專利名稱：：活化凝血酶原的蛋白的制作方法
技術領域：
：本發明涉及新的蛇毒蛋白酶多肽及其編碼核酸序列。本發明還涉及制備和使用該蛇毒蛋白酶的方法，例如，在如手術過程中促進止血和預防血液流失，或者用于治療意外事故以及其它類型損傷或創傷導致的傷口。
背景技術：
：止血，通常是指血液凝血或血液凝塊，是創傷或損傷時防止血液過量流失的重要生物學反應。這種控制哺乳動物止血的生化級聯反應已被研究得很透徹。該途徑中的一個關鍵步驟是通過凝血酶原酶復合物活化凝血酶原產生凝血酶，然后凝血酶活化因子XIIIa，因子XIIIa與血纖蛋白發生交聯形成穩定的血凝塊(Stubbs&Bode，1994，Curr.Opin.Struct.Biol.4823-32)。在哺乳動物體內，所述凝血酶原激活劑復合物通常由在鈣離子存在的條件下形成于磷脂膜上的絲氨酸蛋白酶因子Xa和輔因子Va組成(Suttie&Jackson，1977，Physiol.Rev.571)。所述哺乳動物凝血酶原酶復合物由輔因子即因子Va和絲氨酸蛋白酶即因子Xa組成。因子Xa單獨活化凝血酶原的速度很慢，但是，在輔助蛋白包括非酶輔因子因子Va、鈣離子(Ca2+)和磷脂存在下，凝血酶原活化的速度提高了很多倍。在體內，因子Xa通過γ-羧基谷氨酸殘基結合血小板的磷脂膜，并優先切割凝血酶中的Arg274-Thr275鍵隨后切割Arg323-Ile324鍵而生成凝血酶。由于在外科手術過程中或損傷或創傷后控制血液流失有著重要的意義，所以，能夠促進血液凝塊或抑制血凝塊溶解(例如通過溶解血纖蛋白的纖溶酶/纖溶酶原途徑；Royston等，1990，BloodCoagul.fibrinol.153；Orchard等，1993，Br.J.Haematol.85596)的調節因子的鑒定已經成為研究的焦點。具體而言，蛇毒已經成為哺乳動物外科手術、創傷中血液流失時阻止血纖蛋白溶解或促進血液凝塊的蛋白質的有效來源。例如，現已經從澳大利亞常見的棕蛇Pseudonajatextilis的蛇毒中分離出了血纖蛋白溶解的抑制劑(國際公開WO99/58569)。就蛇毒-來源的凝血酶原活化劑而言，也可參考中國專利1298017，該專利公開了分離自太攀蛇Oxyuranusscutellatus蛇毒的凝血酶原活化劑凝血酶原活化酶(命名為Os-II)和活化的因子Xa。中國的研究小組提出例如傷口流血時為了促進止血，最好在加入因子Xa前1小時添加Os-II從而活化凝血酶原。他們指出這兩者的同時作用能活化凝血酶原并提高凝血酶的產量。也可參見Joseph等，1999，Blood94621，該文獻公開了一種分離自澳大利亞粗鱗蛇(Tropidechiscarinatus)蛇毒的因子Xa-樣凝血酶原活化劑(trocarin)。Trocarin形成凝血酶原活化劑復合物，在磷脂、因子Va和鈣離子存在下，該復合物能在體外催化凝血酶原形成凝血酶。目前，使用牛或人來源血液制品成分代替各種因子，用來在哺乳動物外科手術、創傷中血液流失時阻止血纖蛋白溶解或促進血液凝塊。但是，使用牛或人來源的血液制品成分可能會使患者受到病毒污染及其它有害事件的威脅。發明概述本發明部分上以凝血酶原活化的多肽的發現為基礎，該多肽在本申請中稱為“蛇毒蛋白酶或SVP’s”，是因子非依賴性的。蛇毒蛋白酶具有與因子Xa和trocarin的氨基酸序列類似的氨基酸序列，因子Xa和trocarin是凝血酶原活化劑，它們在活化時需要鈣、磷脂及因子Va的參與。但是，本發明的蛇毒蛋白酶是完全或部分完全的凝血酶原活化劑，因此不需要人因子Xa或trocarin活化劑所需的輔因子。換句話說，它們能在無鈣、磷脂和/或因子Va等輔因子存在下處理凝血酶原生成凝血酶。例如，來自棕蛇、海岸太攀蛇和兇猛太攀蛇蛇毒的蛇毒蛋白酶是完全的凝血酶原因子，因為它們能在無鈣、磷脂和/或因子Va存在下，處理凝血酶原生成凝血酶凝血酶。這些SVP’s顯示包含一個內部結構域，即圖23中第292-305位殘基，這一結構域使得它們無須依賴宿主提供的因子Va。來自紅腹蛇、虎蛇和粗鱗蛇的蛇毒蛋白酶是部分完全凝血酶原活化劑，因為它們能在無鈣和磷脂存在下處理凝血酶原，但是需要有因子Va的存在。此外，本發明優選的SVP’s能切割去羧基凝血酶原，去羧基凝血酶原是人因子X的不良(poor)底物。因此，一個方面，本發明涉及蛇毒蛋白酶多肽，及其生物活性或抗原性片段，它們是完全或部分完全凝血酶原活化劑，可以用作例如促進凝血的試劑。另一方面，本發明提供了具有活化凝血酶原的活性的蛇毒蛋白酶多肽。一個實施方案中，所述蛇毒蛋白酶包括一個或多個輕鏈和重鏈或其生物活性片段。優選的輕和重鏈蛋白在長度上等同或非常類似于(例如有1或2個殘基的差別)其天然存在形式。另一實施方案中，所述蛇毒蛋白酶包括原肽、輕鏈、活化肽和重鏈。所有的處理中間體，無論是否天然存在，都在本發明的范圍之內。因此，在另一實施方案中，本發明的蛇毒蛋白酶多肽包括輕鏈、活化肽和重鏈。優選的實施方案包括輕鏈和重鏈，其中的原肽結構域和一或多種活化肽已經被切去。純化制劑可以包括或具有切割后的原肽結構域和純化掉的切割片段(cleavagefragmentspurifiedaway)。一個優選實施方案中，活化SVP的完全或部分完全凝血酶原包括一個或多個以及一些情況下包括所有下列結構域(編號與指圖23中的編號一致)第一或原肽結構域，對應于圖23中第1-40位殘基。優選實施方案中，該結構域與圖23列出5個序列中任一個的相應結構域之間具有至少31、40、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。優選的活性產物當然不含有原肽結構域。一些情況下，期望修飾蛇原肽結構域使其與人X之間更為相似，或者用人原肽結構域取代蛇原肽結構域。除了紅腹黑蛇中V→E的單個氨基酸改變之外，原肽結構域在所有6種蛇中100％保守。與人相應序列比較發現相同的殘基數為12/40(30％同一性)。保守殘基中的大部分是疏水的；位于圖23中第40-41位殘基之間的輕鏈切割位點；對應于圖23中第41-85位殘基的結構域。該結構域在功能上類似于人因子X的GLA(γ-羧基谷氨酸)結構域。優選實施方案中，該結構域與圖23列出6個序列中任一個的相應結構域之間具有至少71、75、80、85、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。一些實施方案中，可取地保留該區域中的11個谷氨酸殘基中的一個或多個。這些殘基中的10個在人因子X序列與所有6種蛇序列之間保留，包括46/47，54，56，59/6065/66，69，72。值得注意的是在人序列中第79位也是γ-羧基化的，圖23所有6種蛇序列另外在第76和78位殘基還有2個潛在殘基。許多實施方案中，該區域的起始殘基就是產物的輕鏈的起始位點。一個優選實施方案中，該區域與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少85％的序列同一性；對應于圖23中第86-122位殘基的結構域。該結構域在功能上類似于人因子X的EGF結構域。優選實施方案中，該結構域與圖23列出6個序列中任一個的相應結構域之間具有至少71、75、80、85、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。與蛇共有序列的同一性為25/37。該結構域與人序列之間具有70％的同一性。一個優選實施方案中，該結構域與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少70％的序列同一性；對應于圖23中6種蛇序列中任一種的第123-165位殘基的結構域。該結構域在功能上類似于人因子X的第二EGF結構域。優選實施方案中，該結構域與圖23列出的6個序列中任一個的相應結構域之間具有至少36、50、75、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。與蛇共有序列的同一性為15/43。該結構域與人序列之間具有35％的同一性。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少50％的序列同一性；對應于圖23中6種蛇序列中的第166-179位殘基的結構域。優選實施方案中，該結構域與圖23列出6個序列中任一個的相應結構域之間具有至少75、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。一個優選實施方案中，該結構域與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少70％的序列同一性；對應于圖23中第180-182位殘基的結構域。優選實施方案中，該結構域與圖23列出的6序列中的任一序列之間可以具有至少1、2或3個相同的殘基。優選地該結構域不出現于活性產物中。對應于圖23中第183-209位殘基的結構域。該結構域在功能上類似于人因子X中的活性肽。優選實施方案中，該結構域與圖23列出6個序列中任一個的相應結構域之間具有至少17、50、75、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。與蛇共有序列的同一性為8/51。該結構域與人序列之間具有16％的同一性。該結構域是處理蛋白酶的輕鏈和重鏈時被切去的那個區域，并優選不出現于活性產物中。對于人因子X該結構域長51個氨基酸，對于每一種蛇該結構域長27個氨基酸。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少50％的序列同一性；對應于圖23中第210-467位(就棕蛇、海岸太攀蛇、兇猛太攀蛇或紅腹黑蛇而言)或第210-456位殘基(就虎蛇或粗鱗蛇而言)的重鏈結構域。該結構域在功能上類似于人因子X中的重鏈。優選實施方案中，該結構域與圖23列出6個序列中任一個的相應結構域之間具有至少50、75、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。該結構域與蛇共有序列的同一性為135/268，與人序列之間具有50％的同一性。人因子X的催化結構域含有重要的活性位點三聯體H236、D282和S379。這3個殘基在所有6種蛇中都保留，如圖23中的H251，D309和S406，并且它們在本發明的SVP’s的優選實施方案中保留。第292-305位氨基酸提供因子Va樣活性，或與序列292-305之間不同殘基數不超過1、2、3、4或5個的序列應該出現于完全SVP’s中。一個優選實施方案中，該結構域與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少75％的序列同一性。如上所述，一個優選實施方案包括完全處理后的輕鏈和重鏈的二聚體分子，該分子是從原肽結構域和活化或切割結構域中切割而來。優選實施方案中，所述輕鏈包括輕鏈的第57和62位、第90和101位、第95和110位、第112和121位、第129和140位、和/或第151和164位殘基間的鏈內Cys-Cys鍵，重鏈的第216和221、第236和252、第377和391，和/或第402和430位殘基間的鏈內Cys-Cys鍵，以及輕鏈第172位殘基與重鏈第329位殘基間的鏈間Cys-Cys鍵。優選實施方案中，所述SVP是一種完全或部分完全凝血酶原活化劑，因而能在無輔因子存在下，表現出比不完全活化因子例如人因子X或trocarin明顯高的活性。優選地，所述完全或部分完全凝血酶原活化劑的活性比單獨的不完全活化劑例如人因子X或trocarin的活性高至少1.5，2，4，10，15，20，50，或100倍(兩個數量級)。這一比較結果是在相同或近似條件下例如無Ca和磷脂存在下，對蛇毒蛋白酶和不完全活化劑進行測定得出的。優選實施方案中，完全或部分完全活化劑活性的％(即完全或部分完全活化劑在無Ca和磷脂存在下的活性與該活化劑在有Ca和磷脂存在下的活性之間的％)比不完全活化劑例如人因子X或trocarin表現的相應％高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000或4000倍。優選的完全或部分完全活化劑在約10-10～10-06M，例如10-8或10-7M濃度下能使檸檬酸化血漿凝塊，凝快時間約50-15秒，這表明其是Ca2+和磷脂非依賴性的。因此，所述凝血酶原活化劑在約10-10～10-06M濃度的范圍內，表現輔因子(鈣離子和/或磷脂)非依賴性的動力學特性，這是一個適于減少血液流失的工作范圍。一個優選實施方案中，活化SVP的完全或部分完全凝血酶原包括一個或多個以及一些情況下包括所有下列結構域(編號參照圖22中的共有編號)第一或原肽結構域，對應于圖22中5種蛇序列的第1-40位殘基(或兇猛太攀蛇的相應序列)。優選實施方案中，該結構域與圖22列出5個序列中任一個的相應結構域(或兇猛太攀蛇的相應序列)之間具有至少31、40、80、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。優選的活性產物當然不含有原肽結構域；對應于圖22中5種蛇序列的第41-120位殘基(或兇猛太攀蛇的相應序列)的結構域，該結構域與圖22列出5個序列中任一個的相應結構域(或兇猛太攀蛇的相應序列)之間具有至少67、90、95或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少90％的序列同一性。對應于圖22中5種蛇序列的第121-132位殘基(或兇猛太攀蛇的相應序列)的結構域，該結構域與圖22列出5個序列中任一個的相應結構域(或兇猛太攀蛇的相應序列)之間具有至少43、60、65、80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少60％的序列同一性。對應于圖22中5種蛇序列的第133-182位殘基(或兇猛太攀蛇的相應序列)的結構域，該結構域與圖22列出5個序列中任一個的相應結構域(或兇猛太攀蛇的相應序列)之間具有至少80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少80％的序列同一性。對應于圖22中5種蛇序列的第183-233位殘基(或兇猛太攀蛇的相應序列)的結構域，該結構域與圖22列出5個序列中任一個的相應結構域(或兇猛太攀蛇的相應序列)之間具有至少17、30、50、95、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。優選的活性產物當然缺乏活化結構域。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少90％的序列同一性。對應于圖22中5種蛇序列的第234-378位殘基(或兇猛太攀蛇的相應序列)的結構域，該結構域與圖22列出5個序列中任一個的相應結構域(或兇猛太攀蛇的相應序列)之間具有至少80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少80％的序列同一性。對應于圖22中5種蛇序列的第379-394位殘基(或兇猛太攀蛇的相應序列)的結構域，該結構域與圖22列出5個序列中任一個的相應結構域(或兇猛太攀蛇的相應序列)之間具有至少39、30、50、80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少50％的序列同一性。對應于圖22中5種蛇序列的第395-456位殘基(或兇猛太攀蛇的相應序列)的結構域，該結構域與圖22列出5個序列中任一個的相應結構域(或兇猛太攀蛇的相應序列)之間具有至少80、85、90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3、5或10個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少80％的序列同一性。對應于圖22中5種蛇序列的第457-467位殘基(或兇猛太攀蛇的相應序列)的結構域，該結構域與圖22列出5個序列中任一個的相應結構域(或兇猛太攀蛇的相應序列)之間具有至少90、96或98％的序列相似性或者不同的氨基酸殘基數不超過1、2、3或5個，具體地是與名稱為棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇序列的完全SVP’s之一或者名稱為紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇序列的部分完全SVP’s之一的相應結構域之間。一個優選實施方案中，與本申請公開的6種蛇毒蛋白酶中的一種的相應結構域之間具有至少90％的序列同一性。如上所述，一個優選實施方案包括完全處理后的輕鏈和重鏈的二聚體分子，該分子從原肽結構域和活化或切割結構域切割而來。優選實施方案中，所述輕鏈包括輕鏈的第57和62位、第90和101位、第95和110位、第112和121位、第129和140位、和/或第151和164位殘基間的鏈內Cys-Cys鍵，重鏈的第216和221、第236和252、第377和391，和/或第402和430位殘基間的鏈內Cys-Cys鍵，以及輕鏈第172位殘基與重鏈第329位殘基間的鏈間Cys-Cys鍵。優選實施方案中，所述二聚體SVP是一種完全凝血酶原活化劑，在其它方案中，它是一種部分完全凝血酶原活化劑。優選實施方案中，所述SVP是一種完全或部分完全凝血酶原活化劑，因為其能在無輔因子存在表現出比不完全活化因子例如人因子X或trocarin明顯高的活性。優選地，所述完全或不完全凝血酶原活化劑的活性比單獨的不完全活化劑例如人因子X或trocarin的活性高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000，或4000倍(2-4個數量級)。這一比較結果是在相同或近似條件下例如無Ca和磷脂存在下，對蛇毒蛋白酶和不完全活化劑進行測量得出的。優選實施方案中，完全或部分完全活化劑活性的％(即完全或部分完全活化劑在無Ca和磷脂存在下的活性與該活化劑在有Ca和磷脂存在下的活性之間的％)比不完全活化劑例如人因子X或trocarin表現的相應％高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000或4000倍。優選的完全或部分完全活化劑在約10-10～10-06M，例如10-8或10-7M濃度下能使檸檬酸化血漿凝塊，凝快時間約50-15秒，這表明其是Ca2+和磷脂非依賴性的。因此，所述凝血酶原活化劑在約10-10～10-06M濃度范圍內表現輔因子(鈣離子和/或磷脂)非依賴性的動力學特性，這是一個適于減少血液流失的工作范圍。本發明的SVP’s不包括trocarin，例如圖21所示。優選實施方案中，完全SVP的處理后的輕鏈與trocarin的處理后的輕鏈之間有至少1，3，5，10，15或20個不同殘基。優選實施方案中，完全SVP的處理后的重鏈與trocarin的處理后的重鏈之間有至少5，10，15，20或30個不同殘基。(不同指同一性不同或者是通過插入或缺失，除非另有說明)。優選實施方案中，本發明的完全SVP的序列具有一種或多種下列特征，第41位殘基不為絲氨酸(所有編號參照圖21中的共有編號)，第48位殘基不為異亮氨酸，第50位殘基不為脯氨酸，第74位殘基不為天冬酰胺，第104位殘基不為脯氨酸，第105位殘基不為天冬酰胺，第123位殘基不為賴氨酸，第127位殘基不為谷氨酰胺，第142位殘基不為精氨酸，第145-7位殘基不為絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸，第154位殘基不為絲氨酸，第156位殘基不為精氨酸，第159位殘基不為纈氨酸，第167位殘基不為谷氨酸，第169位殘基不為天冬氨酸，第178位殘基不為丙氨酸；包含出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇序列中任一序列的序列181-208(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基；第228位殘基不為異亮氨酸，第229位殘基不為天冬酰胺，第233位殘基不為甘氨酸，第232位殘基不為谷氨酸，第245位殘基不為組氨酸，第258-9位殘基不為絲氨酸、纈氨酸；包含出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇序列中任一序列的序列260-270(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基；第274位殘基不為精氨酸，第286位殘基不為蘇氨酸，第292-300位殘基不為天冬酰胺-酪氨酸-酪氨酸-酪氨酸-纈氨酸-組氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺，第303位殘基不為精氨酸，第305位殘基不為丙氨酸，第314位殘基不為精氨酸，第338位殘基不為谷氨酸，第345位殘基不為絲氨酸，第353-360位殘基不為RIQFKQPT，第367位殘基不為異亮氨酸，第368位殘基不為蘇氨酸，第382位殘基不為天冬氨酸，第384位殘基不為精氨酸，第387位殘基不為谷氨酰胺，第389位殘基不為天冬酰胺，第424位殘基不為異亮氨酸，第342位殘基不為精氨酸，第451位殘基不為賴氨酸，第454-455位殘基不為絲氨酸、亮氨酸；或者包含出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇序列中任一序列的序列457-467(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基；優選實施方案中，部分完全SVP的處理后的輕鏈與trocarin的處理后的輕鏈之間有至少1，3，5，10或15個不同殘基。優選實施方案中，完全SVP的處理后的重鏈與trocarin的處理后的重鏈之間有至少5，10，15，20或30個不同殘基。優選實施方案中，本發明的部分完全SVP的序列出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇序列中任一序列的序列181-208(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基；或包含出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇序列中任一序列的序列260-270(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基。一個優選實施方案中，所述SVP是一種完全凝血酶原活化劑，包括輕鏈和/或重鏈，其中所述輕鏈與圖24中共有序列之間具有至少87、89或90％的序列同一性或者之間的不同殘基數不超過16、14或13個，所述重鏈與圖24中共有序列之間具有至少82、85或84％同一性或者之間的不同殘基數不超過45、39或40個。優選實施方案中，完全SVP包括輕鏈和/或重鏈，其中所述鏈與圖24所示棕蛇、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇SVP序列相同或具有至少84、86或86％的序列同一性或者之間的不同殘基數不超過61或53個。一個優選實施方案中，所述SVP是一種部分完全凝血酶原活化劑，包括輕鏈和/或重鏈，其中所述鏈與圖24所示序列之間具有至少84％序列同一性或者之間的不同殘基數不超過61或53個。優選實施方案中，部分完全SVP包括1條輕鏈或1條重鏈或者同時包括輕鏈和/或重鏈，其中所述鏈與圖24所示紅腹黑蛇、虎蛇或粗鱗蛇SVP序列相同或具有至少84、80或82％的序列同一性或者之間的不同殘基數不超過61、76、68個。其它實施方案中，本發明提供了蛇毒蛋白酶多肽，例如，具有下列氨基酸序列的多肽SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示的氨基酸序列，或SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列編碼的氨基酸序列；基本上等同于SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列或SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列編碼的氨基酸序列的氨基酸序列；或者與所列氨基酸序列之一具有至少85，90，95，98或99％序列同一性或之間的不同殘基數不超過1，2，5，10，15，或20個的序列。其它實施方案中，本發明提供了蛇毒蛋白酶輕鏈多肽，例如，具有下列氨基酸序列的多肽SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示任一氨基酸序列中第41-179位氨基酸殘基(編號參照圖23中共有序列的編號)，或SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列編碼的氨基酸序列中的第41-179位氨基酸殘基；基本上等同于SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列中第41-179位氨基酸殘基，或基本上等同于SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列編碼的氨基酸序列；或者與所列氨基酸序列之一具有至少85，90，95，98或99％序列同一性或之間的不同殘基數不超過1，2，5，10，15，或20個的氨基酸序列。其它實施方案中，本發明提供了蛇毒蛋白酶重鏈多肽，例如，具有下列氨基酸序列的多肽SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示任一氨基酸序列中第235-至少453位氨基酸殘基，或SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示核酸序列編碼的氨基酸序列中的第235-至少453位氨基酸殘基；基本上等同于SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列中第235-至少453位氨基酸殘基，或基本上等同于SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核酸序列編碼的氨基酸序列中第235-至少453位氨基酸殘基的氨基酸序列；或者與所列氨基酸序列之一具有至少85，90，95，98或99％序列同一性或之間的不同殘基數不超過1，2，5，10，15，或20個的氨基酸序列。在一個相關方面，本方面提供了包含本申請所述蛇毒蛋白酶核酸分子的核酸構建體。在一個相關方面，本方面提供了蛇毒蛋白酶多肽或其片段，該多肽或片段可操作連接于蛇毒蛋白酶多肽以形成融合蛋白。一個實施方案中，可以將編碼蛇毒蛋白酶輕鏈、激活劑多肽和蛇毒蛋白酶重鏈中一個或多個序列連接于編碼非蛇毒凝血酶原活化多肽的原肽的序列，例如，人因子Xa原肽編碼序列。另一個實施方案中，可以用編碼非蛇毒凝血酶原活化多肽的核酸序列將編碼蛇毒蛋白酶輕鏈的序列和編碼蛇毒蛋白酶重鏈的序列彼此連接在一起，例如用人因子X激活劑肽編碼序列。其它實施方案中，可將SVP序列融合于一序列，優選融合于易于切割的序列，這樣可使分離得以實現，例如，融合于GST部分或表位標簽。另一方面，本發明涉及一種分離的蛋白質，其含有下列氨基酸序列之一或全部KREASLPDFVQS[SEQIDNO19]；LKKSDNPSPDIR[SEQIDNO20]；和SVX1VGEIX2X3SR[SEQIDNO21]。X1，X2和X3可以為任一氨基酸。優選地，X1為纈氨酸或異亮氨酸，X2為天冬酰胺或天冬氨酸，以及X3為精氨酸、賴氨酸或異亮氨酸。一個實施方案中，所述分離的蛋白質進一步含有選自下列組的氨基酸序列MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK[SEQIDNO22]和ANRFLQRTKR[SEQIDNO23]一個具體的實施方案中，本發明所述凝血酶原活化蛋白分離自蛇毒。優選地，本發明所述凝血酶原活化蛋白可獲自選自下列非限制組的澳大利亞蛇的蛇毒任何棕蛇(Psuedonajasp.)包括常見棕蛇(Pseudonajatextilis)、太攀蛇(Oxyuranusscutellatus)、大陸虎蛇(Notechisscutatus)、粗鱗蛇(Tropidechiscarinatus)以及紅腹黑蛇(Pseudechisporphyriacus)。另一方面，本發明涉及編碼本發明所述蛇毒蛋白酶多肽或其生物活性片段的分離的核酸。一個優選實施方案中，所述的分離的核酸分子編碼的多肽具有SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示的氨基酸序列。其它實施方案中，本方面提供了分離的核酸分子，其具有SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列，或者SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18的全長互補序列。其它實施方案中，本方面提供了基本等同于SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列的核酸分子(例如，天然存在的等位變體)。其它實施方案中，本方面提供了一種核酸分子，其能在本申請所述嚴謹條件下與含有SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示核苷酸序列的核酸分子雜交，其中所述核酸編碼全長蛇毒蛋白酶多肽或其活性片段。在一個相關的方面，本方面進一步還提供了核酸構建體，其中包含編碼蛇毒蛋白酶或其部分的核酸分子，例如，如本發明所述。一些實施方案中，本發明所述核酸分子可操作地連接于天然或異源調控序列。其它實施方案中，所述核酸分子含有編碼原肽的核酸、編碼蛇毒蛋白酶輕鏈的核酸序列、編碼激活劑肽的核酸序列以及編碼蛇毒蛋白酶重鏈的核酸序列，其中編碼原肽序列和編碼激活劑肽的序列中的一個或多個不是來自蛇毒蛋白酶。例如，原肽編碼序列和激活劑肽編碼序列中的一個或多個可以來自哺乳動物凝血酶原激活劑，例如，人凝血酶原激活劑，例如人因子Xa。另外，本發明還提供了含有本發明所述核酸分子的載體和宿主細胞，例如，適于制備蛇毒蛋白酶核酸分子及多肽的載體和宿主細胞。另一相關方面，本方面提供了適于作為引物或雜交探針以檢測或擴增蛇毒蛋白酶-編碼核酸的核酸片段。例如，本發明包括用于擴增下列物質的分離的引物全長蛇毒蛋白酶，例如本申請所述蛇毒蛋白酶，或本申請所述蛇毒蛋白酶的任一結構域或區域。另一相關方面，本方面提供了與蛇毒蛋白酶-編碼核酸分子的反義核酸分子。本發明還包括本發明上述的分離的蛋白質和核酸的生物活性片段、變體、衍生物以及同系物。另一方面，本發明涉及一種抗體，該抗體能夠結合分離的蛇毒蛋白酶多肽，例如，本申請所述的蛇毒蛋白酶多肽。一個實施方案中，所述抗體能結合本申請所述的蛇毒蛋白酶多肽的原肽或其片段、本申請所述的蛇毒蛋白酶多肽的輕鏈或其片段、本申請所述的蛇毒蛋白酶多肽的激活劑多肽或其片段、或者本申請所述的蛇毒蛋白酶多肽的重鏈或其片段。另一實施方案中，所述抗體能夠結合蛇毒蛋白酶的部分，該部分含有本申請所述的蛇毒蛋白酶多肽的輕鏈和重鏈。抗體可用于，例如，從樣品中分離蛇毒蛋白酶。另一方面，本發明涉及一種藥物組合物，其中含有一種分離的蛇毒蛋白酶多肽(例如，本申請所述的分離的蛇毒蛋白酶多肽)或其生物活性片段以及可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。一個實施方案中，所述組合物，例如藥物組合物，其pH值為約5-9，優選約6.5-7。所述組合物，例如藥物組合物，可以進一步含有，例如，穩定劑，如多元醇。所述實施方案中，所述組合物，例如藥物組合物可以含有約5％、10％、20％或更多的一種多元醇(或多種多元醇)。可用于所述組合物的多元醇的一個實例為甘油。一些實施方案中，所述組合物，例如藥物組合物，不含有輔因子。另一實施方案中，所述組合物，例如藥物組合物含有一種或多種輔因子，例如，鈣、磷脂和因子Va中的一種或多種。另一方面，本方面提供了用于篩選藥劑(agents)的方法，例如，輔因子等化合物，其能調節蛇毒多肽活性，例如能調節血液凝血反應和/或將凝血酶原處理為凝血酶過程的化合物。一個實施方案中，所述方法包括提供一種凝血酶原與蛇毒蛋白酶的反應混合物，例如本申請所述蛇毒蛋白酶，然后讓反應混合物與一種或多種輔因子(例如，鈣、磷脂、因子Va和維生素例如維生素K中的一種或多種)。所述反應混合物可以進一步包括，例如血纖蛋白原。所述方法可以進一步包括將在有和無所述制劑例如輔因子存在情況下比較蛇毒蛋白酶處理凝血酶原的活性。另一實施方案中，所述方法包括提供一種樣品(例如，血樣)，讓該樣品與蛇毒蛋白酶在有和無所述制劑例如輔因子存在的情況下接觸，并比較輔因子對蛇毒蛋白酶凝血作用的影響。另一實施方案中，所述方法包括讓血小板與蛇毒蛋白酶在有和無所述制劑例如輔因子存在情況下接觸，測定所述藥劑對血小板活化的作用。一個實施方案中，本發明涉及通過檸檬酸鹽抗凝血化的全血或其血漿級分測定活性水平的方法，所述檸檬酸鹽抗凝血化的全血或其血漿級分可用于通過測量固體血凝塊形成的時間來測定蛇毒多肽(蛋白酶)的活性。這種測定可手工操作或者使用任一自動血凝測量裝置進行。另外，蛋白酶的活性還可以通過使用連接有對硝基苯胺(p-nitroanilide)的四肽(顯色底物)測量，這種四肽與蛋白酶底物(凝血酶原)的特異性結構域相類似。這種測定方法是一種測量溶液中p-硝基苯胺形成速率的簡單的比色測定法。另一方面，本發明涉及治療受試者的方法，例如通過誘導止血。該方法包括向受試者施用本發明的蛇毒蛋白酶，從而例如通過誘導止血治療受試者。一個優選實施方案中，治療受試者以抑制該受試者體表或體內部位的流血。所述治療可用于抑制與醫學處理例如外科手術相關的流血。其它實施方案中，治療對象為傷口、創傷或其它傷害。一些實施方案中，所述受試者為缺陷患者，不能形成或維持血凝塊。這種缺陷可以是基因缺陷也可以是醫學處理導致的，例如因施用會減弱受試者形成或維持血凝塊能力的藥物導致的，例如芐芮酮香豆素鈉(coumadine)或華法令(Warfarin)。一個實施方案中，將所述蛇毒蛋白酶施用給受試者之外的人，而在其它實施方案中，所述蛇毒蛋白酶為自體-施用。所述的受試者之外的人可以是衛生保健提供者(healthcareprovider)但在一些情況下也可以不是衛生保健提供者。例如，一些實施方案中，所述產品可用于治療戰場外傷，由除衛生保健提供者之外的人給藥。一些實施方案中，將所述蛇毒蛋白酶提前提供給需要使用它的受試者，例如，因缺陷而不能形成或維持血凝塊的受試者，或者被認為是易受創傷的個體，例如軍人、操作危險機械的人、或者經常從事危險職業的人，例如農業或采礦業。所述蛇毒蛋白酶附有文字、音頻或視頻、或者口頭的使用說明書。一些實施方案中，所述蛇毒蛋白酶以能使得使用者(受試者或向受試者用藥的人)可按計量好的劑量施用的形式提供。因此，可將所述蛇毒蛋白酶置于分配裝置，例如，分配液體、液滴、氣溶膠、干粉等的裝置，優選按計量好的劑量分配。另一方面，本方面提供了一種活化凝血酶原的方法。該方法包括讓凝血酶原與本發明的蛇毒蛋白酶接觸，從而活化所述凝血酶原。所述凝血酶原可以在體外或體內活化。一個實施方案中，所述凝血酶原包括脫羧凝血酶原。具體實施方案中，所述誘導止血和/或凝血酶原活化的組合物和方法可以用于阻止血液從傷口流失。一個這樣的實施方案中，所述組合物可以是組織封閉劑和/或血纖蛋白膠的組合物。還應該想到的是抗血纖蛋白溶解藥劑可以作為此類實施方案的部分。抗血纖蛋白溶解劑可以選自包括下列物質的非限制組textilinin(國際公開號WO99/58569)，抑酶肽和EACA，其中的任一個都可以加入進去，通過抑制纖溶酶或纖溶酶激活劑的作用從而阻止血凝塊的溶解。另一方面，本發明涉及一種用于獲得蛋白質、核酸、或文庫、或者核酸或蛋白質的序列信息的方法，例如，如本發明所述。例如，用于獲得蛇蛋白質，例如SVP，例如本申請所述的SVP；編碼蛇蛋白質的核酸，例如編碼SVP的核酸，例如本申請所述的SVP；或者本申請所述的任一文庫。這些方法在本申請中稱為“以采集為基礎(collectionbased)的方法”。該方法包括采集選自下列蛇組成的非限制組的澳大利亞蛇棕蛇(Pseudonajatextilis)、西部擬眼鏡蛇(Pseudonajanuchalis)、Pseudonajaaffinis、Pseudonajainframacula、太攀蛇(Oxyuranusscutellatus)、兇猛太攀蛇(Oxyuranusmicrolepidotus)、大陸虎蛇(Notechisscutatus)、Notechisaterniger，Notechisaterserventyi，Hoplocephalusstephansii、紅腹黑蛇(Pseudechisporphyriacus)、Australapssurperba、粗鱗蛇(Tropidechiscarinatus)(或者從所述這些蛇采集組織或者采集用所述這些蛇制備成的組織，例如，卵，或丟棄的組織如脫落的皮膚)以及從蛇或從蛇的后代獲取蛋白質、核酸、或文庫，或者從來自蛇或蛇后代的蛋白質或核酸中獲取序列信息。所述方法可以包括采集死亡的澳大利亞蛇或者捕獲活的澳大利亞蛇或活的受傷的澳大利亞蛇。一個實施方案中，所述方法進一步包括從蛇獲取樣品，例如從蛇獲取蛇毒樣品；以及從所述樣品，例如從蛇毒樣品獲取蛋白質或蛋白質文庫。其它實施方案包括從蛇獲取樣品；以及從所述樣品，例如從毒腺獲取核酸或核酸文庫。所述方法還可包括從取自蛇或其后代的材料測定核酸或蛋白序列。所述方法還可包括用采集到的蛇或其后代制備蛋白或核酸文庫。所述方法還可包括獲取多肽，用于例如動物、人或植物保健，工業處理或診斷。另一個實施方案中，所述方法還可包括采集蛇或樣品，然后將采集來的蛇或樣品送達乙方，例如在另外一個國家執行該方法后續步驟的一方。另一個方面，本發明涉及蛋白質、核酸、或文庫，或者核酸或蛋白質的序列信息，例如，如本發明所述到的，其是用本申請所述方法制備或生產的，例如本申請所述的一種采集方法。在優選的實施方案中，本發明涉及一種蛇蛋白，例如一種SVP，如一種本申請所述的SVP，或者編碼蛇蛋白的核酸，例如編碼SVP例如本申請所述的SVP的核酸；或者用本申請所述方法，例如用本申請所述方法，例如本文的采集方法產生或制備的本文所述任一文庫或本申請所述任一核酸或蛋白的序列信息。一個方面，，本發明涉及含有下列序列的分離的多肽MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKX1ANRFLQRTKRX2NSLX3EEX4X5X6GNIERECIEEX7CSKEEAREX8FX9DX10EKTEX11FWNVYVDGDQCSSNPCHYX12GX13CKDGIGSYTCTCLX14X15YEGKNCEX16X17LX18X19SCRX20X21NGNCWHFCKX22VQX23X24X25QCSCAEX26YX27LGX28DGHSCVAX29GX30FSCGRNIKX31RNKREASLPDFVQSX32X33AX34X35KKSDNPSPDIRIX36NGMDCKLGECPWQAX37LX38X39X40X41X42X43X44FCGGTILSPIX45VLTAAHCIX46X47X48X49X50X51SVX52VGEIX53X54SRX55X56X57X58X59LLSVDK60YVHX61KFVX62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77YDYDIAIX78X79X80KTPIQFSENVVPACLPTADFAX81X82VLMKQDX83GIX84SGFGX85X86X87X88X89X90X91X92SX93X94LKX95X96X97VPYVDRHTCMX98SSX99X100X101ITX102X103MFCAGYDTLPX104DACQGDSGGPHITAYX105DTHFX106TGIX107SWGEGCAX108X109GX110YGX111YTKX112SX113FIX114WIKX115X116MX117X118X119Z，其中X1，X10，X12-13，X15-16，X19-23，X25，X27-30，X33-34，X37，X39，X42-47，X50，X53-56，X58-62，X64，X79，X81-83，X85-94，X96，X99-105，X108-109，X113-115和X117-119彼此獨立地選自任一種氨基酸殘基；X2，X6，X11，X14，X26，X31，X48，X57和X63均為小的氨基酸殘基；X3，X4，X8，X17，X18，X35-36，X38，X51-52，X78，X80，X84，X95，X98，X106-107，X111-112和X116均為疏水氨基酸殘基；X5，X7和X110均為堿性氨基酸殘基；X9，X40-41和X49均為帶電氨基酸殘基；X24為酸性氨基酸殘基；X32為中性/極性氨基酸殘基；X65-67，X70-72和X75各自獨立地缺失或者各自獨立地選自任一種氨基酸殘基；X68和X74各自獨立地缺失或者各自獨立地選自酸性氨基酸殘基；X69，X73和X76各自獨立地缺失或者各自獨立地選自疏水氨基酸殘基；X77缺失或為一種小的氨基酸殘基；以及Z缺失或為一種長度為1-20個氨基酸的肽。一些實施方案中，X1選自疏水或酸性氨基酸殘基，例如Val或其修飾形式，或者Glu或其修飾形式。一些實施方案中，X2選自Ala或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X3選自Tyr或Phe或其修飾形式。一些實施方案中，X4選自Phe或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X5選自Lys或Arg或其修飾形式。一些實施方案中，X6選自Pro或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X7選自Arg或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，X8選自Val或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X9選自Glu或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，X10為中性/極性或酸性氨基酸殘基，例如X10選自Asp或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X11選自Thr或Ala或其修飾形式。一些實施方案中，X12為一種小的或堿性氨基酸殘基或其修飾形式，例如，X12選自Gly或Arg或其修飾形式。一些實施方案中，X13為一種疏水或小的氨基酸殘基或其修飾形式，例如，X13選自Ile或Thr或其修飾形式。一些實施方案中，X14選自Pro或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X15為一種小的或中性/極性氨基酸殘基，例如，X15選自Gly或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X16為一種堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X16選自Arg，His或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，X17選自Val或Leu或其修飾形式。一些實施方案中，X18選自Tyr或Phe或Leu或其修飾形式。一些實施方案中，X19為一種堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X19選自Lys或Gln或其修飾形式。一些實施方案中，X20為一種疏水或小的氨基酸殘基，例如，X20選自Val，Phe或Ala或其修飾形式。一些實施方案中，X21為一種酸性或疏水氨基酸殘基，例如，X21選自Asp或Phe或其修飾形式。一些實施方案中，X22為一種小的或堿性氨基酸殘基，例如，X22選自Pro，Asp或Phe或其修飾形式。一些實施方案中，X23為一種中性/極性或小的氨基酸殘基，例如，X23選自Asn或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X24選自Asp或Glu或其修飾形式。一些實施方案中，X25為一種疏水或小的氨基酸殘基，例如，X25選自Ile或Thr或其修飾形式。一些實施方案中，X26選自Gly或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X27為一種疏水或堿性氨基酸殘基，例如，X27選自Leu或Arg或其修飾形式。一些實施方案中，X28為一種酸性或疏水氨基酸殘基，例如，X28選自Glu，Asp或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X29為一種小的或酸性氨基酸殘基，例如，X29選自Gly或Glu或其修飾形式。一些實施方案中，X30為一種中性/極性或酸性氨基酸殘基，例如，X30選自Asn或Asp或其修飾形式。一些實施方案中，X31選自Thr或Ala或其修飾形式。一些實施方案中，X32選自His或Gln或其修飾形式。一些實施方案中，X33是中性/極性或堿性氨基酸殘基，例如，X33選自Asn或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，X34為一種小的或疏水氨基酸殘基，例如，X34選自Thr或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X35選自Leu或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X36選自Val或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X37為一種小的或疏水氨基酸殘基，例如，X37選自Ala或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X38選自Val，Leu或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X39為一種酸性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X39選自Asp或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X40選自Asp，Glu或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，X41選自Lys或Glu或其修飾形式。一些實施方案中，X42為一種帶電的或小的氨基酸殘基，例如，X42選自Lys，Glu或Gly或其修飾形式。一些實施方案中，X43為一種小的或酸性氨基酸殘基，例如，X43選自Gly，Asp或Glu或其修飾形式。一些實施方案中，X44為一種小的或疏水氨基酸殘基，例如，X44選自Ala或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X45為一種疏水或中性/極性氨基酸殘基，例如，X45選自Tyr或His或其修飾形式。一些實施方案中，X46為一種小的或中性/極性氨基酸殘基，例如，X46選自Thr或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X47為一種酸性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X47選自Glu或Gln或其修飾形式。一些實施方案中，X48選自Thr或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X49選自Glu或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，X50為一種小的、疏水的或中性/極性氨基酸殘基，例如，X50選自Thr，Met，His或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X51選自Ile或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X52選自Val或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X53為一種酸性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X53選自Asp或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X54為一種堿性或疏水氨基酸殘基，例如，X54選自Arg或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X55為一種小的或堿性氨基酸殘基，例如，X55選自Ala或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，X56為一種酸性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X56選自Glu或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X57選自Pro或Thr或其修飾形式。一些實施方案中，X58為一種小的或堿性氨基酸殘基，例如，X58選自Gly或Arg或其修飾形式。一些實施方案中，X59為一種小的、堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X59選自Pro，Arg或His或其修飾形式。一些實施方案中，X60為一種疏水或小的氨基酸殘基，例如，X60選自Val，Ile或Ala或其修飾形式。一些實施方案中，X61為一種、中性/極性或小的氨基酸殘基，例如，X61選自Lys，Gln或Thr或其修飾形式。一些實施方案中，X62為一種小的或疏水氨基酸殘基例如，X62選自Pro或Leu或其修飾形式。一些實施方案中，X63選自Pro或Ala或其修飾形式。一些實施方案中，X64為一種堿性、小的或中性/極性氨基酸殘基例如，X64選自Lys，Thr或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X65存在時為一種堿性、小的或疏水氨基酸殘基例如，X65選自Lys，Ser或Tyr或其修飾形式。一些實施方案中，X66存在時為一種小的或疏水氨基酸殘基，例如，X66選自Ser，Gly或Tyr或其修飾形式。一些實施方案中，X67存在時為一種中性/極性或疏水氨基酸殘基，例如，X67選自Gln或Tyr或其修飾形式。一些實施方案中，X68當存在時為Glu或其修飾形式。一些實施方案中，X69存在時選自Phe或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X70存在時為一種疏水或中性/極性氨基酸殘基，例如，X70選自Tyr或His或其修飾形式。一些實施方案中，X71存在時為一種酸性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X71選自Glu或Gln或其修飾形式。一些實施方案中，X72存在時為一種堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X72選自Lys或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X73存在時選自Phe或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X74存在時為Asp或其修飾形式。一些實施方案中，X75存在時為一種疏水或堿性氨基酸殘基，例如，X75選自Leu或Arg或其修飾形式。一些實施方案中，X76存在時選自Val或Phe或其修飾形式。一些實施方案中，X77存在時選自Ser或Ala或其修飾形式。一些實施方案中，X78選自Ile或Leu或其修飾形式。一些實施方案中，X79為一種中性/極性或堿性氨基酸殘基，例如，X79選自Gln或Arg或其修飾形式。一些實施方案中，X80選自Met或Leu或其修飾形式。一些實施方案中，X81為一種中性/極性或堿性氨基酸殘基，例如，X81選自Asn或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，X82為一種中性/極性或酸性氨基酸殘基，例如，X82選自Gln或Glu或其修飾形式。一些實施方案中，X83為一種疏水或小的氨基酸殘基，例如，X83選自Phe或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X84選自Val或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X85為一種小的、堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X85選自Gly，Arg或His或其修飾形式。一些實施方案中，X86為一種疏水或小的氨基酸殘基例如，X86選自Ile或Thr或其修飾形式。一些實施方案中，X87為一種疏水、堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X87選自Phe，Arg或Gln或其修飾形式。一些實施方案中，X88為一種酸性、小的或疏水氨基酸殘基，例如，X88選自Glu，Ser或Phe或其修飾形式。一些實施方案中，其中X89為一種堿性、小的或疏水氨基酸殘基，例如，X89選自Arg，Lys，Gly，或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X90為一種小的或中性/極性氨基酸殘基，例如，X90選自Gly，或Gln或其修飾形式。一些實施方案中，X91為一種小的、中性/極性或疏水氨基酸殘基，例如，X91選自Pro，Gln或Tyr或其修飾形式。一些實施方案中，X92為一種中性/極性或小的氨基酸殘基，例如，X92選自Asn，Gln或Thr或其修飾形式。一些實施方案中，X93為一種堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X93選自Lys或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X94為一種小的或疏水氨基酸殘基例如，X94選自Thr或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X95選自Leu，Val或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X96為一種堿性或小的氨基酸殘基，例如，X96選自Lys或Thr或其修飾形式。一些實施方案中，X97選自Val或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X98選自Leu或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X99為一種中性/極性或酸性氨基酸殘基，例如，X99選自Asn，Glu或Asp或其修飾形式。一些實施方案中，X100為一種疏水或小的氨基酸殘基，例如，X100選自Phe或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X101為一種小的或堿性氨基酸殘基，例如，X101選自Pro或Arg或其修飾形式。一些實施方案中，X102為一種小的或中性/極性氨基酸殘基，例如，X102選自Pro或Gln或其修飾形式。一些實施方案中，X103為一種小的或中性/極性氨基酸殘基，例如，X103選自Thr或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X104為一種中性/極性或堿性氨基酸殘基，例如，X104選自Gln或Arg或其修飾形式。一些實施方案中，X105為一種堿性或小的氨基酸殘基，例如，X105選自Arg或Gly或其修飾形式。一些實施方案中，X106選自Ile或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X107選自Val或Ile或其修飾形式。一些實施方案中，X108為一種堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X108選自Arg，Gln或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，X109為一種堿性或小的氨基酸殘基，例如，X109選自Lys或Thr或其修飾形式。一些實施方案中，X110選自Arg或Lys或其修飾形式。一些實施方案中，Xx選自Ile或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X112選自Leu或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X113為一種堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X113選自Lys或Asn或其修飾形式。一些實施方案中，X114為一種小的或疏水氨基酸殘基，例如，X114選自Pro或Leu或其修飾形式。一些實施方案中，X115為一種堿性或小的氨基酸殘基，例如，X115選自Arg，Lys或Ala或其修飾形式。一些實施方案中，X116選自Ile或Val或其修飾形式。一些實施方案中，X117為一種堿性或小的氨基酸殘基，例如，X117選自Arg或Ser或其修飾形式。一些實施方案中，X118為一種中性/極性、堿性或疏水氨基酸殘基，例如，X118選自Gln，Lys或Leu或其修飾形式。一些實施方案中，X119為一種堿性或中性/極性氨基酸殘基，例如，X119選自Lys或His或其修飾形式。一些實施方案中，Z存在并且含有序列X118PSTESSTGRL，其中X118為任一氨基酸殘基。一些實施方案中，X118為一種疏水或中性極性氨基酸殘基，例如，X118選自Leu或Gln或其修飾形式。一些實施方案中，X65-77代表一段長為n個氨基酸的序列，其中n為0-13個氨基酸殘基，例如，所述序列選自KX119X120EFYEKFDLVS、SYYQNIDRFA或YYYVHQNFDRVA，其中X119為一種小的氨基酸殘基，例如，X119選自Ser或Gly或其修飾形式；以及X120為任一氨基酸殘基，例如，X120選自Gln或Tyr或其修飾形式。本發明的其它特點和優勢可以從下面的發明詳述部分和權利要求中顯而易見的看出。表格和附圖的說明表1使用SephacrylS-300純化棕蛇蛇毒蛋白酶過程中的樣品鑒定。表2使用Superdex200純化棕蛇蛇毒蛋白酶過程中的樣品鑒定。表3采用方案1純化棕蛇蛇毒蛋白酶過程中的樣品鑒定。表4采用方案2純化棕蛇蛇毒蛋白酶過程中的樣品鑒定。表5采用方案3純化棕蛇蛇毒蛋白酶過程中的樣品鑒定。表6采用方案4純化棕蛇蛇毒蛋白酶過程中的樣品鑒定。表7在加和不加輔助成分時，S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶復合物作用下的水解情況(單獨使用棕蛇蛇毒蛋白酶復合物，棕蛇蛇毒蛋白酶復合物加10mMCaCl2以及棕蛇蛇毒蛋白酶復合物加10mMCaCl2和磷脂)。表8檸檬酸化血漿在下列物質作用下的凝血時間單獨使用棕蛇蛇毒蛋白酶復合物、棕蛇蛇毒蛋白酶復合物加10mMCaCl2，以及棕蛇蛇毒蛋白酶復合物加10mMCaCl2和磷脂。表9檸檬酸化血漿凝血試驗±Ca2+的凝血時間，添加了源自P.textilis(棕蛇)的分離的蛇毒蛋白酶。表10檸檬酸化血漿在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的凝血情況。表11在源自P.textilis的分離的蛇毒蛋白酶作用下，S-2222水解的初始速度，加或未加Ca2+。表12檸檬酸化人血漿產生血凝塊的大致凝血時間，其使用棕蛇蛇毒蛋白酶加40mMCaCl2，或棕蛇蛇毒蛋白酶，以及單獨使用40CaCl2。表13用各種方法測定棕蛇蛇毒蛋白酶的分子量。表14尾靜脈出血小鼠模型用棕蛇蛇毒蛋白酶處理時的血液流失。表15棕蛇蛇毒蛋白酶(測試)及鹽水(對照)處理小鼠的血液流失情況。可以看到每一測試小鼠個體的數據以及平均血液流失土標準偏差(SD)。表16檸檬酸化人血漿在各種澳大利亞本地以及外來蛇蛇毒作用下的凝血情況。圖1棕蛇蛇毒(10mL；233mg)用ConA-Sepharose4B層析柱(2.5×16cm)層析后以0.05MTris-HCl，pH7.4洗脫的圖譜。A.層析曲線的模式描跡(Traceofchromatographypattern)。在箭頭B所指處將洗脫緩沖液(0.02M甲基α-D甘露吡喃糖苷溶于0.05MTris-HCl)應用到層析柱。將具有S-2222水解活性的級分匯總并濃縮(A線標示的那段)。圖2ConA-Sepharose4B層析峰匯總并濃縮后的SDSPAGE。泳道1分子量標志(大小用kDa表示)，泳道2沒加β-巰基乙醇的棕蛇蛇毒蛋白酶復合物，泳道3加入了β-巰基乙醇的棕蛇蛇毒蛋白酶復合物。圖3源自棕蛇的蛇毒蛋白酶復合物經0.8MNaSCN處理后，對檸檬酸化血漿凝血時間以及S-2222水解的影響。圖4棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的HPLC數據。圖5SDSPAGE±β-Me。泳道110μlBIO-RAD分子量標志；泳道220μl棕蛇蛇毒；泳道320μl完整的Pt-PA；泳道420μlSephacrylS-300(1)匯總級分30-43；泳道520μlSephacrylS-300(2)匯總級分25-29；泳道6、7和810μlSephacrylS-300(3)匯總級分25-29；泳道920μlSephacrylS-300(3)匯總級分25-29+β-Me；以及泳道1020μl完整血清蛇毒蛋白酶復合物+β-Me。圖6棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的SDS-PAGE，加或未加β-Me。泳道1BIO-RAD分子量標志；泳道2完整棕蛇蛇毒；泳道3SephacrylS-300(3)混合級分30-43；泳道4SephacrylS-300(#3)；泳道5S-300(#3)+β-Me；泳道6S300(#3)；泳道7SephacrylS-300(#3)+β-Me；泳道8SephacrylS-300(3)混合級分30-43+β-Me；泳道9完整棕蛇蛇毒蛋白酶復合物+β-Me；以及泳道10BIO-RAD分子量標志。#代表棕蛇蛇毒蛋白酶復合物按照上述進行SephacrylS-300層析后混合并濃縮所得的活性峰。所有樣品都為10μl等份溶液。圖7A棕蛇蛇毒蛋白酶復合物(18mL；50.4mg)在Superdex200層析柱(2.5×90cm)的0.05MTris-HCl，pH7.4，0.8MNaSCN中進行層析步驟1后的洗脫曲線。混合并濃縮具有S-2222活性的級分，即A線所標示的那段。圖7B用與圖7A相同的條件進行層析步驟2。圖7C棕蛇蛇毒蛋白酶經Superdex200純化所得樣品的SDSPAGE。泳道1&2.層析步驟1所得混合濃縮物，加β-巰基乙醇(2)，不加β-巰基乙醇(1)；泳道3&4.層析步驟2所得混合濃縮物，加β-巰基乙醇(5)，不加β-巰基乙醇(4)；泳道5.分子量標志物(大小用kDa表示)；箭頭A、B和C指示泳道4中的雜質。圖8A無輔助成分存在時，檸檬酸化血漿在棕蛇蛇毒蛋白酶(稱為Pt-PA蛋白酶)作用下的凝血情況(數據點是雙份平行測量的平均值)。圖8B加入10mMCaCl2時，檸檬酸化血漿在棕蛇蛇毒蛋白酶(“Pt-PA”)作用下的凝血情況。圖8C加入10mMCaCl2和磷脂時，檸檬酸化血漿在棕蛇蛇毒蛋白酶(“Pt-PA”)作用下的凝血情況。圖9A無輔助成分存在時，S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶(稱為Pt-PA蛋白酶)作用下的水解情況(數據點是雙份平行測量的平均值)。圖9B加入10mMCaCl2且無輔助成分存在時，S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的水解情況(數據點是雙份平行測量的平均值)。圖9C加入10mMCaCl2和磷脂且無輔助成分存在時，S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的水解情況(數據點是雙份平行測量的平均值)。圖9D圖9A、圖9B和9C中各個圖線的斜率和R2值。R2值是直線的相關系數。圖10凝血酶原在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的活化情況。在X軸所示的時間段內，凝血酶原(100μL1.3mg/mL的制劑)在棕蛇蛇毒蛋白酶(20μL1.3mg/mL的制劑)作用下轉化為凝血酶，反應的總體積為500μL。然后每一反應物取一等份加入檸檬酸化血漿凝血試驗，測量凝血時間(Y-軸)。圖11A凝血酶原經棕蛇蛇毒蛋白酶孵育后的非還原性SDSPAGE。在第0分鐘時將棕蛇蛇毒蛋白酶加入凝血酶原(時間，t＝0)；泳道1，分子量標志物(大小用kDa表示)；泳道2，t＝0；泳道3，t＝6分鐘；泳道4，t＝24小時；泳道5，t＝48小時。PT，凝血酶原；PT1，p前凝血酶1；T，凝血酶；F1.2，片段1.2；PT2，前凝血酶2；F1，片段1。圖11BS-2238在由棕蛇蛇毒蛋白酶-生成的凝血酶作用下的水解情況。圖12我們提出的凝血酶原在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下活化的模型。箭頭標示的是被凝血酶和棕蛇蛇毒蛋白酶切割的鍵。圖13血纖蛋白凝塊在β-巰基乙醇存在下的SDSPAGE。泳道1.分子量標志物(大小用kDa表示)；泳道2.檸檬酸化血漿在22μg棕蛇蛇毒蛋白酶單獨作用下獲得的血纖蛋白凝塊；泳道3.檸檬酸化血漿在22μg棕蛇蛇毒蛋白酶加40mMCaCl2作用下獲得的血纖蛋白凝塊；泳道4.單獨使用40mMCaCl2得到的血纖蛋白凝塊；泳道5.人血纖蛋白原。凝膠右邊的希臘字母表示人血纖蛋白原的鏈，包括Aα(α單體和血纖肽A)，Bβ(β單體與血纖肽B)以及γ鏈。圖14蛋白酶活性位點的圖譜。經過及未經DNS-GGACK處理的純化的棕蛇蛇毒蛋白酶的SDSPAGE。泳道1和2.被DNS-GGACK抑制的棕蛇蛇毒蛋白酶復合物，有β-巰基乙醇(2)和無β-巰基乙醇(1)。泳道3和4.經DNS-GGACK抑制的棕蛇蛇毒蛋白酶，有β-巰基乙醇(4)和無β-巰基乙醇(3)。泳道5-8是未經DNS-GGACK抑制的泳道1-4的重復，用考馬氏藍染色。泳道9.分子量標志物(大小用kDa表示)。圖15棕蛇蛇毒蛋白酶、trocarin和人因子Xa中含推定活性位點的蛋白片段的氨基酸序列比對，提議的相互作用性組氨酸用粗體表示。圖16推測的棕蛇蛇毒蛋白酶重鏈與Trocarin的部分氨基酸序列比對。期望值(E)是一種參數，反映在NCBI數據庫中搜索時偶然發現的命中(hit)數。期望值越接近0，序列的匹配就越顯著。E值隨兩序列之間的匹配分值而呈指數減小，該數值還取決于所比較序列的長度。期望值為1表示在數據庫內偶然出現1個匹配得到一個近似分值。分值＝39.7，期望值＝0.004；同一性＝11/11(100％)，相似性(positives)＝11/11(100％)。圖17推測的棕蛇蛇毒蛋白酶重鏈與人因子Xa之間的部分氨基酸序列比對。圖18推測的棕蛇蛇毒蛋白酶輕鏈與Trocarin之間的部分氨基酸序列比對。圖19推測的棕蛇蛇毒蛋白酶輕鏈與小鼠因子X之間的部分氨基酸序列比對。分值＝24.8，期望值＝116；同一性＝9/12(75％)，相似性＝9/12(76％)。圖20A編碼P.textilis(常見棕蛇)蛇毒蛋白酶的核苷酸序列[SEQIDNO1]。圖20BP.textilis(常見棕蛇)蛇毒蛋白酶的氨基酸序列[SEQIDNO2]。圖21.分離自下列澳大利亞蛇的毒腺的蛇毒蛋白酶與Trocarin[SEQIDNO31]之間的氨基酸序列比對P.textilis(棕蛇)[SEQIDNO2]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQIDNO5]，P.porphyriacus(紅腹黑蛇)[SEQIDNO11]，N.scutatus(大陸虎蛇)[SEQIDNO14]，T.carinatus(粗鱗蛇)[SEQIDNO17]。圖22.分離的蛇毒蛋白酶與人Xa[SEQIDNO27]之間的氨基酸序列比對。給出的是源自下列蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列棕蛇[SEQIDNO2]，海岸太攀蛇[SEQIDNO5]，紅腹黑蛇[SEQIDNO11]，粗鱗蛇“Roughie”[SEQIDNO14]以及大陸虎蛇[SEQIDNO17]。圖23.分離自下列澳大利亞蛇毒腺的蛇毒蛋白酶之間的氨基酸序列比對P.textilis(棕蛇)[SEQIDNO2]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQIDNO5]，O.microepidotus(兇猛太攀蛇)[SEQIDNO8]，P.porphyriacus(紅腹黑蛇)[SEQIDNO11]，N.scutatus(大陸虎蛇)[SEQIDNO14]和T.carinatus(粗鱗蛇)[SEQIDNO17]。圖24.分離自下列澳大利亞蛇的毒腺的蛇毒蛋白酶與共有序列[SEQIDNO]之間的氨基酸序列比對P.textilis(棕蛇)[SEQIDNO2]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQIDNO5]，O.microepidotus(兇猛太攀蛇)[SEQIDNO8]，P.porphyriacus(紅腹黑蛇)[SEQIDNO11]，N.scutatus(大陸虎蛇)[SEQIDNO14]和T.carinatus(粗鱗蛇)[SEQIDNO17]。圖25.編碼下列澳大利亞蛇蛇毒蛋白酶的核酸的核苷酸序列比對P.textilis(棕蛇)[SEQIDNO1]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQIDNO4]，O.microlepidotus(兇猛太攀蛇)[SEQIDNO7]，P.porphyriacus(紅腹黑蛇)[SEQIDNO10]，N.scutatus(大陸虎蛇)[SEQIDNO13]，和T.carinatus(粗鱗蛇)[SEQIDNO16]。圖26.編碼下列澳大利亞蛇蛇毒蛋白酶的核酸與因子Xa[SEQIDNO26]之間的核苷酸序列比對P.textilis(棕蛇)[SEQIDNO1]，O.scutellatus(海岸太攀蛇)[SEQIDNO4]，P.porphyriacus(紅腹黑蛇)[SEQIDNO10]，N.scutatus(大陸虎蛇)[SEQIDNO13]和T.carinatus(粗鱗蛇)[SEQIDNO16]。圖27顯示的是經和未經棕蛇蛇毒蛋白酶處理的小鼠尾巴(注意經蛋白酶處理形成大的血凝塊)。圖28小鼠出血結果的箱形圖(Boxplot)。每個箱形圖表示包括50％數值的一個范圍。其中須線(whisker)是從箱體向最高和最低值延伸的線。貫穿箱體的線代表中間值。發明詳述蛇毒富含能通過抑制和/或活化血小板聚集，血纖蛋白溶解和凝血級聯反應途徑中的因子從而影響哺乳動物止血機制的蛋白質以及其它成分。特別值得一提的是蛇毒蛋白酶是澳大利亞蝙蝠蛇所獨有的。通常，凝血酶原經蛋白水解切割成為其活性形式凝血酶是由哺乳動物系統中的凝血酶原酶復合物催化的。凝血酶原酶中功能性的蛋白酶是因子Xa。但是，為顯示最佳活性，在鈣離子和磷脂存在下，Xa酶還需要因子Va作為輔因子。本發明部分是以從澳大利亞蛇中分離蛇毒蛋白酶為基礎的。澳大利亞蛇的實例包括澳大利亞常見的棕蛇，海岸太攀蛇，兇猛太攀蛇，大陸虎蛇，粗鱗蛇和紅腹黑蛇以及蝙蝠蛇科的其它蛇。本發明所述蛇毒蛋白酶在體內模擬因子Xa的作用，將凝血酶原切割為凝血酶，但是它們在無輔因子例如因子Va、磷脂和鈣存在下也能發揮作用。因此，本申請所述蛇毒蛋白酶可以作為完全或部分完全凝血酶原活化劑起作用。本申請使用的“完全凝血酶原活化劑”是指在無鈣、磷脂和因子Va存在下能將凝血酶原處理成為凝血酶的蛇毒蛋白酶。可作為完全凝血酶原活化劑的蛇毒蛋白酶的實例包括來自棕蛇和太攀蛇的蛇毒蛋白酶。本申請使用的“部分完全凝血酶原活化劑”是指在可以無鈣、磷脂存在，但必需有因子Va存在的條件下能將凝血酶原處理成為凝血酶的蛇毒蛋白酶。在一個具體的實施方案中，本方面提供了分離自下列蛇的蛇毒的分離的蛇毒蛋白酶常見的澳大利亞棕蛇(P.textilis)、海岸太攀蛇或兇猛太攀蛇(Oxyuranusscutellatus)、大陸虎蛇(Notechisscutatus)、粗鱗蛇(Tropidechiscarinatus)和紅腹黑蛇(Pseudechisporphyriacus)。本發明的蛇毒蛋白酶可以分離自本申請中稱之為″蛇毒蛋白酶復合物″的凝血酶原酶復合物。所述蛇毒蛋白酶復合物可以含有數種蛋白質和/或輔因子。本發明的蛇毒蛋白酶包括，例如，圖23中所示的那些蛋白質及其蛋白水解的亞片段。圖23圖示了來自棕蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO2)；來自海岸太攀蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO5)；來自兇猛太攀蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO8)；來自紅腹黑蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO11)；來自虎蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO14)；以及來自粗鱗蛇的蛇毒蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO17)。本發明的蛇毒蛋白酶含有大量相互共有的結構特征。“家族”一詞當用來指本發明的蛋白質及核酸分子時，意味著兩種或多種蛋白質或核酸分子，其具有共同的結構域或基序，并且具有如本申請所述的足夠的氨基酸或核苷酸序列同源性。這類家族的成員可以是天然存在的或者也可以是非天然存在的，可以來自相同或不同物種。家族成員還可以具有共同的功能特性。本申請中使用的“蛇毒蛋白酶活性”、“蛇毒蛋白酶生物活性”或“蛇毒蛋白酶功能活性”，是指蛇毒蛋白酶蛋白、多肽或核酸分子顯示的活性。例如，蛇毒蛋白酶活性可以是下列能力中的一種或多種可將凝血酶原處理成為凝血酶的活性(例如，能夠在凝血酶原的第274位精氨酸殘基和第275位蘇氨酸殘基之間，以及凝血酶原的第323位精氨酸殘基和第324位異亮氨酸殘基之間切割凝血酶原，例如，能夠在凝血酶原的第274位精氨酸殘基和第275位蘇氨酸殘基之間，以及凝血酶原的第323位精氨酸殘基和第324位異亮氨酸殘基之間切割凝血酶原，但不能在凝血酶原的第155位精氨酸和第156位絲氨酸殘基之間和/或在第286位精氨酸和第287位蘇氨酸殘基之間切割凝血酶原)；讓檸檬酸處理后的血漿中生成血凝塊的活性；在無鈣和磷脂存在下處理凝血酶原和/或產生血凝塊的活性。本發明所述分離的蛇毒蛋白酶特征在于具有很大程度上不依賴于鈣的凝血酶原酶活性，例如，如表8-12所示。本發明涉及蛇毒多肽及其生物活性片段，它們是完全或部分完全的凝血酶原活化劑。在沒有輔因子例如沒有人因子X或trocarin存在下，完全或部分完全活化劑顯示出比不完全活化劑明顯高更的活性。本發明的完全或部分完全凝血酶原活化劑的實施方案的活性水平為完全凝血酶原活化劑與Ca2+和磷脂結合時活性的約0.4％。在優選的實施方案中，完全或部分完全凝血酶原活化劑單獨作用時的活性比不完全活化劑例如人因子Xa或trocarin單獨使用時的活性高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000，或4000倍(2-4個數量級)。這種比較是在同樣或類似條件下測定的蛇毒蛋白酶和不完全活化劑之間進行的，例如在無Ca和磷脂存在下。優選實施方案中，完全或部分完全活化劑的活性％(即，完全或部分完全活化劑在無Ca和磷脂下的活性與有Ca和磷脂存在下活性的％)比不完全活化劑例如人因子X或trocarin顯示的同種活性％高至少1.5，2，4，10，15，20，50，100，1000，或4000倍。優選的完全或部分完全活化劑在濃度為約10-10-10-06M，例如10-8或10-7M時，能使檸檬酸化的血漿凝血，凝血時間為約50-15秒，這表明其是非Ca2+和磷脂依賴性的。因此，所述凝血酶原活化劑在約10-10-10-06M濃度范圍內表現出非輔因子(鈣離子和/或磷脂)依賴性的動力學特性，這是能夠減少血液流失的合適工作范圍。蛇毒蛋白酶、其片段，以及SEQIDNO2，5，8，11，14和17所示序列的衍生物及其它變體，統稱為“本發明的多肽或蛋白質”或者“蛇毒蛋白酶多肽或蛋白”。編碼所述多肽或蛋白的核酸統稱為“本發明的核酸”或者“蛇毒蛋白酶的編碼核酸”。蛇毒蛋白酶分子是指蛇毒蛋白酶核酸、多肽及抗體。在本申請中，“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)以及DNA或RNA的類似物。DNA或RNA類似物可以是從核苷酸類似物合成的。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但是優選是雙鏈DNA。圖26圖示的是編碼來自棕蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQIDNO1，編碼區SEQIDNO3)；編碼來自海岸太攀蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQIDNO4，編碼區SEQIDNO6)；編碼來自兇猛太攀蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQIDNO7，編碼區SEQIDNO9)；編碼來自紅腹黑蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQIDNO10，編碼區SEQIDNO12)；編碼來自虎蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQIDNO13，編碼區SEQIDNO15)；以及編碼來自粗鱗蛇的蛇毒蛋白酶的核酸序列(SEQIDNO16，編碼區SEQIDNO18)。“分離的核酸分子”或“純化的核酸分子”包括從天然環境中存在的其它核酸分子中分離出來的核酸分子。例如，就基因組DNA而言，“分離的”包括從基因組DNA天然結合的染色體分離出來的核酸分子。優選地，“分離的”核酸中不含有這樣的序列，即天然地側接于該核酸所來源的生物體的基因組DNA中的核酸的那些序列(即，位于該核酸5′和/或3′末端的序列)。例如，在不同的實施方案中，所述的分離的核酸分子可包含小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然側接于該核酸所來源細胞的基因組DNA中的核酸分子。而且，“分離的”核酸分子，例如cDNA分子，在用重組技術制備時可以基本上不含有其它細胞物質或培養基，或者當化學合成時基本上不含有化學前體或其它化合物。本申請中使用的“在低度嚴謹、中度嚴謹、高度嚴謹或極高度嚴謹條件下雜交”描述了雜交和洗滌的條件。雜交反應的操作指南可參見CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，在此引入作為參考。該參考文獻中描述了含水方法和無水方法(Aqueousandnonaqueousmethods)，這兩種方法均可使用。本申請提及的具體雜交條件如下所述1)低度嚴謹雜交條件是指，在約45℃在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后在至少50℃(對于低度嚴謹條件洗滌溫度可以增至55℃)用0.2XSSC，0.1％SDS洗滌兩次；2)中度嚴謹雜交條件是指，在約45℃在6XSSC中雜交，然后在60℃用0.2XSSC，0.1％SDS洗滌一次或多次；3)高度嚴謹雜交條件是指，在約45℃在6XSSC中雜交，然后在65℃用0.2XSSC，0.1％SDS洗滌一次或多次；以及優選地4)極高度嚴謹雜交條件是指，在約65℃在0.5M磷酸鈉、7％SDS中雜交，然后在65℃用0.2XSSC，0.1％SDS洗滌一次或多次。極高度嚴謹條件(4)是優選的條件，并且是應該使用的條件除非另有專門說明。優選地，本申請分離的核酸分子能夠在本申請所述嚴謹條件下與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示序列雜交，其相應于天然存在的核酸分子。本申請中的“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子，例如，天然存在的核酸分子能夠編碼天然蛋白質。本申請中使用的“基因”和“重組基因”是指至少包含編碼蛇毒蛋白酶蛋白的至少開放閱讀框架的核酸分子。所述基因可任選進一步包含非編碼序列，例如，調控序列和內含子。“分離的”或“純化的”多肽或蛋白質基本上不含來自該蛋白所來源細胞或組織源的細胞物質或其它污染蛋白，或者當化學合成時基本上不含化學前體或其它化合物。“基本上不含”意指蛇毒蛋白酶蛋白制劑有至少10％的純度。一個優選實施方案中，蛇毒蛋白酶蛋白制劑含有低于約30％、20％、10％以及更優選低于約5％(以干重計算)的非蛇毒蛋白酶蛋白(本申請中又稱“污染蛋白”)或者化學前體或非蛇毒蛋白酶化合物。當所述蛇毒蛋白酶蛋白或其生物活性部分是重組制備時，還優選基本上不含有培養基，即，培養基低于蛋白制劑體積的約20％，優選低于約10％，以及最優選低于約5％。本發明包括干重為至少0.01、0.1、1.0和10mg的分離的或純化的制劑。″非必需″氨基酸是指蛇毒蛋白酶野生型序列中發生變化而不消除或基本上不改變該蛇毒蛋白酶活性的那些氨基酸殘基。優選地所述變化基本上不改變蛇毒蛋白酶活性，例如，所述活性為野生型活性的至少20％、40％、60％、70％或80％。“必需”氨基酸是指這樣的氨基酸，其從蛇毒蛋白酶野生型序列中變化時，會消除蛇毒蛋白酶活性從而只留存了野生型活性的不足20％。例如，預期蛇毒蛋白酶之間的保守氨基酸殘基，例如圖24中的蛇毒蛋白酶尤其不能變化。“保守性氨基酸取代”是指用具有類似側鏈的氨基酸殘基來代替原來的氨基酸殘基。具有類似側鏈的氨基酸殘基的家族已為本領域定義。這些家族包括帶有堿性側鏈的氨基酸(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，帶有酸性側鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電的極性側鏈氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側鏈氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-分枝側鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，以及帶有芳香族側鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，優選用來自同一側鏈家族的另一種氨基酸殘基取代蛇毒蛋白酶蛋白中被推測為非必需氨基酸殘基。可選地，另一實施方案中，例如通過飽和誘變在蛇毒蛋白酶編碼序列的全長或部分處隨機引入突變，然后對產生的突變體進行蛇毒蛋白酶生物活性篩選以鑒定出保留活性的突變體。SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18在誘變后，可以重組表達所編碼的蛋白質，并且可以測定該蛋白質的活性。氨基酸殘基通常可以進一步分為下列主要亞類酸性氨基酸殘基這種殘基在生理pH值下失去H離子而帶有負電荷，當含有該殘基的肽存在于生理pH值的含水介質中時，該殘基被水溶液吸引從而可搜尋所述肽構象中的表面位置。帶有酸性側鏈的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。堿性氨基酸殘基這種殘基在生理pH值下或者在其1或2個pH單位內(例如，組氨酸)結合H離子而帶有正電荷，當含有該殘基的肽存在于生理pH值的含水介質中時，該殘基被水溶液吸引至所述肽構象中的表面位置。帶有堿性側鏈的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶電的氨基酸殘基這種殘基在生理pH值下帶有電荷，因而包括帶有酸性和堿性側鏈的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和組氨酸)。疏水氨基酸殘基這種殘基在生理pH值下不帶電荷，當含有該殘基的肽存在于含水介質中時，該殘基被水溶液排斥至所述肽構象中的內部位置。帶有疏水側鏈的氨基酸包括酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性/極性氨基酸殘基這種殘基在生理pH值下不帶電荷，但是當含有該殘基的肽存在于含水介質中時，該殘基卻不足以能被水溶液排斥至所述肽構象的內部位置。帶有中性/極性側鏈的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。本說明書中還將一些氨基酸定義為“小的”的氨基酸，因為它們所帶的側鏈的大小(即使極性基團缺失)不足以賦予疏水性。除了脯氨酸外，“小的”氨基酸是指當極性基團位于側鏈上時含有4個或低于4個碳原子的氨基酸或者當極性基團不位于側鏈時含有3個或低于3個碳原子的氨基酸。帶有小的側鏈的氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。基因編碼的二級氨基酸脯氨酸是一個具體情況，這是由于其已知能夠影響肽鏈的二級結構。脯氨酸的結構不同于所有其它天然存在的氨基酸，因為它的側鏈鍵與α氨基的氮原子和α碳原子結合。但幾種氨基酸相似性矩陣(例如，PAM120矩陣和PAM250矩陣)公開于例如Dayhoff等(1978)Amodelofevolutionarychangeinproteins。MatrixfordeterminingdistancerelationshipsInM.O.Dayhoff，(ed.)，Atlasofproteinsequenceandstructure，Vol.5，pp.345-358，NationalBiomedicalResearchFoundation，WashingtonDC；andbyGonnet等，1992，Science256(5062)144301445)，將脯氨酸包含在與甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸相同的組。因此，在本發明中，脯氨酸也被歸入“小的”氨基酸。由于分類為極性或非極性所需要的吸引或排斥的程度是可以自行制定的，因此本發明特別涉及的氨基酸都已被歸類為了極性或非極性。大多數沒有特別命名的氨基酸可以根據已知行為來歸類。氨基酸殘基還可以分為環狀氨基酸或非環狀氨基酸，以及芳香族氨基酸或非芳香族氨基酸，根據殘基側鏈取代基團的自明性分類(self-explanatoryclassificationswithrespecttotheside-chainsubstituentgroupsoftheresidues)，以及分為小的氨基酸或大的氨基酸。所述殘基若含有總數為4個或低于4個的碳原子(包括羧基碳原子在內)，只要還存在另一極性取代，就被認為是小的殘基；當不存在另一極性取代時，若該殘基含有的碳原子(包括羧基碳原子在內)的總數是3個或低于3個，那么該殘基就被稱為是小的殘基。當然，小的殘基全部是非芳香族的。就天然存在蛋白質氨基酸而言，根據上述方案進行的分類列于下表。氨基酸亞分類基因編碼的二級氨基酸脯氨酸是一個例外，由于其已知能夠影響肽鏈的二級結構，因而沒有被分類。可以包含入SVPs的“修飾的”氨基酸是基因編碼氨基酸，它們已經經過了基因的翻譯后處理，例如，通過添加甲基，或者通過共價連接其它取代基或氧化或還原或其它共價修飾而進行的衍生。可以通過對修飾后形式進行特征分析將得到的修飾后的氨基酸歸類。例如，如果賴氨酸經過了在ε-氨基上酰化的修飾，那么修飾后形式就不能再歸類為堿性而應該是極性/中性氨基酸。一些不是基因密碼子編碼的常見氨基酸，包括，例如，β-丙氨酸(β-Ala)，或其它Ω-氨基酸，例如3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(2，3-diaP)、4-氨基丁酸等，α-氨基異丁酸(Aib)，肌氨酸(Sar)，鳥氨酸(Orn)，瓜氨酸(Cit)，t-丁基丙氨酸(t-BuA)，t-丁基甘氨酸(t-BuG)，N-甲基異亮氨酸(N-MeIle)，苯基甘氨酸(Phg)，和環己基丙氨酸(Cha)，去甲亮氨酸(Nle)，2-萘基丙氨酸(2-Nal)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；蛋氨酸亞砜(MSO)；和高精氨酸(Har)。這些氨基酸也不能方便地歸入具體的類別。根據上述定義，Sar、β-Ala和Aib是小的氨基酸；t-BuA，t-BuG，N-MeIle，Nle，Mvl，Cha，Phg，Nal，Thi和Tic為疏水氨基酸；2，3-diaP，Orn和Har是堿性氨基酸；Cit，乙酰Lys和MSO為中性/極性/大氨基酸。根據氨基酸的大小可以將不同Ω-氨基酸分為小(β-Ala和3-氨基丙酸)或大的氨基酸以及疏水氨基酸(所有其它Ω-氨基酸)。基因編碼氨基酸的其它氨基酸取代物也可以歸入屬于本發明范圍的SLEs，也可以根據其結構歸入這種常規方案。在所有本發明的SVPs中，可以任選地將1個或多個酰胺鍵(--CO--NH--)用另一種電子等排的鍵取代，例如--CH2NH--，--CH2S--，--CH2CH2，--CH＝CH--(順式和反式)，--COCH2--，--CH(OH)CH2-以及--CH2SO--。這種取代可以用本領域已知方法完成。下列文獻描述了含有這些替代-連接基團肽類似物的制備方法Spatola，A.F.，VegaData(March1983)，Vol.1，Issue3，“PeptideBackboneModifications”(綜述)；Spatola，A.F.，in“ChemistryandBiochemistryofAminoAcidsPeptidesandProteins”，B.Weinstein，eds.，MarcelDekker，NewYork，p.267(1983)(綜述)；Morley，J.S.，TrendsPharmSci(1980)pp.463-468(綜述)；Hudson，D.，等，IntJPeptProtRes(1979)14177-185(--CH2NH--，--CH2CH2--)；Spatola，A.F.，等，LifeSci(1986)381243-1249(--CH2--S)；Hann，M.M.，JChemSocPerkinTransI(1982)307-314(--CH--CH--，順式和反式)；Almiquist，R.G.，等，JMedChem(1980)231392-1398(--COCH2--)；Jennings-White，C.，等，TetrahedronLett(1982)232533(--COCH2--)；Szelke，M.，等，歐洲專利申請EP45665(1982)CA9739405(1982)(--CH(OH)CH2--)；Holladay，M.W.，等，TetrahedronLett(1983)244401-4404(--C(OH)CH2--)；和Hruby，V.J.，LifeSci(1982)31189-199(--CH2--S--)。本申請中使用的蛇毒蛋白酶蛋白″生物活性部分″包括參與相互作用的蛇毒蛋白酶蛋白片段，例如，分子內或分子間相互作用。分子內-相互作用可以是特異性結合的相互作用或酶的相互作用(例如，所述相互作用可以是瞬時的且可使共價鍵形成或斷裂)。分子間-相互作用可以是蛇毒蛋白酶分子和非蛇毒蛋白酶分子之間的相互作用，例如凝血酶原，或者第一蛇毒蛋白酶分子，例如蛇毒蛋白酶輕鏈，和第二蛇毒蛋白酶分子之間的相互作用例如，二聚體化相互作用)。蛇毒蛋白酶蛋白的生物活性部分包括含有具有下述特征氨基酸序列的肽即與蛇毒蛋白酶蛋白的氨基酸序列足夠同源或源自蛇毒蛋白酶蛋白的氨基酸序列，例如SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列，這些肽含有的氨基酸比全長蛇毒蛋白酶蛋白少而且顯示了蛇毒蛋白酶蛋白的至少1種活性。通常，生物活性部分含有具有蛇毒蛋白酶蛋白至少1種活性的結構域或基序，例如，如在無鈣和/或磷脂存在下，將凝血酶原處理成為凝血酶的能力。蛇毒蛋白酶蛋白的生物活性部分可以是長度為例如10、25、50、100、200或更多個氨基酸的多肽。優選地，所述片段是一種“生物活性部分”，具有本申請所述蛇毒蛋白酶的不低于凝血酶原處理活性的1％，優選不低于10％，更優選不低于25％，以及甚至更優選不低于50％。本發明包括本發明所述蛇毒蛋白酶的“片段”，“片段”一詞的范圍內包括蛇毒蛋白酶的重鏈和輕鏈。一個實施方案中，所述片段是一種含有如下所述氨基酸序列的肽(殘基編號如圖27所示)KREASLPDFVQS(第181-192位殘基)[SEQIDNO19]LKKSDNPSPDIR(第198-209位殘基)[SEQIDNO20]SVXVGEIXXSR(第260-270位殘基)[SEQIDNO21]MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK(殘基1-29)[SEQIDNO22]ANRFLQRTKR(第31-40位殘基)[SEQIDNO23]KREASLPDFVQSXXAXXLKKSDNPSPDIR(第181-209位殘基)[SEQIDNO24]MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKXANRFLQRTKR(第1-40位殘基)[SEQIDNO25]X可以為任一氨基酸。應該理解的是，上述肽片段的肽亞片段也包括在本發明范圍之內，例如SEQIDNO19和20所示肽分別是SEQIDNO24所示肽的亞片段。其它片段和亞片段可以為本領域技術人員篩選。另一實施方案中，“片段”是一種小肽，例如至少6個，優選至少10個以及更至少20個氨基酸的長度。本發明還提供了含有不止1個肽段的較大片段，這種片段可以通過使用常規重組核酸技術獲得或者用常規液相或固相合成技術合成。可選地，可以通過用蛋白酶消化本發明所述多肽來制備這樣的肽，所述蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄狀球菌V8-蛋白酶。消化后的片段可以通過，例如，高效液相色譜(HPLC)技術純化。序列間同源性或序列同一性(本申請中這兩名詞可以交互使用)按下述方法計算為了測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列之間的同一性百分比，將所述序列比對從而優化對比的目的(例如，為進行比對，可以向第一和第二氨基酸或核酸序列中的之一或所有兩個中引入間隔，并且可以將非同源序列刪去)。一個優選實施方案中，用于比較的比對參照序列的長度為參照序列長度的至少30％，優選至少40％，更優選至少50％、60％，甚至更優選至少70％、80％、90％、100％。然后對相應的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸進行比較。如果第一序列中的位置被與第二序列中對應位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占居，那么該分子在該位置上是同一性的(本申請中的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。兩序列間的同一性百分比是這兩序列共有的同一性位置數目的函數，其中將為這兩序列優化比對而引入的間隔的數目和長度也考慮在內。序列間的比較和同一性百分比的測定可以用數學算法來完成。一個優選實施方案中，兩氨基酸序列間的同一性百分比是用NeedlemanandWunsch((1970)J.Mol.Biol.48444-453)算法測定的，該算法已被引入GCG軟件包中的GAP程序(可從http//www.gcg.com獲得)，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，間隔權重為16，14，12，10，8，6或4，長度權重為1，2，3，4，5或6。另一優選實施方案中，兩核苷酸序列間同一性百分比是用入GCG軟件包中的GAP程序(可從http//www.gcg.com獲得)測定的，使用NWSgapdna.CMP矩陣，間隔權重為40，50，60，70或80，長度權重為1，2，3，4，5，或6。具體優選的一套參數(除非另有說明就應該使用的一套參數)使用Blossum62計分矩陣，間隔罰分為12，間隔距離(extend)罰分為4，移碼間隔罰分為5。兩核苷酸序列間同一性百分比可以用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，411-17)算法測定，該算法已被引入ALIGN程序(2.0版)，使用PAM120權重殘基表(weightresiduetable)，間隔長度罰分為12，間隔罰分為4。本申請所述核酸和蛋白序列可用作″查詢序列″，在公共數據庫中進行搜索，例如以鑒定其它家族成員或相關序列。這種搜索可以用Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215403-10中的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)完成。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序，分值＝100，字節長度＝12，獲得與本發明53010核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以使用XBLAST程序，分值＝50，字節長度＝3獲得與本發明53010個蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得比較用的帶間隔的比對(gappedalignment)，可以使用Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.253389-3402一文中的GappedBLAST。當使用BLAST和GappedBLAST程序時，可以使用各個程序的默認參數(例如，XBLAST和NBLAST)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov.本發明具體優選的蛇毒蛋白酶多肽具有基本上等同于SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示的氨基酸序列的氨基酸序列。在氨基酸序列的范疇內，本申請使用的“基本上等同”是指第一氨基酸序列含有足夠或最少數目的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基與第二核酸序列中的比對氨基酸i)相同或ii)是其保守取代，從而使得這兩氨基酸序列具有共同結構域和/或共同功能活性。例如，含有具有下述特征共同結構域的氨基酸序列為基本上等同的即與SEQIDNO2，5，8，11，14或17具有至少約60％或65％同一性，很可能75％同一性，更可能85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。在核苷酸序列的范疇內，本申請使用的“基本上等同”是指第一核酸序列含有足夠或最少數目的相同核苷酸，所述氨基酸與第二核酸序列的比對核苷酸相同，從而使得第一和第二核苷酸序列能夠編碼出具有相同功能活性的多肽或者編碼出相同結構的多肽結構域或相同功能多肽活性。例如，與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18具有至少約60％或65％同一性，很可能75％同一性，更可能85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的核酸序列為基本上等同的。本申請中使用的″受試者″是指人和非人動物。本發明的“非人動物”包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物，例如非人靈長類(特別是較高等的靈長類)，綿羊、狗、嚙齒類(如，小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、豬、貓、兔，以及非哺乳動物，例如雞，兩棲動物，爬行動物等。一個優選實施方案中，所述受試者為人。另一實施方案中，所述受試者是實驗動物或適合作為疾病模型的動物。本申請使用的″細胞的純化制備物″是指體外細胞制備物在細胞源自多細胞生物體的情況(例如，植物和動物)，細胞的純化制備物是獲自生物體的細胞子集，而非整個完整的生物體。在細胞源自單細胞微物的情況(例如，培養物細胞和微生物細胞)，細胞的純化制備物是由至少10％，更優選至少50％的受試者細胞制備物組成的。所有變體都落在本發明蛇毒蛋白酶蛋白“同系物”的范圍之內。本申請通常使用的“同系物”與本發明的核酸或氨基酸序列之間具有一定程度的核苷酸或氨基酸序列相互關系，具體程度視情況而定。源自不同蛇的本發明蛇毒蛋白酶蛋白彼此互為同系物。所述同系物中包括“直向同源物”，這些直向同源物是蛇毒蛋白酶蛋白及其編碼核酸，分離自除Pseudonajatextilis，Oxyuranusscutellatus，Notechisscutatus，Tropidechiscarinatus和Pseudechisporphyriacus之外的生物體。另外，上述源自蛇種之一的蛇毒蛋白酶蛋白是上述任一其它蛇種的直向同源物。例如，源自P.textilis的蛇毒蛋白酶蛋白是源自O.scutellatus的蛇毒蛋白酶蛋白的直向同源物。本發明涉及的其它衍生物包括，但不限于，側鏈修飾、非天然氨基酸和/或它們的衍生物，在肽、多肽或蛋白合成過程中的摻入，以及使用交聯劑和向本發明多肽、片段及變體施加結構限定的方法。本發明所涉及側鏈修飾實例包括氨基酸修飾，例如，用乙酸酐對氨基進行酰化；用丁二酸酐和四氫化鄰苯二甲酸酐對氨基進行酰化；用乙酰亞胺甲酯(methylacetimidate)酰胺化；用氰酸鹽對氨基進行甲氨酰化；用5-磷酸吡哆醛對賴氨酸進行吡哆醛化(pyridoxylation)然后NaBH4還原；通過與乙醛反應進行還原性烷基化，然后用NaBH4還原；以及用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基進行三硝基苯磺酸化(trinitrobenzylation)。可以通過下述操作對羧基進行修飾通過形成O-乙酰異尿素(O-acylisourea)，然后衍生為例如相應的酰胺實現碳化二亞胺活化。精氨酸殘基的胍基可以通過與2，3-丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛等試劑形成雜環縮合產物完成修飾。可以用來修飾巰基的方法有，例如，過甲酸氧化為半胱氨酸；用氯化汞基苯磺酸(chloromercuriphenylsulphonicacid)、4-氯高汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚，氯化苯汞以及其它汞劑形成汞劑衍生物(mercurialderivatives)；用其它硫羥基化合物形成混合二硫化物；與馬來酰亞胺、馬來酐或其它取馬來酰亞胺反應；用碘乙酸或碘乙酰胺進行羧甲基化；以及在堿性pH用氰酸鹽進行甲氨酰化。色氨酸殘基可以通過下列方法修飾，例如，用2-羥基-5-硝基溴化物或磺酰鹵化物將吲哚環烷基化，或者用N-溴丁二酰亞胺氧化。酪氨酸可以通過用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生。組氨酸殘基的咪唑環可以通過下述方法修飾即用焦碳酸二乙酯進行N乙酯基化(N-carbethoxylation)或者用碘乙酸衍生物進行烷基化。在肽合成過程中引入非天然氨基酸及衍生物的實例包括但不限于，使用4-氨基丁酸，6-氨基己酸，4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸(phenylpentanoicacid)，4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，t-丁基甘氨酸，去甲亮氨酸，去甲纈氨酸，苯基甘氨酸，鳥氨酸，肌氨酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構物。本發明的分離的凝血酶原活化蛋白(包括其片段、變體、衍生物和同系物)可以用本領域技術人員已知的任一合適方法制備。本發明的各個方面將在下文作進一步詳述。分離的核酸分子一個方面，本發明提供了一種分離的或純化的核酸分子，該核酸分子編碼本申請所述蛇毒蛋白酶多肽，例如，全長蛇毒蛋白酶蛋白或其片段，例如蛇毒蛋白酶蛋白的生物活性片段。本發明還包括適于用作雜交探針的核酸片段，該核酸片段可用于例如鑒定編碼本發明多肽的核酸分子，蛇毒蛋白酶mRNA，以及適于用作引物的片段，例如，用于擴增或突變核酸分子的PCR引物。一個實施方案中，本發明的分離的核酸分子包括SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示的核苷酸序列，或這些核苷酸序列中任一的部分。一個實施方案中，所述核酸分子包括蛇毒蛋白酶蛋白的編碼序列(即，SEQIDNO1，4，7，10，13或16的″編碼區″，分別如SEQIDNO3，6，9，12，15或18所示)，以及5’非翻譯序列。可選地，所述核酸分子可以只含有SEQIDNO1，4，7，10，13或16的″編碼區″(例如，分別為SEQIDNO3，6，9，12，15或18)，例如，沒有任何通常情況下伴隨該靶序列的側翼序列。另一實施方案中，所述核酸分子編碼相應于蛋白片段的序列。例如，所述核酸分子編碼蛇毒蛋白酶原肽、輕鏈、活化肽和重鏈中的一種或多種。另一實施方案中，所述核酸分子可編碼一種或多種本申請所述結構域或區域。另一個實施方案中，本發明的分離的核酸分子包括互補的核酸分子，例如，SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列的全長互補鏈，或者這些核苷酸序列中任一的部分，例如，編碼本申請所述結構域或區域的任一部分。其它實施方案中，本發明所述的核酸分子與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列充分互補以致于其能夠與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列(例如，在本申請所述嚴謹條件下)雜交從而形成穩定的雙鏈體。一個實施方案中，本發明的分離的核酸分子包括與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列全長具有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高同源性的核苷酸序列或其一部分，優選與這些核苷酸序列中任一個等長。蛇毒蛋白酶核酸片段本發明的核酸分子可以只含有SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列的一部分。例如，所述核酸分子可以含有可用作探針或引物的片段或者編碼部分蛇毒蛋白酶蛋白的片段，例如，蛇毒蛋白酶蛋白的免疫原性部分或生物活性部分，例如，本申請所述蛇毒蛋白酶蛋白的免疫原性部分或生物活性部分。所述片段可以含有SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示的那些核苷酸，其編碼例如蛇毒蛋白酶的原肽、輕鏈、活化肽、重鏈、GLA結構域、EGF-1結構域、EGF-2結構域、或本申請所述任一其它結構域或區域。從蛇毒蛋白酶基因的克隆測得的核苷酸序列可以用于下述用途的探針和引物從其它物種中鑒定和/或克隆其它蛇毒蛋白酶家族成員、或其片段、以及蛇毒蛋白酶同系物或其片段。另一個實施方案中，所述核酸含有的核苷酸序列包括部分或全長編碼區，并延伸入5′和/或3′非編碼區。其它實施方案含有的片段包括編碼本申請所述氨基酸片段的核苷酸序列。核酸片段可以編碼本申請所述特定結構域或位點或其片段，具體為其長度為50，100，150，200，250，300，350，400，450，500或550氨基酸的片段。片段還包括對應于上述特定氨基酸序列或其片段的核酸序列。核酸片段不應該被理解為包括在本發明之前已經公開的那些片段。核酸片段可包括與本申請所述結構域、區域或功能位點對應的序列。核酸片段還可以包括一個或多個本申請所述結構域、區域或功能位點。因此，例如，蛇毒蛋白酶核酸片段可以包括與GLA結構域、EGF結構域或因子Va-樣結構域對應的序列。本發明還提供了蛇毒蛋白酶探針和引物。通常，核酸/探針是一種分離或純化的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包括一個具有下述特征的核苷酸序列區域即在本申請所述嚴謹條件下能夠與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16和/或18的有義或反義序列中至少約7、12或15個，優選約20或25個，更優選約30，35，40，45，50，55，60，65或75個連續核苷酸雜交，或者與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18的天然存在的等位基因變體或突變體雜交。優選地，寡核苷酸序列的長度少于約200，150，120或100個核苷酸。一個優選實施方案中，所述蛇毒蛋白酶探針或引物能夠與蛇毒蛋白酶的編碼核酸的區雜交，但是不與人因子Xa和/或trocarin的區域雜交。一個實施方案中，將所述探針或引物附著于固相支持物，例如，本申請所述固相支持物。一個范例性的引物試劑盒含有與編碼鏈退火的正向引物和與非編碼鏈退火的反向引物。所述正向引物能夠與起始密碼子退火，例如，編碼SEQIDNO2，5，8，11，14或17的第1位氨基酸殘基的核酸序列。所述反向引物能夠與最后一位密碼子退火，例如，緊鄰于終止密碼子之前的密碼子，例如，編碼SEQIDNO2，5，8，11，14或17的第581位氨基酸殘基的密碼子。一個優選實施方案中，正向引物和反向引物的退火溫度之間相差不超過5、4、3或2℃。一個優選實施方案中，所述核酸為一探針，長度為至少10，12，15，18，20個且少于200個，更優選少于100個，或少于50個核苷酸。它應該與本申請公開的序列等同或者相差1或2個，或少于5或10個核苷酸。如果作這種比較需要比對，那么應該將該序列做最大化同源性的比對。由于缺失或插入或錯配導致被“環”切去掉(loopout)的序列就是二者的差異部分。探針或引物可以源自編碼下列物之的核酸的有義或反義鏈原肽、輕鏈、活化肽、重鏈或其部分(或者這些區域中的結構域)。在另一個實施方案中，本發明提供了一套引物，例如，適于用于PCR的引物，其可用于擴增蛇毒蛋白酶序列的選擇區域，例如，本申請所述結構域、區域、位點或其它序列。所述引物的長度應該至少5，10或50個堿基對，并且少于100或少于200個堿基對。所述引物應該與本申請公開的序列或者天然存在變體等同或相差1個堿基。例如，提供了適于擴增任一下列區域全長或部分的引物原肽、輕鏈、活化肽、重鏈或其部分(或者這些區域中的結構域和位點)。核酸片段可以編碼帶有本申請所述多肽區域的表位。編碼″蛇毒蛋白酶多肽的生物活性部分″可以通過下述方法制備分離SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列中的一部分，該部分編碼的多肽具有蛇毒蛋白酶生物活性(例如，本申請所述的蛇毒蛋白酶蛋白的生物活性)；表達蛇毒蛋白酶蛋白的編碼部分(例如，通過體外重組表達)；以及對所述蛇毒蛋白酶蛋白的編碼部分的活性進行評估。編碼蛇毒蛋白酶多肽的生物活性的核酸片段可以含有長度大于300或更多個核苷酸的核苷酸序列。優選實施方案中，核酸含有長度至少約300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1300，1400或更多個核苷酸的核苷酸序列，并且能夠與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示核酸分子在本申請所述嚴謹條件下雜交。蛇毒蛋白酶核酸變體本申請還包括有別于SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示核苷酸序列的核酸分子。這種差別是由于遺傳密碼簡性的存在，并產生編碼與本申請所述核苷酸序列編碼的蛇毒蛋白酶蛋白相同的核酸。另一實施方案中，本發明的分離的核酸分子具有這樣一種核苷酸序列，其編碼的蛋白質的氨基酸序列與SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列相差至少1個，但低于5，10，20，50或100個氨基酸殘基。如果作這種比較需要比對，那么應該將所述序列做最大化同源性的比對。編碼的蛋白質相差不超過5，4，3，2，或1個氨基酸。由于缺失或插入或錯配導致被“環”切去掉的序列就是二者的差異部分。可以選擇具體表達系統優選或非優選密碼子的本發明的核酸。例如，所述核酸可以是其中的至少1個密碼子，優選密碼子中的至少10％或20％已經改變以至該序列適于在大腸桿菌、酵母、人、昆蟲或CHO細胞中表達。核酸變體可以是天然存在的，例如等位基因變體(同一座位)，同系物(不同座位)，以及直向同源(不同生物體)，或者非天然存在的。非-天然存在變體可以通過誘變技術制備，包括那些可用于多核苷酸、細胞或生物體的誘變技術。所述變體可包括核苷酸取代、缺失、倒位和插入。改變可以發生于編碼區和/或非編碼區二者或其中之一。改變能產生保守和非保守氨基酸取代(與編碼產物相比)。一個實施方案中，核酸同系物是分離自除下列蛇之外其它蛇的直向同源核酸Pseudonajatextilis，Oxyuranusscutellatus，Notechisscutatus，Tropidechiscarinatus和Pseudechisporphyriacus。一個優選實施方案中，所述核酸與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18之間具有例如如下所述的差異至少1個但少于10，20，30或40個核苷酸；至少1個但少于目的核酸中核苷酸總數的1％，5％，10％或20％。所述核酸可以相差不超過5，4，3，2，或1個核苷酸。如果作這種分析需要比對，那么應該將該序列做最大化同源性的比對。缺失或插入或錯配導致被“環”切去掉的序列就是二者的差異部分。直向同源物、同系物和等位基因變體可以用本領域已知方法鑒定。這些變體含有編碼多肽的核苷酸序列或該序列的片段，該核苷酸序列與SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示核苷酸序列通常具有至少約70-75％，更通常至少約80-85％，以及最通常至少約90-95％或更高的同一性，并且優選具有蛇毒蛋白酶活性。所述核酸分子可以根據能夠與SEQIDNO2，5，8，11，14，17所示核苷酸序列或其片段在本申請所述嚴謹條件下雜交很容易地鑒定出來。相應于本發明蛇毒蛋白酶cDNA的直向同源物、同系物和等位基因變體的核酸分子還可以通過對蛇毒蛋白酶基因相同的染色體或座位做圖而分離。優選的變體包括那些具有蛇毒蛋白酶活性的變體，例如，在鈣、磷脂和因子Va中一種或多種不存在時能夠誘導凝血。蛇毒蛋白酶的等位基因變體包括功能及非功能蛋白。功能性等位基因變體是蛇毒蛋白酶蛋白的天然存在的氨基酸序列變體，其保留了處理凝血酶原的能力。功能性等位基因變體通常只含有SEQIDNO2，5，8，11，14或17中一或多個氨基酸的保守性取代，或者該蛋白非關鍵區內非關鍵殘基的取代、缺失或插入。蛇毒蛋白酶的等位基因變體包括功能及非功能蛋白。功能性等位基因變體是蛇毒蛋白酶蛋白的天然存在的氨基酸序列變體，其不具有處理凝血酶原的能力。非功能性等位基因變體通常含有SEQIDNO2，5，8，11，14，17所示氨基酸序列的非保守性取代、缺失或插入或未成熟截短(prematuretruncation)，或者該蛋白關鍵區內關鍵殘基的取代、缺失或插入。另外，編碼其它蛇毒蛋白酶家族成員的核酸分子，從而其具有不同于SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18所示蛇毒蛋白酶序列的核苷酸序列，這些核酸分子也在本發明的范圍之內。本發明的分離的核酸同系物也可以通過使用核酸序列擴增技術的方法制備。一個實施方案中，所述方法包括下列步驟(i)從宿主細胞或動物獲取核酸提取物；(ii)制備一種或多種引物，可任選為簡并性的，其中所述每一引物都對應本發明的分離的核酸的一部分；以及(iii)使用所述引物通過核酸擴增技術從所述核酸提取物中擴增出一種或多種擴增產物。合適地，所述一種或多種引物設計為能夠與本發明雙鏈核酸中一條或另一條在擴增通常使用的退火和引物延伸條件下退火。就簡并性引物而言，引物與分離的核酸序列之間的序列差異是有意引入的目的是為了解決例如由于同源編碼序列之間簡并性導致的可能的序列變化。合適的擴增技術已為本領域技術人員所熟知，包括例如Ausubel等同上第15章中所述的聚合酶鏈反應(PCR)和連接酶鏈反應(LCR)；例如美國專利5,422,252中描述的鏈取代擴增(SDA)；例如國際專利申請WO92/01813和國際專利申請WO97/19193中公開的滾環復制(RCR)；例如Sooknanan等，1994，Biotechniques171077中所述的基于核酸序列的擴增(NASBA)；以及例如Tyagi等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA935395中描述的Qβ復制酶擴增；但不僅限于這些。優選的核酸序列擴增技術是PCR。本申請使用的“擴增產物”是指用本申請泛指的核酸擴增技術制備的核酸產物。核酸同系物可以編碼蛋白質同系物。因此，上述用于分離核酸同系物的方法也可以用于分離蛋白質同系物。分離的蛇毒蛋白酶多肽另一方面，本發明涉及一種分離的蛇毒蛋白酶蛋白或片段，例如，能夠用作免疫原或抗原以激發或測試(或者更常見的是結合)抗-蛇毒蛋白酶抗體的生物活性部分。所述蛇毒蛋白酶蛋白可以用常規蛋白純化技術分離自細胞或組織來源。一個實施方案中，所述蛇毒蛋白酶分離自下列蛇Pseudonajatextilis，Oxyuranusscutellatus，Notechisscutatus，Tropidechiscarinatus或Pseudechisporphyriacus。優選地，所述蛇毒蛋白酶分離自澳大利亞蛇的毒腺，例如，本申請所述的澳大利亞蛇。蛇毒蛋白酶蛋白或其片段可以用重組DNA技術或化學合成制備。本發明的多肽包括由于可變翻譯和翻譯后事件存在而生成的多肽。所述多肽可以在系統中表達，例如在培養物細胞中表達，從而產生與當該多肽在天然細胞中表達時基本上相同的翻譯后修飾；或者該多肽在這樣的系統中表達，其導致該多肽在天然細胞中表達時出現的翻譯后修飾(例如糖基化或切割)的改變或省略。一個優選實施方案中，蛇毒蛋白酶多肽具有一種或多種下列特性(i)能夠處理凝血酶原；(ii)其具有分子量例如推導分子量，優選忽略蛇毒蛋白酶多肽(例如SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示多肽)的翻譯后修飾，氨基酸組成或其它物理特性的任何影響；(iii)其與蛇毒蛋白酶多肽(例如與SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示多肽)具有至少60％，更優選至少70，80，90，或95％的總體序列相似性；(iv)其與一種或多種本申請所述結構域或區域具有基本上等同的序列，例如，如本申請所述。一個優選實施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白或其片段不同于SEQIDNO2，5，8，11，14或17中的相應序列。一個實施方案中，相差至少1個但少于15、10或5個氨基酸殘基。另一個優選實施方案中，與SEQIDNO2，5，8，11，14或17中相應序列間相差至少1個殘基，但相差少于SEQIDNO2，5，8，11，14或17中相應序列中的殘基的20％，15％，10％或5％。(如果作這種比較需要比對，那么應該將所述序列做最大化同源性的比對。缺失或插入或錯配導致被“環”切去掉的序列就是二者的差異部分。)這些差異優選是在非必需殘基上的差異或改變或者是保守取代。其它實施方案包括氨基酸序列中含有1處或多處變化的蛋白質，例如，非活性所必需氨基酸殘基的變化。這些蛇毒蛋白酶蛋白的氨基酸序列不同于SEQIDNO2，5，8，11，14或17，但仍保留生物活性。一個實施方案中，所述蛋白質含有的氨基酸序列與SEQIDNO2，5，8，11，14或17具有至少約50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或更高的同源性，且具有蛇毒蛋白酶生物活性。一個實施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白生物活性部分包括一種或多種下列結構域GLA結構域、EGF-1結構域、EGF-2結構域和因子Va樣結構域。另外，其它生物活性部分(其中所述蛋白的其它區域缺失)，可以通過重組技術制備，并對天然蛇毒蛋白酶蛋白的一種或多種功能活性進行評估。一個優選實施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白具有SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示的氨基酸序列。其它實施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白基本上等同于SEQIDNO2，5，8，11，14，或17，且保留有SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示蛋白的生物活性，詳見上文章節中的描述。一個優選實施方案中，所述蛇毒蛋白酶蛋白保留了在鈣、磷脂和因子Va中的一種或多種不存在時處理凝血酶原的能力，優選保留了在鈣和磷脂都不存在時處理凝血酶原的能力。蛇毒蛋白酶的嵌合蛋白或融合蛋白另一方面，本方面提供了蛇毒蛋白酶的嵌合或融合蛋白。本申請使用的蛇毒蛋白酶″嵌合蛋白″或″融合蛋白″包括與非蛇毒蛋白酶多肽相連的蛇毒蛋白酶多肽。″非蛇毒蛋白酶多肽″是指一種多肽，其具有不同于蛇毒蛋白酶蛋白并源自相同或不同的生物體的蛋白的相應氨基酸序列。融合蛋白的蛇毒蛋白酶多肽可以對應于蛇毒蛋白酶氨基酸序列的全長或部分，例如本申請所述的片段。一個優選實施方案中，蛇毒蛋白酶融合蛋白含有至少一種(或兩種)蛋白酶蛋白的生物活性部分。可將所述非蛇毒蛋白酶多肽融合于所述蛇毒蛋白酶多肽的N-末端或C-末端。一個實施方案中，所述“非蛇毒蛋白酶多肽”是除蛇毒蛋白酶之外的來自凝血酶原活化蛋白的原肽，例如，它是哺乳動物因子Xa的原肽，例如人因子Xa。另一實施方案中，所述“非蛇毒蛋白酶多肽”可以含有除蛇毒蛋白酶之外的凝血酶原活化蛋白的活化肽，例如，哺乳動物因子Xa，例如人因子Xa的活化肽。另一實施方案中，所述嵌合或融合多肽含有來自“非蛇毒蛋白酶多肽”，例如，來自哺乳動物因子Xa多肽(如人因子Xa多肽)的原肽和活化肽。所述融合蛋白可以包含具有對配體具有具有高親合力的部分。例如，所述融合蛋白可以是GST-蛇毒蛋白酶融合蛋白，其中蛇毒蛋白酶序列融合于GST序列的C-末端。所述融合蛋白能有助于重組蛇毒蛋白酶的純化。可選地，所述融合蛋白可以是在其N-末端含有異源信號序列的蛇毒蛋白酶蛋白。在一些宿主細胞(例如，哺乳動物宿主細胞)中，可以通過使用異源信號序列增強蛇毒蛋白酶的表達和/或分泌。融合蛋白可以包含全長或部分血清蛋白，例如，IgG恒定區，或人血清白蛋白。本發明所述的蛇毒蛋白酶融合蛋白可以引入藥物組合物，施用到受試者體內。所述蛇毒蛋白酶融合蛋白可用于改變蛇毒蛋白酶底物的生物利用度。另外，本發明所述的蛇毒蛋白酶融合蛋白可以用作免疫原，在受試者體內制備抗-蛇毒蛋白酶抗體，用于純化蛇毒蛋白酶配體以及在篩選試驗中鑒定能抑制蛇毒蛋白酶與蛇毒蛋白酶底物相互作用的分子。已經編碼融合部分(例如，GST多肽)的表達載體可從商業化途徑購得。可以將蛇毒蛋白酶編碼核酸克隆入所述表達載體從而將所述融合部分連接入蛇毒蛋白酶蛋白的閱讀框內。蛇毒蛋白酶蛋白的變體另一方面，本發明還提供了一種蛇毒蛋白酶多肽的變體，例如，可用作激動劑(模擬物)或拮抗劑的變體。蛇毒蛋白酶蛋白的變體可通過下述方法制備例如，誘變例如離散點突變(discretepointmutation)，序列的插入或缺失，或蛇毒蛋白酶蛋白的截短。蛇毒蛋白酶蛋白的激動劑可基本上保留了蛇毒蛋白酶蛋白天然存在形式的完全相同的或部分生物活性。蛇毒蛋白酶蛋白拮抗劑能抑制蛇毒蛋白酶蛋白天然形式的一種或多種活性，例如通過競爭性調控蛇毒蛋白酶蛋白的蛇毒蛋白酶介導的活性。因此，用具有限制功能的變體處理能激發特定生物反應。蛇毒蛋白酶蛋白的變體可以通過對蛇毒蛋白酶蛋白的變體，例如截短變體的文庫進行激動劑或拮抗劑活性篩選而鑒定。例如，蛇毒蛋白酶蛋白編碼序列的片段文庫，例如N末端、C末端或內部片段的文庫可用于制備一組千差萬別的片段，用于篩選以及隨后選擇蛇毒蛋白酶蛋白變體。具有下述特征的變體是特別優選的即添加或缺失了半胱氨酸殘基的變體，添加或缺失了鈣結合殘基例如羧基谷氨酸殘基或天冬酰胺殘基的變體，添加或缺失了糖基化殘基的變體。從用定點誘變或截短方法制備的重組文庫中篩選基因產物的方法，以及從cDNA文庫中篩選具有選定特性的基因產物的方法都已為本領域所知。這類方法調整后可用于對通過蛇毒蛋白酶蛋白進行組合誘變后制得文庫進行快速篩選。回歸整體誘變(Recursiveensemblemutagenesis)(REM)是一項用于提高文庫中功能突變體出現頻率的新技術，可與篩選試驗結合鑒定蛇毒蛋白酶變體(ArkinandYourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA897811-7815；Delgrave等(1993)ProteinEngineering6327-331)。另一方面，本發明涉及一種制備蛇毒蛋白酶多肽的方法，例如，一種具有非野生型活性的肽，例如，天然存在的蛇毒蛋白酶多肽的拮抗劑、激動劑或超激動劑，例如，天然存在的蛇毒蛋白酶多肽。該方法包括改變蛇毒蛋白酶多肽的序列，例如通過對一或多個殘基進行取代或缺失改變本文公開的非保守區，結構域或殘基的序列；然后檢測改變后的多肽的所需活性。另一方面，本發明涉及制備蛇毒蛋白酶多肽的片段或類似物的方法，該片段或類似物具有天然蛇毒蛋白酶多肽的生物活性。該方法包括例如通過對蛇毒蛋白酶多肽的一或多個殘基進行取代或缺失改變本文所述的序列，例如改變本文所述非保守區、結構域或殘基的序列；然后檢測改變后多肽的所需活性。抗蛇毒蛋白酶抗體另一方面，本方面提供了抗蛇毒蛋白酶抗體或其片段(例如，其抗原結合片段)。本申請中使用的“抗體”是指免疫球蛋白分子或其免疫原性活性部分，即抗原結合部分。本申請中使用的“抗體”是指含有至少1個且優選兩個重(H)鏈可變區(本申請中縮寫為VH)以及至少1個且優選兩個輕(L)鏈可變區(本申請中縮寫為VL)的蛋白質。所述的VH和VL區可進一步分為名為“互補決定區”(″CDR″)的高變區，其中分散有的較為保守的區域即“骨架區”(FR)。骨架區和CDR的范圍已作精確限定(參見，Kabat，E.A.，等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，FifthEdition，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIHPublicationNo.91-3242，andChothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196901-917，這些文獻在此引入作為參考)。每一個VH和VL都是由3個CDR和4個Fs組成，從N-末端到C-末端按下列順序排列FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。抗蛇毒蛋白酶抗體還可以包括重鏈和輕鏈恒定區，從而分別形成免疫球蛋白的重鏈和輕鏈。一個實施方案中，所述抗體是兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過二硫鍵交聯在一起。重鏈的恒定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。輕鏈的恒定區由1個結構域CL組成。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區通常介導抗體與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)以及經典補體系統中的第一組分(Clq)。本申請使用的“免疫球蛋白”是指一或多種基本上由免疫球蛋白基因編碼的多肽所組成的蛋白質。識別的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ、ε和μ恒定區基因以及無數的可變區基因。全長的免疫球蛋白“輕鏈”(約25KDa或214個氨基酸)是由NH2-末端的可變區基因(約110個氨基酸)和COOH-末端的κ或λ恒定區基因編碼的。全長的免疫球蛋白“重鏈”(約50KDa或446個氨基酸)類似地由可變區基因(約116個氨基酸)和其它上述恒定區基因中的1種例如γ(編碼約330個氨基酸)編碼。本申請中使用的抗體的“抗原結合片段”(或者簡稱為″抗體部分″或″片段″)是指全長抗體中的1個或多個片段，其保留有特異性結合抗原的能力，例如，蛇毒蛋白酶多肽或其片段。抗蛇毒蛋白酶抗體的抗原結合片段的實例包括但不限于(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，由通過絞鏈區二硫橋連接在一起的兩個Fab片段組成的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單個臂上的VL和VH結構域組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)，由VH結構域組成；以及(vi)分離的互補決定區(CDR)。另外，盡管Fv片段的兩個結構域VL和VH是由分離基因編碼的，但是它們可以用重組方法通過一個合成接頭連接在一起，使得它們能被制成一單個蛋白鏈，其中VL和VH區域配對形成單價分子(已知為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。所述單鏈抗體也包括在抗體的″抗原結合片段″范圍內。這些抗體片段是使用本領域技術人員已知的重組技術制備的，篩選片段從而使其使用方式與完整抗體相同。所述抗蛇毒蛋白酶抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。其它實施方案中，所述抗體可重組制備，例如，通過噬菌體展示或通過組合方法(combinatorialmethod)制備。用于制備抗蛇毒蛋白酶抗體的噬菌體展示和組合方法已為本領域所知(描述見，例如，Ladner等，美國專利5,223,409；Kang等，國際公開WO92/18619；Dower等，國際公開WO91/17271；Winter等，國際公開WO92/20791；Markland等，國際公開WO92/15679；Breitling等，國際公開WO93/01288；McCafferty等，國際公開WO92/01047；Garrard等，國際公開WO92/09690；Ladner等，國際公開WO90/02809；Fuchs等，(1991)Bio/Technology91370-1372；Hay等，(1992)HumAntibodHybridomas381-85；Huse等，(1989)Science2461275-1281；Griffths等，(1993)EMBOJ12725-734；Hawkins等，(1992)JMolBiol226889-896；Clackson等，(1991)Nature352624-628；Gram等，(1992)PNAS893576-3580；Garrad等，(1991)Bio/Technology91373-1377；Hoogenboom等，(1991)NucAcidRes194133-4137；andBarbas等，(1991)PNAS887978-7982，所有文獻內容在此引入作為參考)。在優選的實施方案中，抗體是用下列物質免疫制得的純化的蛇毒蛋白酶抗原或其片段，例如本申請所述片段；組織，例如組織粗提物；全細胞，優選活細胞；裂解后的細胞或細胞碎片。全長蛇毒蛋白酶蛋白或蛇毒蛋白酶抗原性肽片段可用作免疫原，或者可用于對用其它免疫原，例如細胞、膜制備物等制得的抗蛇毒蛋白酶抗體進行鑒定。蛇毒蛋白酶的抗原性肽應該含有SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列中的至少8個氨基酸殘基，并且包括蛇毒蛋白酶的表位。優選地，所述抗原性肽含有10個氨基酸殘基，更優選至少15個氨基酸殘基，甚至更優選至少20個氨基酸殘基，以及最優選至少30個氨基酸殘基。優選實施方案中，所述抗蛇毒蛋白酶抗體能結合本申請所述的蛇毒蛋白酶區域、結構域或位點。本發明提供了與這些區域之一或本申請所述其它區域或結構域反應的或對其具有特異性的抗體。只結合原始蛇毒蛋白酶蛋白抗體，或只結合變性或其它非原始蛇毒蛋白酶蛋白的抗體，或者二者都結合的抗體，都在本發明的范圍內。帶有線性或構象表位的抗體也在本發明的范圍內。構象表位有時可以根據能與原始蛇毒蛋白酶蛋白結合但不能與變性蛇毒蛋白酶蛋白結合來鑒定。抗原性肽含有的優選表位是位于輕鏈或重鏈親水區的蛇毒蛋白酶區域以及具有高抗原性的區域。優選實施方案中，抗體能與下列物質中的1種或多種結合純化抗原；組織，例如組織切片；全細胞，優選活細胞；裂解的細胞或細胞成分。所述抗蛇毒蛋白酶抗體可以是一種單鏈抗體。單鏈抗體(scFV)可以改造(參見，例如，Colcher，D.等，(1999)AnnNYAcadSci880263-80；和Reiter，Y.(1996)ClinCancerRes2245-52)。可以將單鏈抗體二聚化或多聚化制得對同一目標蛇毒蛋白酶蛋白上不同表位特異的多價抗體。可以將所述抗體偶聯于一化合物，例如，標記物(如放射性核素)，或顯像劑，如放射性、酶促或其它顯像劑，例如，顯像劑如NMR對比劑。能產生可檢測的放射性發射信號或熒光的標記物是優選的。抗蛇毒蛋白酶抗體(例如，單克隆抗體)可用于通過常規技術分離蛇毒蛋白酶，例如通過親合層析或免疫沉淀。另外，抗蛇毒蛋白酶抗體可用于檢測蛇毒蛋白酶蛋白(例如，在細胞裂解物或細胞上清中)來評價蛋白質表達的豐度和模式。在診斷學上，抗蛇毒蛋白酶抗體可用于臨床測試方法中監測組織中的蛇毒蛋白酶水平。可以通過將抗體偶聯(即，物理連接)于可檢測物質(即，抗體標記)促進檢測。可檢測物質的實例包括各種酶、輔基(prostheticgroups)、熒光物質、發光材料、生物發光材料以及放射性物質。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適輔基復合物的實例包括鏈霉親合素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光物質的實例包括傘形酮(umbelliferone)、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹酰氯或藻紅蛋白；發光材料的實例包括魯米諾(luminal)；生物發光材料的實例包括螢光素酶、發光素和水母蛋白，合適的放射性物質的實例包括125I，131I，35S或3H。所述標記物可以選自生色原(chromogen)、催化劑、酶、熒光團、化學發光分子、稀土離子如銪(Eu34)、放射性同位素以及直接可見標記物。就直接可見標記物而言，可以利用下列形式膠體金屬或非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、有機聚合物、乳膠顆粒、脂質體或其它含有信號產生物質的顆粒等。大量可用作標記物的酶公開于美國專利說明書4,366,241，4,843,000，和4,849,338，在此引入作為參考。可用于本發明的酶標記物包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、熒光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。所述酶標記物可單獨使用也可與溶于溶液中的第二種酶結合使用。重組表達載體、宿主細胞以及遺傳構建細胞另一方面，本發明包括載體，優選為表達載體，其中含有編碼本申請所述多肽的核酸。本申請使用的″載體″一詞是指能運送與其連接的另一核酸的核酸分子，并包括質粒、粘粒或病毒載體。所述載體能自主復制或者能整合入宿主DNA。病毒載體包括，例如，復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒以及腺伴隨病毒。載體包括以適于表達宿主細胞中的核酸的形式而存在的蛇毒蛋白酶核酸。優選地，所述重組表達載體含有可操作連接于待表達序列的1或多個調控序列。″調控序列″包括啟動子、增強子和其它表達調控元件(例如，多聚腺苷酸化信號)。調控序列包括那些指導核苷酸序列組成型表達的調控序列，以及組織特異性調控序列和/或可誘導的序列。可以根據下列因素設計表達載體例如待轉化宿主細胞的選擇、目的蛋白的表達水平等。可以將本發明所述的表達載體導入宿主細胞從而制備出由本申請所述核酸編碼的蛋白質或多肽，包括融合蛋白或多肽(例如，蛇毒蛋白酶蛋白、融合蛋白等)。本發明所述的重組表達載體可以設計用于在原核或真核細胞中表達蛇毒蛋白酶蛋白。例如，本發明所述多肽可在大腸桿菌、昆蟲細胞(例如，使用桿狀病毒載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。合適宿主細胞的進一步討論見Goeddel，(1990)GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，CA。可選地，所述重組表達載體可以體外轉錄和翻譯，例如使用T7啟動子調控序列和T7聚合酶。原核細胞中的蛋白質表達最常見的是在大腸桿菌進行，使用含有指導融合或非融合蛋白表達的組成型或誘導型啟動子的載體。融合載體對其中編碼的蛋白添加了許多氨基酸，通常是在重組蛋白的氨基末端。所述融合載體通常用于下列三種目的1)增加重組蛋白的表達；2)提高重組蛋白的的溶解度；以及3)通過作為親合純化配體輔助重組蛋白的純化。通常，在融合部分與重組蛋白的結合處導入蛋白水解切割位點，使得能將重組蛋白從融合部分中分離出來，以純化融合蛋白。所述酶，及其同源(cognate)識別序列，包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。常用融合表達載體包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith，D.B.andJohnson，K.S.(1988)Gene6731-40)，pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)這三種載體分別把谷胱甘肽S轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白A融合于目的重組蛋白。在大腸桿菌中最大化重組蛋白的表達是指在蛋白水解切割該重組蛋白能力缺陷的宿主菌中表達該蛋白(Gottesman，S.，(1990)GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，California119-128)。另一種策略是改變待插入表達載體的核酸序列從而使編碼每一氨基酸的單個密碼子都是大腸桿菌優選的(Wada等，(1992)NucleicAcidsRes.202111-2118)。本發明核酸序列的這種改變可以通過常規DNA合成技術實現。所述蛇毒蛋白酶表達載體可以是酵母表達載體、在昆蟲細胞中表達的載體如桿狀病毒表達載體以及其它適于在哺乳動物細胞中表達的載體。當用于哺乳動物細胞時，所述表達載體的控制功能可通過病毒調控元件提供。例如，常用的啟動子源自多瘤病毒，腺病毒2，巨細胞病毒和猿猴病毒40。另一個實施方案中，所述啟動子是誘導型啟動子，例如，受類固醇激素調控的啟動子，受多肽激素調控的啟動子(例如，通過信號傳導途徑)，或受異源多肽調控的啟動子(例如，四環霉素誘導系統，“Tet-On”和“Tet-Off”；參見，例如，ClontechInc.，CA，GossenandBujard(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA895547，andPaillard(1989)HumanGeneTherapy9983)。另一個實施方案中，所述重組哺乳動物表達載體能指導特定細胞類型中優選核酸的表達(例如，組織特異性調控元件可用于表達核酸)。合適的組織特異性啟動子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝特異性的；Pinkert等，(1987)GenesDev.1268-277)；淋巴樣細胞特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)，具體為T細胞受體啟動子(WinotoandBaltimore(1989)EMBOJ.8729-733)和免疫球蛋白啟動子(Banerji等，(1983)Cell33729-740；QueenandBaltimore(1983)Cell33741-748)；神經元特異性啟動子(例如，神經絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA865473-5477)；胰腺特異性啟動子(Edlund等，(1985)Science230912-916)和乳腺特異性啟動子(例如，乳清啟動子；美國專利4,873,316和歐洲專利申請公開號264,166)。還包括發育調控啟動子，例如小鼠hox啟動子(Kessel和Gruss(1990)Science249374-379)和α-甲胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)GenesDev.3537-546)。一些實施方案中，當用于哺乳動物細胞時，所述表達載體可表達蛇毒蛋白酶輕鏈和重鏈，以及表達來自非蛇毒蛋白酶多肽(例如非蛇毒蛋白酶凝血酶原活化蛋白)的原肽結構域和/或活化肽，例如，來自哺乳動物因子X，如人因子X的原肽和/或活化肽。本發明進一步提供了一種重組表達載體，其包含以反義方向克隆入表達載體的本發明DNA分子。可以對可操作連接于以反義方向克隆的核酸的調控序列(例如，病毒啟動子和/或增強子)進行選擇，所述調控序列指導反義RNA在多種細胞類型中的組成型、組織特異性或細胞類型特異性表達。所述反義表達載體的使用形式可以是重組質粒、噬粒或減毒病毒。本方面另一方面提供了一種宿主細胞，其中含有本申請所述核酸分子，例如，位于重組表達載體內的蛇毒蛋白酶核酸分子，或含有能使其同源重組入宿主細胞基因組特定位點的序列的蛇毒蛋白酶核酸分子。“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在本申請中可以換用。這種詞匯不僅指具體的目的細胞還指目的細胞的后代或潛在后代。由于隨后的代次中由于突變或環境影響會發生一些修飾，所以后代實際上不可能與親代細胞完全相同，但是仍包括在本發明的范圍之內。宿主細胞可以是任一原核或真核細胞。例如可將蛇毒蛋白酶蛋白可以在以下細胞中表達細菌細胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞(例如中華倉鼠卵巢細胞(CHO)或COS細胞(非洲綠猴腎細胞CV-1原代SV40細胞；Gluzman(1981)CellI23175-182))。其它合適的宿主細胞已為本領域所知。可以通過常規轉化或轉染技術將載體DNA導入宿主細胞。本申請使用的″轉化″和″轉染″都是用來指本領域所認可的用于將外源核酸(例如，DNA)導入宿主細胞多種技術，包括磷酸鈣和氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染法(lipofection)或電穿孔。本發明的宿主細胞可用于制備(即表達)蛇毒蛋白酶蛋白。因此，本發明進一步還提供了使用本發明所述宿主細胞制備蛇毒蛋白酶蛋白，例如，本申請所述蛇毒蛋白酶蛋白的方法。一個實施方案中，所述方法包括在合適的培養基中培養本發明所述宿主細胞(其中已經導入了編碼蛇毒蛋白酶蛋白的重組表達載體)，從而制備出蛇毒蛋白酶蛋白。另一實施方案中，所述方法進一步還包括從培養基或宿主細胞分離蛇毒蛋白酶蛋白。另一方面，本發明涉及一種人細胞，例如，造血干細胞，該細胞用編碼目的蛇毒蛋白酶多肽的核酸轉化。信息學(informatics)蛇毒蛋白酶的序列可以在多種有助于其使用的載體中提供。與蛋白質和核酸不同，記錄序列可以作為制品提供。所述制品能以一種形式提供核苷酸或氨基酸序列(例如，開放閱讀框)，這種形式可以使用不可直接用于檢測核苷酸或氨基酸序列或其子集的工具，例如通過序列分析程序或直接觀察，來對制品進行檢測，就如同它們以天然或純化形式存在那樣。序列信息可包括但不限于，SVP全長核苷酸和/或氨基酸序列，部分核苷酸和/或氨基酸序列，多態性序列(包括單核苷酸多態性(SNPs))，表位或結構域序列等。一個優選實施方案中，所述制品是一種機讀載體，例如，磁、光學、化學或機械信息存儲設備。本申請使用的“機讀載體”是指可被機器直接閱讀或訪問的載體，例如，數字計算機或模擬計算機。計算機的非限制性實例包括臺式PC，便攜式電腦，大型電腦(mainframe)，服務器(例如網絡服務器、互連網服務器，或服務器田)，便攜式數字助理(handhelddigitalassistant)，呼叫器，移動電話等等。所述計算機可以是單機也可以是聯網，例如，局域網(例如VPN或內網)，廣域網(例如，外網或因特網)，或電話網(例如，無線，DSL，或ISDN網絡)。機讀載體包括但不限于磁存儲載體，例如軟盤，硬盤存儲載體，和磁帶；光學存儲載體例如CD-ROM；電子存儲載體例如RAM，ROM，EPROM，EEPROM，快閃記憶(flashmemory)等；以及這些類別的雜合體例如磁/光存儲載體多種數據存儲結構都可以被本領域技術人員用于制備機讀介質，其上記錄本發明所述核苷酸或氨基酸序列。數據存儲結構的選擇通常根據獲取存儲信息的方法來選擇。此外，可用多種數據處理器程序和格式將本發明所述核苷酸序列存儲在計算機可讀載體上。序列信息可以保存為文字處理文本文件，格式化于商業化軟件例如WordPerfect和MicrosoftWord，或者保存為ASCII文件，存儲于數據庫應用，例如DB2，Sybase，Oracle等中。本領域技術人員可以很容易地采集任意數目的數據處理器結構格式(例如，文本文件或數據庫)，以獲得記錄了本發明核苷酸序列信息的計算機可讀載體。一個優選實施方案中，所述序列信息存儲于相關數據庫(例如Sybase或Oracle)。該數據庫具有用于存儲序列(核酸和/或氨基酸序列)的第一表格(firsttable)。可以將序列信息存入表行的一個字段(field)(例如，第一列)，并將序列的注冊碼(identifier)存入該行的另一字段(例如，第二列)。該數據庫可以有第二表格，例如，存儲標注(annotation)。第二表格可以具有一個序列注冊碼的字段、一個描述信息塊(descriptor)或標注文本(annotationtext)(例如，描述信息塊可指序列的功能)的字段、一個標注所指的序列起始位置的字段，以及一個標注所指的序列最后位置的字段。氨基酸序列標注的非限制性實例包括多肽結構域，例如，本申請所述結構域；活性位點及其它功能氨基酸；以及修飾位點。通過以計算機可讀形式提供本發明所述核苷酸或氨基酸序列，本領域技術人員通常可以為多種目的而常規獲得序列信息。例如，本領域技術人員可以使用計算機可讀形式的本發明所述核苷酸或氨基酸序列，將靶序列或靶結構基序與數據存儲工具中的序列信息進行比較。可以用搜索來鑒別與具體靶序列或目的基序匹配的本發明的片段或區域。所述搜索可以是BLAST搜索或其它常用序列比較。例如，本申請所述的搜索。因此，一個方面，本發明提供了一種分析SVP序列的方法，例如，分析結構、功能或者與其它1種或多種核酸或氨基酸序列的相關度。該方法包括提供SVP核酸或氨基酸序列；將SVP與第二序列進行比較，所述第二序列為例如，一種更優選為來自序列集的多種列，例如，核酸或蛋白數據庫，從而分析SVP。該方法可在機器例如計算機上進行，或者由本領域技術人員手工操作。該方法可以包括評估SVP序列與第二序列之間的序列同一性，例如，數據庫序列。也可以通過在第二位置處訪問數據庫來實施該方法，例如在互聯網上。本申請使用的“靶序列”可以是六個或更多個核苷酸中的任一DNA或者是兩個或多個氨基酸的氨基酸序列。本領域技術人員可以很容易地認識到靶序列越大，那么靶序列在數據庫中隨機出現的可能性就越小。靶序列的常見序列長度為約10-100個氨基酸或約30-300個核苷酸殘基。但是，很容易理解的是商業意義的片段，例如，參與基因表達和蛋白處理的序列片段的長度可以較短一些。電腦軟件是公眾能夠得到的，所以本領域技術人員能夠訪問計算機可讀載體提供的序列信息，進行分析及與其它序列比較。多種已知算法都已向公眾公開，而且多種用于進行搜索的商業化軟件可用于本發明中以電腦為基礎的系統。所述軟件的實例包括但不限于，MacPattern(EMBL)，BLASTN和BLASTX(NCBI)。因此，本發明涉及一種制備SVP序列的序列計算機可讀記錄的方法，其中包括將該序列記錄在計算機可讀矩陣上。一個優選實施方案中，所述記錄包括1種或多個下列過程鑒定ORF；鑒定結構域、區域或位點；鑒定轉錄起始位點；鑒定轉錄終止子；蛋白的全長氨基酸序列或其成熟形式；翻譯區的5’末端。另一方面，本發明涉及一種分析序列的方法。該方法包括提供一種SVP序列，或其機讀形式的記錄；比較第二序列與該SVP序列，例如，分析該SVP序列中有無特定基序或結構域；從而分析該序列。比較包括比較序列的同一性或測定一個序列是否包含在另一序列內，例如，測定所述SVP序列是否含有所比較的序列。一個優選實施方案中，所述SVP或第二序列存儲于第一個計算機，例如，在第一位置，并在第二個計算機，例如在第二位置，進行比較、閱讀或記錄。例如，可將SVP或第二序列保存于一臺計算機的公共或專屬數據庫，在第二臺計算機上計算，閱讀和記錄比較的結果。一個優選實施方案中，所述記錄包括1種或多個下列過程鑒定ORF；鑒定結構域、區域或位點；鑒定轉錄起始位點；鑒定轉錄終止子；蛋白的全長氨基酸序列或其成熟形式；翻譯區的5’末端。文庫本發明包括源自本申請所述蛇的核酸或蛋白文庫，例如，棕蛇、兇猛太攀蛇、海岸太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇或粗鱗蛇。核算文庫可以是基因組文庫或cDNA文庫。cDNA文庫可源自特定組織，例如，毒腺組織。通常，一個文庫含有至少102，103，104，105或更多個不同成員。所述核酸文庫成員可插入載體，例如，表達載體如誘導型表達載體之中。蛋白質文庫可以用多種方式展示，例如，噬菌體展示或細胞展示系統。陣列及其用途另一方面，本發明涉及一種陣列，其中包括具有眾多地址的底物(substrate)。所述陣列可以是核酸陣列或蛋白質陣列。核酸陣列能展示源自1種或多種本申請所述蛇的核酸文庫。蛋白陣列能展示源自1種或多種本申請所述蛇的蛋白、多肽或肽文庫。將蛋白質或核酸成員置于該陣列上的可鑒定地址。所述陣列的密度為至少小于10，50，100，200，500，1,000，2,000，或10,000或更多個地址/cm2，以及介于其間的范圍(rangesbetween)。一個優選實施方案中，所述眾多地址包括至少10，100，500，1,000，5,000，10,000，50,000個地址。一個優選實施方案中，所述眾多地址包括等于或少于10，100，500，1,000，5,000，10,000，或50,000個地址。所述底物可以是一種二維底物例如玻片、晶片(例如，硅或塑料)、質譜板，或者三維底物，例如凝膠墊。可以將所述眾多地址之外的地址置于陣列上。一個優選實施方案中，在眾多地址中的至少1個含有核酸俘獲探針，該探針能與核酸文庫中的成員特異性雜交，例如，有義或反義鏈。一個優選實施方案中，眾多地址中的一個地址子集含有針對核酸文庫成員的核酸俘獲探針。該子集中的每一地址都可以含有能與文庫成員的不同區域雜交的俘獲探針。可以用各種方法制備陣列，例如，用光蝕刻方法(參見，例如，美國專利5,143,854；5,510,270；和5,527,681)，機械算法(例如，導向流算法，描述見美國專利5,384,261)，基于針的算法(pin-basedmethod)(例如，描述見美國專利5,288,514)，以及基于小珠的技術(bead-basedtechnique)(例如，描述見PCTUS/93/04145)。另一優選實施方案中，眾多地址中的至少1個地址含有能與SVP多肽或其片段特異性結合的俘獲探針。所述多肽可以是SVP多肽天然存在的相互作用配偶體。優選地，所述多肽是一種抗體，例如，本申請所述抗體(參見“抗-SVP抗體”上文)，例如單克隆抗體或單鏈抗體。藥物組合物本發明還提供了藥物組合物，其中包括本發明所述的蛇毒蛋白酶多肽和可藥用的載體。本申請中使用的″可藥用的載體″包括與藥物施用相匹配的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等滲及吸收延緩劑等。這些載體可選自但不限于蔗糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽，明膠，滑石粉，硫酸鈣，植物油，合成油，多元醇，褐藻酸，磷酸鹽緩沖溶液，乳化劑，聚乙二醇及其不同分子量形式，等滲鹽水和鹽如無機酸鹽包括氫氯化物，溴化物和硫酸鹽，有機酸鹽如醋酸鹽，丙酸鹽和丙二酸鹽以及無熱原水。描述可藥用的載體、稀釋劑及賦形劑的一本有用的參考書是Remington’sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCo.N.J.USA，1991)，在此引入作為參考。另外也可將補充活性化合物并入所述組合物。本發明的藥物組合物可用于促進或加速血液凝血。使用的實例包括向如外科手術過程中的流血傷口或損傷或創傷后的傷口給藥。一個方面，蛇毒蛋白酶多肽是所述藥物組合物中唯一的凝血成分。本發明藥物組合物的一個優點是血液凝血快速發生且無需多種成分如輔因子的后續或組合作用。例如，附加成分如鈣離子、因子Va和磷脂是非必需的。因此，一些實施方案中，所述藥物組合物不含有任一輔因子，例如，鈣、磷脂、因子Va或維生素K之一。其它實施方案中，所述藥物組合物可以含有鈣、磷脂、和因子Va中的1或多種，但非全部。一些實施方案中，所述藥物組合物可以含有附加成分或佐劑。例如，所述組合物可以含有下列物質中的1或多種抗微生物劑，例如，抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑，抗炎癥劑，抗組胺劑，抗纖維溶解劑和生長因子。抗生素的實例包括四環素，環丙沙星，慶大霉素，環孢菌素，頭孢噻唑(cefataxim)等。抗病毒劑的實例包括更昔洛韋(gangcyclovir)，齊多夫定(zidovudin)，三環癸胺(amantidine)，阿糖腺苷(vidarabin)，病毒唑(ribaravin)，三氟胸苷(trifluridine)，阿昔洛韋(acyclovir)，二脫氧尿苷(dideoxyuridine)等。抗真菌劑包括但不限于大扶康(diflucan)，ketaconizole，制霉菌素(nystatin)等。抗寄生蟲劑包括例如噴他脒(pentamidine)可以使用。所述組合物還可進一步含有抗炎癥劑例如I-1-抗-胰蛋白酶，I-1-抗糜蛋白酶等。可并入所述組合物的生長因子的實例是促進傷口愈合的生長因子，包括但不限于，血管生成素；內皮素；肝細胞生長因子和角質細胞生長因子；成纖維細胞生長因子，包括成纖維細胞生長因子-1(FGF-1)，成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)和成纖維細胞生長因子-4(FGF-4)；血小板源性的生長因子(PDGF)；胰島素結合生長因子(IGF)，包括胰島素結合生長因子-1和胰島素結合生長因子-2；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)，包括轉化生長因子-I和轉化生長因子軟骨誘導因子(CIF)，包括CIP-A和CIP-B；類骨質(osteoid)誘導因子(OIF)；成骨素以及其它生長因子；骨形態發生生長因子(bonemorphogenicgrowthfactor)(BMP)，包括BMP-l和BMP-2；膠原生長因子；肝素結合生長因子，包括肝素結合生長因子-和肝素結合生長因子-2；細胞因子；干擾素；激素。可并入所述組合物的其它化合物包括血管收縮劑例如腎上腺素，或麻醉劑，例如，局部麻醉劑。所述藥物組合物可以經過配制提高蛇毒蛋白酶的穩定性，例如，減少對蛇毒蛋白酶的消化，如自身消化。可以通過下述方法提高蛇毒蛋白酶的穩定性例如，將蛇毒蛋白酶以pH約5-9的組合物的形式提供，優選約6.5-7。蛇毒蛋白酶穩定性的提高還可以通過將蛇毒蛋白酶以另外含有穩定劑(如多元醇)的藥物組合物來實現。這些實施方案中，所述藥物組合物可以含有約5％，10％，20％或更多的多元醇(或多種多元醇)。可用于所述藥物組合物的多元醇的一個實例是甘油。其它方面，可以將蛇毒蛋白酶以結晶、冷凍-干燥或凍干的形式提供來提高蛇毒蛋白酶的穩定性。如果所述組合物是冷凍的，那么就應該在使用前融化。另一實施方案中，本發明提供了一種組合物，其中含有蛇毒蛋白酶，例如，本申請所述的蛇毒蛋白酶，其pH為約5-9，優選約6.5-7。本發明還提供了一種組合物，其中含有蛇毒蛋白酶(例如本申請所述的蛇毒蛋白酶)和穩定劑(例如多元醇，如甘油)。所述多元醇的量為約5％，10％或20％。含蛇毒蛋白酶組合物的劑量依據蛇毒蛋白酶的具體用途而定，但是所述劑量應該是該組合物能實現期望作用的有效量。可以使用從細胞培養試驗和動物試驗獲得的數據計算人用的劑量范圍。通常，由于含蛇毒蛋白酶的組合物是含水溶液，所以認為約1ml～約50ml的所述組合物組以增加纖維蛋白血凝塊的形成。但是，根據所述組合物的用途，劑量范圍可以為約1ml～約200ml。一些實施方案中，將本發明的藥物組合物局部施用于傷口、手術縫合處或其它需防止血液流失的位置。為此，繃帶、補片、紗布、手術用膠帶、棉簽或其它吸附材料或支持物都可以用含本發明所述蛇毒蛋白酶組合物包被、注入或與其結合，以用于局部給藥。另外，還提供了一種血纖蛋白凝膠或手術密封劑形式的藥物組合物。本發明的組合物可以是乳膏、洗液、凝膠、噴霧或氣溶膠形式，用于關閉腹腔鏡或開放性手術或創傷傷口。這些情況下還需局部施用。此外，可以使用用含蛇毒蛋白酶組合物包被或與其發生化學結合的手術縫線和釘。可以將所述藥物組合物與使用說明書一起包裝入容器、試劑包或分液器。另外本發明還提供了一種可加入以防止血凝塊溶解的抗血纖蛋白溶解劑，其是通過組織凝血酶原活化劑例如textilinin(描述見國際公開WO99/58569)，抑肽酶和EACA起作用的。本發明還提供了其中含有本申請所述蛇毒蛋白酶或其部分的試劑盒。該試劑盒可以含有1或多種其它成分，包括使用說明書；其它試劑，例如，1或多種輔因子(例如，鈣、磷脂及因子Va中的1或多種)，和/或其它治療劑(例如，下列藥劑中的1或多種抗微生物劑，例如，抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑，抗炎癥劑，抗組胺劑，抗纖維溶解劑、止痛劑和生長因子)；稀釋劑；器具，例如，容器，例如，無菌容器，或用于制備施用用蛇毒蛋白酶的其它物質；可藥用的載體(例如，穩定劑)；以及用于向受試者給藥的器具或其它物質(例如，注射器、涂藥器、繃帶、噴霧或氣溶膠裝置)。所述說明書包括治療應用說明書，包括建議劑量和/或施用方式，例如，對體外和/或體內出血的患者而言。一些情況下，在給要前讓蛇毒蛋白酶與其它成分反應，例如，1或多種輔因子。其它情況下，可以將蛇毒蛋白酶與其它成分(例如，1或多種輔因子)聯合給藥，且所述試劑盒可以包括記載蛇毒蛋白酶及其它成分的用量、劑量及給藥時間的說明書。一些實施方案中，所述蛇毒蛋白酶可以凍干或冷凍干燥形式提供。這些實施方案中，所述試劑盒可包括下列中的1或多種融化和/或水解說明書，以及可藥用的載體或稀釋劑。一些實施方案中，所述試劑盒可含有稀釋劑或預定量的稀釋劑的說明。用途本發明的蛇毒蛋白酶能通過將凝血酶原處理成為凝血酶而有效地活化凝血酶原。凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，能切割血纖蛋白原產生血纖蛋白，并能夠作用于數種血因子包括因子V、VIII和XIII以穩定血纖蛋白單體間相互作用，從而加速血凝塊的形成。因此，本發明涉及活化凝血酶原以及通過給藥本申請所述蛇毒蛋白酶促進止血的方法。該方法包括向受試者所需部位給要能促進或加速血纖蛋白凝塊形成的有效量的蛇毒蛋白酶，從而增加凝血和/或減少血液或體液的流失。“所需部位”是指需要形成血纖蛋白凝塊的部位。可以將所述組合物直接施用到傷口、其它組織或其它需要的位置。通常，對于外傷，該組合物可以任一方式直接施用，包括向傷口噴霧。也可以內部施用，例如在手術過程中。優選實施方案中，所述受試者為哺乳動物，例如人。由于本申請所述蛇毒蛋白酶不是來自血液，所以消除了對獲自血液成分的密封劑、，粘合劑和止血劑中可能出現血液攜帶的病原體或其它感染因子危險的擔心。蛇毒蛋白酶和含有本申請蛇毒蛋白酶的組合物可用于各種用途，包括作為手術密封劑、粘合劑(例如，局部或手術粘合劑)，或者作為止血劑。本發明的方法、試劑盒或藥物組合物可用于，例如，連接組織或器官、制止或減少流血、防止或抑制出血、愈合傷口和/或封閉傷口。所述方法、試劑盒或藥物組合物可用于各種手術系列，包括神經系統手術；鼻、口、咽的手術；呼吸系統手術；心血管系統手術；血液或淋巴系統手術；消化系統手術；泌尿系統手術；生殖系統手術；肌肉骨骼系統手術；皮膚系統手術；整形手術；矯形手術和移植手術。例如，所述蛇毒蛋白酶可用于血管外科手術，包括在下列情況下用于止血冠脈遠端吻合的針孔(stitchhole)、左室縫線、主動脈切開術和插管處的出血；再次手術時出現的彌漫性心外肌膜出血；以及靜脈出血部位的滲血，例如，在心房、腔靜脈或右室水平。本發明還可用于移植前縫合滌綸動脈移植物，體外組織縫合，受傷脾、肝及其它實質性器官的止血(從而挽救所述器官)；封閉氣管和支氣管吻合口及肺氣漏或裂傷；封閉支氣管切除殘端(stumps)、支氣管瘺和食管瘺；以及用于無縫線無痕手術(suturelessseamlesshealing)(″Zipper″技術)。本發明還可用于角膜移植、鼻出血、扁桃腺切除手術后、拔牙以及其它情況中的止血。參見G.F.GestringandR.Lermer，VascularSurgery，294-304，September/October1983。另外，本發明所述的藥物組合物特別適合凝血缺陷的個體，例如血友病(例如，血友病A和血友病B)。另外還發現與因子Xa和trocarin不同，本發明的蛇毒蛋白酶能活化脫羧凝基血酶原。脫羧凝血酶原發現于，例如，經抗凝血劑例如華法林(coumadin)治療后的受試者。因此，本發明的方法、試劑盒和藥物組合物可用于活化凝血酶原，并促進用抗凝血劑如華法林治療過的受試者的止血。本申請所述方法和組合物可在手術或創傷時用于這些受試者，且無需抑制或減少華法林的治療。如上所述，可將蛇毒蛋白酶配制成傷口敷料、繃帶、補片、紗布、手術用膠帶、棉簽或其它吸收材料或支持基質的一部分。敷料和繃帶簡單易用，不需高級技術知識或技能就能操作。它們甚至可用作突發事件急救措施而自身施用。所述傷用敷料和繃帶可用于各種野外用途，例如，用于戰士、救護人員/護理隊、消防人員的傷口包扎；用于由醫院和門診部急診室人員進行先期外傷急救處理，特別是災難情況下。所述敷料還可用于急救箱，供一般公眾或醫務人員使用。含蛇毒蛋白酶的傷用敷料或繃帶還可包括下列物質中的1種或多種鈣、磷脂、穩定劑或例如本申請所述的其它化合物或藥劑。例如，所述傷用敷料或繃帶還可包括止痛劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑，抗炎癥劑，抗組胺劑，抗纖維溶解劑和生長因子。可以向組合物添加除蛇毒蛋白酶之外的一種以上化合物，可以同時施用，或者可以各自以預定時間釋放。添加至組合物的附加化合物(或多種化合物)可以一定濃度添加以致其有效地達到預期目的，例如，抗生素抑制微生物的生長，止痛劑減輕疼痛，等等。一些實施方案中，所述敷料或繃帶可以包括粘合劑層和/或支持層。所述敷料或繃帶的支持層可以是常規的非再吸收材料，例如，硅酮補片或塑料材料；或者其可以是生物相容性的再吸收材料，例如，殼質或其衍生物。對于其它用途，例如用作手術密封劑或手術粘合劑，所述藥物組合物可以是血纖蛋白凝膠或手術密封劑形式，其可制成乳膏、洗液、凝膠、噴霧、泡沫或氣溶膠形式，就噴霧、泡沫或氣溶膠而言，可將所述組合物存儲在帶有加壓推進裝置的罐或槽內，從而使所述成份以可膨脹的泡沫或噴霧形式遞送到傷口。一個優選實施方案中，所述噴霧、泡沫或氣溶膠被定量提供。這些實施方案中，所述方法包括向受試者定量提供噴霧、泡沫或氣溶膠，以及向受試者提供(例如，向傷口給藥)噴霧、泡沫或氣溶膠的說明書。說明書可以是自身施用或向他人施用。盡管所述組合物形成凝塊的速度一定程度根據具體情況而定的，例如，動脈傷口及出血組織損傷的快速情況，骨組織傷口處理的較緩的情況。優選地，凝塊要在應用后10分鐘內明顯出現。最優選，凝塊要在應用后2-8分鐘內明顯出現。本發明還通過下列實施例進一步說明，這些實施例不應該理解為有限制作用。本申請全文中引用的所有文獻、專利以及公開的專利申請在此引入作為參考。實施例材料和方法材料棕蛇蛇毒蛋白酶復合物制備方法的描述見Masci等，1988，Biochem.Int.17825，在此引入作為參考。將4mg/ml的凝血酶原活化劑在保存于-20℃的50％甘油中。SephacrylS-300獲自AmershamPharmaciaBiotech.，Uppsala，Sweden，合成發色底物S-2222獲自Chromogenex，Stockholm，Sweden。過期的檸檬酸化血漿是由PrincessAlexandra醫院血庫從正常的經過病毒篩選的志愿者制備獲得的。Hampton1和2篩選試劑盒獲自HamptonResearch，美國。Wizard1和2篩選試劑盒獲自EmeraldBiostructures，英國。棕蛇蛇毒蛋白酶的純化ConA-Sepharose4BP.textilis-蛇毒蛋白酶純化的第一步是從粗制蛇毒中分離棕蛇蛇毒蛋白酶復合物，描述見Masci等，1988，同上。將ConA-Sepharose4B填充入2.5×16cm柱體，按廠商推薦方法洗滌，用起動緩沖液(0.05MTris-HCl，pH7.4)平衡。將P.textilis蛇毒(233mg干重)重配于10ml起動緩沖液，然后置于37℃水浴直至溶解。將樣品上樣于上述柱體，用過柱緩沖液洗滌直至底線歸零。將洗脫緩沖液(0.02M甲基α-D吡喃甘露糖苷溶于0.05MTris-HCl)施加柱體，從ConA-Sepharose4B上洗脫出結合蛋白(棕蛇蛇毒蛋白酶復合物)。過柱的流速是52ml/小時。將雙波長紫外檢測器設置為280mm且衰減0.32和0.64吸光度單位滿量程(AUFS)。收集具有S-2222水解活性的級分，在405型Amicon濃縮器中用YM3膜濃縮，流速為48mL/小時。將純化后的棕蛇蛇毒蛋白酶復合物保存于-20℃的50％甘油中。從棕蛇蛇毒蛋白酶復合物中純化棕蛇蛇毒蛋白酶SephacrylS-300層析SephacrylS-300層析凝膠按照廠商推薦洗滌。87cm×2.5cm的SephacrylS-300層析柱6℃填充，用起動緩沖液(0.05MTris-HCl緩沖液，pH7.4)平衡，然后在上樣前再用兩倍體積的同種緩沖液添加0.8MNaSCN來平衡。將10ml4mg/ml凝血酶原活化劑與10ml1.6MNaSCN孵育10分鐘，然后上樣于層析柱。為了將流速控制在40ml/小時，在Gilson蠕動泵上安裝一個紫/黑色小室。將Altex雙波長紫外檢測器設置為A280且衰減0.32AUFS，將ColePalmer2penchart記錄儀設置為1cm/hr，進行使用。使用LKB7000級分收集器按時間收集級分，開始按10min/管的間隔收集級分，隨后變至12min/管，分別收集6.5和8ml級分。進行上述的發色試驗，將混合后在42型Amicon濃縮器中用YM3膜濃縮的具有S-2222水解活性的級分進行評估。將該操作重復三次。Superdex200凝膠層析另外，還使用了Superdex200高分離度凝膠層析從棕蛇蛇毒蛋白酶復合物中純化蛋白酶。Superdex200按照廠商推薦洗滌，填充入2.5×90cm柱體，用過柱緩沖液(0.05MTris-HCl，pH7.4，0.8MNaSCN)平衡。將含9mL5.6mg/mL棕蛇蛇毒蛋白酶復合物的溶液與9mL1.6MNaSCN孵育30分鐘，然后上樣于層析柱。流速為48mL/小時。280nm處波長檢測儀的衰減為0.32或0.64AUFS。混合具有S-2222活性的級分，在52型Amicon濃縮器中用YM3膜濃縮。然后將混合并濃縮的樣品(5mL)在相同的層析柱上再層析。將最終的蛋白酶制劑在0.05MTris-HCI，pH7.4中透析過夜，除去溶液中的NaSCN。該制劑(保存于10％甘油/Tris緩沖液-20℃)用于所有功能和結構特性研究。高效液相層析(HPLC)反向-HPLC在25℃進行，使用由6000A雙活塞泵和M45A泵組成的Waters(TM)系統、調至A280nm的490波長檢測器，以及Wisp樣品注射器和PhemonenexJupiterC18-層析拄(KHO-4154)(1.4mm×250mm)。層析采用在60分鐘內線性梯度的模式，使用起動溶液(A)溶于蒸餾水的0.1％TFA，用(B)洗脫，(B)是溶于(A)的80％乙腈。使用WatersMilleniumversion1.01軟件操作該系統并整理數據。十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)SDSPAGE基本上按照Laemlli，1970，Nature227680描述進行。將SDS-PAGE樣品置于含或不含β-巰基乙醇(β-Me)的SDS樣品緩沖液中煮沸10分鐘。凝膠用考馬斯蘭染色，然后用甲醇、乙酸及水(45∶10∶45)脫色。N-末端氨基酸測序測序采用Edman降解法。使用AppliedBiosytemsProcine492cLC蛋白測序系統對棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶測序。參考AppliedBiosystems使用手冊no.904244部分，修訂本D關于設備的詳細描述。然后用ExPAsy/NCBIblast進行搜索，鑒定爬行動物絲氨酸蛋白酶和因子Xa與T.carinatus因子Xa樣絲氨酸蛋白酶之間的序列同源性。第一鏈cDNA合成和cDNA末端擴增取1μg分離自蛇腺體的總RNA用于cDNA合成。為了制備5’RACE-ReadycDNA，我們使用了來自SMARTRACEcDNA擴增試劑盒的5’-CDS[5’-(T)25N-1N-3’；N＝A，C，G，或T；N-1＝A，G，或C][SEQIDNO32]和SMARTIIAoligo[5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’][SEQIDNO33]引物，為了制備3’RACEreadycDNA-使用了來自同一試劑盒的3’-CDS引物A[5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3’；N＝A，C，G，或T；N-1＝A，G，或C][SEQIDNO34]，還使用了同一試劑盒中的PowerScript反轉錄酶。這兩種cDNA均加入100μl水稀釋，然后用于cDNA末端快速擴增(RACE)，按照使用手冊(SMARTRACEcDNAAmplificationKit，Clontech)描述的方案進行。對于3’RACEPCR3’RACEcDNA，UPM[通用引物混合物A5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(長)[SEQIDNO35]和5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(短)[SEQIDNO36]以及簡并GSP-2(正向)引物[AAYGGWATGGAYTGYAA；Y＝C+T，W＝A+T][SEQIDNO37]都基于N-末端氨基酸序列IVNGMD。用高保真1聚合酶混合物(Advantage2PolymeraseMix)(Clontech)啟動反應。熱個循環儀1個循環95℃1min；25個循環95℃30sec，65℃1min，68℃3min；1個循環68℃3min。用QIAquickGel提取試劑盒(Qiagen)從凝膠中分離出主要PCR-產物(1.5kbp)，克隆入pGEM-TEasyVector。篩選后，用QIAprepSpin小量抽提試劑盒(Qiagen)從35個集落中分離出小量抽提物。DNA測序DNA測序采用BigDyeTerminator和針對pGEM-TEasyVector的正向引物(GTTTTCCCAGTCACGAC)[SEQIDNO38]來進行。結果發現只有2個克隆在大約500bp內不含有終止密碼子。用For2引物(ATCGTTAGTGGATTTGG)[SEQIDNO39]對這些克隆進行測序。結果發現了終止密碼子。這兩個克隆的全序列相似，3’-DNA的長度從GSP-2到第1個終止密碼子為776bp。使用3’cDNA序列設計反向引物GSP-1GAAATCGTCTCGGTCTCATTA[SEQIDNO40]。對于5’RACEPCR5’cDNA，使用UPM(見上文)，GSP-1和高保真2聚合酶混合物(Clontech)。PCR反應條件與3’RACEPCR相同。分離主要PCR產物(1kbp)，克隆入pGEM-TEasyVector。選出15個克隆進行測序，6個結果相同，不含有終止密碼子。使用兩種測序引物針對pGEM-TEasyVector的正向引物(見上文)和反向引物GSP-1。所有6個克隆都含有ATG，且從起始位置到對應于GSP-2引物序列的位置長度為628bp。使用3’和5’cDNA序列設計針對全長cDNA的正向及反向引物SE(正向)ATGGCTCCTCAACTACTCCTCTG[SEQIDNO41]和SE(反向)TTAGAGCCGACCAGTGCTTGACTC[SEQIDNO42]。將PCR-產物(1.407bp)克隆入測序用pGEM-TEasyVector以備測序。棕蛇蛇毒蛋白酶復合物的發色凝血酶原活化試驗進行一系列試驗，獲得S-2222水解速度相對棕蛇蛇毒蛋白酶復合物或棕蛇蛇毒蛋白酶用量的標準曲線。用0.05MTris-HCl，pH7.4對棕蛇蛇毒蛋白酶復合物(4mg/ml)和蛋白酶(1mg/ml)分別稀釋為1/10-1/10,000，然后保存于冰上。通過下述方法測定P.textilis絲氨酸蛋白酶或棕蛇蛇毒蛋白酶復合物對S-2222的水解活性將含或不含10mMCaCl2的0.05MTris-HCl，pH7.4，緩沖液0.93ml與50μl3.0mMS-2222置于Hitachi557分光光度計1ml小室中25℃平衡。通過加入20μl不同濃度的蛋白酶(0.4mg/ml)啟動反應。在405nm處監測p-硝基苯胺的釋放情況。試驗使用0.91ml0.05MTris-HCl緩沖液，pH7.4，其中含有0.8MNaSCN，50μlS-2222和40μl0.4mg/ml棕蛇蛇毒蛋白酶復合物，時間間隔為0，1，2，5和10分鐘。1個活性單位相當于水解1μmol底物/分鐘。棕蛇蛇毒蛋白酶的凝血酶原活化試驗將棕蛇蛇毒蛋白酶(5μg)加入2mL凝血酶原溶于0.05MTris-HCl，pH7.4中濃度為0.25mg/mL的溶液。在不同時間間隔取等份(20μL)的該溶液，用凝血酶-選擇性底物S-2238進行發色試驗。這些試驗由930μL0.05MTris-HCl，pH7.4，50μLS-2238和20μL樣品組成。在405nm處測定底物水解速度。在每一時間間隔取兩個20μL溶液等份，進行SDSPAGE分析±β-巰基乙醇。凝血試驗檸檬酸化血漿凝血試驗使用Hyland-Clotek機器，按照BlackwellScientificPublishers，OxfordUK1975中的在Alaboratorymanualofbloodcoagulation。Austen&Rhymes方法進行。試驗由100μl0.05MTris-HCl緩沖液，pH7.4，100μl檸檬酸化人血漿和20μl不同濃度蛋白酶組成。同樣的試驗也在加或不加0.04MCaCl2以及加0.8MNaSCN的情況下進行，按時間間隔取等份溶液。通過棕蛇蛇毒蛋白酶在檸檬酸化血漿中形成血纖蛋白將人檸檬酸化血漿(970μl)與下列混合(1)20μl1.16mg/mL蛋白酶；(2)20μl1.16mg/mL蛋白酶和10μl4MCaCl2，使Ca2+終濃度為40mM(濃度從無Ca2+～10mM)；(3)10μl4MCaCl2。向每一溶液中加入0.05MTris-HCl，pH7.4使其體積達到1mL。將這三種溶液放置4小時，將得到的血凝塊壓實，然后用dH2O洗滌數次，以便從血纖蛋白凝塊中除去其它血漿蛋白。然后，將得到的血凝塊加入裝有500μL含β-巰基乙醇和4M尿素的4xSDS樣品緩沖液的Eppendorf管中。向每個Eppendorf管中再加入一滴β-巰基乙醇，放置過夜。樣品煮沸5分鐘，每一樣品取10μL，按照本申請所述進行SDSPAGE丙烯酰胺凝膠電泳分析。棕蛇蛇毒蛋白酶復合物和棕蛇蛇毒蛋白酶活性位點的標記讓棕蛇蛇毒蛋白酶復合物(4mg/mL)和棕蛇蛇毒蛋白酶(2mg/mL)的溶液樣品(120μl)與15μL40mMDNS-GGACK(在0.05MTris-HCl，pH7.4中的終濃度為4mM)反應1小時。然后，用磁力攪拌器在4℃用0.05MTris-HCl，pH7.4將樣品透析過夜，除去多余的抑制劑。然后，用加或不加β-巰基乙醇的SDSPAGE對標記和未標記的棕蛇蛇毒蛋白酶復合物和蛋白酶進行電泳分析。將帶有活性位點標記后的蛋白的凝膠置于紫外線燈下觀察，而其它凝膠用考馬氏蘭染色。血纖蛋白膠研究將過期的(outdated)檸檬酸化血漿(3.5ml)分配于37℃水浴中的20ml錐形塑料小管內。向兩個小管中都加入20μl2mg/ml棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶。其中一個管中加入0.025MCaCl2，另一個管中加入鹽水。肉眼觀察監視凝血時間，當血凝塊形成時，將其置于no.54濾紙上并按壓。得到壓實的血凝塊用蒸餾水強力洗滌后4℃保存過夜。給血凝塊拍照評價紋理(texture)。結果如本申請所示，以P.textilis為例，所述的蛇毒蛋白酶復合物中含有具有因子Xa樣絲氨酸蛋白酶特性的蛋白酶和大量功能未知的其它蛋白質。來自P.textilis，O.scutellatus，N.scutatus，T.carinatus和Pporphyriacus的分離的蛇毒蛋白酶可用于制備局部用藥的血纖蛋白″膠(glue)″或“粘合劑(sealant)”形式的藥物組合物。本申請中的一些試驗使用的是來自P.textilis的樣品和蛋白質。但是，本領域技術人員應該理解的是這些試驗是一些對蛇毒蛋白酶復合物和蛇毒蛋白酶定性的實例，它們也適用于本發明的其它蛇毒蛋白酶。蛇毒蛋白酶的純化棕蛇蛇毒蛋白酶復合物的純化(ConA-Sepharose4B)純化P.textilis-蛇毒蛋白酶的第一步是從粗制蛇毒中分離棕蛇蛇毒蛋白酶復合物。使用的方法以Mascietal，1988，同上描述的方法為基礎。將233mg干重的粗制P.textilis蛇毒在ConA-Sepharose4B上層析，將得到的280nm洗脫曲線圖示于圖1(原始層析圖的描繪)。蛇毒分為了兩個主要的蛋白峰，其中一個結合ConA-Separose4B，具有抗因子Xa的底物S-2222的活性(圖1中A線標示的那段)。根據A280計算，活性峰占總蛇毒蛋白的約30％。從ConA-Sepharose4B層析得到的混合的棕蛇蛇毒蛋白酶復合物濃縮物，其SDS-PAGE電泳分析如圖2所示；泳道1分子量標志物(大小用kDa表示)，泳道2沒加β-巰基乙醇的棕蛇蛇毒蛋白酶復合物，泳道3加入了β-巰基乙醇的棕蛇蛇毒蛋白酶復合物。泳道2中箭頭A指示完整棕蛇蛇毒蛋白酶的條帶，而泳道3中箭頭B和C指示的分別是棕蛇蛇毒蛋白酶的重鏈和輕鏈(見下文)。棕蛇蛇毒蛋白酶復合物，在沒加β-巰基乙醇時(泳道2)，包括約150-200kDa處的1條單個的明顯的蛋白條帶和其它3條分子量約60、50和45kDa的主要條帶。泳道2中3條主要條帶的大約分子量的總和得到整個混合物的計算分子量為300-350kDa。棕蛇蛇毒蛋白酶復合物在加入了β-巰基乙醇時(泳道3)分離成為幾條表觀分子量為110，93，80，55，46，40的蛋白帶和一條約32-34kDa寬的條帶(可能是條帶二聯體)。泳道2和3的差異表明二硫鍵將復合物中的一些多肽連接在一起。棕蛇蛇毒蛋白酶復合物中的蛋白酶成分在泳道2中呈約50-60kDa的肉眼可見的二聯體，如箭頭A所指。蛋白酶的重鏈顯示為一約40kDa的條帶(如箭頭B所指)，蛋白酶輕鏈的大約分子量為32kDa(如箭頭C所指)。A、B和C對SDSPAGE條帶的指示得到了本申請所述分離和定性試驗的驗證。圖2中的一些條帶可能代表的是棕蛇蛇毒蛋白酶復合物中的蛇毒雜質。從棕蛇蛇毒蛋白酶復合物中純化蛋白酶成分SephacrylS-300層析為了分離棕蛇蛇毒蛋白酶復合物中棕蛇蛇毒因子Xa樣絲氨酸蛋白酶成分，需要解離該復合物。Speijeretal(1986)表明0.8MNaSCN能有效解離O.scutellatus-凝血酶原活化劑，但是沒有試圖用0.8MNaSCN通過層析方法純化它。為了說明用0.8MNaSCN能夠解離棕蛇蛇毒蛋白酶復合物，進行下列試驗，結果提供于圖3。棕蛇蛇毒蛋白酶復合物加入0.8MNaSCN導致檸檬酸化血漿凝血活性快速減弱，從不足10秒延長至超過60秒，但是S-2222活性卻大部分都仍保留。棕蛇蛇毒蛋白酶復合物用0.8MNaSCN處理后，在已用含0.8MNaSCN的緩沖液平衡過的SephacrylS-300層析柱上進行凝膠過濾層析，分離成單個成分。級分30-43表現出S-2222水解活性。為了減少級分的數目，在剩余層析步驟中將級分體積從6.5ml/管增至8ml/管。對混合和濃縮后的級分30-43進行第二次SephacrylS-300層析。級分25-29表現出S-2222水解活性。對混合和濃縮后的級分25-29進行第三次SephacrylS-300層析。級分25-29中基本上只有一個具有S-2222水解活性的蛋白峰。高度同質性得到了HPLC的證實(圖4)。根據HPLC，所述棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的純度大于95％。表1-6概括了成套試驗的純化結果及樣品鑒定。SephacrylS-300凝膠過濾產物的SDSPAGE±β-Me對來自所有層析步驟的混合級分進行SDSPAGE電泳，結果圖示于圖5。泳道4(含SephacrylS-300，層析步驟1，混合級分30-43)表明混合的棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的同質制劑已經不復存在，因為有分子量約107kDa的污染物存在。泳道5(含SephacrylS-300，層析步驟2，混合級分25-29)表明55-56kDa成分所占比例更大，但是仍含有污染物需要第3步層析。泳道6-8中是不同量的來自第3層析步驟的SephacrylS-300混合級分25-29，表明是同質制劑。完整棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的分子量為55-56kDa，如泳道5-8所示。已經將棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶與整個P.textilis蛇毒(泳道2)以及加入(泳道10)和沒有加β-Me(泳道3)的完整棕蛇蛇毒蛋白酶復合物進行了比較。結果表明了棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶在復合物及整個蛇毒中所占的位置。圖5中的泳道9顯示的是用β-Me還原來自層析步驟3的SephacrylS-300混合級分25-29。能夠看到分子量約31kDa的單個條帶。進行第二次凝膠分離，鑒定棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶還原應該得到的預期兩條帶。該凝膠圖示于圖6。圖6中看到的是SephacrylS-300的混合濃縮級分25-29在加或沒加β-Me條件下的SDSPAGE。泳道3(包括SephacrylS-300，層析步驟3，混合級分25-29)、4和6(包括來自第3次層析的SephacrylS-300混合濃縮級分25-29)表明已經成功得到了棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的同質制劑。但是，泳道3和6中的條帶都很淡。棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的分子量為55-56kDa，與圖5的結果一致。泳道5(包括來自第3次層析的SephacrylS-300混合濃縮級分25-29，加入β-Me)表明所述棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶含有3個亞單位，但是最后的那個條帶可能是染料前沿，染料前沿在Laemlli方法中經常可以看到，或者它可以是自身消化的產物。泳道7(包括SephacrylS-300，層析步驟3，混合且濃縮的級分25-29+β-Me)中沒有出現任何條帶，泳道8(包括SephacrylS-300，來自層析步驟3，混合且濃縮的級分25-29+β-Me)表明棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶包括重鏈和輕鏈。根據相應的因子Xa和O.scutellatus絲氨酸蛋白酶的結構可以斷定，棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶包括重鏈和輕鏈。棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶重鏈的分子量為約31kDa，與圖5的結果一致，輕鏈的分子量為約18kDa。將P.textilis整個蛇毒(泳道2)以及加有β-Me的完整棕蛇蛇毒蛋白酶復合物(泳道9)也包括在凝膠內，這樣可與代表棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的條帶做比較。Superdex200凝膠過濾在試圖提高棕蛇蛇毒蛋白酶純度的嘗試中，使用高分辨率的凝膠過濾介質(Superdex200)代替SephacrylS-300。在NaSCN存在下用Superdex200層析和再層析棕蛇蛇毒蛋白酶復合物后得到的280nm洗脫曲線圖示于圖7A和7B。圖7A和7B給出的是洗脫曲線，這些曲線是棕蛇蛇毒蛋白酶復合物(18mL；50.4mg)于Superdex200層析柱(2.5×90cm)上含0.8MNaSCN的0.05MTris-HCl，pH7.4中層析得到的。圖7A圖示了層析步驟1，圖7B圖示了層析步驟2。將每一步驟中具有S-2222活性的級分(即A線標示的那段)混合并濃縮。如圖7C所示，將用Superdex200純化得到的棕蛇蛇毒蛋白酶樣品，在每一純化步驟后通過SDSPAGE電泳分離。泳道1和2層析步驟1得到的混合濃縮物，加有(泳道2)及沒加(泳道1)β-巰基乙醇；泳道3和4層析步驟2得到的混合濃縮物，加有(泳道5)及沒加(泳道4)β-巰基乙醇；泳道5分子量標志物(大小用kDa表示)；箭頭A、B和C指示的是泳道4中的雜質。Superdex200純化時使用的起始物質的比活性基本上低于SephacrylS-300層析所使用起始物質的比活性(表2)。這可能反映了不同蛇毒樣品的不同活性。Superdex200純化得到的最終產物的比活性為1.1U/mL/A280，不及SephacrylS-300產物的2.4U/mL/A280的一半。提供的其它分離方法包括離子交換層析、用尿素作為另一種解離劑、使用ConA-Sepharose4B一步純化法從粗制P.textilis蛇毒中純化棕蛇蛇毒蛋白酶、基于蛋白酶底物特異性的親合方法以及其它本領域已知方法。下列是適于分離本發明的凝血酶原活化蛋白的方法的實例，以分離棕蛇蛇毒蛋白酶為例。表3-6給出的是純化過程中不同步驟得到樣品的特性。方案1ConA-Sepharose(07-01-03)·起動緩沖液，0.05MTris-HCl，pH7.4·洗脫緩沖液，0.05MTris-HCl，0.02M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷·加載的樣品將VenomSupplies來源的干的蛇毒(重量541mg)重配于10ml起動緩沖液*1ml溶液的A28013.5*加載的總A280單位(TotalA280unitsloaded)135*樣品活性38U/ml*加載的總活性單位(Totalactivityunitsloaded)377·混合具有S-2222活性的級分*濃縮混合物的A280為6.8，共10ml。*混合后的總的A280單位68*混合物活性2.6U/ml*混合后的總活性單位26.0Superdex200(13-01-03)·起動緩沖液，0.05MTris-HCl，pH7.4，0.8MNaSCN·加載的樣品從加有0.8MNaSCN的ConA-Sepharose層析得到的混合且濃縮峰的一部分(A2808.9，10ml，3.25U/ml)*A280總加載單位89*總加載活性單位32.5·混合具有S-2222活性的級分*濃縮混合物的A280為0.350，共20ml*混合后的總的A280單位7*濃縮混合物的活性0.46U/ml*混合后的總活性單位9.2Superdex200(14-01-03)·起動緩沖液，0.05MTris-HCl，pH7.4，0.8MNaSCN·加載的樣品從提前Superdex200層析得到的混合且濃縮級分(A2800.350，20ml，0.46U/ml)*A280總加載單位7*總加載活性單位9.2·混合具有S-2222活性的級分*濃縮混合物的A280為0.076，共40ml*混合后的總的A280單位3.0*濃縮混合物的活性0.11U/ml*混合后的總活性單位4.4方案2ConA-Sepharose(21-01-03)·起動緩沖液，0.05MTris-HCl，pH7.4·洗脫緩沖液，0.05MTris-HCl，0.02M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷，然后0.05MTris-HCl，pH7.4，0.8MNaSCN·加載的樣品將來自JohnWeigel的干的蛇毒(重量432mg)重配于10ml起動緩沖液*1ml溶液的A28025.6*A280總加載單位256*樣品活性102.9U/ml*總加載活性單位1028·混合具有S-2222活性的級分*制備2個級分混合物1.用甲基-α-D-吡喃甘露糖苷洗脫并濃縮的級分(應用于苯基-Sepharose層析柱)*濃縮混合物的A280為0.95，共22ml*混合后的總的A280單位20.9*混合物活性5.0U/ml*混合后的總活性單位1102.用NaSCN洗脫并濃縮的級分(只將其中一半用于下面的2個完全相同Superdex200層析步驟)。200層析柱如下所述*濃縮混合物的A280為1.85，共27ml*混合后的總的A280單位68*混合物活性2.6U/ml*混合后的總活性單位26.0Superdex200(29-01-03和30-01-03)·起動緩沖液，0.05MTris-HCl，pH7.4，0.8MNaSCN·加載的樣品從上述ConA-Sepharose層析得到的混合濃縮峰的一部分。進行2個完全相同的層析步驟。加載的樣品由來自上述ConA-Sepharose層析的混合濃縮峰添加0.8MNaSCN組成*1ml溶液的A2801.2*A280總加載單位19.2*樣品活性15.7U/ml*總加載活性單位250.6·將從每一層析步驟得到的具有高且相同比活性的級分混合并濃縮(其它級分也具有S-2222活性但是所述比活性較低，將這些級分另行混合)*濃縮混合物的A280為1.9，共9ml*混合后的總的A280單位17.1*濃縮混合物的活性25.7U/ml*混合后的總活性單位231.3Superdex200(04-02-03)·起動緩沖液，0.05MTris-HCl，pH7.4(不含NaSCN)·加載的樣品得自前述Superdex200層析的混合且濃縮級分(A2801.9，9ml，25.7U/ml)*A280總加載單位17.1*總加載活性單位231.3·混合具有S-2222活性的級分(下列結果包括具有最高S-2222活性的級分，其它級分也具有S-2222活性，將這些級分另行混合)*濃縮混合物的A280為1.7，共9.5ml*混合后的總的A280單位16.2*濃縮后混合物的活性17.7U/ml*混合后的總活性單位168.2方案3ConA-Sepharose(10-02-03)·起動緩沖液，0.05MTris-HCl，pH7.4·洗脫緩沖液，0.025MTris-醋酸，pH6.5，4M尿素·加載的樣品將干的蛇毒(重量557mg)重配于25ml起動緩沖液*1ml溶液的A28028*A280總加載單位700*樣品活性83.4U/ml*總加載活性單位2087·混合具有S-2222活性的級分*混合物的A280為0.592，共640ml。*混合后的總的A280單位379*混合物活性0.152U/ml*混合后的總活性單位97.3CM-Sepharose(12-02-03)·起動緩沖液，0.025MTris-醋酸，pH6.5，4M尿素·加載的樣品來自ConA-Sepharose層析的混合級分(A2800.592，640ml，0.152U/ml)*加載的總A280單位379*加載的總活性單位97·一旦將全部樣品加載到層析柱，就應用0-0.5MNaCl梯度。·混合具有S-2222活性的級分*濃縮混合物的A280為4.5，共17.5ml。*混合后的總的A280單位79*濃縮后混合物的活性1.44U/ml*混合后的總活性單位25Superdex200(13-02-03)·起動緩沖液，0.05MTris-醋酸，pH6.5·加載的樣品來自CM-SEPHAROSE層析的混合且濃縮的級分(A2804.5，17.5ml，1.44U/ml)*A280總加載單位79*總加載活性單位25·混合具有S-2222活性的級分(下列結果是指混合的對稱峰，其它級分也具有S-2222活性)*濃縮混合物的A280為0.330，共7.5ml*混合后的總的A280單位2.5*濃縮后混合物的活性0.146U/ml*混合后的總活性單位1方案4苯基Sepharose(15-02-03)·起動緩沖液，0.8MNaSCN-磷酸，pH6.5·加載的樣品來自ConA-Sepharose層析的混合且濃縮的級分(A2800.95，22ml，5.03U/ml)*A280總加載單位20.9*總加載活性單位110·一旦將全部樣品加載到層析柱，就應用0.8-0MNaSCN梯度。·混合具有S-2222活性的級分*濃縮混合物的A280為0.485，共9.5ml*混合后的總的A280單位4.6*濃縮后混合物的活性1.4U/ml*混合后的總活性單位13Superdex200(18-02-03)·起動緩沖液，0.05MTris-醋酸，pH6.5·加載的樣品來自苯基Sepharose層析的混合且濃縮的級分(A2800.485，10ml，1.4U/ml)*A280總加載單位4.85*總加載活性單位14·混合具有S-2222活性的級分(制備2個混合物，下面描述的這個含有具有最大活性的級分)*濃縮混合物的A280為0.327，共3.5ml*混合后的總的A280單位1.14*混合物活性1.83U/ml*混合后的總活性單位6.4P.textilis-蛇毒蛋白酶復合物的特性Ca2+對棕蛇蛇毒蛋白酶復合物水解發色底物S-2222的影響為了測定蛇毒蛋白酶復合物因子Xa樣切割特異性，使用因子Xa特異性發色底物S-2222進行發色試驗。棕蛇蛇毒蛋白酶復合物能夠水解S-2222，無論有無加入Ca2+。無Ca2+時的初始水解速度與Ca2+存在下近似，但只有當棕蛇蛇毒蛋白酶復合物濃度大于2μg/ml時才這樣(數據未給出)。試驗中，棕蛇蛇毒蛋白酶復合物水解S-2222的速度相對棕蛇蛇毒蛋白酶復合物的量近乎呈線性(如表7中的R2值所示，圖未給出)。加入Ca2+或加入Ca2+與PL基本上不影響棕蛇蛇毒蛋白酶復合物對S-2222的水解，這與分離的棕蛇蛇毒蛋白酶類似。對S-2222被棕蛇蛇毒蛋白酶復合物水解與被棕蛇蛇毒蛋白酶水解的情況進行比較表明在單位/μg水平的速度是近似的。由于棕蛇蛇毒蛋白酶復合物中只有約10-15％是蛋白酶(按質量計算)，所以在摩爾水平，棕蛇蛇毒蛋白酶復合物中蛋白酶水解S-2222的速度比分離的蛋白酶高約10倍。用棕蛇蛇毒蛋白酶復合物使檸檬酸化血漿凝血使用棕蛇蛇毒蛋白酶復合物與使用分離的棕蛇蛇毒蛋白酶的檸檬酸化血漿凝血試驗，以比較凝血特性。這些試驗的結果顯示于表8。表8中的數據來自于與下述凝血有關的數據，即在有和無輔助成分存在時檸檬酸化血漿在棕蛇蛇毒蛋白酶復合物作用下的凝血(即，單獨使用棕蛇蛇毒蛋白酶復合物、使用棕蛇蛇毒蛋白酶復合物時加入40mMCaCl2、以及使用棕蛇蛇毒蛋白酶復合物時加入40mMCaCl2和磷脂)。結果表明Ca2+和PL不影響棕蛇蛇毒蛋白酶復合物的凝血效率。Ca2+對檸檬酸化血漿在棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶作用下的凝血時間的影響為了研究棕蛇蛇毒蛋白酶的凝血特性，將檸檬酸化血漿在無Ca2+時的凝血時間與有Ca2+存在時的凝血時間進行比較。表9和10的結果表明棕蛇蛇毒蛋白酶復合物不需要Ca2+就能使血凝血。例如，39μg/mL的分離的棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶在無Ca2+存在時使檸檬酸化血漿凝血的時間不足30秒。Ca2+加入使凝血時間為70秒所需要的棕蛇蛇毒蛋白酶的量減少了200倍(表10)。這表明棕蛇蛇毒蛋白酶在無Ca2+存在時能將凝血酶原轉化為凝血酶，Ca2+有助于凝血酶原的切割。圖8A-8C給出的是在有無輔助成分存在時檸檬酸化血漿在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的凝血情況(數據點值是雙份平行測量的平均值)。圖8A單獨使用棕蛇蛇毒蛋白酶，圖8B使用棕蛇蛇毒蛋白酶時加入10mMCaCl2，以及圖8C使用棕蛇蛇毒蛋白酶時加入10mMCaCl2和磷脂(platelin)。Ca2+也能促進棕蛇蛇毒蛋白酶產生的凝血酶對血纖蛋白原的活化(MankadandCodispoti，2001，AmJSurg18221S)，因此Ca2+加入對凝血的影響對于凝血酶原的活化是次要的。PL也有助于凝血酶原被棕蛇蛇毒蛋白酶的切割，導致凝血所需棕蛇蛇毒蛋白酶的量進一步減少了10倍，如表14所示。Ca2+對S-2222發色底物被凝血酶原活化蛋白切割的影響為了測定棕蛇蛇毒蛋白酶復合物因子Xa樣切割特異性，使用因子Xa特異性發色底物S-2222進行發色試驗。S-2222是一種在Xa作用下顯色的合成發色底物(Aurell等，1977，ThrombinRes11595)。S-2222水解釋放p-硝基苯胺，p-硝基苯胺可以通過405nm處吸光度的增加來檢測。酶活性相對于棕蛇蛇毒蛋白酶量的圖線(plot)基本上是線性的，如圖12A-12D所示。結果表明S-2222水解的速度不受Ca2+或Ca2+和PL存在的影響，因而催化位點是不受Ca2+和PL影響的。從0.002U/μg蛋白酶的斜率可知，純化制劑的比活性是2U/mg。圖9A-9D顯示的是在有和無輔助成分存在時S-2222在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的水解情況(數據點值是雙份平行測量的平均值)。圖9A單獨使用棕蛇蛇毒蛋白酶，圖9B使用棕蛇蛇毒蛋白酶時加入10mMCaCl2，以及圖9C使用棕蛇蛇毒蛋白酶時加入10mMCaCl2和PL，以及圖9D圖12A-12C各自顯示的每一圖線的斜率和R2值。R2值是直線的相關系數。從表11看出棕蛇蛇毒蛋白酶在加入或不加Ca2+時都能水解S-2222，雖然無Ca2+時的水解初始速度比有Ca2+時略微低一點。相反，合成的因子Xa底物在Textarin作用下的水解卻因為加入Ca2+和PL而增強(Stocker等，1994，Toxicon321227)，與源自粗鱗蛇蛇毒的因子Xa樣絲氨酸蛋白酶Trocarin的情況一樣(Joseph等，1999，Blood94621)。分離的棕蛇蛇毒蛋白酶對凝血酶原的活化不受理論的限制，可以認為凝血的發生通過兩步反應完成(1)凝血酶原在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下轉化為凝血酶，接著(2)凝血酶切割血纖蛋白原成血纖蛋白并活化因子XIII。圖10顯示的是棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶活化凝血酶原，在10分鐘的反應時間內，棕蛇蛇毒蛋白酶將凝血酶原轉化為凝血酶，這足以將檸檬酸化血漿的凝血時間從65秒減少到12秒的基線水平。凝血酶原被棕蛇蛇毒蛋白酶活化下面的試驗結果表明在沒有Ca2+、PL或輔助蛋白樣因子Va時，棕蛇蛇毒蛋白酶能將凝血酶原轉化為凝血酶。S-2222試驗的結果表明棕蛇蛇毒蛋白酶與因子Xa水解凝血酶原中相同的鍵。棕蛇蛇毒蛋白酶對凝血酶原的作用通過下述操作進行了測定使用人凝血酶原(0.5mg溶于2mL0.05MTris-HCl緩沖液)與5μg棕蛇蛇毒蛋白酶(酶∶底物為1∶100)反應。反應產物用非還原SDSPAGE電泳分析，如圖11A所示。此外，通過S-2238水解監測凝血酶形成速率，如圖11B所示。S-2238通常用于測定凝血酶的酶活性(KornalikandBlomback，1975，Nature227680)，在此引入作為參考。圖11A顯示的是凝血酶原被棕蛇蛇毒蛋白酶切割時程(timecourse)的SDSPAGE電泳結果。約40kDa的蛋白條帶(泳道5)表明凝血酶(分子量36.7kDa)是主要終產物。該蛋白條帶的濃度隨時間增強表明凝血酶原(PT)在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下轉化為凝血酶(T)。凝血酶原在48小時時間點基本上不復存在(泳道5)。圖11B表明起初的抗S-2238活性很低，然后增加了約20倍。從SDSPAGE凝膠電泳可預知，S-2238活性在48小時達到最大。這些試驗中使用的人凝血酶原并不是完全純的，如圖11A泳道2中的條帶所示。其實應該只在72kDa處出現凝血酶原(PT)條帶(Mann，1976，MethodsEnzymol1976132)。在約55kDa處的較淡的蛋白條帶表明有一些前凝血酶1(PT1)存在，可能是由于凝血酶切割凝血酶原得到的，如圖12所示。前凝血酶1不是一種活性酶，這一點通過t＝0時凝血酶原溶液的S-2238試驗得到證實。前凝血酶1條帶隨時間增強然后減弱。可能是由于凝血酶存在于凝血酶原溶液中，但是是S-2238試驗所無法檢測的。更可能的是，孵育過程中產生的凝血酶導致前凝血酶1的形成。為了有助于理解結果，已經提出了凝血酶原在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下活化的機制，原理圖如圖12所示。但是本發明并不受該原理圖的限制。分離的棕蛇蛇毒A蛋白酶對凝血酶原的活化以及交聯血纖蛋白的形成從上述結果可知，棕蛇蛇毒蛋白酶能夠活化凝血酶原形成凝血酶。隨后活化的凝血酶將血纖蛋白原轉化為血纖蛋白。為了查明這一過程，將檸檬酸化血漿與棕蛇蛇毒蛋白酶在有或無Ca2+存在下孵育。這導致血凝塊的形成，用水洗滌然后通過SDSPAGE電泳分離，與之同時獲得一種通過向檸檬酸化血漿單獨添加Ca2+的形成并經洗滌的血纖蛋白血凝塊(代表由于Ca2+獨自活化凝血級聯反應而在正常情況下體內血凝塊的形成)。該試驗的結果圖示于圖13，從中可以看出在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下產生的血纖蛋白具有與正常血纖蛋白類似的結構，交聯血纖蛋白的形成是應答下述過程而發生的凝血酶在棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶作用下活化以及因此而發生的因子XIII活化。各個試驗的大致凝血時間也記錄了下來(表12)。使用分子量標準物(泳道1)以及圖13中的血纖蛋白原(泳道5)和Ca2+作用下產生的血纖蛋白血凝塊(泳道4)二者的鏈結構，可以對條帶進行鑒定。泳道2和3(分別為未加和加入了Ca2+的棕蛇蛇毒蛋白酶)中約100kDa的條帶代表γ-二聚體(γ-γ)。γ-二聚體分子量為105kDa，是兩個γ-單體在因子XIIIa作用下共價交聯形成的(McKee等，1970，ProcNatlAcadSci66738)。在這些泳道中還可以看到分別代表血纖蛋白α-單體(α)和β-單體(β)鏈的約70和60kDa的條帶。α-單體的分子量為73kDa，而β單體的分子量為60kDa(McKee等，1970，同上)。分子量大于400kDa的條帶(凝膠的上方)代表α-多聚體(αp)，是α-單體在因子XIIIa作用下發生賴氨酸-谷氨酸共價交聯得到的(GaffneyandBrasher，1974，Nature25153)。另外，在泳道2-4中還可以看到約～38kDa的α-鏈降解產物(α1)。可以看出棕蛇蛇毒蛋白酶作用下得到的凝血酶能夠以與正常α-凝血酶類似的方式將血纖蛋白原轉化為血纖蛋白。通過將正常途徑(通過向檸檬酸化血漿添加Ca2+)產生的血凝塊的條帶模式與加和未加Ca2+(分別為泳道3和2)時棕蛇蛇毒蛋白酶作用下產生的血凝塊的條帶模式進行比較，可以看出這一點。與加入Ca2+(泳道3)時的情況相比，在棕蛇蛇毒蛋白酶單獨作用下(泳道2)產生的血凝塊中存在著大量未交聯的α-單體。這說明這時因子XIIIa的活性在形成前一種血凝塊方面不一樣。這與文獻記載一致這是由于Ca2+存在下活化的因子XIIIa的活性比無Ca2+存在時活化的該酶的活性高(TurnerandMaurer，2002，Biochemistry417947)。α-單體在因子XIIIa作用下交聯是一種比γ-鏈交聯更慢的過程，這就解釋了為什么γ-鏈在所有三種血凝塊中都充分地交聯。將血凝塊放置4小時以上可以讓α-單體完全交聯。在使用棕蛇蛇毒蛋白酶Ca2+產生的血凝塊與象征正常體內形成(Ca2+單獨)的血凝塊中觀察到了極相似的條帶模式，但是這兩種血凝塊的凝血時間不同(表12)。使用棕蛇蛇毒蛋白酶加Ca2+血凝塊的凝血時間比單獨使用Ca2+快約30倍。這說明凝血取決于棕蛇蛇毒蛋白酶對檸檬酸化血漿的作用而非Ca2+的作用。添加鈣使檸檬酸化血漿在棕蛇蛇毒蛋白酶作用下的凝血時間略微縮短(從120秒降為60秒)。這與使用棕蛇蛇毒蛋白酶加Ca2+的檸檬酸化血漿凝血試驗的結果一致。P.textilis-蛇毒蛋白酶的結構特征棕蛇蛇毒蛋白酶活性位點的標記丹磺酰基-L-谷氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基氯甲基酮(DNS-GGACK)是一種抑制劑，能夠將絲氨酸蛋白酶(包括因Xa)的組氨酸活性位點特異性烷基化，從而將其活化(KettnerandShaw，1981，MethodsEnzymol80826)。為了測定哪條或哪幾條SDSPAGE條帶中含有催化位點，將棕蛇蛇毒蛋白酶和完整棕蛇蛇毒蛋白酶復合物分別與DNS-GGACK孵育，然后SDSPAGE電泳分離。DNS-GGACK的熒光特性使得摻入了共價結合的抑制劑的棕蛇蛇毒蛋白酶可以用紫外燈觀察。該試驗的結果圖示于圖14。泳道3中看到醒目的熒光條帶，與完整的棕蛇蛇毒蛋白酶對應(泳道7)。β-巰基乙醇存在時(泳道4)，所述熒光抑制劑僅僅摻入蛇毒蛋白酶的重鏈(泳道8中約37kDa的條帶)。這表明棕蛇蛇毒蛋白酶的活性位點位于重鏈而非輕鏈。這些結果以及棕蛇蛇毒蛋白酶在棕蛇蛇毒蛋白酶復合物條帶模式中的位置在泳道1和2以及7和8中得到驗證。哺乳動物因子Xa的重鏈含有一個酶活性位點(Bock等，1989，ArchBiochemBiophys273375)。因子Xa在DNS-GGACK作用下失活的肽消化試驗已顯示重鏈第42位的組氨酸形成了活性位點的一部分。通過序列比對得出，Trocarin和棕蛇蛇毒蛋白酶的活性位點組氨酸殘基與因子Xa的活性位點組氨酸在同一位置，如圖15所示。推導的組氨酸活性位點用粗體字母表示。棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的N-末端氨基酸測序，以及與因子Xa和T.carinatus因子Xa樣絲氨酸蛋白酶之間的序列同一性。對推定的棕蛇蛇毒蛋白酶輕鏈和重鏈進行N-末端氨基酸序列測定。另外，還需要短序列幫助對來自P.textilis毒腺cDNA文庫的棕蛇蛇毒蛋白酶進行cDNA克隆。棕蛇蛇毒蛋白酶復合物和棕蛇蛇毒蛋白酶在β-巰基乙醇存在下通過SDSPAGE電泳分離，然后轉移到PVDF膜上。從該膜上可以進行蛋白條帶的測序。開始，得到了棕蛇蛇毒蛋白酶重鏈的部分氨基酸序列IVNGMD(C)KLGE[SEQIDNO43]。要注意的是(C)意味著這個循環是空白，表示半胱氨酸可能出現但是不一定。該半胱氨酸殘基的出現在隨后對相應cDNA測序后得到了驗證。棕蛇蛇毒蛋白酶的重鏈是第一種被轉移到PVDF膜上并測序的蛋白質。重鏈片段的N-末端包含氨基酸序列IVNGMDCKLGE[SEQIDNO43]。同源性搜索表明該序列與Trocarin重鏈的N-末端序列100％相同(參見圖16)。該序列可用于設計能成功擴增棕蛇蛇毒蛋白酶cDNA的核酸引物。另外，還發現棕蛇蛇毒蛋白酶與人因子Xa重鏈在N-末端序列之間具有相似性，如圖17所示。棕蛇蛇毒蛋白酶輕鏈也進行了氨基酸測序。對應于輕鏈的條帶的N-末端序列為ANSLVXXFKSGNI[SEQIDNO44]。“X”代表在第6和第7個測序循環中這些位置是空白。這說明這些氨基酸序列要么是半胱氨酸，在測序過程中被降解，要么是含有翻譯后修飾的殘基。從相應cDNA推導出的棕蛇蛇毒蛋白酶氨基酸序列顯示“X”氨基酸殘基兩個都是谷氨酸。氨基酸序列中的“X”被這些殘基所取代。本發明輕鏈測序后的N-末端與Trocarin之間的序列同源性圖示于圖18。另外通過將部分棕蛇蛇毒輕鏈序列與小鼠因子Xa輕鏈的N-末端序列比對也發現了相似性，如圖19所示。圖18-23中所示的比對表明棕蛇蛇毒蛋白酶與Trocarin以及與因子Xa之間具有同源性。還發現了棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶與因子Xa之間在另一序列上的序列同源性。同源性大于55％。在trocarin氨基酸序列與獲自棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的N-末端序列之間進行了比較。如上述獲得了棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的全長cDNA以及編碼的蛋白序列，這兩序列見圖25-30。棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶和trocarin之間的全序列比較見圖21。序列同一性的總體水平是81％，但是棕蛇蛇毒蛋白酶在N-末端原肽序列(40個氨基酸)上有很多不為trocarin所具有的獨一無二特性。可以預料所述原肽切割位點是在原肽末端的R和A之間，如圖23所示。這一點得到BLAST搜索的支持，BLAST搜索揭示了一系列止血因子，包括因子X、IX、VII以及它們的與棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶相關的前體。原肽末端序列KRANS------EE-----EREC以及對于Ca2+結合功能具有重要意義的另外的谷氨酸殘基都高度保守。實際上，保守的序列有多組(block)，包括切割位點及其位于重鏈和輕鏈之間的部分RIVNGMD[SEQIDNO45]，緊接于第200位殘基之后。在比對中與trocarin的另一區別是棕蛇蛇毒蛋白酶中的28個氨基酸(第182-209位殘基)在trocarin中不存在。該序列向上通到輕鏈和重鏈間的預測的切割位點，如圖21和23所示。Trocarin的輕鏈由141個殘基組成，末端氨基酸序列為KARNK[SEQIDNO46](Joseph等，1999，Blood94621)。棕蛇蛇毒蛋白酶輕鏈的預測氨基酸序列含有一段類似序列(KTRNK)[SEQIDNO47]，起始于圖23中的第176位氨基酸。棕蛇蛇毒蛋白酶的輕鏈可能在該位點切割從而除去位于重鏈起點之前的這最后28個氨基酸。經過計算棕蛇蛇毒蛋白酶的分子量為43,587Da，假如就在上述指出的那個點切割，預計重鏈和輕鏈的分子量分別為27,952和15,652Da(參見表13)。另外，還使用SDSPAGE分離中蛋白的遷移距離測算棕蛇蛇毒蛋白酶及其組成鏈的分子量(數據未給出)。根據SDSPAGE數據測定，完整棕蛇蛇毒蛋白酶及其重鏈和輕鏈的大約分子量分別為53kDa、35kDa和29kDa(參見表13)。cDNA核苷酸序列沒有顯示蛋白質是否被切割或者其是否有翻譯后修飾。因此，由于天然Trocarin的氨基酸序列(通過蛋白測序測定)和棕蛇蛇毒蛋白酶翻譯后的cDNA核苷酸序列十分類似，所以使用Trocarin作為模型。天然Trocarin的分子量估計為46,515Da(Joseph等，1999，同上)。從沒有任何翻譯后修飾的Trocarin氨基酸序列計算出的分子量為約42,455Da。因此，約有4,060Da的翻譯后修飾，包括Glu殘基、N-糖基化和O-糖基化。Trocarin和棕蛇蛇毒蛋白酶非常相似，因此可以預見棕蛇蛇毒蛋白酶具有與trocarin類似的翻譯后修飾。根據這一推測，帶有翻譯后修飾和切割的輕鏈的棕蛇蛇毒蛋白酶的分子量為47,647Da，這與試驗測定的數值53和48kDa相符。因子Xa的分子量為46kDa(DiScipio等，1977，Biochemistry6799)。這種計算的分子量47,647Da可用于測定溶液中棕蛇蛇毒蛋白酶的濃度。蛇源蛇毒蛋白酶蛋白的比較從活的路邊受損標本獲取海岸太攀蛇、兇猛太攀蛇、棕蛇、虎蛇、紅腹黑蛇以及粗鱗蛇的毒腺，通過RNA提取用的TRIReagent方法提取總RNA(Sigma，CastleHill，Australia)。然后從RNA合成出第一鏈cDNA。然后使用根據由棕蛇蛋白酶推導的初步氨基酸序列設計的簡并引物通過PCR方法從cDNA篩選因子Xa樣蛇毒蛋白酶基因。要注意的是擴增蛋白酶的不同區域要使用不同的引物對，特別是因子Xa樣組分的重鏈。將所有PCR產物用1.5％TAE瓊脂糖凝膠分離，用QIAEXII凝膠提取試劑盒提取(Qiagen，Hilden，Germany)，然后克隆入pGEM-T載體系統(Promega，Annandale，Australia)，接著用ABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequenceReadyReaction試劑盒(Perkin-Elmer，Boston，U.S.A.)測序。然后對分離自所有5種蛇的蛋白酶進行序列比對。圖21顯示了本發明所述的棕蛇、海岸太攀蛇、紅腹黑蛇、虎蛇以及粗鱗蛇蛋白酶與trocarin之間的氨基酸比對情況。圖22顯示的是本發明的這些蛋白酶與人因子Xa之間的氨基酸比對情況。圖23顯示的是所有本發明所述的棕蛇、海岸太攀蛇、兇猛太攀蛇、紅腹黑蛇、虎蛇以及粗鱗蛇的蛋白酶的比對情況，其中還顯示了原肽、輕鏈及重鏈結構域。太攀蛇、虎蛇、粗鱗蛇和紅腹黑蛇的蛇毒蛋白酶蛋白的編碼核酸的克隆和測序將編碼太攀蛇、虎蛇、粗鱗蛇和紅腹黑蛇的蛇毒蛋白酶蛋白的全長核酸分別克隆并測序。將上述蛇源核酸的核苷酸序列與來自普通棕蛇的蛇毒蛋白酶進行比對，結果表明有大量的興趣點。這其中包括在40個氨基酸的原肽氨基酸序列(圖23和24所示的第1-40位殘基)間近乎100％的同源性，其不考慮紅腹黑蛇中的單個氨基酸改變。另外，在位于原肽和輕鏈之間、輕鏈和重鏈之間的切割位點的區域也表現出高度保守(參見圖23)。總體而言這5種蛇之間的同源程度為72％。來自太攀蛇的蛋白酶與普通棕蛇的蛋白酶最接近，同源性為92％，因此可以認為二者都是C組凝血酶原活化劑。同樣地，來自大陸虎蛇和粗鱗蛇的D組凝血酶原活化劑之間具有95％的同源性區，而紅腹黑蛇蛋白酶是5種當中親緣關系最遠的。最后一個興趣點是重鏈內的低同源性，其中在虎蛇、紅腹黑蛇和粗鱗蛇內觀察到了缺失，另外，虎蛇和粗鱗蛇的蛋白酶在末端提前11個氨基酸而終止。蛇毒蛋白酶中存在保守的新區域，所述區域與trocarin和人因子Xa以及所有其它已知蛋白都不同。這些區域包括下列序列，它們也作為共有序列圖示于圖21-23。KREASLPDFVQS(殘基181-192)[SEQIDNO19]；LKKSDNPSPDIR(殘基198-209)[SEQIDNO20]；和SVX1VGEIX2X3SR(殘基260-270)[SEQIDNO21]X1，X2和X3可以為任一氨基酸，但是優選X1是V或I，X2為D或N以及X3為R或I。MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSK(殘基1-29)[SEQIDNO22]和ANRFLQRTKR(殘基31-40)[SEQIDNO23]KREASLPDFVQSXXAXXLKKSDNPSPDIR(殘基181-209))[SEQIDNO24]，其中X可以為任一氨基酸MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKXANRFLQRTKR(殘基1-40)[SEQIDNO25]，其中X可以為任一氨基酸應該可以理解的是SEQIDNO23，24和25對應的是含有第1-40位氨基酸的預測原肽，如圖23所示，因此不能在一個實施方案中形成蛋白水解后消化后成熟蛋白的一部分。本領域技術人員根據圖21-23提供的數據能夠鑒定出本發明所述凝血酶原活化蛋白的其它新的保守區域。類似地，也可以從圖24提供的比對數據中確定出編碼本發明所述凝血酶原活化蛋白的新的保守核酸。所述新的保守核酸可以用于，例如設計特異性核酸引物和/或探針，來擴增、測序和/或鑒定本發明的核酸。血纖蛋白膠加入了棕蛇蛇毒絲氨酸蛋白酶的檸檬酸化血漿在有及無10mMCa2+存在下都非常快速的凝血。這兩種血凝塊的肉眼可見紋理因這兩種制劑的不同而不同。小鼠尾靜脈出血模型使用尾靜脈出血的小鼠模型測試純化棕蛇蛇毒蛋白酶作為抗出血劑的效果。這些試驗的結果顯示于表14和15以及圖27-28。小鼠尾靜脈出血試驗除極微小改動外基本上按照Mascietal(2000)的描述進行。結果顯示于圖27和28以及表14和15。將P.textilis蛋白酶(250μL；P.textilis蛋白酶在0.02MTris-HCl，pH7.4，10mMCaCl2中的濃度為65μg/mL的溶液)在受傷嚴重尾巴的開放傷口應用3分鐘。用預先稱重的eppendorf管計算血液流失。精確度規定血液流失要用重量計算而非體積。值得注意的是所有用蛋白酶局部處理后的小鼠都在受傷部位出現了大的血凝塊，如圖27所示。通過脫頸椎讓小鼠安樂死去。表15和圖28的數據獲自試驗，其中將受傷嚴重的小鼠尾巴的開放傷口浸沒于加入65μg或未加棕蛇蛇毒蛋白酶的250μl0.9％氯化鈉(鹽水對照)中3分鐘。血液流失用重量計算。如表15和圖28所示，血液凝塊并不需要輔因子。如表14和15以及圖28所示，與對照動物(0.542±0.160)相比，棕蛇蛇毒蛋白酶使小鼠的血液流失顯著減少(0.169g±0.086)(MannWhitneyU檢驗，p＝0.021)，已修正了技術誤差。實例從P.textilis的毒腺制備cDNA文庫從而建立種間比較以及藥物篩選所用的微陣列芯片使用SMARTcDNA文庫合成試劑盒，將從目的蛇的毒腺提取的信使RNA擴增為cDNA，然后將大于600bp的片段克隆入λTriplEx2載體(Clontech，PaloAlto，U.S.A.)。制備太攀蛇和棕蛇的cDNA文庫，每一文庫取約30個轉錄本進行初步序列分析。該過程包括PCR擴增檢測插入片段的存在和大小，然后將λTriplEx2轉化為pTriplEx2質粒并測序。由于其平均增大的插入片段的大小及變化，決定選擇太攀蛇cDNA文庫建立微陣列芯片。然后，為了大規模PCR擴增和純化，隨機分離4800個cDNA克隆，然后使用可從QueenslandInstituteofMedicalResearch獲得的GMS417陣列點樣器將這些克隆以雙份平行方式點樣于包被后的玻片上。然后使用改良的Eberwine反義RNA擴增方法將來自上述蛇毒腺的RNA以線性方式擴增(使RNA濃度增高最多70倍)用于芯片雜交。討論本發明的蛇毒蛋白酶具有獨特的結構和功能特性。另外它們還與因子Xa和O.scutellatus-凝血酶原活化劑之間具有一定的相似性。本發明的蛇毒蛋白酶能夠在無Ca2+存在下使檸檬酸化血漿凝血。在體內，為了正常凝血，因子Xa還需要有Ca2+的存在。因此，在沒有因子例如磷脂、因子Va或Ca2+存在下本發明的蛇毒蛋白酶能夠使血液凝血，這是一種全新且令人驚奇的發現。因子Xa特異性發色底物S-2222可被本發明所述的蛇毒蛋白酶切割。這表明該蛇毒蛋白酶與因子Xa具有極為相似的特異性。另外，值得注意的是只有當棕蛇蛇毒蛋白酶復合物的濃度低于2μg/ml時Ca2+才能提高S-2222的水解速度。另外，當將NaSCN加入棕蛇蛇毒蛋白酶復合物時，S-2222活性沒有完全保留。這些發現與Speijer等(1986)關于O.scutellatus-凝血酶原活化劑所作工作不同。從純化所需層析的次數可以明顯看出，使用SephacrylS-300的簡易凝膠過濾方法對于從棕蛇蛇毒蛋白酶復合物中分離絲氨酸蛋白酶成分的效果是相對較差的。不過繼續純化最終得到了同質制劑，是通過HPLC和無β-Me的SDSPAGE測定的。SDSPAGE結果表明棕蛇蛇毒蛋白酶的天然分子量為55-56kDa。棕蛇蛇毒蛋白酶在大小上與54kDa哺乳動物因子Xa(Mannetal，1987)比與60kDaO.scutellatus因子Xa樣蛋白酶(Speijeretal，1987，J.Biol.Chem.26113258)更為近似。另外，棕蛇蛇毒蛋白酶鏈結構表明與因子Xa之間比與O.scutellatus因子Xa樣絲氨酸蛋白酶之間更為相似。SDSPAGE(+β-Me)表明棕蛇蛇毒蛋白酶包括兩個肽鏈，可能是通過二硫鍵連接在一起。這一點還得到在棕蛇蛇毒蛋白酶測序時發現兩個N-末端氨基酸的事實的支持。從這些結果可知，重鏈和輕鏈的大小分別為約31和18kDa，但是這與全蛋白酶分子量55-56kDa不相符。與本發明的棕蛇蛇毒蛋白酶不同，發現O.scutellatus因子Xa樣絲氨酸蛋白酶是由大小都為30kDa的兩條鏈組成(Speijeretal，1986，同上)。一個值得注意的發現是T.carinatus因子Xa樣絲氨酸蛋白酶的開始的11個氨基酸與本發明的棕蛇蛇毒蛋白酶具有100％的序列同源性。這表明在這兩種澳大利亞蛇蛇毒凝血酶原活化劑的進化的全過程中，出現了一定程度的氨基酸序列保守性(用棕蛇蛇毒蛋白酶全長氨基酸序列發現)。序列同源性還存在于因子Xa與棕蛇蛇毒蛋白酶之間，這表明一些氨基酸在蛇和哺乳動物的進化中是保守的。但是，如圖27和28所示，本發明的蛇毒蛋白酶具有全新的保守區域，這些區域不同于因子Xa和Trocarin以及所有申請人已知的其它蛋白質。因子Xa具有絲氨酸蛋白酶所有典型的特征，具有兩個相似的結構域、結構域內二硫鍵以及其它(Stubbs&Bode，1994，同上)。但是，絲氨酸蛋白酶的差異賦予了其特異性功能。例如，因子Xa活性位點裂口比凝血酶的裂口更敞開(Stubbs&Bode，1994，同上)，這使得因子Xa切割特異性在Arg274-Thr275和Arg323-Ile324。本發明蛇毒蛋白酶的一個新的治療用途是作為試劑制備局部用血纖蛋白膠。本發明的蛇毒蛋白酶在制備血纖蛋白膠上比目前方法能提供更有效的治療作用。用本發明蛇毒蛋白酶制備而成的局部用血纖蛋白膠可以大大減少創傷的出血從而能夠挽救許多人和非人動物的生命。例如，可以給醫療急救箱裝配灌滿了含有本發明蛇毒蛋白酶的血纖蛋白膠的繃帶和其它器具以便防止意外出血。縮寫A405-405nm處的吸光度Arg-精氨酸AUFS-280nm處的滿量程的吸光度單位C-半胱氨酸Ca2+-鈣離子CaCl2-氯化鈣cm-厘米D-天冬氨酸E-谷氨酸F-苯丙氨酸G-甘氨酸HPLC-高效液相層析hr-小時I-異亮氨酸Ile-異亮氨酸K-賴氨酸kDa-千道爾頓L-亮氨酸M-蛋氨酸M-摩爾mg-毫克min-分鐘ml-毫升mM-毫摩爾N-天冬酰胺NaSCN-硫氰酸鈉nm-納米O.scutellatus-太攀蛇(Oxyuranusscutellatus)P.textilis-棕蛇(Pseudonajatextilis)PAGE-聚丙酰胺凝膠電泳PEG-聚乙二醇Q-谷氨酰胺S-絲氨酸SDS-十二烷基硫酸鈉sec-秒T-蘇氨酸T.carinatus-粗鱗蛇(Tropidechiscarinatus)TFA-三氟乙酸Thr-蘇氨酸TOF-飛行時間V-纈氨酸Y-酪氨酸β-Me-β-巰基乙醇μl-微升μmol-微摩爾表1表2表3表4表5表6表7表8表9表10表11表12表13表14表15表16說明書中實現了描述了本發明優選實施方案的目的，但是絕非意將本發明限制在任一技術方案或具體特征組。因此，本領域技術人員理解的是根據本申請公開的內容可以對例舉的具體實施方案做出各種修飾和改動而不脫離本發明的范圍。權利要求1.一種分離的蛇毒蛋白酶(SVP)制劑，其中含有下列鏈中的一種或多種與SEQIDNO2，5，8，11，14或17任一所示輕鏈序列之間具有至少50％序列同一性的輕鏈，以及與SEQIDNO2，5，8，11，14或17任一所示重鏈序列之間具有至少50％序列同一性的重鏈，而且該制劑無需鈣就可發揮活性。2.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述SVP發揮活性無需因子Va。3.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述SVP發揮活性無需磷脂。4.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述SVP含有原肽結構域。5.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述SVP含有活化結構域。6.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述的輕鏈和重鏈都在同一個多肽鏈上。7.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述的輕鏈和重鏈在不同的多肽鏈上。8.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述的輕鏈和重鏈蛋白都存在，并且與天然生成形式長度相等或非常近似。9.權利要求1的分離的SVP制劑，其中含有以下一種或多種結構域第一或原肽結構域，與圖23所示6個SVP中任一個的第1-40位殘基之間具有至少31％的序列同一性；輕鏈切割位點，在圖23所示6個SVP中任一個的第40-41位殘基之間；與圖23所示任一SVP中第41-85位殘基之間具有至少80％序列同一性的結構域；與圖23所示任一SVP中第86-122位殘基之間具有至少75％序列同一性的結構域；與圖23所示任一SVP中第123-165位殘基之間具有至少75％序列同一性的結構域；與圖23所示任一SVP中第166-179位殘基之間具有至少75％序列同一性的結構域；對應于圖23中第180-182位殘基的結構域；與圖23所示任一SVP中第183-209位殘基之間具有至少50％序列同一性的結構域；以及重鏈結構域，與圖23中第210-467位(就棕蛇、海岸太攀蛇、兇猛太攀蛇或紅腹黑蛇序列而言)或第210-456位殘基(就虎蛇或粗鱗蛇序列而言)之間具有至少75％的序列同一性。10.權利要求1的分離的SVP制劑，其中含有圖23所示的H251，D309和S406殘基。11.權利要求1的分離的SVP制劑，其中含有一種序列，該序列與圖23所示任一SVP中第292-305位氨基酸的序列相同或不相同的殘基數不超過5個。12.權利要求1的分離的SVP制劑，其中包括一種由完全處理后的輕鏈和重鏈組成的二聚分子。13.權利要求1的分離的SVP制劑，其中包括一種由輕鏈和重鏈組成的二聚分子，其中含有下列鍵輕鏈中第57和62位、第90和101位、第95和110位、第112和121位、第129和140位、及第151和164位殘基間的鏈內Cys-Cys鍵，重鏈中第216和221、第236和252、第377和391、及第402和430位殘基間的鏈內Cys-Cys鍵，以及輕鏈第172位殘基與重鏈第329位殘基間的鏈間Cys-Cys鍵。14.權利要求1的分離的SVP制劑，其中含有一種或多種以及一些情況下含有所有下列結構域(編號參照圖22中的共有編號)第一或原肽結構域，與圖22所示任一SVP中第1-40位殘基之間具有至少30％的序列同一性；與圖22所示任一SVP中第41-120位殘基之間具有至少90％序列同一性的結構域；與圖22所示任一SVP中第121-132位殘基之間具有至少60％序列同一性的結構域；與圖22所示任一SVP中第133-182位殘基之間具有至少80％序列同一性的結構域；與圖22所示任一SVP中第183-233位殘基之間具有至少90％序列同一性的結構域；與圖22所示任一SVP中第234-378位殘基之間具有至少80％序列同一性的結構域；與圖22所示任一SVP中第395-456位殘基之間具有至少80％序列同一性的結構域；與圖22中第457-467位殘基之間具有至少90％序列同一性的結構域。15.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述SVP是一種完全的凝血酶原活化劑，具有一個或多個下列特征該序列的第41位殘基不為S(所有編號參照圖21中的共有編號)，第48位殘基不為I，第50位殘基不為P，第74位殘基不為N，第104位殘基不為P，第105位殘基不為N，第123位殘基不為K，第127位殘基不為Q，第142位殘基不為R，第145-7位殘基不為SET，第154位殘基不為S，第156位殘基不為R，第159位殘基不為V，第167位殘基不為E，第169位殘基不為D，第178位殘基不為A；包含出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇中任一序列的序列181-208(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基；第228位殘基不為I，第229位殘基不為N，第233位殘基不為G，第232位殘基不為E，第245位殘基不為H，第258-9位殘基不為SV；包含出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇任一序列的序列260-270(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基；第274位殘基不為R，第286位殘基不為T，第292-300位殘基不為NYYY-VHQN，第303位殘基不為R，第305位殘基不為A，第314位殘基不為R，第339位殘基不為E，第345位殘基不為S，第353-360位殘基不為RIQFKQPT，第367位殘基不為I，第368位殘基不為T，第382位殘基不為D，第384位殘基不為R，第387位殘基不為Q，第389位殘基不為N，第424位殘基不為I，第342位殘基不為R，第451位殘基不為賴氨酸，第454-455位殘基不為SL；或者包含出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇任一序列的序列457-467(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基；16.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述SVP是一種部分完全的凝血酶原活化劑，具有一個或多個下列特征包含出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇序列中任一序列的序列181-208(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基；或包含出自圖21中棕蛇、太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇、粗鱗蛇序列中任一序列的序列260-270(或者兇猛太攀蛇中相應序列)中的至少1個殘基。17.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述制劑含有輕鏈，該輕鏈與SEQIDNO2，5，8，11，14或17中任一序列的輕鏈序列之間具有至少95％的序列同一性。18.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述制劑含有輕鏈，該輕鏈與SEQIDNO2，5，8，11，14或17中任一序列的輕鏈序列之間的不同殘基為10個或更少。19.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述制劑含有輕鏈，該輕鏈具有SEQIDNO2，5，8，11，14或17中任一的序列。20.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述制劑含有重鏈，該重鏈與SEQIDNO2，5，8，11，14或17中任一序列的重鏈序列之間具有至少95％的序列同一性。21.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述制劑含有重鏈，該重鏈與SEQIDNO2，5，8，11，14或17中任一序列的重鏈序列之間的不同殘基為10個或更少。22.權利要求1的分離的SVP制劑，其中所述制劑含有重鏈，該重鏈具有SEQIDNO2，5，8，11，14或17中任一的序列。23.一種分離的核酸，該核酸選自a)編碼含有SEQIDNO2，5，8，11，14或17所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；b)含有SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列的核酸分子，或者SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16或18的全長互補序列；c)與SEQIDNO1，3，4，6，7，9，10，12，13，15，16，或18所示核苷酸序列具有至少85％序列同一性的核酸分子；d)編碼含有圖23所示6個SVP中任一個中第41-179位氨基酸殘基的多肽的核酸分子；e)編碼一種多肽的核酸分子，就棕蛇、海岸太攀蛇、兇猛太攀蛇或紅腹黑蛇而言，該多肽具有圖23中序列的第210-467位氨基酸殘基，或者就虎蛇或粗鱗蛇而言，該多肽具有圖23中序列的第210-456位殘基；f)編碼具有圖23所示6個SVP中任一個中第1-40位氨基酸殘基的多肽的核酸分子；g)編碼具有圖23所示6個SVP中任一個中第180-209位或第183-209位氨基酸殘基的多肽的核酸分子；24.權利要求23的核酸分子，其中進一步含有載體核酸序列。25.權利要求23的核酸分子，其中進一步含有編碼異源多肽的核酸序列。26.一種載體，其中含有權利要求23所述核酸分子。27.一種宿主細胞，其中含有權利要求23所述核酸分子。28.一種制備SVP多肽的方法，該方法包括將權利要求27所述宿主細胞在能使所述核酸分子表達的條件下培養。29.一種含有權利要求1所述多肽的組合物，其中該組合物的pH值為約5-9。30.權利要求29的組合物，其中所述pH值為約6.5-7。31.一種組合物，其中含有權利要求1所述多肽和多元醇。32.權利要求31中的組合物，其中所述多元醇是甘油。33.一種藥物組合物，其中含有權利要求1所述多肽和可藥用的載體。34.一種試劑盒，其中含有權利要求1所述多肽以及一種或多種下列物質使用說明書；其它試劑；稀釋劑；用于制備蛇毒蛋白酶以便施用的器具或其它材料；可藥用的載體；以及為了向受試者施用而提供的器具或其它材料。35.權利要求34的試劑盒，其中該試劑盒含有下列物質中的1或多種輔因子，抗微生物劑，例如抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑，抗炎癥劑，抗組胺劑，抗纖維溶解劑、止痛劑和生長因子。36.權利要求35的試劑盒，其中進一步含有一種或多種下列輔因子鈣、磷脂和因子Va。37.一種治療受試者的方法，該方法包括向所述受試者施用權利要求1所述SVP，從而治療所述受試者。38.權利要求37的方法，其中該方法抑制所述受試者體表或體內部位的流血。38.權利要求38的方法，其中所述部位是一種藥物或手術干預部位。39.權利要求38的方法，其中所述部位是一種意外創傷部位。40.權利要求38的方法，其中所述受試者在形成或保持血液凝塊能力方面有缺陷。41.權利要求40的方法，其中所述缺陷是由于基因缺陷或者因向受試者施用了能使受試者形成或保持血液凝塊能力減弱的藥物而導致的。42.權利要求37的方法，其中所述SVP是由受試者以外的其它人施用的。43.權利要求37的方法，其中所述SVP是由受試者本人施用的。44.權利要求37的方法，其中所述SVP是在還不需要使用前就提前提供給受試者。45.權利要求37的方法，其中所述SVP是以防液體包裝連同使用說明書一起提供的。46.權利要求1的SVP制劑，該制劑放置于不透水或不透氣的容器內。47.權利要求46中的制劑，其中所述容器的構成使得SVP能以液體、噴霧、氣溶膠、粉末或晶體的形式分配。48.權利要求47的制劑，其中所述容器的構成使得SVP能按計量或預定劑量分配。49.一種裝置，該裝置與受試者接觸時，其能夠分配出足以抑制流血的量的權利要求1所述SVP。50.權利要求49的裝置，其中所述裝置是下列中的任一種繃帶、敷布、傷用敷料、縫合線或一種布料制品。51.一種機讀載體，其上記載了權利要求1或23所述的核酸或蛋白序列。52.一種分析SVP序列的方法，該方法包括提供SVP核酸或氨基酸序列，將該SVP序列與第二個序列進行比較或者將該序列從一臺電腦轉移到另一臺電腦上，從而對SVP進行分析。53.一種核酸文庫，該文庫源自棕蛇、兇猛太攀蛇、海岸太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇或粗鱗蛇中的任一種。54.一種蛋白質文庫，該文庫源自棕蛇、兇猛太攀蛇、海岸太攀蛇、紅腹蛇、虎蛇或粗鱗蛇中的任一種。55.一種分離的多肽，其中包括下列序列MAPQLLLCLILTFLWSLPEAESNVFLKSKX1ANRFLQRTKRX2NSLX3EEX4X5X6GNIERECIEEX7CSKEEAREX8FX9DX10EKTEX11FWNVYVDGDQCSSNPCHYX12GX13CKDGIGSYTCTCLX14X15YEGKNCEX16X17LX18X19SCRX20X21NGNCWHFCKX22VQX23X24X25QCSCAEX26YX27LGX28DGHSCVAX29GX30FSCGRNIKX31RNKREASLPDFVQSX32X33AX34X35KKSDNPSPDIRIX36NGMDCKLGECPWQAX37LX38X39X40X41X42X43X44FCGGTILSPIX45VLTAAHCIX46X47X48X49X50X51SVX52VGEIX53X54SRX55X56X57X58X59LLSVDKX60YVHX61KFVX62X63X64X65X66X67X68X69X70X71X72X73X74X75X76X77YDYDIAIX78X79X80KTPIQFSENVVPACLPTADFAX81X82VLMKQDX83GIX84SGFGX85X86X87X88X89X90X91X92SX93X94LKX95X96X97VPYVDRHTCMX98SSX99X100X101ITX102X103MFCAGYDTLPX104DACQGDSGGPHITAYX105DTHFX106TGIX107SWGEGCAX108X109GX110YGX111YTKX112SX113FIX114WIKX115X116MX117X118X119Z其中X1，X10，X12-13，X15-16，X19-23，X25，X27-30，X33-34，X37，X39，X42-47，X50，X53-56，X58-62，X64，X79，X81-83，X85-94，X96，X99-105，X108-109，X113-115和X117-119彼此獨立地選自任一種氨基酸殘基；X2，X6，X11，X14，X26，X31，X48X57和X63均為小的氨基酸殘基；X3，X4，X8，X17，X18，X35-36，X38，X51-52，X78，X80，X84，X95，X98，X106-107，X111-112和X116均為疏水氨基酸殘基；X5，X7和X110均為堿性氨基酸殘基；X9，X40-41和X49均為帶電氨基酸殘基；X24是一種酸性氨基酸殘基；X32是一種中性/極性氨基酸殘基；X65-67，X70-72和X75彼此間獨立地缺失或選自任一氨基酸殘基；X68和X74彼此間獨立地缺失或選自酸性氨基酸殘基；X69，X73和X76彼此間獨立地缺失或選自疏水氨基酸殘基；X77缺失或者是一種小的氨基酸殘基；以及Z缺失或為一種長度為1-20個氨基酸的肽。全文摘要本發明涉及蛇毒蛋白酶多肽及其編碼核酸序列。本發明還涉及制備和使用該蛇毒蛋白酶的方法，例如，促進止血和預防血液流失如手術過程中，或者用于治療意外事故以及其它類型損傷或外傷導致的傷口。文檔編號C07K14/46GK1659184SQ03812810公開日2005年8月24日申請日期2003年4月3日優先權日2002年4月3日發明者保羅·P·馬西,約翰·德杰西,馬丁·拉文申請人:昆士蘭大學