小時。記錄了用于指示制劑穩定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現象。在以下實施例中，使用助性脂質和/或低溫防護劑制備脂質體。例18制備CPT184-ST983脂質體在2L燒瓶中，向20mgCPT184和600mgST983中加入100ml甲基氯仿，并稍加熱直至完全溶解。在旋轉蒸發器中濃縮得到的溶液直至在燒瓶表面得到一個脂質膜，并在高效真空泵中干燥2小時。用乳糖溶液(6g/300ml水)在45℃將脂質膜水合，在一個旋轉蒸發器中攪拌2小時。然后將懸浮液聲處理2小時，每個周期持續半小時。隨后將產品通過200nm濾器過濾并冷凍干燥。測定制劑中CPT184的化學穩定性用HPLC法確定CPT184的化學穩定性。產品在實驗的24小時內穩定。測定制劑的物理穩定性用比濁法測定制劑的物理穩定性。在24小時的測定過程中，產品穩定。顆粒體積也是穩定的(平均值為100nm)。例19制備CPT184-ST983脂質體按以下步驟制備1ml脂質體(POPC-1-棕櫚酰基-2-油酰基磷脂酰基膽堿5mM；ST9831.25mM；CPT1840.25和海藻糖150mM)0.11mg，0.25μmolCPT184溶解在250μL乙酸乙酯中，3.79mg，4.89μmolPOPC溶解在100μL乙醇中，0.74mg，1.25μmolST983溶解在100μL乙醇中。將此三溶液混合在一起并旋轉蒸發。在室溫及80mbar的條件下用旋轉蒸發儀將溶劑蒸發除去。在暗處將脂質膜干燥2小時。將脂質膜懸浮在1ml的150mMD(+)海藻糖二水合物溶液中(Fluka，HPLC99％)，通過0.22nm濾器滅菌，并旋轉2分鐘。使懸浮液通過200nm聚碳酸酯濾器21次。將過濾后的脂質體懸浮液在液氮中冷凍，并冷凍干燥2夜。得到白色固體。例20制備CPT184-ST983脂質體使用例19的方法，不同的是使用500mM海藻糖。ST983脂質體-抗癌劑復合物的抗癌活性如下所述，ST983脂質體主要蓄積在肺部。此部位特異性使其在鼠科模型肺癌發生方面的應用具有優勢。此例中使用的抗癌劑是紫杉醇。為誘發體內腫瘤，未麻醉的Balb/c小鼠在右后爪的股四頭肌處接受注射0.1mlRPMI-1640(Sigma)，其中有3×105細胞的鼠肺癌M109。植入腫瘤10天后，用磷酸鹽-緩沖鹽溶液(PBS，SIGMA，P-4417)稀釋脂質體-紫杉醇復合物并以2.5mg/mLST983和75μg/mL紫杉醇的濃度靜脈注射。紫杉醇(paclitaxelINDENA)作為空白，以20mg/mL的濃度溶解在cremophor載體EL(BASF)中并在+4℃避光儲存另外24小時。使用時，用磷酸鹽-緩沖鹽溶液(PBS，SIGMA)稀釋并用和ST983脂質體輸送的紫杉醇相同的體積和濃度靜脈注射。按1∶1的比例用乙醇稀釋制備cremophor。從接種腫瘤后的第10天開始連續給藥7天。持續觀察動物直至接種后第17天，并脫頸椎處死動物，取出肺測定轉移瘤的數目。在5mlBouin’s溶液中將肺培養10天進行染色，以測定轉移瘤的數目，Bouin’s溶液中含有71％苦味酸飽和溶液、4.8％冰醋酸(Merck)，和24％的10％甲醛(Fluka)。在Bouin’s溶液中培養結束時，對轉移瘤計數。與未經處理的對照小鼠比較，由cremophor輸送的紫杉醇未顯示降低肺轉移瘤數目的效果，雖然后者小于未經處理的對照鼠，然而與ST983脂質體復合的紫杉醇顯示出降低肺轉移瘤數目和體積的顯著效果。用針對未配對數據的Mann-Whitney無參數試驗法對肺移植瘤數目進行數據統計學分析。所得結果示于以下表1。表1在BALB/c小鼠體內接種腫瘤M109和用紫杉醇及紫杉醇/脂質體ST983處理后第17天的肺轉移瘤M＝平均值(1-2mm直徑)S＝小(＜1mm直徑)體外細胞毒性試驗在96孔平板上測定對HeLa和M109細胞的毒性。鋪平板后，用所測定的分子對細胞再處理48小時。然后用PBS洗滌細胞，并將其置于正常的生長條件下48小時。除去生長介質后，在冰上用16％TCA培養細胞，在水中洗滌3次，用硫氰酸胺(sulforhodamine)B(SRB)在1％醋酸中的溶液處理細胞30分鐘，在單純的1％醋酸中洗滌細胞3次，在pH10.5的TRIS10mM中培養20分鐘，最后在540nm讀取讀數。測定CPT83的細胞毒性進行CPT83細胞毒性的體外測定以評價與脂質體復合的抗癌劑的細胞毒性，作為對有效活性的初步預測。使用上述硫氰酸胺B試驗評價在體外在M109細胞中脂質體輸送CPT83的能力。另外，也評價了溶解在二甲亞砜(DMSO)中的CPT83的細胞毒性，以與和ST983脂質體復合的相同分子的毒性進行比較。在細胞毒性測定中使用脂質體-CPT83復合物，其濃度示于以下表2.1，2.2和3.3，它是SUV和MLV構型。所用的摩爾比為脂質體∶CPT83＝40∶1。SUV和MLV構型的ST983-CPT83復合物的細胞毒性平均值示于表2.1，2.2和2.3，它提示ST983脂質體能以非常近似于DMSO的方式輸送CPT83，并顯示同樣數量等級的細胞毒性。表2.1ST983SUV-CPT83的細胞毒性(SRB)濃度單位為μM表中的值指在540nm的光密度讀數。表2.2ST983MLV-CPT83的細胞毒性(SRB)濃度單位為μM表中的值指在540nm的光密度讀數。表2.3DMSO-CPT83的細胞毒性(SRB)濃度單位為μM表中的值指在540nm的光密度讀數。ST983脂質體-CPT184復合物的生物活性測定例18脂質體(以下命名為脂質體A)和例20脂質體(以下命名為脂質體B)的生物活性。對健康小鼠的毒性按q4d×4(每日4次，給藥4天)的方案，以1.2mg/kg的劑量口服、靜脈注射脂質體A和B，與游離的CPT184相比較。兩種脂質體對體重、肺、脾和腎沒有顯著影響。靜脈注射脂質體B，口服脂質體A，與游離的CPT184相似，對胸腺產生影響。靜脈注射脂質體A僅有小的影響。24小時后兩種脂質體未使血液學參數顯示顯著的變化。，按qd5的方案靜脈注射脂質A顯示與游離的CPT184相似的毒性。脂質體的肺向性脂質體A和B顯示主要在肺水平聚集。靜脈注射1.2mg/kg劑量的脂質體。將溶解在DMSO中的游離CPT184以1.2mg/kg的劑量口服給藥。在最后一次給藥后24小時處死動物，即健康小鼠。從動物體取出肺在液氮中冷凍。當融化后，將組織匯集并在0.1％醋酸/乙腈溶液中1∶5均質化。將勻漿分成3份，2份加入CPT184測定回收率。在16,000g將3份樣品離心5分鐘。收集上清液并用二氯甲烷提取。用speedvac將有機相干燥，殘余物再次溶解在乙腈中以在50μL中含有相當于一只動物的量，在HPLC上加樣。在WatersSymmetryC183.5μm(4.6×7.5mm)上進行HPLC。使用在370nm激發和510nm發射的Merck熒光計作為檢測器。洗脫劑是水/乙腈60∶40，等度洗脫。樣品體積為50μL。CPT184的回收率約為70％。脂質體A和B的CPT184聚集水平高于DMSO中游離的CPT184，如圖3所示。基因傳遞制備脂質體-DNA復合物將脂質體和質粒DNA分別適當稀釋在PBS中。然后將DNA加到脂質體中，將脂質體DNA復合物在約4℃保持約30min以促進形成穩定的脂質體-DNA相互作用體。在體外試驗中，使用1，2-二油酰基氧-3-三甲基-銨丙烷(DOTAP)作為參考的陽離子脂質；每2×105HeLa細胞使用2.5μg質粒DNA，脂質體濃度為9μM。在體內試驗中，使用DOTAP和[2，3(二油酰基)丙基]三甲基銨(DOTMA)作為參考的陽離子脂質。結果中的摩爾比定義為每毫克NDA中各陽離子脂質的nmol濃度。在體內轉染試驗中，每只動物使用25μg質粒DNA。在這些試驗中使用的質粒pCMVluc含有受巨細胞病毒(CMV)啟動子轉錄控制的蟲螢光素酶基因cDNA。螢光素酶活性的定量測定用BoehringerMannheimkit(catno.1669893)方法測定細胞和組織內蛋白質螢光素酶活性。在PBS中洗滌細胞3次，然后從平板中移出，在溶胞緩沖液(lysisbuffer)(100mM磷酸鉀pH7.8.1mM二硫蘇糖醇-DTT)中散布成一層，然后進行3次連續的冷凍融化循環。在1.5mLEppendorf試管中離心后，上清液在提取蛋白質后5小時內進行發光試驗。用在562nm的發光計測定發射出的光。在液氮中首次冷凍后細細研磨得到粉末。將組織再次懸浮在溶胞緩沖液中，在冰中培養10-15分鐘。然后將樣品在2mlEppendorf試管中離心，測定上清液的熒光素酶活性。斑點印跡分析按Sanbrook，Fritsch和Maniatis在MolecularCloning(分子克隆)1989記載的堿性溶胞過程提取細胞DNA。使用Biorad斑點印跡裝置將從細胞中提取得到的5μgDNA預吸附在尼龍濾器(Boehringer)上。在65℃將這些濾器與含有0.5M焦磷酸鈉(NaPi)，1mMEDTA，7％SDS的溶液預雜交4小時。用質粒pCMVlucDNA作模板和隨機接觸過抗原的AmershamKit制備32P(α)標記的探針。使用1×106CPM/ml在42℃將濾器在同樣的預雜交緩沖液中雜交12小時。然后在65℃，在含有40mMNaPi，1％SDS的緩沖液中將濾器洗滌3次，每次10分鐘。借助磷光劑成像進行放射自顯影分析，使用由β射線活化的磷光屏(phosphorscreens)，借助與圖像分析程序結合的光電倍增管系統讀數和測量。使用IP-LabGel圖像分析程序在斑點印跡上進行的光密度法。質粒DNA轉染試驗在體內和體外進行了一些質粒DNA轉染試驗。使用DOTAP和DOTMA作為參考陽離子脂質，Abkenet等在《美國國家科學院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1993，90，6518充分表征和記載了其轉染效率。在體內試驗中，分析了陽離子脂質與質粒DNA各種不同的摩爾比，以測定各陽離子脂質的活性和各自對于基因轉移最有效的濃度。用pCMVluc質粒中含有的熒光素酶基因轉運體評價了各種脂質體體內和體外的轉染能力，即以用于快速定量的相對發光單位(RLU)(以上已敘述)表述的其活性。如上所述，作為一種選擇，通過對從預吸收在硝酸纖維素濾器上(斑點印跡)的轉染細胞中提取并與32P-標記的質粒DNA標記物雜交DNA樣品進行光密度分析(磷光劑成像)，評價了一些陽離子脂質體的轉染效率。體內轉染試驗體內轉染效率對ST983脂質體∶DNA摩爾比的依賴性在此試驗中，評價了肝、肺和心的轉染效率對ST983脂質體∶質粒DNA摩爾比的依賴性。對以下與每μgDNA對應的納摩爾(nmol)脂質體的比例12∶1，24∶1，36∶1和48∶1進行了測定。小鼠每組6只，體重約為20g，用分散在200μlPBS中的上述數量的脂質體-DNA復合物對其靜脈注射，在并在給予復合物24小時后處死。從肺、心和肝組織中提取的熒光素酶活性顯示了在所測定的所有摩爾比的情況下，熒光素酶主要在肺分布。實際上，從三種組織中提取得到的熒光素酶約99％分布在肺中。已證明最優的脂質體∶DNA摩爾比為12∶1。所得結果示于下表3。表3作為ST983∶DNA摩爾比(μgDNA)的函數的ST983體內轉染效率體內轉染效率對SRT983脂質體制劑之間的差異的依賴性將表示為相對發光單位(RLU)的熒光素酶活性值，報告于表4，所測試的蟲熒光素酶是從接受靜脈注射不同的ST983脂質體制劑的Balb/c小鼠的肺提取得到的，脂質體制劑中脂質體∶DNA的摩爾比例為12∶1。所得數據，除證明ST983脂質體能夠在體內轉運質粒DNAI，其效率高于和/或類似于DOTMA外，也顯示了在不同ST983制劑之間的一定程度的變異性。這可能是由于一些物理化學特性如脂質體囊的體積、或與不同的ST983制劑的單層(SUV)或多層結構相關的囊的有關性質造成的。實際上，R.I.Mahato等在《人類基因療法》9.19982083已充分說明了以上列出的物理化學參數，它們是達到最佳體內和體外轉染效率的決定因素。表4ST983的體內轉染效率(不同的制劑)<tablesid="table8"num="008"><tablewidth="733">脂質體平均RLU/mg蛋白質±s.d.肺ST983∶DNA摩爾比ST983/#72ST983/#73ST983/#4對照DOTMA3118235±35±8270671022117±604021523±983410125±18952012∶112∶112∶112∶1</table></tables>體內轉染效率對ST983-DNA脂質體復合物預培養時間的依賴性表5列出了從接受靜脈注射ST983脂質體的小鼠的肝、肺、心提取得到的相對發光單位，此脂質體在給藥前與質粒DNA預培養30分鐘或3小時。用與DNA預培養3小時的ST983處理的動物與用預培養30分鐘的相同脂質體處理的動物相比，在肺和心的熒光素酶活性方面顯示增長到5倍。此結果提示穩定的脂質體-DNA復合物的形成具有時間依賴性，并且在測定體內轉染效率方面具有關鍵的作用。表5ST983的體內轉染效率作為脂質體/DNA預培養時間的函數<tablesid="table9"num="009"><tablewidth="832">脂質體時間平均RLU/mg蛋白質±s.d.T983∶DNA摩爾比肝肺心ST983ST98330分鐘3h3526±2602497±682874882±659174225656±2117318118±26337100±185312∶112∶1</table></tables>ST772脂質體在HeLa細胞內的質粒DNA轉染圖1和2顯示ST772脂質體在HeLa細胞中的質粒DNA轉染效率。為此目的，從ST272轉染的細胞中提取DNA進行了光密度分析，用DOTAP作為對照陽離子脂質。斑點分析的結果顯示質粒DNA的數量與由DOTAP得到的結果在相同數量級。權利要求1.含有式(II)化合物的脂質體的用途，用于輸送藥物或有化妝品活性的物質，其中R3是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個碳原子的酰基鏈；R4是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個碳原子的烷基鏈；并且X-是藥理學可接受的酸的陰離子。2.根據權利要求1所述的用途，其中R3優選壬酰基、十二烷酰基、肉豆蔻酰基、棕櫚酰基、硬脂酰基或油酰基。3.根據權利要求1所述的用途，其中R4優選壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。4.根據權利要求2所述的用途，其中X-選自氯、溴、碘、門冬氨酸根、酸式門冬氨酸根、檸檬酸根、酸式檸檬酸根、酒石酸根、酸式酒石酸根、磷酸根、酸式磷酸根、延胡索酸根、酸式延胡索酸根、甘油磷酸根、葡萄糖磷酸根、乳酸根、順丁烯二酸根、酸式順丁烯二酸根、粘酸根、乳清酸根、草酸根、酸式草酸根、硫酸根、酸式硫酸根、三氯醋酸根、三氟醋酸根、甲磺酸根、雙羥萘酸根和酸式雙羥萘酸根。5.根據權利要求1-4任一項的用途，其中的化合物選自-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯；-硬脂酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯；-硬脂酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯；-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯；-肉豆蔻酰基L-肉堿氯化物十四烷基酯；-棕櫚酰基L-肉堿溴化物十六烷基酯；-油酰基L-肉堿氯化物油基酯.6.根據權利要求1所述的用途，其中所述的藥物選自抗癌劑、抗血管生成劑、抗病毒劑、抗細菌劑、抗真菌劑、抗原生動物劑，具有心血管系統活性的化合物，或免疫原性肽。7.根據權利要求6所述的用途，其中所述的藥物是抗癌劑或抗血管生成劑.8.根據權利要求7所述的用途，其中所述的抗癌劑選自紫杉醇或喜樹堿的衍生物。9.根據權利要求8所述的用途，其中所述的喜樹堿的衍生物選自-7-芐氧基亞氨甲基喜樹堿或-7-丁氧基亞氨基甲基喜樹堿。10.根據權利要求1所述的用途，其中脂質體還含有輔助性脂質。11.根據權利要求10所述的用途，其中的輔助性脂質選自膽固醇，1-棕櫚酰基-2-油酰基磷脂酰基膽堿或二油基磷脂酰基膽堿。12.含有根據權利要求1所述脂質體的組合物，用于輸送藥物或具有化妝品活性的物質。13.根據權利要求12的組合物，其中所述的藥物選自抗癌劑、抗血管生成劑、抗病毒劑、抗細菌劑、抗真菌劑、抗原生動物劑，具有心血管系統活性的藥物，或免疫原性肽。14.根據權利要求12或13的組合物，可以通過口服、腸道外、肌內、靜脈注射、皮下、透皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。全文摘要公開了L－肉堿和烷酰基L－肉堿的酯，它們可以作為陽離子脂質用于細胞內釋放藥理學的活性化合物。也公開了具有式(II)結構的L－肉堿和烷酰基L－肉堿的新酯，其中R基團的定義如說明書所述。文檔編號C07C229/00GK1823731SQ200510129598公開日2006年8月30日申請日期2000年4月11日優先權日1999年4月13日發明者C·匹薩諾,M·O·廷提,M·圣塔尼羅,L·克里泰利,G·薩爾瓦托利申請人:希格馬托制藥工業公司