專利名稱：可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物，治療血栓栓塞疾病的藥物，含這種血纖溶酶原激活物的藥物組合物和它們的用途。
組織血纖溶酶原激活物(t-PA)是一種由多個結構域組成的絲氨酸蛋白酶，它們催化血纖溶酶原向血纖溶酶的轉變并用于血纖維蛋白溶解的治療。
有許多t-PA變體和突變是眾所周知的，例如參見T.J.R.Harris(1987)和J.Krause(1988)的綜述文章。
此外，為了已知t-PA的作用原理，通過t-PA和血纖溶酶原激活物抑制劑I(PAI-1，一種得自絲氨酸蛋白酶抑制劑族的絲氨酸蛋白酶抑制劑)之間的相互作用來部分調節纖維蛋白的溶解作用。將PAI-1結合到t-PA上主要通過氨基酸296-302進行。這些區域的突變降低了PAI-1對t-PA的抑制影響(E.L.Madison等人(1990))。為了了解PAI-1和t-PA的氨基酸區域296-302間的相互作用機理，人們進行了大規模的試驗(也參見E.L.Madison,《自然》339(1989)第721-723頁；R.V.Schohet,《血栓形成與止血法)》71(1994)第124-128頁；C.J.Refino,《血栓形成與止血法》70(1993)第313-319頁；N.F.Paoni,《蛋白質工程》6(1993)第529-534頁和《血栓形成與止血法》70(1993)第307-312頁；W.F.Bennett,《生物化學》雜志266(1991)第5191-5201頁，D.Eastman,《生物化學》31(1992)第419-422頁)。
未修飾的人的t-PA(此外，特征在于t-PA)在血漿中存在的形式由527氨基酸組成并可通過血纖溶酶裂解成兩個鏈，該鏈然后又通過二硫化物橋結合在一起。A鏈(也稱為主(schwere)鏈)由四個結構域構成。指狀結構域(氨基酸l-49)表示與纖連蛋白中指狀結構相似。生長-因子-結構域(氨基酸50-86)在某些范圍內與鼠和人的表皮生長因子同源。Kringle結構域(氨基酸87-261)在更大的范圍內與第四個和第五個血纖溶酶原的Kringle結構域同源。t-PA的指狀結構域和Kringle-2-結構域尤其是通過血纖蛋白包含在血纖蛋白結合和蛋白溶解活性的刺激中。t-PA的B-鏈(氨基酸276-527，蛋白酶結構域)是一種絲氨酸蛋白酶，并主要與尿激酶和血纖溶酶的B-鏈同源(T.J.R.Harris(1987)和J.Krause(1988))。
t-PA的酶活性(血纖溶酶原對血纖溶酶的催化活性)在無血纖蛋白或血纖蛋白裂解產物的存在下較低，但是，在這種刺激劑的存在下可顯著地提高(約大于10個因子)。t-PA在體內的作用機理例如在Kominger和Collen,《血栓形成與止血法》46(1981)第561-565頁中已有描述。t-PA使血纖溶酶原活化成血纖溶酶。血纖溶酶使血纖蛋白裂解成可溶的血纖蛋白裂解產物。通過血液中存在的蛋白酶/血纖溶酶，t-PA在氨基酸275(精氨酸)和276(異亮氨酸)之間進行裂解，由此進行活化。因此，通過半胱氨酸橋結合保留的鏈的兩部分。
通過血纖蛋白，血纖蛋白裂解產物的活性的可刺激性是t-PA的一個主要特征，該t-PA與另一個已知的血纖溶酶原激活物例如尿激酶或鏈激酶的t-PA是有區別。通過修飾t-PA的氨基酸序列可進一步改善可刺激性。可刺激性的程度是在或不在血纖蛋白的存在下催化效率的比例(Kcat/Km)。Kcat是催化反應的速度常數，而Km是米氏(Michael)常數。在修飾氨基酸292和/或305時，t-PA的可刺激性提高達19-81倍(E.L.Madison等人，《科學》262(1993))第419-421頁。
由USP5501853已知t-PA衍生物，它們在氨基酸272-280的區域內，尤其在274-277的區域內，另外在糖基位置(117-119和184-186)(Glykosylierungsstellen)的區域內得到修飾。這種t-PA衍生物具有改進的蛋白溶解活性和血纖溶酶原溶解活性，對于抑制具有降低的敏感性，對于血纖蛋白具有改進的親合力和/或改進的血纖溶酶原溶解活性的血纖蛋白依賴性。
Wen-Pin Yang等人在《生物化學》33(1994)第2306-2312頁中描述了可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物。這種嵌合血纖溶酶原激活物(59D8-scu PA-t)由抗血纖蛋白抗體(59D8)的Fab片段和可凝血酶活化的低分子量單鏈尿激酶-血纖溶酶原激活物(scu PA-t)的C末端部分制備，它們通過氨基酸Phe-157和Lys-158的缺失，由低分子量單鏈尿激酶-血纖溶酶原激活物(scu PA)通過定點誘變而獲得。
K.N.Dawson等人在《生物化學》雜志269(1984)第15989-15992頁公開了一種血纖溶酶原突變體，它們通過凝血酶可活化。這些血纖溶酶原衍生物通過可凝血酶裂解的序列取代裂解位置的P3-,P2-和P1＇-氨基酸而獲得。
N.F.Paoni.等人在《蛋白質工程》5(1992)第259-266頁中公開了在氨基酸區域296-299區的t-PA的修飾。借此，獲得改進的血纖蛋白特異性。
USP5200340公開了可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物，如此地進行修飾使得它們含有用來活化的凝血酶裂解位置。進一步進行修飾使得在這種t-PA衍生物中，盡管生長因子結構域(EGF結構域)可缺失，但是，必須保持血纖蛋白結合結構域(指狀結構域)和Kringle結構。
由WO91/09118和WO94/10318已知，血纖溶酶原可通過將凝血酶的凝血酶裂解位置插入到血纖溶酶中進行活化。因為在血塊中含有凝血酶，所以這種活化主要在血塊上進行。但是，這種方法的缺點在于必須向病人給藥大量的經修飾的血纖溶酶原。
本發明的目的是提供使用一種改進的血纖溶酶原激活物，這種激活物具有較高的特異性和有效性，能夠在體內溶解血塊。
本發明的目的通過來源于人的組織血纖溶酶原激活物的血纖溶酶原激活物的下列修飾來實現(a)如此地進行修飾使得血纖溶酶原激活物通過凝血酶可裂解并通過這種裂解轉變成雙鏈的形式，(b)如此地進行修飾使得它們的酶原性(Zymogenitat)與人的t-PA相比至少大1.2個因子，優選大于2個因子和(c)這種血纖蛋白的結合力要如此地降低，使得高于50％的血纖溶酶原激活物可進入血塊中。
這種血纖溶酶原激活物在血塊上起特異作用，因此它們的副作用要比已知的血纖溶酶原激活物明顯地降低。
本發明的出發點是人的組織血纖溶酶原激活物的序列。因此，根據本發明，“來源于人的組織血纖溶酶原激活物”是指本發明的血纖溶酶原激活物的序列來源于人的血纖溶酶原激活物的序列。這表明在結構上至少部分地保持了t-PA特性的結構特征(結構域)。例如結果表明本發明的血纖溶酶原激活物是可利用的，其中仍然保持了Kringel2和/或蛋白酶結構域的結構，并且另外可按本發明進行修飾。同樣可能的是可進一步保持結構域并且通過氨基酸的缺失，突變和/或加入產生本發明的特征。氨基酸序列的改變可通過專業人員已知的方法例如定向誘變或PCR進行。
在一個優選的實施方式中，與人的組織血纖溶酶原激活物相比，如此地修飾本發明的血纖溶酶原激活物，使得本發明血纖溶酶原激活物的可裂解性通過血纖溶酶在氨基酸P1(275)和P1＇(276)之間降低。在本發明的血纖溶酶原激活物中，通過血纖溶酶使可裂解性有效地降低了10％或以上，更優選20％或以上，特別優選地50％或以上。因此無需完全保持可血纖溶酶的裂解性。尤其是，通過本發明血纖溶酶原激活物的可血纖溶酶裂解性，可改進凝血酶的活化。
但是也優選地是，應如此地降低可裂解性，使得在體內不再進行與生理有關的裂解。借此可明顯地降低副作用。因此實現了體內凝血參數的分解(Abbau)明顯地得到削弱，并且如在已知的血纖溶酶原激活物中不會明顯地延長出血時間。
可在一個體外試驗中，測定通過血纖溶酶的可裂解性。因此，將具有提高量的血纖溶酶的血纖溶酶原激活物在25℃下溫育5分鐘，接著在具有12.5-15％丙烯酰胺的丙烯酰胺凝膠中根據血纖溶酶原激活物的量進行SDS電泳(U.Kohnert等人，《蛋白質工程》5(1992)第93-100頁)。
血纖溶酶原激活物的修飾可按以下的方式，以對于每個專業人員來說已知的方法進行，使得在P1和P1＇之間(根據Schechter,J.和Berger A.,的命名法，《生物化學與物理研究通訊》27(1967)第157-162頁)不再進行裂解或降低通過血纖溶酶的裂解。血纖溶酶裂解序列R275-I276(在單字母密碼中的氨基酸符號)。例如，通過修飾一種或兩種氨基酸可提高或明顯降低通過血纖溶酶的可裂解性。
也可通過P4-P3＇位置(氨基酸272-278)的修飾來降低通過血纖溶酶的可裂解性。在這種情況下，最好將P2轉變成優選不疏水的和/或非芳香族的氨基酸例如P。由此，令人驚奇地是除了降低可血纖溶酶的裂解性外，實現了凝血酶的可裂解性。
此外，優選地遵守一個或多個下列的一般條件(P)P4任何氨基酸(但是不是P，如果P2是P，優選是L,I,V)(Q)P3任何氨基酸(F)P2疏水的氨基酸(F,H,G,V,L,I,T,A或P，特別優選P)(R)P1:R或K,優選R(I)P1＇:V或I，優選I(K)P2＇:V,L,I或K，優選V(G)P3＇:G特別優選地，將P4轉變成V,P2轉變成P,P2＇轉變成V。由此產生特別好的裂解位置(272-278)VQPRIVG。(序列NO:1)凝血酶裂解位置的插入也可按現有技術進行。但是，優選地是在氨基酸264-288的區域內插入相應的突變。
向凝血酶引入親合力的t-PA的修飾也可通過環459-471，自溶環417-425和/或氨基酸Q475,K505和/或E506的修飾進行。
對其底物來說，酶的特異性主要取決于裂解位置的序列(初級序列)。對于絲氨酸蛋白酶例如凝血酶和血纖溶酶來說，P1殘余物是主要的特定決定子。可折疊的蛋白底物的特異性也取決于酶(凝血酶或血纖溶酶)和底物(血纖溶酶原激活物)之間的特性接觸以及裂解位置的構象和適應性。因為血纖溶酶和凝血酶的初級特異性極為類似(根據精氨酸，在P1位置上兩種都裂解)，所以不再有另一種可能，為獲得血纖溶酶原激活物，其中通過血纖溶酶(血纖溶酶的可活化性)降低裂解并通過凝血酶(凝血酶的可活化性)保留裂解或基本上要比血纖溶酶的可活化性大(至少小2-10因子)但是，令人驚奇地發現，通過在酶和底物之間的二次結合位置上的修飾以及對活化環的結構和動力特性的修飾，可獲得這種特性。
優選在降低可血纖溶酶的裂解性的同時，通過突變改變在活化環中的初級特異性而在氨基酸264和288之間進行插入凝血酶特異的裂解位置。對此，特別優選地是上述突變在區域272-277(P4-P2＇)內進行。
可通過適應性的修飾和/或結合環的可接近性來提高可凝血酶的裂解性。此外，特別優選地是修飾G265(突變引起適應性降低)或R267(突變引起G265和E410之間鹽橋的改變或裂解)。同樣優選地是在264和267之間的區域內進行插入。特別優選地是在S中修飾R267(D.Lamba等人，《分子生物》雜志258(1996)第117-135頁)。
一種可提高適應性的突變是在S處改變R267，優選與F處的P4,G處的P3和V處的P2＇的突變結合。
可通過二次特異結合位置的改變進一步改進可凝血酶的裂解性和特異性。此外，例如環459-471可完整或部分地缺失。這種環由下列氨基酸組成GDTRSGGPQANLH.(序列NO:2)優選地，在這種環中，區域PQANLH(序列NO:3)完全或至少部分缺失(而且優選保留H)或在它們的氨基酸序列中進行改變。
優選在氨基酸272-277的區域中使用下列序列GIPRIV(序列NO:4)AQPRIK(序列NO:5)同樣有利的是在265-277的氨基酸區域(t-PA原始序列GLRQYSQPQFRIK(序列NO:6))中，使用下列序列GLSQASQGIPRIV (序列NO:7)對于該區域，同樣優選地是下列序列GLRQYSQAQGIPRIV (序列NO:8)在該序列中，將在Q和P(原始序列Q和F)之間插入氨基酸G和I以使其延長。優選地，這種插入可在264和276之間的區域內在任何位置上進行。
同樣特別優選地是本發明的化合物，其中將裂解位置(序列NO:1)與一個或多個，優選全部的F處的突變P4,G處的突變P3,P處的突變P2和V處的突變P2＇和S處的突變R267相結合。
在本發明的一個優選的實施方式中，血纖溶酶原激活物含有另一個突變，其單鏈形式的活性，而不是雙鏈形式的活性顯著地降低，由此提高酶原性，使其達到約1.2因子，優選為2因子或更高。
術語“酶原性”是指雙鏈形式活性和單鏈形式活性的商。活性是酰胺分解測定的。使用這種血纖溶酶原激活物在明顯降低副作用的同時實現了體內血栓溶解的高選擇性和有效性。在E.L.Madison等人《科學》262(1993)第419-421頁中描述了合適和優選的單鏈形式的突變。
為提高酶原性(血纖溶酶原激活物的雙鏈形式的酰胺分解活性與單鏈形式的酰胺分解活性的比例)，特別優選地是(也對于所有的血纖溶酶原激活物，它們是由人的組織血纖溶酶原激活物產生的)修飾Q處的K429和/或T處的H417和/或阻止或破壞在K429和H417之間的相互作用。
特別優選的本發明的化合物含有裂解位置(272-278)VQPRIVG(SEQ ID NO:1)，它們在Q處具有另外的突變K429和/或在T處的突變H417。
血纖蛋白結合的降低可這樣進行，使對血纖蛋白結合呈特異性的t-PA結構域(血纖蛋白結合結構域，指狀結構域)缺失或如此進行突變，以使血纖蛋白的結合不是通過指狀結構域進行或者僅在小范圍內進行(不起作用的指狀結構域)。通過這種血纖蛋白結合的降低，實現了可將血纖溶酶原激活物滲透到血塊中(優選50％以上)并且分布均勻。在那兒，它們通過凝血酶發生裂解并使它們的活性以活化雙鏈的形式顯示。一種按這種方式降低其血纖蛋白結合的血纖溶酶原激活物對于t-PA不再具有典型的高親合力的血纖蛋白結合。通過這種特異的作用方式，血纖溶酶原激活物的能力增強，并且尤其是明顯地降低了副作用。可以一種體外模型來確定本發明血纖溶酶原激活物在血塊中的滲透。肉眼觀察確定血塊滲透的程度和在血塊中的分布。為了進行判斷，使用USP5223256中公開的滲透到血塊中分布均勻的血纖溶酶原激活物作為標準，并由此按定義將該值定為100％(在濃度為3μg/ml時進行測定)。使用EP-B0093619的重組體人的組織血纖溶酶原激活物作為另一個標準，按定義不是滲透到血塊中，而是基本上結合到表面上。為了研究血塊的滲透，在實施例3c中描述了該過程。與該標準進行對比表明“未滲透到血塊中”是指絕大部分(80％或以上)的血纖溶酶原激活物位于血塊的四分之一位置上，而“均勻分布”是指至少50％的血纖溶酶原激活物進一步地滲透到血塊中，并且因此在剩余的四分之三位置中定位。
當使用本發明的血纖溶酶原激活物時，還可進一步提高溶解凝結物的特異性和有效性，沒有或僅有極少量的非特異血纖蛋白的結合。這種分子滲透到凝血的內部，從而使人們擔心血纖溶酶原對血塊中的血纖溶酶的有效活化。這種血纖溶酶原激活物例如基于t-PA的蛋白酶結構域(WO96/17928)或基于一種物質，這種物質主要含有Kringle2-結構域和蛋白酶結構域作為t-PA結構域，而不含指狀結構域作為t-PA結構域(WO90/09437,USP5223256,EP-B0297066,EP-B0196920)。
在一個優選的實施方式中，本發明的血纖溶酶原激活物另外還進行如此地修飾，以使它們不是通過PAI-1來抑制的。一種這樣的修飾優選通過突變氨基酸296-302(Madison,E.L.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990)第3530-3533頁)，特別優選通過由AAAA交換氨基酸296-299(KHRR)(WO96/01312)而進行。
本發明的化合物是溶血栓活化蛋白質，這種蛋白質優選與t-PA(Alteplase)不同，適合于以靜脈內大丸劑注射液的形式給藥。它們在劑量較少時是有效的并且實際上具有相同的溶血栓作用，例如Alteplase臨床常用的輸注。
提高特異性和與此有關的降低出血副作用使得可將本發明的化合物變成對用于治療所有血栓栓塞疾病的極有價值的溶血栓藥。與迄今僅在最威脅生命的疾病如心肌梗塞和大面積肺栓塞容許的溶血栓藥不同，利用這種變體開辟了在輕度急性威脅生命的疾病例如深度腿靜脈血栓形成中也使用本發明的化合物進行溶血栓的可能性。此外，現在可比以往更多地使用基于本發明化合物溶血栓藥，因為對于更寬的應用來說，主要的阻礙原因是存在出血并發癥的危險。對此無關，本發明的化合物具有優點，也可在急性疾病如心肌梗塞形成或肺栓塞中使用。
可根據專業人員常用的方法，在真核細胞或原核細胞中進行本發明中所使用的血纖溶酶原激活物的制備方法。優選采用基因工藝制備本發明的化合物。例如在WO90/09437,EP-A0297066,EP-A0302456,EP-A0245100和EP-A0400545中已公開了這種方法，這些文件公開的主題是這種制備方法。可通過“寡核苷酸的定點特異誘變”在t-PA或其衍生物的cDNA中插入突變。例如Zoller和Smith(1984)，根據T.A.Kunkel(1985)和Morinaga等人(1984)的修飾，描述了“定點特異誘變”。同樣適用的是PCR誘變法，例如Ausubel等人(1991)描述了該方法。
如果在適用于所使用的寄主細胞的表達載體中有核酸存在，那么按該方法獲得的核酸起表達本發明中使用的血纖溶酶原激活物的作用。
另外還可修飾本發明蛋白質的核酸序列。這種修飾的實例是改變核酸序列，以便插入減少連接、克隆和誘變步驟的限制酶的不同的識別序列，改變核酸序列，以便構建對于寄主細胞的優選的密碼子，在附加的調節元件和轉錄元件周圍補充核酸序列，以便使在寄主細胞中的表達達到最佳。
所有其它的適于表達載體的制備和表達的方法步驟是現有技術并對專業人員是已知的。例如Sambrook等人在《分子克隆》的“在大腸桿菌中克隆基因的表達”中描述了這種方法實驗手冊(1989),Cold Spring Harbor實驗出版社，美國紐約。
本發明所使用的糖基化的血纖溶酶原激活物的制備是在真核寄主細胞中進行的。本發明所使用的非糖基化的血纖溶酶原激活物的制備也是在真核寄主細胞中進行的(其中必須將首先獲得的糖基化產物通過專業人員常用的方法脫糖基化)或者優選通過在非糖基化的寄主細胞中，特別優選在原核寄主細胞中表達來進行。
例如，將大腸桿菌，鏈酶菌素或枯草芽胞桿菌用作原核宿主生物體。為了制備本發明的蛋白質，按常規方法發酵原核細胞，在細菌分解后，按常規方法分離蛋白質。如果蛋白質以失活的形式(包含體)沉淀的話，那么按照專業人員已知的方法進行溶解和天然化(naturiert)。同樣可按專業人員已知的方法，從微生物中分泌出作為活化蛋白質的蛋白質。對此適用的表達載體優選含有在使用的宿主細胞中適合于蛋白質分泌的信號序列和編碼蛋白質的核酸序列。在這種情況下，用這種載體表達的蛋白質在培養基(在革蘭氏陽性菌時)中或者在胞質間隙(在革蘭氏陰性菌時)中分泌。在信號序列和用于編碼本發明t-PA衍生物的序列之間含有適當的用于編碼裂解位置的序列，它們在加工時或通過用蛋白酶處理允許蛋白質裂解。
插入到用來編碼本發明血纖溶酶原激活物的DNA序列中的基礎載體的選擇取決于以后表達所使用的宿主細胞。合適質粒以及對這種質粒提出的最低要求(例如復制源，限制片段位置)是專業人員已知的。在本發明的范圍內，也可將一種質粒調整成噬菌體(λ,M13)的復制雙股形式的粘粒或使用其它專業人員已知的載體。
在原核生物中制備本發明的血纖溶酶原激活物時，優選不進行分泌，由溶解細胞顆粒分離形成的包含體，在還原條件下通過用變性劑進行處理，溶解含血纖溶酶原激活物的包含體，接著用GSSG進行衍生，通過添加GSH和非變性濃縮物形式的變性劑或L精氨酸來復性血纖溶酶原激活物。EP-A0219874和EP-A0241022公開了活化t-PA和由包含體衍生的這類方法。但是，也可使用從包含體獲得活化蛋白質的其它方法。
純化本發明血纖溶酶原激活物的過程優選在L精氨酸的存在下進行，精氨酸的濃度優選為10-1000mmol/l。
異種蛋白的分離優選通過親和色譜，特別優選通過一種固定在ETI(刺酮屬胰蛋白酶抑制劑)上的吸附柱進行。例如使用Sepharose作為載體材料。通過ETI吸附柱進行純化的優點是甚至在有如此高的精氨酸濃度例如0.8mol/l的存在下可裝填直接由濃縮復性添加劑而獲得的ETI吸附柱材料。優選地，在0.6-0.8mol/l精氨酸的存在下，通過ETI吸附柱純化本發明的血纖溶酶原激活物。在這種情況下，所使用的溶液具有的pH優選大于7，特別優選在7.5-8.6的范圍內。
既可以在精氨酸的存在下，也可以不在精氨酸的存在下，通過降低pH從ETI柱中洗脫本發明的血纖溶酶原激活物。優選地，使pH值落在酸性范圍內，特別優選地pH為4.0-5.5。
本發明的另一個目的是提供一種含本發明溶血栓活化蛋白質的藥物組合物，其中優選起唯一溶血栓活性作用結構的蛋白質含有蛋白酶結構域和必要時含有人的組織血纖溶酶原激活物的Kringel2-結構域。
為了進行治療，按專業人員已知的方法配制本發明使用的血纖溶酶原激活物，其中通常將本發明的化合物與一種可藥用載體相結合進行使用。這種組合物含有通常的有效量的按體重計0.1-7mg/kg，優選0.7-5mg/kg，特別優選1-3mg/kg的劑量。這種治療用的組合物通常以無菌水溶液或無菌可溶解的干制劑例如凍干物的形式存在。組合物通常含有適量的可藥用鹽，用等滲溶液制得。此外，可使用緩沖劑例如精氨酸緩沖劑，磷酸鹽緩沖劑以穩定合適的pH值(優選5.5-7.5)。本發明化合物劑量的增加通過每個專業人員無需進一步的測定即可確定。例如，它們取決于施用的種類(灌注或大丸劑)和治療的周期。根據它們延長的半衰期(有關的體內分解)，本發明的化合物特別適用于大丸劑施用(一倍大丸劑，多倍大丸劑)。一種大丸劑施用的合適形式的實例是安瓿，含有25-1000mg本發明的化合物，一種改進血纖溶酶原激活物溶解性的物質(例如精氨酸)和緩沖劑。優選靜脈內施用，但是也可皮下，肌內或動脈內施用。同樣可以注入本發明的血纖溶酶原激活物或局部施用。
可將本發明的化合物作為多倍大丸劑(優選作為雙倍大丸劑)施用。合適的時間間隔為20-180分鐘，優選的時間間隔為30-90分鐘，特別優選的時間間隔為30-60分鐘。此外，作為灌注時，一次劑量的時間間隔為1小時到2天。
本發明的化合物特別適合于治療所有血栓栓塞疾病例如急性心肌梗塞，腦梗塞，肺栓塞，深度腿靜脈血栓形成和急性動脈阻塞等。特別優選地是施用本發明的化合物治療亞慢性血栓栓塞疾病，其中必須進行較長時間的血栓溶解。
優選地將本發明的化合物與一種凝塊抑制劑(抗凝血劑)例如肝素和/或血小板聚集作用的抑制劑結合施用，由此在減小副作用的同時增強血管的擴展作用。抗凝血劑的一次給藥劑量可與本發明化合物的一次給藥劑量同時進行或者不同時進行。同樣優選地是添加使血液流通的物質或改善微循環的物質。
下面的實施例，公開物，序列記錄和附圖用于說明本發明，其保護范圍由權利要求書確定。可借助于實施例來理解所述方法，對實施例的一些改變也落入本發明的范圍。
此外，術語“r-PA”是指重組體的血纖溶酶原激活物，它們由人的t-PA的結構域K2和P組成。例如，USP5223256公開了這種血纖溶酶原激活物的制備方法。
術語“r-PA(F274P,K277V)”是指在由結構域K2和P組成的血纖溶酶原激活物中，用氨基酸P代替氨基酸274(F)，用氨基酸V代替氨基酸277(K)(類似于T.J.Harris(1987)的氨基酸符號)。


圖1是血漿-血塊滲透模型和裂解模型的附圖。為了避免滿足碎片(Scherbe anspruchung)所引起的血漿凝固，通過緩沖劑室(畫影線的區域)產生壓力。可通過引入一種Blasenfalle來避免通過血塊而使緩沖劑與血漿的混合(加點區域)。1緩沖儲器；2蠕動泵；3:Blasenfalle；4用于纖維蛋白溶解藥的注射器；5帶血塊的吸管尖(交叉陰影線區域)；6軟管夾頭；7壓力構件。
圖2示出了r-PA(F274P,K277V)(A)或r-PA(B)通過凝血酶的裂解。(詳文參見實施例8)圖3示出了r-PA(F274P,K277V)(A)或r-PA(B)通過血纖溶酶的裂解。(詳文參見實施例9)圖4示出了r-PA(P272V,F274P,K277V)(A)通過凝血酶的裂解。(詳文參見實施例10)實施例1本發明化合物重組體的制備a)表達質粒的結構EP0382174中公開的原始質粒pA27fd含有下列組分tac啟動子，具有ATG起始密碼子的lac操縱基因區域，由Kringle2結構域和蛋白酶結構域和fd轉錄終止子組成的用于t-PA-突變蛋白的編碼區域。原始載體是質粒pkk223-3。
為了進行突變，主要采用Morinaga等人《生物工藝學》(1984)第636頁的方法進行。為了形成異源雙鏈，從pA27fd中分離出兩種合適的片段(例如片段A大的BamHI片段，片段B帶有PvuI的線性化載體)。
表1列出了所使用的寡核苷酸和由此產生的突變。
將異源雙鏈添加物與質粒pUBS520一起轉化成大腸桿菌(Brinkmann等人，《基因》85(1989)第109頁)。通過向培養基中添加氨芐青霉素和卡那霉素(分別50μg/ml)來選擇轉化。
分別由添加物產生的質粒同樣示于表1中。b)在大腸桿菌中的表達為了測試表達效率，在氨芐青霉素和卡那霉素(分別50μg/ml)的存在下，在LB介質(Sambrook等人，1989,《分子克隆》Cold Spring Harbor)中用各種質粒(參見表1)和pUBS520培養大腸桿菌直到在550nm處的OD為0.4。通過添加5mmol/l IPTG開始表達。進一步溫育培養物4小時。在這之后，通過離心收集大腸桿菌細胞，并再次懸浮到緩沖液(50mmol/lTris-HCl pH8,50mmol/l EDTA)中；通過超聲波作用引起細胞裂解。通過再次離心，收集未溶解的蛋白質部分，并通過超聲波作用再次懸浮到上述緩沖液中。向懸浮液中加入1/4體積的培養緩沖液(Auftragspuffer)(250mmol/lTris-HCl pH6.8,10mmol/l EDTA,5％SDS,5％巰基乙醇，50％甘油和0.005％溴酚蘭)，并用12.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠進行分析。用一種具有大腸桿菌(含有未用IPTG誘導的各種質粒)培養物的相同制劑作為對照物，并在凝膠中進行分離。在IPTG誘導的培養物的制劑中，在用考馬斯籃R250(溶解在30％甲醇和10％乙酸中)染色凝膠后，識別分子量約為40kD的明顯條帶；在對照物制劑中沒有這種帶存在。
EP-A0382174的實施例2和3中公開了制備相應活化化合物的其它步驟。
表1
1)序列NO:92)序列NO:103)序列NO:114)序列NO:12實施例2體內表征為了檢測本發明蛋白質的溶血栓的能力和有效性，使用由D.Coolen(《臨床檢查》雜志71(1983)第368-376頁)建立的頸靜脈血栓溶解的家兔模型。在這種情況下，在動物的頸靜脈中產生放射性標記的血栓。對動物皮下給藥100IU/kg肝素，進行抗凝固試驗。向家兔靜脈內給藥Alteplase(重組體的野生型組織血纖溶酶原激活物，“t-PA”為德國，比貝臘赫，Thomae公司的市售產品，商標為Actilyse)，實施例1中公開的蛋白質，鏈激酶(德國，馬爾堡，Behring公司市售的產品，商標為Streptase)或溶劑(0.2M精氨酸磷酸鹽緩沖液)。
靜脈內一次給藥1mg/kg溶劑的大丸劑注射液，得到空白對照劑組。靜脈內給藥總劑量為1.45mg/kg，得到Alteplase組，其中開始時的大丸劑注射量為0.2mg/kg,30分鐘時的灌注量為0.75mg/kg,60分鐘時直接進行的持續灌注量為0.5mg/kg(總灌注時間90分鐘)。靜脈灌注給藥64000IU/kg達60分鐘得到鏈激酶組。靜脈一次給藥大丸劑注射液得到本發明的蛋白質組。對于Alteplase和鏈激酶來說，這些是眾所周知的標準規則。
在開始治療后2小時，除去剩余的血栓，借助于血栓中放射活性的降低測定的血栓溶解的程度。為了獲得血漿，采集治療前和治療開始后2小時的血樣。采用標準方法確定活化凝血致活酶的時間。此外，根據溶血栓治療來定量血液損失。對此，在向動物給藥溶血栓藥前，用模板和解剖刀在動物的股上切出長4cm，深0.3cm的皮膚切口。因此產生的血通過自然凝固至停止。在開始治療后，在傷口上放置海綿，用它來抽吸由血栓溶解新產生血的血。通過稱重海綿(扣除本身重量后)，測定產生的血量并由此說明出血的副作用。
Alteplase和實施例1的本發明的蛋白質都是溶血栓的高活化物質，與溶劑對照物相比，它們顯著地溶解了血栓。實施例3血塊溶解活性的對比a)進行血塊溶解測定在血塊溶解測定中，測定t-PA和實施例1重組的蛋白質的活性。
通過添加緩沖劑(0.06M Na2HPO4,pH7.4,5mg/ml BSA(牛血清白蛋白),0.01％Tween80)，將試樣調節到各種所需的蛋白質濃度。將1ml人的血纖蛋白原溶液(IMCO)(2mg/ml 0.006M Na2HPO4,pH7.4,0.5mg/mlBSA,0.01％Tween80)加入到0.1ml試樣中，在37℃下保溫5分鐘。接著，分別加入100μl血纖溶酶原溶液(10IU/ml 0.06M Na2HPO4/H3PO4,pH7.4,0.5mg/ml BSA,0.01％Tween80)和凝血酶溶液(30U/ml 0.06M Na2HPO4,pH7.4,0.5mg/ml BSA,0.01％Tween80)，重新在37℃下保溫試驗添加物。在2分鐘后，在血纖蛋白血塊上放置Telflon球，直到該球已經到達試驗小管的底部停止時間。b)測定動態血漿模型中的活性在該動態血漿模型中，在極接近體內條件的條件下，試驗本發明的物質。將該物質通過血塊，在通過心搏動引起的類似實際壓力的壓力作用下加入到血漿中。
將200μl檸檬酸鹽血漿與20μl 0.25mol/l CaCl2溶液混合，在37℃下保溫。加入0.16U凝血酶并將混合物加入到1ml吸管尖(Eppendorff，漢堡，BRD)中。將吸管尖在23℃下垂直貯存2分鐘，在0.01mol/l Tris/HCl,pH7.4,0.15mol/l NaCl2,0.025mol/l CaCl2,0.01％Tween80中保溫60分鐘，并將它們加入到血塊溶解裝置中。在一個由彈性軟管組裝的分段系統(圖1)中測定血塊溶解活性。通過一個蠕動泵形成流量，并分成兩個平行的支路。支路A包括有用來密封支路并裝有血漿血塊的1ml吸管尖。支路B是與支路A平行隱性導管。借助于軟管夾頭將支路B中的壓力調節到10毫巴。向血塊上添加血漿(1ml)。關閉泵，測定各種血塊的穩定性達15分鐘。借助于1ml結核菌素注射器，用肌內注射的皮下針(Braun,Melsungen,BRD)小心地向血漿中注射纖維蛋白溶解藥(實施例1蛋白質或CHO-t-PA的血漿最終濃度在0.5-10-20μg/ml之間)。血塊溶解時間按添加纖維蛋白溶解酶和添加纖維蛋白溶解藥前壓降達50％之間的時間差來計算。借助于水校正的壓電壓力識別系統測定壓力，并借助于依賴計算機的軟件程序表示。c)在靜態模型中血塊的滲透將800μl人的檸檬酸鹽血漿(健康的供體)與75μl的Ca緩沖劑(50mmol/l Tris/HCl,pH7.2,0.25mol/l CaCl2),20μl在0.9％NaCl的明膠溶液(10％w/v)和100ml凝血酶溶液(8U/ml,0.05mol/l檸檬酸鈉/HCl,pH6.5,0.15mol/lNaCl)混合。將800μl的這種混合物小心地轉移到2ml柱(Pierce,Rockfort,IL,USA)中。通過在37℃下保溫3小時形成血漿塊。用首先用Glu-Gly-Arg-氯甲基酮抑制血纖溶酶原激活物，并將2ml緩沖劑(0.008mol/lNa2HPO4,0.001mol/l KH2PO4,0.003mol/l KCl,0.137mol/l NaCl,0.1％牛血清白蛋白，0.01％Tween80)與之混合以調節到所需濃度(0,0.5,1.2和3μl/ml)，將1ml這種溶液涂在血塊的表面上。丟棄剩余的緩沖劑。用2mlPBS緩沖劑(0.008mol/l Na2HPO4,0.001mol/l KH2PO4,0.003mol/l KCl和0.137mol/l NaCl)洗滌血塊的表面，通過添加2ml PBS的戊二醛溶液固定蛋白質。接著用2ml 50mmol/l Tris/HCl,pH8.0洗滌血塊表面，用1ml過氧化物酶標記的多克隆抗體對t-PA(250mU/ml)進行溫育。在用1ml PBS洗滌血塊后，通過用3-氨基-9-乙基咔唑溫育，測定抗體結合的蛋白質，通過過氧化物酶將它們轉變成難溶的紅色。
本發明的血纖溶酶原激活物不是集中在血塊的表面上，而是滲透到血塊中，并且均勻分布。血塊的免疫染色部分的強度隨著血漿中本發明血纖溶酶原激活物濃度的增加而增加。實施例4血纖蛋白結合的對比在該實施例中，對實施例1溶血栓活化蛋白質的功能進行測試，以便將其結合到血纖蛋白上，還將有關的這種特性與Alteplase進行對比。
以1.5μg蛋白質/ml溶液的形式制備Alteplase和本發明蛋白質的試樣。接著將溶血栓活化蛋白質的試樣(100μl)分別與770μl緩沖劑(0.05MTris/HCl,pH7.4,0.15NaCl,0.01％Tween80),10μl牛血清白蛋白溶液(100mg/ml),10μl抑肽酶(3.75mg/ml),10μl牛凝血酶(濃度100U/ml)和提高量的血纖蛋白原(10μg/ml-300μg/ml)混合。所有溶液都是水性的。眾所周知，凝血酶將血纖蛋白原轉變成難溶的血纖蛋白血塊。
將這些組分混合，在37℃下保溫1小時。接著通過離心分離(15分鐘，13000UPM,4℃下)從血纖蛋白血塊中分離出上清液，通過標準的ELISA測定上清液中存在的血纖溶酶原激活物蛋白質的量。實施例5血纖溶酶原溶解活性和可刺激性的對比Verheijen等人在《血栓形成與止血法》48(1982)第266-269頁中公開了測定血纖溶酶原溶解活性的可刺激性的一種已知方法。
在室溫下，用70％v/v氨基酸中的氰基溴化物(1g人的血纖蛋白原，100ml的1.3gCNBr水溶液)處理人的血纖蛋白原17小時，接著用蒸餾水進行透析而制備起刺激劑作用的血纖蛋白原片段。
在進行測定時，在含0.1％v/v Tween80,0.13μmol/l Glu-血纖溶酶原，0.3mmol底物S2251(顯色底物H-D-Val-Leu-Lys-對硝基N-酰苯胺HCl)和120μg/ml血纖蛋白原片段的1ml 0.1mol/1 Tris/HCl(pH7.5)中溫育5ng/nlt-PA或當量濃度的實施例1的蛋白質。將混合物在25℃下保溫2小時，與作為對照物的空白試驗值相比較而測定沒有反應間歇時405nm處的吸收率。測定顯色底物S2251的裂解作為衡量酶的血纖溶酶原溶解的活性。可刺激性按血纖蛋白原片段的活性除以沒有血纖蛋白原片段的活性來計算。
將相應地用0.1mol/lTris,pH7.5,0.15％Tween80稀釋的各25μl試樣移液到微量滴定板的“孔”中。接著加入200μl試劑混合物，測定與空白試驗值相比在2小時間隔中的405nm處的消光(25μl,0.1mol/lTris,pH7.5，0.15％Tween80,200μl試劑混合物)。
EBVt=2小時后的試劑空白試驗值
EBV0=時間點t=0時的試劑空白試驗值試劑混合物5ml試驗緩沖劑(0.1mol/l Tris,pH7.5,0.15％Tween80)1ml t-PA刺激劑(1mg/ml人血纖蛋白原的溴氰基片段)1ml底物溶液(3mmol/l S2251,H-D-Val-Leu-Lys-pNA；顯色劑，Moelndal,SE)1ml血纖溶酶原溶液(7U/ml血纖溶酶原，Boehringer Mannheim GmbH)刺激因子的計算為計算刺激因子，用有t-PA刺激劑的存在下的活性除以無t-PA刺激劑的活性。應分別進行稀釋使得在兩種制劑中，達到基本上相同的消光。沒有t-PA刺激劑的反應混合物中加入1mlH2O以代替1mlt-PA刺激劑，以相同的方式，不僅測定無刺激劑時的活性，而且也測定有刺激劑存在時的活性。按下式計算刺激因子F
特異活性是血纖溶酶原溶解活性(KU/ml)和蛋白質濃度(mg/ml)的商。實施例6組織血纖溶酶原激活物的實施例1的重組體蛋白質的大丸劑注射液在冠狀動脈血栓形成的狗模型中誘導起作用和安全的血栓溶解在左心臟冠狀動脈的由電刺激誘導的血栓形成的狗模型中評價在大腸桿菌中產生的實施例1蛋白質的血栓溶解。實施例7酰胺分解活性的測定為了測定酰胺分解活性，將200ml緩沖劑(0.1mol/l Tris/HCl,pH7.5,0.15％Tween80)和200μl血纖溶酶原激活物溶液(用緩沖劑稀釋至濃度為1-12μg/ml)的混合物在37℃下保溫5分鐘。添加200μlS2288(6mmol/l，H-D-Ile-Pro-Arg-P-硝基苯胺二鹽酸化物，Kabi Vitrum，瑞典)開始進行測定。在37℃時預平衡S2288底物。在對-硝基苯胺的消光系數為9750l/mol/cm時，由第一個2.5分鐘內在405nm處的消光的增加計算酰胺分解的活性。實施例8r-PA(F274P,K277V)通過凝血酶的裂解1．實施分別將44μgr-PA(F274P,K277V)和p-PA(參照物)在37℃下預保溫15分鐘，并且與同樣在37℃下預保溫15分鐘下述單位人的凝血酶(Sigma)混合并在37℃保溫30分鐘。接著以1∶1(v/v)的比例，將試樣與SDS試樣緩沖劑(0.125mol/l Tris/HCl,pH8.8,4.6％(w/v)SDS,4mol/l尿素，0.1％溴酚蘭，0.3mol/l二硫赤蘚醇)混合，在95℃下保溫3分鐘，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。2．結果圖2示出了r-PA(F274P,K277V)通過凝血酶的裂解。數據表明通過提高凝血酶的量可完全將r-PA(F274P,K277V)裂解成雙鏈形式。通過凝血酶裂解的r-PA(F274P,K277V)蛋白酶結構域和Kringle2-結構域和通過血纖溶酶-消化產生的r-PA(r-PA(tc))雙鏈形式的相應結構域有相同高度上。
與r-PA(F274P,K277V)(A)不同，在下列所述條件下作為參照物的一起進行的r-PA(B)不通過凝血酶來裂解。A刺激物1分子量標準*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA(F274P,K277V)刺激物5: r-PA(F274P,K277V)+凝血酶緩沖劑刺激物6: r-PA(F274P,K277V)+0.055NIH單位凝血酶刺激物7: r-PA(F274P,K277V)+0.55NIH單位凝血酶刺激物8: r-PA(F274P,K277V)+2.74NIH單位凝血酶刺激物9凝血酶(5NIH單位)刺激物10分子量標準*B刺激物1分子量標準*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA+凝血酶緩沖劑刺激物5: r-PA+0.055NIH單位凝血酶刺激物6: r-PA+0.55NIH單位凝血酶刺激物7: r-PA+2.74NIH單位凝血酶刺激物8凝血酶(5NIH單位)刺激物9分子量標準**)分子量標準溶菌酶(14.307Da)，大豆-胰蛋白酶抑制劑(20.100Da)，磷酸丙糖異構酶(26.626Da)，醛縮酶(39.212Da)，谷氨酸脫氫酶(55.562Da)，果糖-6-磷酸鹽-激酶(85.204Da),β-半乳糖苷酶(116.353Da),α-2-巨球蛋白(170.000Da)。**)r-PA(tc)通過用血纖溶酶溫育r-PA獲得的r-PA的雙鏈形式。實施例9r-PA(F274P,K277V)通過血纖溶酶的裂解1．實施分別將25μgr-PA(F274P,K277V)和r-PA(參照物)在37℃下預保溫15分鐘，并且與同樣在37℃下預保溫15分鐘下述單位人的凝血酶(人)混合并在37℃下保溫10分鐘。接著以1∶1(v/v)的比例，將試樣與SDS試樣緩沖劑(0.125mol/l Tris/HCl,pH8.8,4.6％(w/v)SDS,4mol/l尿素，0.1％溴酚蘭，0.3mol/l二硫赤蘚醇)混合，在95℃下保溫4分鐘，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。2．結果圖3示出了r-PA(F274P,K277V)(A)和作為參照物一起進行的r-PA(B)通過凝血酶的裂解。
數據表明通過用提高量的凝血酶進行溫育可將r-PA(B)轉變成雙鏈形式。在應用條件下，通過25mU血纖溶酶可將使用量的r-PA完全轉變成雙鏈形式。
與此相反，r-PA(F274P,K277V)(A)通過血纖溶酶的裂解明顯差。在用0.025U和0.1U血纖溶酶進行溫育時，沒有明顯地觀察到r-PA(F274P,K277V)通過血纖溶酶的裂解。在用25mU血纖溶酶溫育25μgr-PA(F274P,K277V)時，未進行完全的裂解。
通過凝血酶裂解的r-PA(F274P,K277V)的蛋白酶結構域和Kringle2-結構域和通過用血纖溶酶瓊脂糖凝膠消化產生的r-PA(r-PA(tc))雙鏈形式的相應結構域有相同高度，以致得出變體的裂解如同在氨基酸275和276之間的r-PA時所進行的(根據Harris，《蛋白質工程》1,449-458(1987))。A刺激物1分子量標準*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA(F274P,K277V)刺激物5: r-PA(F274P,K277V)+0.25mU血纖溶酶刺激物6: r-PA(F274P,K277V)+2.5mU血纖溶酶刺激物7: r-PA(F274P,K277V)+12.5mU血纖溶酶刺激物8: r-PA(F274P,K277V)+25mU血纖溶酶B刺激物1分子量標準*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA+0.25mU血纖溶酶刺激物5: r-PA+2.5mU血纖溶酶刺激物6: r-PA+12.5mU血纖溶酶刺激物7: r-PA+25mU血纖溶酶*)分子量標準溶菌酶(14.307Da)，大豆-胰蛋白酶抑制劑(20.100Da)，磷酸丙糖異構酶(26.626Da)，醛縮酶(39.212Da)，谷氨酸脫氫酶(55.562Da)，果糖-6-磷酸鹽-激酶(85.204Da),β-半乳糖苷酶(116.353Da),α-2-巨球蛋白(170.000Da)。**)r-PA(tc)通過用血纖溶酶-瓊脂糖溫育r-PA獲得的r-PA的雙鏈形式。實施例10r-PA(P272V,F274P,K277V)通過凝血酶的裂解1．實施將40μgr-PA(P272V,F274P,K277V)在37℃下預保溫15分鐘，并且與同樣在37℃下預保溫15分鐘下述單位的牛凝血酶(Sigma)混合并在37℃下保溫10分鐘。接著以1∶1(v/v)的比例，將試樣與SDS試樣緩沖劑(0.125mol/l Tris/HCl,pH8.8,4.6％(w/v)SDS,4mol/l尿素，0.1％溴酚蘭，0.3mol/l二硫赤蘚醇)混合，在95℃下保溫3分鐘，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。2．結果圖4示出了r-PA(P272V,F274P,K277V)通過凝血酶的裂解。數據表明通過提高凝血酶的量可完全將r-PA(P272V,F274P,K277V)裂解成雙鏈形式。通過凝血酶裂解的r-PA(P272V,F274P,K277V)的蛋白酶結構域和Kringle2-結構域和通過血纖溶酶-消化產生的r-PA(r-PA(tc))雙鏈形式的相應結構域有相同高度上。刺激物1分子量標準*刺激物2: r-PA刺激物3: r-PA(tc)**刺激物4: r-PA(P272V,F274P,K277V)刺激物5: r-PA(P272V,F274P,K277V)+凝血酶緩沖劑刺激物6: r-PA(P272V,F274P,K277V)+0.055NIH單位凝血酶刺激物7: r-PA(P272V,F274P,K277V)+0.55NIH單位凝血酶刺激物8: r-PA(P272V,F274P,K277V)+2.74NIH單位凝血酶刺激物9分子量標準**)分子量標準溶菌酶(14.307Da)，大豆-胰蛋白酶抑制劑(20.100Da)，磷酸丙糖異構酶(26.626Da)，醛縮酶(39.212Da)，谷氨酸脫氫酶(55.562Da)，果糖-6-磷酸鹽-激酶(85.204Da),β-半乳糖苷酶(116.353Da),α-2-巨球蛋白(170.000Da)。**)r-PA(tc)通過用血纖溶酶溫育r-PA獲得的r-PA的雙鏈形式。參考文獻Ausubel等人，“分子生物學中的目前草案”，第2卷，第15章(GreenePubl.Associates & Wiley Interscience 1991)Bennett,W.F.,《生物化學》雜志266(1991)5191-5201Brinkmann等人，《基因》85(1989)109Dawson,K.N.等人，《生物化學》雜志269(1984)15989-15992Eastman,D.,《生物化學》31(1992)419-422EP-A0219874EP-A0241022EP-A0245100EP-A0302456EP-A0382174EP-A0400545EP-B0196920EP-B0297066Harris,T.J.R.,《蛋白質工程》1(1987)449-459Kohnert,U.等人《蛋白質工程》5(1992)93-100Kominger和Collen,《血栓形成和止血法》46(1981)561-565Krause,《血纖蛋白溶解》雜志2(1988)133-142Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985)488-492Lamba,D.等人《分子生物》雜志258(1996)117-135Madison,E.L.等人《科學》262(1993)419-421Madison,E.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(1990)3530-3533Madison,E.L.等人，《自然》339(1989)721-723Morinaga等人，《生物工程學》21(1984)634Paoni,N.F.等人，《蛋白質工程》5(1992)259-266Paoni,N.F.等人，《蛋白質工程》6(1993)529-534Paoni,N.F.等人，《血栓形成與止血法》70(1993)307-312Refino,C.J.,《血栓形成與止血法》70(1993)313-319Sambrook等人，“克隆基因在大腸桿菌中的表達”《分子克隆》試驗手冊(1989)Cold Spring Harbor實驗室出版社，紐約，美國
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序列記錄(1)一般數據(ⅰ)申請人(A)姓名Boehringer Mannheim GMBH(B)街Sandhofer街116(C)地區曼海姆(E)國家德國(F)郵編D-68305(G)電話08856/60-3446(H)電傳08856/60-3451(ⅱ)發明名稱可凝血酶活化的血纖溶酶原激活物(ⅲ)序列數目12(ⅳ)計算機可讀的內含(A)數據載體軟盤(B)計算機可兼容的IBM PC(C)驅動系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release#1.0,Version#1.30B(EPA)(ⅵ)原申請的數據(A)申請號EP96112487.2(B)申請日02.08.1996(2)序列NO:1的數據(ⅰ)序列特征(A)長度7氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:1:Val Gln Pro Arg Ile Val Gly1 5(2)序列NO:2的數據(ⅰ)序列特征(A)長度13氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:2:Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His1 5 10(2)序列NO:3的數據(ⅰ)序列特征(A)長度6氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:3:Pro Gln Ala Asn Leu His1 5(2)序列NO:4的數據(ⅰ)序列特征(A)長度6氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:4:Gly Pro Arg Ile Val1 5(2)序列NO:5的數據
(ⅰ)序列特征(A)長度6氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:5:Ala Gln Pro Arg Ile Lys1 5(2)序列NO:6的數據(ⅰ)序列特征(A)長度13氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:6:Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys1 5 10(2)序列NO:7的數據(ⅰ)序列特征(A)長度13氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:7:Gly Leu Ser Gln Ala Ser Gln Gly Ile Pro Arg Ile Val1 5 10(2)序列NO:8的數據(ⅰ)序列特征
(A)長度15氨基酸(B)種類氨基酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類肽(ⅹⅰ)序列描述序列NO:8:Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Ala Gln Gly Ile Pro Arg Ile Val1 5 10 15(2)序列NO:9的數據(ⅰ)序列特征(A)長度38堿基對(B)種類核苷酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述序列NO:9:GTACAGCCAG GTTCAGCCTC GCATCGTTGG AGGGCTCT(2)序列NO:10的數據(ⅰ)序列特征(A)長度53堿基對(B)種類核苷酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述序列NO:10:CTGCGGCCTG AGCCAGTACA GCCAGTTTGG CCCTCGCATCGTTGGAGGGC TCT(2)序列NO:11的數據(ⅰ)序列特征
(A)長度23堿基對(B)種類核苷酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述序列NO:11:GGAGCGGCTG CAGGAGGCTC ATG(2)序列NO:12的數據(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基對(B)種類核苷酸(C)鏈的形式單股(D)拓撲學線性(ⅱ)分子種類其它核酸(A)描述/desc=“寡核苷酸”(ⅹⅰ)序列描述序列NO:12:CTACGGCAAG ACCGAGGCCT TGT
權利要求
1．來源于人的組織血纖溶酶原激活物的血纖溶酶原激活物，它按下列方式進行修飾(a)如此進行修飾，使得血纖溶酶原激活物通過凝血酶可裂解并通過這種裂解轉變成雙鏈的形式，(b)如此進行修飾，使得其酶原性與人的血纖溶酶原激活物相比至少大1.2因子和(c)該血纖蛋白結合力如此地降低，以使高于50％的血纖溶酶原激活物可滲透到血塊中。
2．根據權利要求1的血纖溶酶原激活物，其特征在于，它是如此進行修飾以使得通過血纖溶酶的可裂解性在氨基酸P1(275)和P1＇(276)之間降低10％以上，優選降低20％以上。
3．根據權利要求1或2的血纖溶酶原激活物，其特征在于，它們均勻地滲透到血塊中。
4．根據權利要求1-3的血纖溶酶原激活物，其特征在于，它在G264和A288之間的氨基酸區域如此修飾，以使得血纖溶酶原激活物通過凝血酶可裂解。
5．根據權利要求1-4的血纖溶酶原激活物，其特征在于，修飾氨基酸區域459-471,417-425和/或氨基酸Q475,K505和/或E506。
6．根據權利要求1-5的血纖溶酶原激活物，其特征在于，修飾氨基酸G265和/或R267和/或在264和267之間的區域內插入至少一種氨基酸。
7．根據權利要求1-6的血纖溶酶原激活物，其特征在于，缺失指狀結構域。
8．根據權利要求7的血纖溶酶原激活物，其特征在于，所述血纖溶酶原激活物僅含有蛋白酶結構域或Kringle2-結構域和人的組織血纖溶酶原激活物的蛋白酶結構域。
9．權利要求1-8的血纖溶酶原激活物的用途，用來制備用于治療血栓栓塞疾病的藥物組合物。
10．重組體制備權利要求1-8血纖溶酶原激活物的方法，其特征在于，用能夠表達所述組織血纖溶酶原激活物的載體轉化真核或原核寄主細胞，培育該細胞并分離所述血纖溶酶原激活物。
11．含治療有效量的權利要求1-8血纖溶酶原激活物和必要時的藥物助劑，填料或添加劑的藥物組合物。
全文摘要
血纖溶酶原激活物(t－PA)具有改進的血纖蛋白特異性和降低的副作用,它們按下列方式進行修飾:(a)如此地進行修飾使得血纖溶酶原激活物通過凝血酶可裂解并通過這種裂解轉變成雙鏈的形式,(b)如此地進行修飾使得它們的酶原性與人的t－PA相比因子至少大于1.2和(c)這種血纖蛋白的結合力如此地降低,使得高于50%的血纖溶酶原激活物可滲透到血塊中。
文檔編號C12N15/09GK1226926SQ97196933
公開日1999年8月25日 申請日期1997年7月21日 優先權日1996年8月2日
發明者烏爾里克·科納特, 斯蒂芬·費希爾 申請人:貝林格爾曼海姆股份有限公司