專利名稱：海帶中l－褐藻糖的制備方法
技術領域：
本發明涉及精制單糖制備方法的改進及應用，特別是一種海帶中L-褐藻糖的制備方法，其屬于海帶深加工技術領域。
背景技術：
海帶，為一種大型食用褐藻類，大葉藻科植物大葉藻的全草(Laminaria japonicaAresch)，它屬于褐藻門(phaeophyta)、海帶目(laminariales)、海帶科(laminariceae)的海帶(laminaria)。該屬中有50多個種，世界上已廣泛食用的有四種海帶(Laminariajaponica aresch)、利尻海帶(L.ochotensis-Miy)、狹葉海帶(L.angustata kjellm)和長海帶(L.longissima Mijabe)。我國目前自然生長和人工養殖的是海帶(Laminariajaponica aresch)。在海藻工業發展初期，我國對海帶的綜合作用研究主要集中在碘、甘露醇、褐藻膠等的大宗提取物上。近年來，由于受化學合成及其它方法的影響，市場競爭激烈；同時，由于目前海帶加工工藝存在著耗水量大、耗能大、污染嚴重等問題，致使三大產品生產成本居高不下，導致許多海帶加工企業處于微利或虧損的邊緣。中科院海洋所徐祖洪、李智恩等利用原來生產碘、甘露醇、褐藻膠生產線所生產的廢渣、廢液提取褐藻多糖硫酸酯的成功(已申請了專利)，并已形成產業化，不僅有效解決了海帶加工業的環境污染問題，同時也大幅度降低了上述產品的生產成本，提高了海帶綜合工業的高附加值，促進了我國海藻工業及養殖業的進一步發展。在此基礎上的進一步制備L-褐藻糖，必將極大的提高上述行業產品的質量檔次，為海帶產業化建立完善的技術平臺，從而更好的綜合利用我國豐富的海帶資源，創造更大的經濟效益，是對海帶綜合工業的高附加值的有力促進。
L-褐藻糖(L-fucose)又名L-巖藻糖、6-脫氧-L-半乳糖，是一種以L-異構體天然存在的稀有糖類。在生物體內，L-褐藻糖主要存在于大多糖蛋白和糖酯等復合物糖苷鏈的非還原端及分子量較大的糖酯及血型抗原中。此外，還存在于某些微生物的胞外多糖(EPS)中，但它更多地存在于褐藻多糖硫酸酯中。褐藻多糖硫酸酯是褐藻細胞間的一種多糖，是褐藻細胞分泌產生的粘性物質，為褐藻利用光和營養所必需。其含量隨海藻種類、產地、季節和藻體部位的不同而不同。它的分子量相當大，分子結構非常復雜，主要由1，2-聯結的聚α-L-吡喃褐藻糖組成，平均每個單糖上有一個活性基團-硫酸酯，主要存在于C4的羥基位置上，少量在C3的羥基位置上。其次，它還伴隨有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、糖醛酸、鼠李糖及蛋白質等。
國內外大量研究發現單糖——L-褐藻糖在糖復合物的生理和生物學功能中起著重要作用，如其可抑制肺部腫瘤細胞的增生(即抗癌效應)、抑制白血細胞形成(即消炎作用)、治療風濕性關節炎及合成某些免疫抗原等等。現已有大量文獻報道癌癥患者血清蛋白中的L-褐藻糖含量較高是由于褐藻糖酰轉移酶高度活躍，這就說明細胞轉化作用(致癌作用)與L-巖藻糖代謝間存在某些聯系；在糖尿病患者血清中L-褐藻糖含量較高，說明它是抑制肌醇轉移的一種潛在抑制劑；腫瘤患者尿中游離的L-褐藻糖水平反應了糖復合物中糖鏈的代謝程度，在臨床上可以作為腫瘤標記。最近又發現L-褐藻糖可以促進人體纖維細胞的增生；可以作為抗自由基干擾的保護劑等。同時，鑒于L-褐藻糖的保濕潤膚作用及抗過敏效應也將其應用于化妝品方面。因此，L-褐藻糖在醫藥、化妝品等領域有廣闊的應用前景。此外，L-褐藻糖還是一種很重要的生化試劑，具有多方面的生物活性。它被廣泛用于化學分析、生物工程、細胞工程和糖工程等。現有技術中L-褐藻糖的制備方法有很多，如化學合成、微生物合成、酶合成及采用化學或酶水解含有L-褐藻糖的微生物胞外多糖(EPS)等等。其中，化學合成方法通常是由常見單糖如L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖等等通過一系列的化學反應轉化成L-褐藻糖，反應步驟繁瑣并且產率低，難以實現產業化生產；微生物合成法類似于化學合成，步驟繁瑣，產率低；酶合成方法目前尚未成熟，僅僅處于探索之中；含有L-褐藻糖的微生物胞外多糖(EPS)的化學或酶降解方法雖然為有效制備L-褐藻糖開辟了一條新途徑，但因涉及微生物多糖級分的高粘度性、菌鏈的選擇等等眾多因素，要高效制備褐藻糖，此方法尚需改進。而以褐藻為原料來制備L-褐藻糖的方法大致有兩種苯肼結晶法和乙醇結晶法。有人對從溝鹿角菜、墨角藻、泡葉藻中制備L-褐藻糖進行了研究。直到1966年有人又通過優化水解分離條件得到晶狀L-褐藻糖，但都因產品的純度和質量不高。其工藝不夠完善，難以被應用于工業化生產。經研究發現不同來源的褐藻多糖硫酸酯的化學組成含量及其單糖組分的摩爾比率有明顯的差異，其分析測定結果見表1，表2表1 不同來源的褐藻多糖硫酸酯的化學組成

表2 不同來源的褐藻多糖硫酸酯單糖組分的摩爾比率

研究結果表明從海帶提取的褐藻多糖硫酸酯的單糖組分主要是L-褐藻糖和D-半乳糖，而青島產海帶提取的褐藻多糖硫酸酯中的單糖組分比例為1.00∶0.36。與其它褐藻類海黍子、鼠尾藻等所含有的組分有顯著性差異。因此，從青島產海帶中分離出褐藻多糖硫酸酯，然后再用簡單的方法分離出L-褐藻糖是可行的。

發明內容
本發明的目的是要提高我國海帶綜合工業的高附加值，擴大海帶深加工技術，提供一種制備海帶中L-褐藻糖的制備方法，為確定其在醫藥領域的應用具有重要的理論意義和應用價值，對海帶資源的高值利用做出新的貢獻。
本發明需要解決的技術方案是研制了海帶中L-褐藻糖的制備方法，它是一種6-脫氧己糖類單糖的制備方法。
本發明是在提純的褐藻多糖硫酸酯基礎上進一步精制得海帶中L-褐藻糖。本發明以青島產海帶為原料，首先通過水提醇沉法提取出粗多糖，具體方法是把海帶切成細片后，用一定濃度的甲醛溶液浸泡過夜，然后添加蒸餾水沸水提取，硅藻土過濾，濾液透析，濃縮，75％乙醇沉淀，真空干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。將粗多糖重溶于水，在0.05mol/L MgCl2存在下20％乙醇沉淀，以除去水溶性褐藻膠，濾液透析，濃縮后用75％乙醇沉淀，真空干燥即可得到提純的褐藻多糖硫酸酯。
本發明的海帶中L-褐藻糖的制備方法是以海帶為原料，經水提醇沉法提取并純化得到提純的褐藻多糖硫酸酯；再按如下精制步驟1)取一定量的提純褐藻多糖硫酸酯加水再加酸進行水解反應，按該多糖與水、濃酸的重量比例1∶40-80∶1.96--19.6加水再加酸，輕沸回流水解時間為3-4小時；2)水解液冷卻后，用碳酸鋇中和至pH7±0.2，過濾，去除沉淀；3)將2)步所得的濾液通過732強酸陽離子樹脂柱，收集流出液，去除K、Na.Ca、Mg等無機鹽，然后用該濾液0.5-1體積倍的蒸餾水洗滌，收集合并流出液和洗滌液為陽樹脂流份；4)將適量的IRA-67弱堿陰離子樹脂加入到3)步所得的陽樹脂流份中，不間斷攪拌，觀察pH值至終點，分離該陰離子樹脂去除糖醛酸及硫酸基；再用該分離液0.05-0.1體積倍的蒸餾水洗滌該陰離子樹脂；收集合并分離液和洗滌液為陰樹脂流份；5)將4)步所得的陰樹脂流份真空濃縮至原體積的1/100，再按該濃縮液與95％的乙醇的體積比1∶10-20加入95％乙醇，過濾，除去沉淀；將該濾液再真空濃縮至原體積的1/150的糖漿狀；6)將5)步所得的糖漿，溶于50-100體積倍的無水乙醇中，過濾，除去沉淀；該濾液再真空濃縮至原體積的1/100糖漿狀；7)將6)步所得的糖漿，溶于50-100體積倍的蒸餾水中，并加入該蒸餾水重量的0.04-0.07倍的活性炭，煮沸30分鐘，不停攪拌，然后趁熱硅藻土過濾，濾液再真空濃縮至原體積的1/100的糖漿狀；8)將7)步所得到的糖漿轉移至稱量瓶中，加入該糖漿體積的5.0-10.0倍的無水乙醇溶解該糖漿，然后加入該糖漿體積的2.0-4.0倍的丙酮，過濾，棄去濾出物；9)將8)步所得的濾液，按重量投種比0.5‰投入標準L-褐藻糖晶種，置于5℃的冰箱中，3-7天后結晶，過濾，濾液仍置于冰箱中，以待進一步結晶，取濾出結晶物用無水乙醇洗滌2次，再真空干燥，即得粗制的L-褐藻糖晶體混合物；10)由于9)步所得的粗制L-褐藻糖尚含有18.9-21.7％的半乳糖，需將粗制褐藻糖晶體混合物中加入50～60倍體積的甲醇-丙酮混合溶液，其中甲醇-丙酮體積比為9∶5；在5℃溶解5～8小時，不斷攪動，使L-褐藻糖較多地溶出；11)將10)步所得的混合液過濾，取濾液，在55℃～60℃真空濃縮至原體積的1/90的糖漿狀，12)將11)步所得的糖漿加入到5.0-10.0倍體積的無水乙醇中溶解，再按重量投種比5‰投入標準L-褐藻糖晶種，置于5℃的冰箱中3～7天后，過濾，真空干燥，即得純度高的L-褐藻糖晶體；所得L-褐藻糖晶體的產率為16.2％～17.0％。
所述的水解反應，其反應溫度為100℃-110℃。
所述的3)步的732強酸陽離子樹脂柱規格為Φ3.5×54～60cm；所述的濾液過樹脂柱的流速為1～2倍樹脂柱體積/小時；所述的洗滌液過樹脂柱的流速為1～2倍樹脂柱體積/小時；該濾液和洗滌液過樹脂柱的總時間2～4小時，即可達到脫鹽的目的。
所述的4)步中的觀察終點為pH7±0.2。
所述的5)，6)，7)，11)步中真空濃縮的工藝技術條件為真空度控制在0.09～0.1MPa，控制溫度為55～60℃，真空濃縮3～4小時。
本發明的優點在于由于本發明的1)步將10g的褐藻多糖硫酸酯置于配有攪拌器、恒溫溫度計及冷凝管的三口瓶中，加入800ml水用硫酸調至0.25mol/L，在100℃-110℃輕沸回流水解4小時；使得褐藻多糖硫酸酯中的單糖組分L-褐藻糖和D-半乳糖在輕沸回流中，得以分解游離出來。由于青島產海帶提取的褐藻多糖硫酸酯中的單糖組分比例為1.00∶0.36。與其它褐藻類海黍子、鼠尾藻等所含有的組分有顯著性差異。這樣，本發明以青島產海帶為原料制備L-褐藻糖方法，其工藝簡單，分解的L-褐藻糖產品的純度和產率較高。又由于確定了濾液同過樹脂柱的合適的流速為1～2倍樹脂柱體積/小時；和確定了洗滌液過樹脂柱的合適的流速為1～2倍樹脂柱體積/小時；該濾液和洗滌液過樹脂柱的總時間2～4小時，使得分解游離出來的L-褐藻糖與金屬鹽離子徹底脫離，達到脫鹽的目的，提高了L-褐藻糖產品的純度。由于確定了5)，6)，7)，11)步中真空濃縮的工藝技術條件為真空度控制在0.09～0.1MPa，控制溫度為55～60℃，真空濃縮3～4小時；使得L-褐藻糖產品的質量和產率都較高。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明的內容詳細說明；實施例1取青島產海帶為原料，經水提醇沉法提取并純化得到提純的褐藻多糖硫酸酯；再按如下精制步驟1)取一定量的提純褐藻多糖硫酸酯加水再加酸進行水解反應，按該多糖與水、濃酸的重量比例1∶80∶19.6加水再加酸，在100℃-110℃輕沸回流水解4小時；2)水解液冷卻后，用碳酸鋇中和至pH7±0.2，過濾，去除沉淀；3)將2)步所得的濾液通過732強酸陽離子樹脂柱，收集流出液，去除K、Na.Ca、Mg等無機鹽，然后用該濾液1體積倍的蒸餾水洗滌，收集合并流出液和洗滌液為陽樹脂流份；4)將適量的IRA-67弱堿陰離子樹脂加入到3)步所得的陽樹脂流份中，不間斷攪拌，觀察pH值至終點，分離該陰離子樹脂去除糖醛酸及硫酸基；再用該分離液0.1體積倍的蒸餾水洗滌該陰離子樹脂；收集合并分離液和洗滌液為陰樹脂流份；5)將4)步所得的陰樹脂流份真空濃縮至原體積的1/100，再按該濃縮液與95％的乙醇的體積比1∶20加入95％乙醇，過濾，除去沉淀；將該濾液再真空濃縮至原體積的1/150的糖漿狀；6)將5)步所得的糖漿，溶于80體積倍的無水乙醇中，過濾，除去沉淀；該濾液再真空濃縮至原體積的1/100糖漿狀；7)將6)步所得的糖漿，溶于100體積倍的蒸餾水中，并加入該蒸餾水重量的0.07倍的活性炭，煮沸30分鐘，不停攪拌，然后趁熱硅藻土過濾，濾液再真空濃縮至原體積的1/100的糖漿狀；8)將7)步所得到的糖漿轉移至稱量瓶中，加入該糖漿體積的10.0倍的無水乙醇溶解該糖漿，然后加入該糖漿體積的4.0倍的丙酮，加入的適量無水乙醇使糖漿溶解，又加入丙酮，如生成白色絮狀物，需過濾，棄去濾出物；
9)將8)步所得的濾液，按重量投種比0.5‰投入標準L-褐藻糖晶種，置于5℃的冰箱中，3-7天后結晶，過濾，濾液仍置于冰箱中，以待進一步結晶，取濾出結晶物用無水乙醇洗滌2次，再真空干燥，即得粗制的L-褐藻糖晶體混合物；10)由于9)步所得的粗制L-褐藻糖尚含有18.9-21.7％的半乳糖，需將粗制褐藻糖晶體混合物中加入55倍體積的甲醇-丙酮混合溶液，其中甲醇-丙酮體積比為9∶5；在5℃溶解5～8小時，不斷攪動，使L-褐藻糖較多地溶出；11)將10)步所得的混合液過濾，取濾液，在55℃～60℃真空濃縮至原體積的1/90的糖漿狀；12)將11)步所得的糖漿加入到10.0倍體積的無水乙醇中溶解，再按重量投種比5‰投入標準L-褐藻糖晶種，置于5℃的冰箱中3～7天后，過濾，真空干燥，即得純度高的L-褐藻糖晶體所得單糖產率為16.2％，溶點為135℃-137℃，比旋光度為[α]D20為-76.9。
實施例2取褐藻多糖硫酸酯10g置于配有攪拌器、恒溫溫度計及冷凝管的三口瓶中，加入400ml水用硫酸調至0.5mol/L，在100℃輕沸回流水解4小時。其余條件同實施例1。
實施例3按褐藻多糖硫酸酯樣品與硫酸重量比例為10∶1.96，取一定量的褐藻多糖硫酸酯樣品置于安培管中，封管水解3小時，其余條件同實施例1。
本領域的普通技術人員都會理解，在本發明的保護范圍內，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發明的保護范圍。
權利要求
1.海帶中L-褐藻糖的制備方法，它是一種6-脫氧己糖類單糖的制備方法，其特征在于所述的制備方法是以海帶為原料，經水提醇沉法提取并純化得到提純的褐藻多糖硫酸酯；再按如下精制步驟1)取一定量的提純褐藻多糖硫酸酯加水再加酸進行水解反應，按該多糖與水、濃酸的重量比例1∶40-80∶1.96--19.6加水再加酸，輕沸回流水解時間為3-4小時；2)水解液冷卻后，用碳酸鋇中和至pH7±0.2，過濾，去除沉淀；3)將2)步所得的濾液通過732強酸陽離子樹脂柱，收集流出液，去除K、Na.Ca、Mg等無機鹽，然后用該濾液0.5-1體積倍的蒸餾水洗滌，收集合并流出液和洗滌液為陽樹脂流份；4)將適量的IRA-67弱堿陰離子樹脂加入到3)步所得的陽樹脂流份中，不間斷攪拌，觀察pH值至終點，分離該陰離子樹脂去除糖醛酸及硫酸基；再用該分離液0.05-0.1體積倍的蒸餾水洗滌該陰離子樹脂；收集合并分離液和洗滌液為陰樹脂流份；5)將4)步所得的陰樹脂流份真空濃縮至原體積的1/100，再按該濃縮液與95％的乙醇的體積比1∶10-20加入95％乙醇，過濾，除去沉淀；將該濾液再真空濃縮至原體積的1/150的糖漿狀；6)將5)步所得的糖漿，溶于50-100體積倍的無水乙醇中，過濾，除去沉淀；該濾液再真空濃縮至原體積的1/100糖漿狀；7)將6)步所得的糖漿，溶于50-100體積倍的蒸餾水中，并加入該蒸餾水重量的0.04-0.07倍的活性炭，煮沸30分鐘，不停攪拌，然后趁熱硅藻土過濾，濾液再真空濃縮至原體積的1/100的糖漿狀；8)將7)步所得到的糖漿轉移至稱量瓶中，加入該糖漿體積的5.0-10.0倍的無水乙醇溶解該糖漿，然后加入該糖漿體積的2.0-4.0倍的丙酮，過濾，棄去濾出物；9)將8)步所得的濾液，按重量投種比0.5‰投入標準L-褐藻糖晶種，置于5℃的冰箱中，3-7天后結晶，過濾，濾液仍置于冰箱中，以待進一步結晶，取濾出結晶物用無水乙醇洗滌2次，再真空干燥，即得粗制的L-褐藻糖晶體混合物；10)由于9)步所得的粗制L-褐藻糖尚含有18.9-21.7％的半乳糖，需將粗制褐藻糖晶體混合物中加入50～60倍體積的甲醇-丙酮混合溶液，其中甲醇-丙酮體積比為9∶5；在5℃溶解5～8小時，不斷攪動，使L-褐藻糖較多地溶出；11)將10)步所得的混合液過濾，取濾液，在55℃～60℃真空濃縮至原體積的1/90的糖漿狀，12)將11)步所得的糖漿加入到5.0-10.0倍體積的無水乙醇中溶解，再按重量投種比5‰投入標準L-褐藻糖晶種，置于5℃的冰箱中3～7天后，過濾，真空干燥，即得純度高的L-褐藻糖晶體；所得L-褐藻糖晶體的產率為16.2％～17.0％。
2.根據權利要求1所述海帶中L-褐藻糖的制備方法，其特征在于所述的水解反應，其反應溫度為100℃-110℃。
3.根據權利要求1所述海帶中L-褐藻糖的制備方法，其特征在于所述的3)步的732強酸陽離子樹脂柱規格為Φ3.5×54～60cm；所述的濾液過樹脂柱的流速為1～2倍樹脂柱體積/小時；所述的洗滌液過樹脂柱的流速為1～2倍樹脂柱體積/小時；該濾液和洗滌液過樹脂柱的總時間2～4小時，即可達到脫鹽的目的。
4.根據權利要求1所述海帶中L-褐藻糖的制備方法，其特征在于所述的4)步中的觀察終點為pH7±0.2。
5.根據權利要求1所述海帶中L-褐藻糖的制備方法，其特征在于所述的5)，6)，7)，11)步中真空濃縮的工藝技術條件為真空度控制在0.09～0.1MPa，控制溫度為55～60℃，真空濃縮3～4小時。
全文摘要
本發明是一種以青島產海帶為原料制備L－褐藻糖的簡單方法，是經水提醇沉法提取并純化得到提純的褐藻多糖硫酸酯；再經如下步驟硫酸水解，過濾，濾液上柱脫鹽，除酸脫色，過濾，濾液真空旋轉濃縮，乙醇沉淀，濾液真空旋轉濃縮至糖漿，乙醇沉淀，濾液真空旋轉濃縮至糖漿，加入適量的乙醇和丙酮的混合物，加入數粒L－褐藻糖標準接種，結晶。本發明的L－褐藻糖制備方法工藝簡單，分解制得的L－褐藻糖產品的純度為98.1％，產率為16.2％～17.0％。為確定其在醫藥領域的應用具有重要的理論意義和應用價值，L－褐藻糖制備方法對我國海帶資源的高值利用做出新的貢獻。
文檔編號C07H1/00GK1670028SQ20041007571
公開日2005年9月21日 申請日期2004年12月31日 優先權日2004年12月31日
發明者徐祖洪, 趙增芹, 張全斌, 牛錫珍, 張虹, 李智恩 申請人:中國科學院海洋研究所