專利名稱：一種突變的免疫球蛋白－結合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及突變體蛋白領域，更具體地涉及一種與親本分子相比顯示出提高的穩定性的突變體蛋白以及涉及一種生產本發明的突變體蛋白的方法。本發明也涉及一種親和性分離基質，其中本發明的突變蛋白質被用作親和配體。
背景技術：
在生物技術和制藥工業中的大量的應用需要廣泛關注污染物的嚴格去除。
這些污染物可以是例如色譜分析方法中固定相或基質吸附的非洗脫分子，諸如非目的的生物分子或微生物，包括例如蛋白質、碳水化合物、脂類、細菌和病毒。通常進行目的產物的第一次洗脫之后從基質去除這些污染物，以便在隨后的應用之前再生基質。此類去除通常包括被稱為就地清洗(CIP)的方法，其中使用了能夠從固定相洗脫污染物的試劑。通常使用的這類試劑為流經所述固定相的堿性溶液。目前最廣泛使用的凈化和清潔試劑是NaOH，且其濃度可依據污染的程度和本性在0.1直至例如1M的范圍內。已知NaOH是一種能實現多途徑地減少污染物諸如微生物、蛋白質、脂類和核酸的有效CIP試劑。NaOH的另一個優點是其可以很容易地被去除而不用任何進一步的處理。然而，此方案涉及將基質暴露于超過13的pH值。對于許多含有蛋白親和配體的親和層析基質來說，這樣的堿性環境是非常粗糙的條件，并且因此由于配體對所涉及的高pH值的不穩定性而導致了基質能力的降低。
因此廣泛的研究集中于開發對堿性pH值具有增大的耐受能力的基因工程蛋白質配體。例如，Gulich等(Susanne Gülich，MartinLinhult，Per-ke Nygren，Mathias Uhlén，Sophia Hober，Journalof Biotechnology 80(2000)，169-178對堿性條件的穩定性可被工程改造到蛋白配體中)提出通過蛋白質工程來增加結合鏈球菌白蛋白的結構域(ABD)在堿性環境中的穩定特性。以前，人們表明了天冬酰胺和谷氨酰胺殘基在堿性條件下的結構修飾，諸如肽主鏈的脫酰胺化和裂解是在堿性溶液處理后活性損失的主要原因，且天冬酰胺是兩個中最敏感的(Geiger，T.，和S.Clarke.1987.肽中天冬酰胺酰和天冬氨酰殘基的脫酰胺化、異構化和外消旋作用。J.Biol.Chem.262785-794)。已知脫酰胺化速率是高度特異性和構象依賴的(Kosky，A.A.，U.O.Razzaq，M.J.Treuheit，和D.N.Brems.1999.α-螺旋對天冬酰胺殘基穩定性的影響不同螺旋性的肽中的脫酰胺化速率。Protein Sci.82519-2523；Kossiakoff，A.A.1988.三級結構是蛋白脫酰胺化的主要決定因素。Science.240191-194；和Lura，R.，和V.Schirch.1988.肽的構象在天冬酰胺酰殘基的脫酰胺化速率和機制中的作用。Biochemistry.277671-7677)，且最短的脫酰胺化的半衰期與序列-天冬酰胺-甘氨酸-和-天冬酰胺-絲氨酸相關。相應地，Giilich等人創造了一種ABD的突變體，其中天然ABD的所有四個殘基已被亮氨酸(一個殘基)，天冬氨酸(兩個殘基)和賴氨酸(一個殘基)所替代。此外，Giilich等人報道了他們的突變體顯示出類似于天然蛋白的靶蛋白結合特性，而且含有工程改造的配體的親和層析柱在重復暴露于堿性條件之后，比利用父本的非工程改造的配體制備的柱顯示出較高的結合能力。因此，斷定其中的所有四個天冬酰胺殘基可被替代而對結構和功能沒有任何顯著的影響。
因此，Giilich等人針對結合鏈球菌白蛋白的結構域進行了研究。然而，親和層析也用于純化其它分子諸如例如用于藥物應用的免疫球蛋白的操作流程中。一類特別有趣的親和性試劑是能夠特異性結合于抗體分子的不可變部分的蛋白質，此類相互作用不依賴于抗體的抗原結合特異性。此類試劑可廣泛地用于通過親和性色譜層析從不同的樣品諸如但不限于獲自原種的血清或血漿制品或細胞培養物中回收免疫球蛋白。此蛋白的一個實例為含有能夠結合于來自不同種的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的結構域的葡萄球菌蛋白A。
基于葡萄球菌蛋白A(SpA)的試劑取決于其高度的親和性和選擇性在生物技術領域找到了廣泛的應用，例如，用在捕獲和純化以及檢測抗體的親和層析中。目前，基于SpA的親和性培養基可能是最廣泛應用的從不同樣品包括來自細胞培養物的工業原料來分離單克隆抗體及其片段的親和性培養基。因此，含有蛋白A-配體的不同基質可市售得到，例如以天然蛋白A的形式(例如，Protein A Sepharose，AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)且也包括以重組蛋白質A(例如，ProteinA Sepharose，Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)的形式市售的。更具體地，在所述商品化的重組蛋白質A產物上進行的遺傳操作的目的在于促進其對載體的附著。
因此，在此領域需要獲得能夠結合免疫球蛋白的蛋白配體，特別是通過其Fc-片段結合免疫球蛋白的蛋白配體，這些蛋白配體也對一種或多種利用堿性試劑的凈化方法有耐性。
發明概述本發明的一個目的是提供一種突變的免疫球蛋白結合蛋白配體，其在增加的pH值下顯示出提高的穩定性，因此與親本分子相比對在堿性條件下的凈化有提高的耐性。
本發明的另一個目的是提供這樣的一種蛋白配體，其特異性地結合于免疫球蛋白諸如IgG、IgA和/或IgM的Fc-片段。
本發明的再一個目的是提供一種如上所述的蛋白配體，其在堿性條件下比親本分子顯示出能保持較長時間的親和性。
本發明進一步的目的是提供一種親和性分離基質，其含有能夠優選地通過它們的Fc-片段結合免疫球蛋白諸如IgG、IgA和/或IgM的突變蛋白配體，這些配體與親本分子的配體相比在堿性條件下顯示出提高的耐性。
上述所限定的一或多個目的可通過所附的權利要求書來實現。
附圖的簡要說明

圖1顯示了SpA的5個同源結構域(E，D，A，B和C)的氨基酸比對。
圖2(a)和(b)說明了在對本發明的突變蛋白進行堿處理(原位清洗)之后獲得的與不穩定的蛋白Z相比較的結果。
圖3顯示了如實施例4(a)所述在插入載體中之后編碼Z(N23T/N3AN6D)-Cys的基因。
圖4顯示了實施例4(a)所述的質粒pAY91的質粒圖譜。
圖5顯示了如實施例4(b)所述在插入載體中之后編碼Z(N23T/N3A/N6D)的基因。
圖6顯示了實施例5所述質粒pAY100的質粒圖譜的實例。
圖7顯示了根據實施例6的用于將KpnI-位點導入到具有SPA啟動子和信號序列的載體中的銜接子。
圖8顯示了如實施例6所描述的質粒pAY104，其含有用于導入含有KpnI-位點的銜接子的SPA啟動子和信號序列。
圖9顯示了根據實施例6在插入銜接子之后產生的質粒pAY128。
圖10顯示了實施例6的構建的克隆盒，其中在原始的銜接子下加了下劃線。
圖11顯示了如實施例6所述的在插入Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-四聚體之后的質粒pAY114。
圖12顯示了實施例7的構建的克隆盒，其中在原始的銜接子下加了下劃線。
圖13顯示了根據實施例7在插入銜接子之后產生的質粒pAY129。
圖14顯示了如實施例7所述在插入Z(N23T/N3A/N6D)四聚體-Cys之后的質粒pAY125。
圖15為實施例8所述的通過分離人IgG(hIgG)而獲得的色譜圖。
圖16顯示了表示實施例8的基質的保持動態的結合能力的圖表。
定義術語“蛋白”在此處用來描述蛋白質及其片段。因此，具有三維結構的氨基酸的任意鏈也包括在術語“蛋白”中，相應地也包括蛋白片段。
術語蛋白的“功能性變體”是指一種變異的蛋白，其中與本發明定義的親和性和穩定性有關的功能基本上被保持。因此，一個或多個與所述功能不相關的氨基酸可被替換。
術語“親本分子”是指以在導入本發明的突變之前的形式存在的相應蛋白。
術語“結構穩定性”是指分子的三維形式的完整性，而“化學穩定性”是指承受化學降解的能力。
術語“結合Fc片段的”蛋白是指該蛋白能夠結合于免疫球蛋白的Fc片段。然而，其沒有排除結合Fc片段的蛋白也可以結合其它的區區域，諸如免疫球蛋白的Fab區域。
在本說明書中，若非引用其全稱，氨基酸被用常規的單字碼符號來表示。
突變通過交換位置的編號來定義，前面是野生型或非突變的氨基酸，后面是突變的氨基酸。因此，例如，在位置23處的天冬酰胺突變為蘇氨酸被表示為N23T。
發明詳述在一個方面，本發明涉及一種能夠結合于免疫球蛋白分子的除互補決定區(CDR)之外的其它區域的免疫球蛋白結合蛋白，其中親本的免疫球蛋白-結合蛋白的至少一個天冬酰胺殘基已突變為除了谷氨酰胺之外的氨基酸，與親本分子相比該突變賦予了增加的在堿性pH值下的化學穩定性。增加的穩定性是指突變蛋白對于免疫球蛋白的初始親合力基本上被保持所持續的一段時間，如下面將要討論的。
通過本發明獲得的對于靶蛋白的保留的親合力在某種程度上取決于保留的突變體蛋白的空間構象。突變蛋白質對免疫球蛋白的親合力可以例如由技術人員利用生物傳感器技術通過例如Biacore 2000標準裝備(Biacore AB，Uppsala，瑞典)來測定，如將在以下實驗部分所描述的。在上下文中，可以理解術語“基本上”保持是指突變蛋白顯示出具有與親本分子同一數量級的對于免疫球蛋白的親合力。相應地在初始階段，突變蛋白的結合能力與親本分子的相當。然而，由于下面所討論的突變蛋白的在時間上保持化學穩定性，其所保持的結合能力將比在堿性環境中的親本分子的結合能力更緩慢地減少。環境可以被定義為堿性的，意思是增加的pH值，例如高于大約10，諸如最高達大約13或14，即10-13或10-14通常表示堿性的條件。或者，條件可通過NaOH的濃度來定義。其可最高達大約1.0M，諸如0.7M或特別是大約0.5M，相應地在7-1.0M的范圍內。
本發明的突變蛋白的增加的化學穩定性可被本領域的技術人員很容易地證實，例如通過用NaOH以0.5M濃度進行常規處理，如下面實驗部分所描述的。在此上下文中，可以理解與上所述類似地，“增加的”穩定性是指與親本分子相比初始穩定性被保持較長的一段時間。盡管人們已經報道了關于結合鏈球菌白蛋白的結構域的類似的突變(Gulich等人，同上)，然而眾所周知與在堿性環境中降解的蛋白敏感性有關的脫酰胺化的速率是高度序列和構象依賴的。由于ABD的氨基酸序列與免疫球蛋白-結合蛋白諸如單獨的結構域葡萄球菌蛋白A沒有氨基酸序列相似性，其不會出現好象Gulich等人的教導也可應用于免疫球蛋白-結合蛋白的情況。然而，本發明第一次表明了免疫球蛋白-結合蛋白的一個或多個天冬酰胺殘基的突變令人驚訝地提供了增加的化學穩定性以及在pH大于大約10，諸如最高達大約13或14的環境中的降低的降解速率。
因此，本發明提供了一種突變蛋白，其是有用的，例如作為蛋白配體用于選擇性地吸附免疫球蛋白，諸如來自哺乳動物種類諸如人的IgG，IgA和/或IgM，優選地為IgG的親和層析中。吸附的目的可用于產生純化產物，諸如純的免疫球蛋白組分或來自已經除去免疫球蛋白的液體，或用于檢測樣品中免疫球蛋白的存在。本發明的配體顯示出足以耐受常規的堿洗達較長的一段時間的化學穩定性，這使得該配體成為用于再生柱所必需的有成本效益的大規模操作的有吸引力的候選物。
相應地，在本發明的蛋白中，一個或多個天冬酰胺(N)殘基已經突變為選自由下列氨基酸組成的組的氨基酸甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)、組氨酸(H)、賴氨酸(K)或脯氨酸(P)，或任意經修飾的對不希望的脫酰胺化和異構化不敏感的氨基酸。可選擇地，一個或多個天冬酰胺(N)殘基已突變為谷氨酰胺(Q)。
免疫球蛋白-結合蛋白可以是任意的具有天然免疫球蛋白-結合能力的蛋白，諸如葡萄球菌蛋白A(SpA)或鏈球菌G蛋白(SpG)。為了回顧其它的此種蛋白，參見例如Kaonvall，G.，Jonsson，K.Receptins用于對哺乳動物蛋白質具有結合特性的天然的和工程改造的微生物蛋白的展開譜的新的術語，J.Mol.Recognit.1999Jan-Feb；12(1)38-44，綜述。
在一個實施方案中，本發明為一種突變蛋白，其至少包括免疫球蛋白-結合蛋白的結合區域并且其中在所述區域內存在至少一個此種天冬酰胺突變。相應地，在此實施方案中，本發明的突變蛋白包括至少大約75％，諸如至少大約80％或優選地至少大約95％的SEQ ID NO.1或2的序列，條件是在位置21處沒有天冬酰胺突變。
在本申請的說明書中，SEQ ID NO 1限定了SpA的B-結構域的氨基酸序列，而SEQ ID NO 2限定了被稱為Z蛋白的蛋白。
Z蛋白是獲自SpA的B-結構域的合成的構建體，其中在位置29的甘氨酸已替換為丙氨酸，且已公開在文獻中，參見例如Stahl等人，1999生物技術中的親和性融合關注A蛋白和G蛋白，生物方法技術百科全書發酵，生物催化和生物分離。M.C.Fleckinger和S.W.Drew，editors.John Wiley和Sons Inc.，New York，8-22。此外，蛋白Z被用作親和層析中的配體。然而，盡管蛋白Z與SpAB-結構域相比對除了NaOH之外的某些化學試劑顯示出增加的化學穩定性，但是，其在增加的pH值的條件下仍然是不穩定的，不能滿足經濟工廠中所期望的許多CIP再生步驟的需求。
在一個實施方案中，上述的突變蛋白含有SEQ ID NO 1或2的氨基酸序列，或是其功能性變體。在上下文中的術語“功能性變體”包括任意類似的序列，其包括在增加pH值的環境中在不影響突變體蛋白對免疫球蛋白的親合力或其增加的化學穩定性的氨基酸位置上的一或多個其它的變化。
在一個有利的實施方案中，本發明的突變選自由N23T；N23T和N43E；N28A；N6A；N11S；N11S和N23T以及N6A和N23T組成的組；且其中親本分子包括由SEQ ID NO 2所限定的序列。如上所述，為了獲得對于作為在堿性條件中具有長時間持續的高度結合能力的配體有用的突變體蛋白，避免使位置21處的天冬酰胺殘基突變。在一個實施方案中，在位置3處的天冬酰胺殘基沒有突變。
在最有利的實施方案中，在本發明的蛋白中，位于亮氨酸殘基和谷氨酰胺殘基之間的天冬酰胺殘基已突變為例如蘇氨酸殘基。因此，在一個實施方案中，序列SEQ ID NO 2的位置23處的天冬酰胺殘基已突變為例如蘇氨酸殘基。在一個特定的實施方案中，序列SEQ ID NO 2的位置43處的天冬酰胺殘基也已經突變為例如谷氨酸。在該實施方案中，其中氨基酸43已經突變，其看起來最有利地與至少一個其它的突變，諸如N23T相結合。
本發明的關于可以認為SpA和蛋白Z的B-結構域的不同天冬酰胺殘基對突變蛋白的親合力和穩定性特性具有不同的貢獻的發現是完全出乎意料的，尤其由于上述討論的Gulich等人的教導已斷定所有的ABD的天冬酰胺殘基可被突變而沒有任何內在的差別。
因此，本發明包括上述討論的單體突變體蛋白。然而，這種蛋白單體可結合為多聚體蛋白，諸如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體等等。相應地，本發明的另一個方面是一種由至少一個本發明的突變體蛋白與一個或多個其它的單元，優選地同樣為本發明的突變體蛋白組成的多聚體。因此，本發明是例如由兩個重復單元組成的二聚體。
在一個實施方案中，本發明的多聚體包括通過優選范圍為0到15個氨基酸，諸如5-10個氨基酸的一段氨基酸序列連接的單體單元。這種連接的本性優選地不破壞蛋白單元的空間構象。此外，所述連接優選地在堿性環境中同樣是充分穩定的，不損害突變的蛋白單元的特性。
在目前最好的實施方案中，多聚體是含有突變N23T的蛋白Z的四聚體，其中連接單元的長度為5-10個氨基酸。在一個實施方案中，多聚體含有序列VDAKFN-Z(N23T)-QAPKVDAKFN-Z(N23T)QAPKC。在另一個實施方案中，多聚體含有序列VDAKFD-Z(N23T)-QAPKVDAKFD-Z(N23T)-ZQAPKC。
在一個特定的實施方案中，多聚體也含有一個或多個葡萄球菌蛋白A的E，D，A，B，和C結構域。在此實施方案中，優選位于環形區域的天冬酰胺殘基已經突變為更加水解-穩定的氨基酸。在一個實施方案中，由于對結構穩定性有利的原因，SEQ ID NO.1的位置29處的甘氨酸殘基也已經突變，優選地突變為丙氨酸殘基。同樣地，避免位置52處的天冬酰胺殘基的突變對于結構穩定性也是有利的，因為人們已經發現其對蛋白A分子的α-螺旋二級結構的含量有貢獻。
在進一步的方面，本發明涉及編碼上述突變體蛋白或多聚體的核酸。相應地，本發明包括了可用于通過已建立的生物技術方法在重組的宿主中表達來生產突變體蛋白的DNA序列。因此，本發明的另一個方面是一種表達系統，其能夠產生上述的突變體蛋白。細菌宿主可被方便地用于下面所描述的實驗部分中。在一個可選擇的實施方案中，本發明為一種已被遺傳操作來表達本發明突變體蛋白的細胞系。用于實現此目的的方法，參見例如Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratoryv Manual(2nd ed)，vols.1-3，Cold Spring HarborLaboratory，(1989)。
當然，一旦確定了目的序列，本發明的突變體蛋白可選擇地通過合成方法來生產。
相應地，本發明同樣包括生產本發明的突變體蛋白或多聚體的生物技術方法或合成方法。
在另一個方面，本發明涉及一種用于親合分離的基質，該基質含有包含與固相載體偶聯的免疫球蛋白-結合蛋白的配體，其中在該蛋白中的至少一個天冬酰胺殘基已突變為除了谷氨酰胺之外的氨基酸。本發明的基質，當與由作為配體的親本分子組成的基質相比時，在兩種或多種利用間歇式堿洗分離的過程中顯示出增加的結合能力。突變的蛋白配體優選地為結合Fc-片段的蛋白，并且可用于選擇性結合IgG、IgA和/或IgM，優選IgG。
本發明的基質可含有如上所述的任意實施方案中作為配體的突變體蛋白。在最優選的實施方案中，在固相載體上的本發明的配體含有如上所述的多聚體。
本發明的基質的固相載體可以是任意合適的眾所周知的種類。常規的親和性分離基質通常具有有機特性且基于將其親水性表面暴露于所用的水性介質的聚合物，即將羥基-OH)、羧基(-COOH)、羧氨基(-CONH2，可以是N-取代的形式)、氨基(-NH2，可以是取代的形式)、寡-或聚氧化乙烯基團暴露在它們的外表面上，如果存在，也暴露在內表面上。在一個實施方案中，聚合物可以例如基于多糖，諸如右旋糖酐、淀粉、纖維素、支鏈淀粉、瓊脂糖等等，有利地其已例如與雙環氧化物、表鹵醇、1，2，3-三鹵取代的低級烴交聯，來提供合適的多孔性和剛性。在最優選的實施方案中，固相載體是多孔的瓊脂糖珠。本發明所用的載體可根據標準方法很容易地制備，諸如反向懸浮液凝膠化(SHjertenBiochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)。可選擇的，基體基質是市售的產品，諸如SepharoseTMFF(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)。在一個對于大規模的分離尤其有利的實施方案中，載體已被改造來增加其剛性，由此使得基質更適用于高流速。
可選擇的，固相載體基于合成的聚合物，諸如聚乙烯醇、聚羥烷基丙烯酸酯、聚羥烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯等等。在為疏水性聚合物，諸如基于二乙烯基-和單乙烯基-取代苯的基質的情況下，基質的表面常常被親水化來將上述的親水基團暴露于周圍的水性液體。根據標準方法很容易地生產此種聚合物，參見例如“通過懸浮聚合作用改進基于聚合物載體的苯乙烯”(R ArshadyChimica e L′Industria70(9)，70-75(1988))。可選擇的，使用市售的產品，諸如SourceTM(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)。
在另一個可選擇的實施方案中，本發明的固相載體含有具有無機特性的載體，例如硅石、氧化鋯等等。
在又一個實施方案中，固相載體為其它的形式，諸如表面、芯片、毛細管或過濾器。
關于本發明基質的形狀，在一個實施方案中，基質為多孔整料的形式。在一個可選擇的實施方案中，基質是以多孔的或無孔的珠子或粒子的形式。
珠子或粒子形式的基質可用作填充床或以懸浮的形式使用。懸浮的形式包括被稱為膨脹床和純的懸浮液的那些，其中粒子或珠子自由地移動。在為整料，填充床和膨脹床的情況下，分離方法通常使用常規的帶有濃度梯度的層析分離法。在為純的懸浮液的情況下，使用分批的方式。
可以通過利用例如存在于配體中的氨基和/或羧基基團的常規偶聯技術將配體附著于載體。雙環氧化物、表氯醇、CNBr、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)等等是公知的偶聯試劑。在載體和配體之間，可導入一種被成為間隔子的分子，其將會增加配體的有效性并促進配體與載體的化學偶聯。可選擇地，配體可通過非共價鍵，諸如物理吸附或生物特性的吸附附著于載體上。
在一個有利的實施方案中，配體通過硫醚鍵與載體相偶聯。進行這種偶聯的方法在本領域是眾所周知的，并且本領域的技術人員利用標準技術和設備很容易地進行。在一個有利的實施方案中，首先為配體提供一個用于隨后偶聯的末端半胱氨酸殘基。本領域的技術人員同樣很容易地進行合適的純化步驟。
如上所述，對免疫球蛋白的親和性即配體的結合特性，從而也是基質的容量在通過用堿性試劑處理時基本上沒有改變。通常，為了進行親和性分離基質的就地洗凈，所用的堿性試劑為NaOH且其濃度最高達0.75M，諸如為0.5M。
因此，另一種表征本發明基質的方式是，由于上述討論的突變，在用0.5MNaOH處理7.5h之后，其結合能力將減少到小于大約70％，優選地小于大約50％且更優選的小于大約30％，例如大約為28％。
在進一步的方面，本發明涉及一種分離免疫球蛋白，諸如IgG、IgA和/或IgM的方法，其中使用了本發明的突變體蛋白、多聚體或基質。因此，本發明包含了層析分離的方法，其中通過吸附于如上所述的突變體蛋白或多聚體或基質來從液體中分離至少一種靶化合物。目的產物可以為分離的化合物或液體。因此，本發明在此方面涉及了親和層析，其是一種廣泛使用且眾所周知的分離技術。簡言而之，在第一個步驟中，讓含有靶化合物，優選為上述抗體的溶液，在允許靶化合物吸附到存在于所述基質上的配體上的條件下流經分離基質。例如通過pH和/或鹽濃度即溶液中的離子強度來控制此條件。應注意不要超過基質的容量，即流動應充分地慢來允許進行令人滿意的吸附。在此步驟中，溶液的其它組分將基本上不受阻礙地通過。任選擇地，然后洗滌基質，例如用水溶液洗滌，來除去保留的和/或松馳結合的物質。正如以上所討論的，通過利用堿性試劑的洗滌步驟基質被最有利地利用。在下一步驟中，讓用作洗脫液的第二溶液在提供脫附作用即釋放靶化合物的條件下流經該基質。此條件通常通過改變pH、鹽濃度即離子強度、疏水性等等來提供。各種洗脫方式是已知的，諸如梯度洗脫和步進式洗脫。也可以通過一種含有競爭性物質的第二溶液來提供洗脫，競爭性物質將取代基質上的目的抗體。親和層析原理的綜述，參見，例如Wilchek，M.，和Chaiken，I.2000。親和層析的概述，MethodsMol.Biol.1471-6。
在一個可選擇的實施方案中，本發明的突變體蛋白被用作該方法中的先導化合物，其中有機化合物被模型化而與其三維結構相類似。此所謂的模型化合物被稱為模擬物。模擬物的設計、合成和測試可用于避免隨機篩選大量的分子。簡言之，此方法包括測定對于一種特性諸如對于結合免疫球蛋白關鍵的和重要的蛋白的特定部分。一旦鑒定了這些部分，就可以依據它的物理性能，例如立體化學、鍵、大小、電荷等，利用來自諸如分光技術、X射線衍射數據和NMR的數據而將其結構模型化。
計算分析、相似性映射及其它技術可用于此方法。對于此方法的重要考慮是合成化合物的容易程度、藥學上可接受、體內降解的模式等等。
最后，本發明也包括上述突變體蛋白的其它應用，諸如用于分析方法、用于醫學目的，例如用于診斷、陣列等等。
附圖的詳細說明圖1顯示了SpA的五個同源性結構域(E，D，A，B和C)的氨基酸比對。橫線表明氨基酸是相同的。三個方框顯示了Tashiro及其同事測定的Zwt的α-螺旋(Tashiro等，1997)。天冬酰胺殘基以及B結構域中的一個甘氨酸殘基被替換，在附圖中被加上了下劃線。同樣，也顯示了Zwt和Z(N23T)的氨基酸比對。
圖2說明了在堿處理(就地清洗)之后本發明的突變體蛋白質與去穩定的蛋白Z與相比較的結果。在通過常規的親和層析方式進行重復的CIP-處理之后的能力的比較。0.5M的NaOH用作洗凈劑。該方案進行16輪次且每一輪用堿處理的持續時間為30分鐘。圖2(a)顯示了Z(F30A)及其變體的失活模式，而圖2(b)顯示了Zwt和Z(N23T)的失活模式。
圖3顯示了如實施例4(a)所述，在插入載體中之后編碼Z(N23T/N3AN6D)-Cys的基因。突變用*標記。
圖4顯示了實施例4(a)所述的質粒pAY91的質粒圖譜，其含有編碼實施例4(a)所述編碼Z(N23T/N3AN6D)-Cys的基因。
圖5顯示了如實施例4(b)所述，在插入載體中之后編碼Z(N23T/N3A/N6D)的基因。突變用*標記。
圖6顯示了實施例5中所述的表達四聚體Z(N23T/N3AN6D)-Cys的質粒pAY100的質粒圖譜的實例。
圖7顯示了根據實施例6的用于將KpnI-位點導入到具有SPA啟動子和信號序列的載體中的銜接子。
圖8顯示了如實施例6所述的質粒pAY104，其含有用于導入含有KpnI-位點的銜接子的SPA啟動子和信號序列。
圖9顯示了根據實施例6在插入銜接子之后產生的質粒pAY128。
圖10顯示了實施例6構建的克隆盒，其中原始的銜接子被加上了下劃線。
圖11顯示了如實施例6所述，在插入Z(N23T/N3A/N6D)-Cys-四聚體之后的質粒pAY114。
圖12顯示了實施例7構建的克隆盒，其中原始的銜接子被加上了下劃線。
圖13顯示了根據實施例7，在插入銜接子之后產生的質粒pAY129。
圖14顯示了如實施例7所述的在插入Z(N23T/N3A/N6D)四聚體-Cys之后的質粒pAY125。
圖15為獲自實施例8所述操作的色譜圖，其中第一個峰對應于流通的材料，而第二個峰對應于洗脫的hIgG。
圖16顯示了實施例8的表示保持動態結合能力的基質的圖表。自上而下分別表示Z(N23T/N3A/N6D)二聚體-Cys、Z(N23T/N3A)二聚體-Cys、Z(N23T)二聚體-Cys和Z(N23T/K4G)二聚體-Cys。由于軟件問題，缺少Z(N23T/N3A)二聚體-Cys的最后兩個測定點。
實驗部分在下面，將通過實施例的方式來描述本發明，這些實施例僅用于說明的目的而不應被理解為對附加的權利要求所定義的本發明范圍的限定。所有下面以及其它地方所給出的參考被通過引用在此合并。
在此部分，由于原始形式的Z已具有顯著的但非充分的對堿處理的穩定性，因此由于突變而引起的穩定性的小的改變的假定將難以在實驗室測試中進行評價。
因此，抑制基因突變的方法(Kotsuka，T，.S.Akanuma，M.Tomuro，A.Yamagishi，和T.Oshima.1996，通過抑制基因突變的方法進一步穩定極端嗜熱的生物嗜熱棲熱菌的3-異丙基蘋果酸脫氫酶。J Bacteriol.178723-727；和Sieber，V.，A.Pluckthun，以及F.X.Schmidt.1998，通過基于噬菌體的方法來選擇具有增加的穩定性的蛋白質。NatureBiotechnology.16955-960)被用來提供具有降低的結構穩定性的Z結構域的變體。根據此策略，Z蛋白的不穩定變體，在這里表示為Z(F30A)(Cedergren等，1993，上述)被用作支架來用于隨后導入與堿性穩定性的研究相關的其它突變。此突變體的結合特性類似于天然蛋白Z，因為F30不涉及Fc-結合。
此外，Zwt表示野生型的Z結構域不含有F30A取代。
實驗策略為了分析在堿性條件下造成不穩定性的Z結構域中的天冬酰胺，進行了突變分析。為了能夠檢測Z結構域的堿性穩定性的改善，決定利用一種突變的變體Z(F30A)，因為Z結構域已具有對堿性條件顯著的但不充分的穩定性。先前已經顯示Z(F30A)具有對IgG的親和性也即類似于野生型的親和性，以及由于通常參與疏水核心的氨基酸的突變而具有顯著降低的結構穩定性(Cedergren等，1993，同上文；Jendeberg，L.，B.Persson，R.Anderson，R.Karlsson，M.Uhlen，和B.Nilsson.1995，利用胞質基因共振檢測蛋白A結構域和人Fc之間相互作用的動力學分析，Journal of Molecular Recognitiosl，8270-278)。Z-結構域為由58個氨基酸構成，包括八個天冬酰胺的3-螺旋束(N3，N6，N11，N21，N23，N28，N43和N52)(圖1)(Nilsson，B.，T.Moks，B.Jansson，L.Abrahmsen，A.Elmblad，E.Holmgren，C.Henrichson，T.A.Jones，和M.Uhlen，1987，一種基于葡萄球菌蛋白A的合成的結合IgG的結構域.Protein Eng.1107-113)。為了評價在堿性條件下不同的天冬酰胺對失活率的影響，將其中的7個殘基替換為其它的氨基酸。因為N3位于結構域的柔性氨基末端，其被從研究中排除。假定這些氨基酸的降解不影響單體配體的活性并且因此在本分析中是不可檢測的，所述分析測定保留的活性。此外，因為氨基酸位于結構域的結構部分的外部，認為其在結構域的多聚化而獲得蛋白A類分子的過程中是容易被替換的。為了方便蛋白設計，人們進行了來自蛋白A的其它結構域的同源性序列的比較(附圖1)(Gulich等，2000a)。從比較中可斷定，天冬酰胺11被替換為絲氨酸并且天冬酰胺23被替換為蘇氨酸最后天冬酰胺43被替換為谷氨酸。因為當注視同源序列時可替的是天冬氨酸，因此天冬酰胺6被替換為丙氨酸，也已報道天冬氨酸在堿性條件中是敏感的。蛋白A的所有五個結構域在其它位置(21，28，52)都具有天冬酰胺。因此，將它們替換為丙氨酸。
實施例1突變體蛋白Z的誘變、表達和純化材料和方法利用兩步聚合酶鏈式反應技術進行定點誘變(Higuchi等，1988)。將質粒pDHZF30A(Cedergren等，1993)用作模板。通過Interactiva合成編碼不同的天冬酰胺替換和A29G替換的寡核苷酸(Interactiva Biotechnologie GmbH，Ulm，德國)。依據Sambrook描述的操作方式(Sambrook等，1987)，將限制性內切酶Xba I和HindIII(MBI Fermentas Inc.，Amhurst，NY)用于克隆到載體pDHZ(Jansson等，1996)。為了產生pTrpZ，通過利用質粒pKN1Z作為模板進行PCR來擴增Z結構域(Nord等，1995)。用XbaI和PstI時片段進行限制性酶切并連接到已用相同的酶進行了限制性酶切的載體pTrpABDT1T2中(Kraulis等，1996)。使用MegaBACE 1000 DNA測序系統(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)來證明插入片段的正確序列。在基于雙脫氧法的循環測序方案中根據生產商的建議利用MegaBACE終止劑化學作用(Amersham Bioscienees，Uppsala，Sweden)(Sanger等，1977)。在克隆過程中，使用大腸桿菌菌株RRlAM15(American Type Culture Collection，Rockville，MA)，而為了表達不同的基因產物則利用017(Olsson，M.O.，和L.A.Isaksson.1979.大腸桿菌中rpsD突變的分析。I在核糖體蛋白S4.中具有不同變化的突變體的比較。Molec.gen.Genet.169251-257)。
根據Gülich描述的方案進行Z(F30A)和不同構建體的生產和純化(Gülich等，2000b，參見上面)。根據Kraulis等人描述的規程進行Z和pZ(N23T)的生產(Kraulis，P.J.，P.Jonasson，P.-A.Nygren，M.Uhlen，L.Jendeberg，B.Nilsson，和J.Kordel.1996，鏈球菌G蛋白的血清白蛋白-結合結構域是一種3-螺旋束異核NMR研究。FEBSlett.378190-194)。凍干相應的組分。通過利用特定的吸光率系數在280納米處測定吸光率來估計蛋白的量，a(1g-1cm-1)，Z0.156；Z(N23T)，0.169；Z(F30A)，Z(F30A，N43E)，Z(F30A，N23T，N43E)0.157；Z(F30A，N6A)，Z(F30A，N11S)，Z(F30A，N21A)，Z(F30A，N23T)，Z(F30A，N28A)，Z(F30A，N52A)，Z(F30A，N6A，N23T)，Z(F30A，N11S，N23T)0.158。通過氨基酸分析來確定濃度(BMC，Uppsala，Sweden)。利用Phast系統通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析同質性(Laemmli，U.K.1970，結構蛋白在噬菌體T4的頭部裝配過程中的裂解，Nature.227680-685)。根據生產商的建議在還原條件下將凍干的蛋白裝載高密度凝膠(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上并用用考馬斯亮藍染色。通過質譜分析進一步證實同質性和分子量。
為了進行CD光譜，在磷酸鹽緩沖液(8.1mM K2HPO4，1.9mMKH2PO4，pH7.5)中制備濃度為10pM的蛋白樣品。利J-720分光偏振計(JASCO，Tokyo，Japan)在路徑長度為0.1cm的石英小池中在室溫下以10nm min-1的掃描速度記錄250到200nm的遠UV區域的光譜。每一光譜是五個累積掃描的平均數并且將最后的光譜轉化為平均殘基重疊率(MRE)(deg cm2dmol-1)。
結果(實施例1)所有的Z變體都在大腸桿菌中在37℃下成功地在胞內產生并且顯示出相同的表達水平，由SDS-PAGE估計大約為50mg/l。通過IgG親和層析將蛋白完全純化。
純化之后，用SDS-PAGE分析樣品(數據未顯示)，并且凍干和儲存來用于進一步的分析。蛋白Z及其不同突變體的分子量同樣通過質譜分析來證實。數據證實了所有突變體的正確的氨基酸含量(數據未顯示)。同樣，通過圓二色譜(CD)設備進行結構分析，因為它以前已被證明適用于檢測α-螺旋蛋白的結構變化(Johnson，C.W，Jr.1990.蛋白質的二級結構和圓二色性應用指導，Proteins.7205-214；以及Nord，K.，J.Nilsson，B.Nilsson，M.Uhlen，和P.-A.Nygren.1995.α-螺旋細菌的受體結構域的組合文庫，Prot.eng 8601-608)。所有光譜都在208納米處和在222nm處顯示出最小值以及在195nm附近顯示出最大值，這表明了突變體和親本分子具有類似的結構。然而，Z(F30A，N52A)似乎具有比野生型Z以及另一個突變體稍微較低的α-螺旋度(數據未顯示)。
實施例2生物特異性的相互作用分析材料和方法締合和解離狀態的親和性以及動力學常數的差異被通過BiacoreTm2000裝置(Biacore，Uppsala，Sweden)來檢測。根據生產商的建議，通過將胺偶合到CM5傳感器芯片(Biacore)的羧基化的右旋糖酐層來固定人的多克隆IgG和HSA(陰性參照)。IgG的固定產生大約2000RU。以10種不同的濃度(100-550nM)在HBS(10mM HEPES，0.15MNaCl，3.4mM EDTA，0.005％表面活性劑P20，pH7.4)中制備Z、ZF30A以及不同的突變體。以隨機順序和30μl min-1的流速將樣品注射到表面作為復制本。使用10mM的HC1來再生表面。利用BIA評價3.0.2b軟件(BiacoreAB)分析數據。從IgG表面的信號中扣除用HSA固定的對照表面的信號。
采用1∶1蘭格繆爾模型并計算表觀動力學常數和親和性常數。同樣，計算與天然分子相關的自由結合能(AAG＝-RTln Kaff，mutant/Kaff， native)的變化。
結果(實施例2)為了測定Z變體對IgG的親和性的差異，利用Biacore進行表面胞質團共振(SPR)。目的是比較本發明的不同突變的Z變體的親和性與親本分子的親和性。如上所述，由于親本Z的結構域的高度堿性穩定性，決定使用包括F30A突變的Z的結構去穩定的變體(Cedergren，L.，R.Andersson，B.Jansson，M.Uhlen，和B.Nilsson.1993.葡萄球菌蛋白A和人IgG1之間相互作用的突變分析，Proteineng.6441-448)。因此，重要的是首先證實盡管發生了突變但是仍保留了突變分子和IgG之間親和性。從下表1可見，Z(F30A)的親和性沒有受到顯著的影響。親和性的細微的變化給Z(F30A)和IgG的復合物帶來了比親本分子Z和IgG稍微更高的穩定性。這些與較早的Jendeberg等報道的結果(Cedergren等，1993，同上；Jendeberg等，1995，同上)一致。分析所有的用Z(F30A)作為支架構建的突變體并與它們的親本分子(Z(F30A))相比較。結果顯示了總體上親和性沒有顯著地受突變的影響，表明了沒有一個本發明的天冬酰胺突變對于與IgG的結合是非常重要的(參見下表1)。在包括N21A或N43E突變在內的所有Z變體中，僅僅觀察到稍微較低的親合常數。對于具有N23T突變的突變體而言，令人驚訝地，其親和性甚至看上去稍微更高一些。同樣，在為N28A-突變的情況下，親和性的降低是細微的，并且如果突變用作例如蛋白配體，則不能期待其具有任意實質的影響。此外，包括N28A-突變的所有構建體具有顯著增加的關閉-速率。對于包括N23T突變的突變體而言，稍微增加的親和性似乎是由于增加的開啟-速率的引起的。
同樣，N6A-突變產生了較高的開啟-速率，但因為隨突變而生的還有增加的關閉-速率，因此親和性常數沒有受到影響。
表1利用Biacore對不同Z的結構域進行的動力學研究的概述。

Zwt被用作不同的測定過程中的內標。分別相對于Zwt和Z(F30A)計算了自由結合能的差異。
實施例3對堿性條件的穩定性材料和方法通過固定于標準的親和性基質來分析作為親和配體的結構域Z的變體的特性。利用N-羥基琥珀酰亞胺的化學作用按照生產商的建議把Z、Z(F30A)和突變的變體共價偶聯于HiTraTM親和柱(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)上。用TST和0.2MHAc，pH3.1對柱進行脈沖。在TST中配制人的多克隆IgG并過量注射到柱上。在AKTATMExplorer10(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上進行標準的親合層析流程16個循環。將一個CIP-步驟整合到每一循環之間。洗凈劑為0.5M NaOH且每一脈沖的接觸時間為30分鐘，結果形成7.5小時的總接觸時間。在280納米處檢測洗脫的物質。
結果(實施例3)利用NHS-化學作用將Z、Z(F30A)及其突變體共價吸附到HiTrapTM柱上。過量加載IgG并且在每一循環之后測定洗脫的IgG的量來測定柱的總容量。
在每一循環之間，用由0.5M NaOH組成的CIP處理來處理柱。在16個脈沖之后，得到7.5小時的總接觸時間，具有Z(F30A)-基質的柱顯示出容量降低70％。圖2a中的降解數據顯示四個替換的天冬酰胺(N6，N11，N43和N52)對本實驗中突變體所遭受的堿性條件較少地敏感。相反，N23看起來對Z(F30A)的穩定性是非常重要的。盡管有不穩定的F30A-突變，但是，Z(F30A，N23T)僅僅顯示出28％的容量降低。因此，Z(F30A，N23T)幾乎與Zwt一樣是穩定的，并且由此幾乎與作為支架的具有Z(F30A)的最穩定的變體一樣穩定。具有兩個其它突變Z(F30A，N23T，N43E)的Z(F30A)-結構域也顯示出與Z(F30A，N23T)相同的降解模式。N28替換為丙氨酸也提高了Z(F30A)對堿性條件的穩定性。令人驚訝地，用Z(F30A，N21A)作為親和配體的柱當曝露于NaOH時與親本分子相比顯示出容量的急劇損失。這些數據使得Z(N23T)成為IgG的親和純化的配體的非常優越的候選物。
為了最后證明策略的可靠性，利用分子的一種結構去穩定的變體來使得穩定性上的小變化是可檢測的，將N23T-突變引入到親本的Z-結構域。親本的Z-結構域和Z(N23T)被偶聯于HiTrap-柱上并以與已提到的突變體相同的方式暴露于堿性條件。如可從圖2b觀察到的，當Z(N23T)-突變體暴露于高pH時，它顯示出比Zwt更高的穩定性。
實施例4具有和沒有C-末端半胱氨酸的Z-突變體的單體的構建將三個不同的突變K4G、N3A和雙重突變N3A/N6D導入編碼Z(N23T)的基因。
最初將突變導入到兩個不同的載體中一個在C-末端具有半胱氨酸，另一個沒有半胱氨酸。進行這些操作來隨后促進具有一個單C-末端半胱氨酸的多聚體的構建。
實施例4(a)含有半胱氨酸的單體的構建作為構建的模板，使用表示為“pGEM ZN23T”的質粒。其已經在Z-基因中含有N23T-突變。
用此質粒作為模板和下列兩個寡核苷酸進行PCR-反應AFFI-63TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA CGRTO-40GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATCATT TAG用于K4G-突變，AFFI-64TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA CGRTO-40GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATCATT TAG用于N3A-突變，以及AFFI-65TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC GAC AAA GAA CGRTO-40GAT CTG CTG CAG TTA GCA TTT CGG CGC CTG AGC ATCATT TAG用于N3A/N6D-突變。
PCR反應管含有0,5μl模板pGEM ZN23T[500ng/μl]、5pmol的每一引物(Interactiva，Thermo Hybaid GmbH，Ulm，Germany)、5μl的dNTP混合物([10mM]，Applied Biosystems，CA，USA)、5μl的PCR-緩沖液10x(Applied Biosystems，CA，USA)、0,1μl的AmpliTaq([5U/μl]，Applied Biosystems，CA，USA)以及無菌水至50μl的終體積。PCR-程序由下列組成94℃2分鐘，然后30個循環的96℃ 15秒、50℃ 15秒、72℃ 1分鐘以及最后的72℃ 1分鐘。通過GeneAmpX PCR System 9700(Applied Biosystems，CA，USA)進行PCR反應。
通過1％瓊脂糖凝膠分析PCR產物，并且在證實獲得正確大小的產物后，用QIAquickPCR純化試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，德國)進行純化。
按照Sambrook(Sambrook等)的建議，用限制性酶AccI和PstI(New England Biolabs，NEB，MA，USA)裂解PCR產物。
在瓊脂糖凝膠上分析裂解產物，并在連接之前用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)從瓊脂糖中純化裂解產物。將片段被連接到已用酶AccI和PstI裂解的表示為“-protA-stab-(multi9)”的載體中，并通過加入T4 DNA連接酶和連接緩沖液(MBI Fermentas，Lithuania)進行純化，以及隨后轉化到RRIΔM15-細胞(ATCC，MA，USA)中。構建體分別被命名為pAY87(Z(N23T/K4G)-Cys)、pAY89(Z(N23T/N3A)-Cys)和pAY91(Z(N23T/N3A/N6D)-Cys)。
利用MegaBACETMI000 DNA測序系統(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)來驗證插入片段的正確序列。按照生產商的建議將MegaBACE終止子化學作用(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)用于基于雙脫氧法(Sanger等，1977)的循環測序流程中。
實施例4(b)不含有半胱氨酸的單體的構建用“pTrp(-N)ZN23T-Cys”表示的質粒被用作構建的模板。這些質粒已含有具有N23T突變的基因。
用此質粒作為模板和下列兩個寡核苷酸進行PCR-反應AFFI-63TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA CGRTO-41GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG用于K4G-突變，AFFI-64TTT TTT GTA GAC GCC AAA TTC AAC AAA GAA CGRTO-41GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG用于N3A-突變，
AFFI-65TTT TTT GTA GAC AAC GGA TTC AAC AAA GAA CGRTO-41GAT CTC GTC TAC TTT CGG CGC CTG AGC ATC ATT TAG用于N3A/N6D-突變。
PCR反應管含有0,5μl模板Trp(-N)ZN23T-Cys[500ng/μl]、5pmol的每一引物(Interactiva，Thermo Hybaid GmbH，Ulm，Germany)、5μl的dNTP-混和物([10mM]，Applied Biosystems，CA，USA)，5μl的PCR-緩沖液10x(Applied Biosystems，CA，USA)、0,1μl的AmpliTaq([5U/μl]，Applied Biosystems，CA，USA)以及無菌水至50μl的終體積。PCR-程序由下列組成94℃2分鐘，然后30個循環的96℃ 15秒、50℃ 15秒、72℃ 1分鐘以及最后的72℃ 1分鐘。通過GeneAmpX PCR System 9700(Applied Biosystems，CA，USA)進行PCR反應。
按照生產商的說明(Promega，WI，USA)，直接將PCR產物TA-克隆到載體pGEM中，隨后轉化到RRIΔM15-細胞(ATCC，MA，USA)中。構建體分別被命名為pAY86(Z(N23T/K4G)、pAY88(Z(N23T/N3A)和pAY90(Z(N23T/N3A/N6D)。
利用MegaBACETMI000 DNA測序系統(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)來驗證插入片段的正確序列。按照生產商的建議將MegaBACE終止劑化學作用(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)用于基于雙脫氧法(Sanger等，1977)的循環測序流程中。
實施例5在pTrp-載體中編碼具有C-末端半胱氨酸的單體以及寡聚體的基因的構建用限制性酶Accl裂解上述所有的質粒pAY86至pAY91(總共六個質粒)。結果使得Z突變體完全地從pAY86-，pAY88-和pAY90-載體中釋放以及在pAY87-、pAY89-和pAY91-載體中的基因的3-末端產生一個單一的開口。
將裂解的載體用小牛腸堿性磷酸酶(CIAP，MBI Fermentas，Lithuania)按照生產商的說明進行處理。實施此步驟來進行5′-末端的去磷酸，從而避免載體的自身連接。
在瓊脂糖凝膠上分析釋放的Z-突變體片段，并且隨后從瓊脂糖中純化，然后將片段連接到下列的打開的載體上從pAY86到pAY87的片段從pAY88到pAY89的片段從pAY90到pAY91的片段為了進行連接反應，將不同比例的片段與載體混合，結果產生一系列不同的多聚體，正如所料，獲得了從二聚體到五聚體。
不同的多聚體被轉化到RRIΔM15-細胞(ATCC，MA，USA)中，并且如上所述，通過皇家技術學院(Royal Institute of Technology)的測序設備進行分析來驗證正確的序列。新構建的質粒被表示在下表中表2構的建質粒的概括

上述的質粒載體，除pAY86，pAY88和pAY90外，都具有Trp啟動子、Trp前導序列和卡那霉素(Km)抗性的基因。而pAY86，pAY88和pAY90具有氨芐青霉素抗性基因。
實施例6pK4-載體中編碼具有C-末端半胱氨酸的單體和寡聚體的基因的構建如表2中總結的，編碼蛋白質的基因被轉入到含有SPA啟動子和信號序列的載體中。為了能夠進行該方法，構建含有限制性酶KpnI(NewEngland Biolabs，NEB，MA，USA)切割位點的銜接子。通過兩個寡核苷酸(Interactiva，Thenno Hybaid GmbH，Ulm，Germany)來構建銜接子。
用FspI和PstI(New England Biolabs，NEB，MA，USA)裂解質粒pAY104(pK4-cys-ABDstabdimer)。通過瓊脂糖凝膠純化載體并除去釋放的片段以及用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)，從瓊脂糖中純化保留的載體。
在連接緩沖液(MBI Fermentas，Lithuania)中混合兩個寡聚物AFFI-88和AFFI-89，并加熱到50℃，并且加入裂解的質粒載體和T4DNA連接酶(MBI Fermentas，Lithuania)，之后冷卻混合物至室溫。進行連接反應后，將產物轉化到RRIΔM15-細胞中并如上所述驗證正確的序列。產生的質粒用pAY128表示。
然后用限制性酶KpnI和PstI裂解質粒pAY128，并在瓊脂糖凝膠上分析裂解的載體質粒，隨后用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGENGmbH，Hilden，Germany)從瓊脂糖中純化質粒。在進行瓊脂糖凝膠分離后，將從pAY86到pAY103的表達兩個突變的Z-基因的Z(N23T/N3A)和Z(N23T/N3A/N6A)片段用KpnI和PstI(New England Biolabs，NEB，MA，USA)裂解、分離和純化。不同的片段被連接到來自pAY128的裂解載體中，所產生的質粒，在驗證正確的序列之后，被表示為pAY107至pAY116，概括在表3中。
表3具有SPA啟動子和信號序列的構建的質粒的概括

實施例7在pK4-載體中從N-末端融合到具有C-末端半胱氨酸的單體和寡聚體的蛋白A構建編碼E-基因(E’)的一部分的基因編碼表2中概括的蛋白質的基因被轉入到含有SPA啟動子和信號序列以及編碼蛋白A的E-區域(E’)的基因一部分的載體中。人們較早前已表明了添加成熟的蛋白A(區域E)的N-末端的結合IgG的部分或其部分，可提高正確的加工以及也促進基因產物分泌到周圍的培養基中(Abrahmsen等，1985)。
通過兩個寡核苷酸(Interactiva，Thermo Hybaid GmbH，Ulm，德國)構建含有限制性酶Kpnl切割位點以及來自蛋白A(E’)的區域E的一部分的銜接子。
用FspI和PstI(New England Biolabs，NEB，MA，USA)裂解質粒pAY104(pK4-cys-ABDstabdimer)。在瓊脂糖凝膠上純化載體并除去釋放的片段以及用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，德國)從瓊脂糖中純化保留的載體。在連接緩沖液中混合兩種寡聚物并加熱到75℃，將混合物冷卻至室溫然后加入裂解后的質粒載體和T4 DNA連接酶(MBI Fermentas，Lithuania)。進行連接反應后，將產物轉化到RRIΔM15-細胞中，并且如上所述驗證正確的序列。產生的質粒被表示為pAY129。
然后用限制性酶KpnI和PstI裂解質粒pAY129，并通過瓊脂糖凝膠分析裂解的載體質粒，隨后用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGENGmbH，Hilden，Germany)從瓊脂糖中純化裂解的載體。在瓊脂糖凝膠分離后，將從pAY86到pAY103的表達兩個突變的Z-基因的Z(N23T/N3A)和Z(N23T/N3A/N6A)片段用KpnI和PstI裂解、分離和純化。將不同片段連接到來自pAY129的裂解載體中，所產生的質粒，在驗證正確的序列之后，被表示為pAY118至pAY127，如表4中所概括。
表4具有SPA啟動子和信號序列以及來自蛋白A-E’的區域E的一部分的構建的質粒的概括。

實施例8對堿性條件的穩定性為了評價蛋白質對堿性條件的穩定性，在高pH值的環境中測定四種不同的蛋白。不同的蛋白為Z(N23T)二聚體-Cys、Z(N23T/I(4G)二聚體-Cys、Z(N23T/N3A)二聚體-Cys和Z(N23T/N3A/N6D)二聚體-Cys。
將(Z(N23T)二聚體-Cys)、(Z(N23T/N3A)二聚體-Cys)、(Z(N23T/N3A/N6D)二聚體Cys)和(Z(N23T/K4G)二聚體-Cys)培養在發酵罐中。純化收獲的培養基并在堿性測定之前利用常規的方法偶聯到HF瓊脂糖(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)上。
與HF瓊脂糖偶聯的蛋白表示如下●Z(N23T)二聚體-Cys U631049●Z(N23T/Ik4G)二聚體-Cys U631079●Z(N23T/N3A)二聚體-Cys U631064●Z(N23T/N3A/N6D)二聚體-Cys U631063將基質裝載到柱(HR5/2，Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)中，使終體積為0.1到0.3ml。所用的純化設備為具有路徑長度為2mm的UV樣品流動池的AKTATMExplorer 10(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)。
所使用的緩沖液含有●流動緩沖液(Running buffer)25mM Tris-HCl，1mM EDTA，200mM NaCl，0.05％ Tween 20，5mM醋酸銨，pH8.0●洗脫緩沖液0.2M乙酸(HAc)，pH3.1●就地清洗(CIP)緩沖液0.5M NaOH典型的色譜運行周期由下列組成●用流動緩沖液平衡柱●以0,2毫升/分鐘施加10mg的人的多克隆IgG(hIgG)樣品●徹底洗去未結合的蛋白質●用洗脫緩沖液以1.0ml/min進行洗脫●用流動緩沖液再平衡用CIP-緩沖液就地清洗(CIP)，柱基質和0,5M NaOH之間的接觸時間為1小時●用流動緩沖液再平衡在每輪運行周期中加載的hIgG的量遠遠超過柱的總動態結合容量，因為在所有的情況下當將樣品加載在柱上時未結合的蛋白的貫穿量相當的大。
在包括上述步驟的一個循環之后，一個新的循環開始，其再次包括一個小時的與0.5M氫氧化鈉的接觸。為了測定柱的動態結合容量的降低，將洗脫峰的峰面積與當基質沒有與氫氧化鈉接觸時的洗脫峰的原始的峰面積相比較。設定原始的峰面積為100％的結合容量，則可觀察到hIgG的結合容量的降低。用純化系統附帶的UNICORNTM軟件計算峰面積。
每一循環重復21次，使得對于不同的基質，基質和氫氧化鈉之間的總接觸時間為20小時。歸一化的峰面積顯示在下文(附圖16)的圖表中。對于每一突變體，重復21個循環。
Z(N23T/N3A/N6D)二聚體-Cys和Z(N23T/N3A)二聚體-Cys與最初產生的Z(N23T)二聚體-Cys相比顯示出提高的耐堿性條件的穩定性。
序列表<110>Amersham Biosciences<120>一種突變的免疫球蛋白-結合蛋白<130>PU 0215<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>58<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<400>1Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile1 5 10 15Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Gln Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln20 25 30Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala35 40 45Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys50 55<210>2<211>58<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<220>
<221>誘變劑<222>(29)..(29)<223>
<400>2Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile1 5 10 15Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln20 25 30Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala35 40 45Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys50 55<210>3<21l>58<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<220>
<221>誘變劑<222>(29)..(29)<223>
<220>
<221>誘變劑<222>(30)..(30)<223>
<400>3Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile1 5 10 15Leu His Leu Pro Asn Len Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Ala Ile Gln
20 25 30Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala35 40 45Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys50 55<210>4<211>58<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<220>
<221>誘變劑<222>(23)..(23)<223>
<220>
<221>誘變劑<222>(29)..(29)<223>
<400>4Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile1 5 10 15Len His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln20 25 30Ser Len Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala35 40 45Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys50 5權利要求
1.一種能夠結合于免疫球蛋白分子的除互補決定區(CDR)之外的其它區域的免疫球蛋白-結合蛋白，其中SEQ ID NO.1或2所定義的親本免疫球蛋白-結合蛋白或其功能性變體的至少一個天冬酰胺殘基，已經突變為除了谷氨酰胺之外的其它氨基酸，與親本分子相比，該突變賦予了在堿性pH值下的提高的化學穩定性。
2.根據權利要求1的蛋白，它是Fc片段-結合蛋白。
3.根據權利要求1或2的蛋白，其中所述的突變選自由N23T；N23T和N43E；N28A；N6A；N11S；N11S和N23T；以及N6A和N23T組成的組；并且其中親本分子含有SEQ ID NO.2定義的序列。
4.根據前述任意一項權利要求的蛋白，其中位置23處的天冬酰胺殘基已經突變，優選地突變為蘇氨酸殘基。
5.根據前述任意一項權利要求的蛋白，其中位置43處的天冬酰胺殘基也已經突變，優選地突變為谷氨酸殘基。
6.一種包含前述任意一項權利要求的突變蛋白單元的多聚體，其含有兩個或多個重復單元。
7.根據權利要求6的多聚體，其中所述的蛋白單元通過最高包含大約15個氨基酸的元件來連接。
8.根據權利要求6或7的多聚體，它也含有一個或多個葡萄球菌蛋白A的E、D、A、B和C結構域。
9.根據權利要求6-8中任意一項的多聚體，它是四聚體。
10.根據權利要求9的多聚體，其中每一蛋白單元為SEQ ID NO.2定義的蛋白并且另外含有突變N23T。
11.一種編碼權利要求1-10中任意一項的蛋白或多聚體的核酸。
12.一種表達系統，其含有權利要求11的核酸。
13.一種用于親和層析的基質，其中多個含有權利要求1-5中任意一項的免疫球蛋白-結合蛋白的配體已偶聯于固相載體上。
14.根據權利要求13的基質，其中所述的配體含有一個或多個權利要求6-10中任意一項的多聚體。
15.根據13或14的基質，所述的其中配體已通過硫醚鍵偶聯于載體上。
16.根據權利要求13-15中任意一項的基質，其中所述的載體是一種天然的聚合物質，例如多糖。
17.根據權利要求13-16中任意一項的基質，其提供了對選自由IgG、IgA和IgM組成的組，優選IgG的免疫球蛋白的選擇性結合。
18.根據權利要求13-17中任意一項的基質，在通過間歇式堿洗的兩次或更多次分離過程中，其中，所述的配體具有高于親本蛋白分子的結合容量。
19.根據權利要求18的基質，其中所述的堿洗用NaOH來進行，并且其濃度最高為大約1M，例如大約為0.5M。
20.一種分離免疫球蛋白，例如IgG、IgA和/或IgM的方法，其中使用權利要求1-10中任意一項的突變體蛋白或多聚體或權利要求13-19中任意一項的基質。
21.一種層析方法，其中通過吸附于權利要求1-10中任意一項的突變體蛋白或多聚體或權利要求13-19中任意一項的基質來從液體中分離至少一種靶化合物。
全文摘要
本發明涉及一種免疫球蛋白－結合蛋白，其中至少一個天冬酰胺殘基突變為除了谷氨酰胺或天冬氨酸之外的氨基酸，與親本分子相比該突變在pH值最高達13－14時賦予了增加的化學穩定性。蛋白可例如獲自能夠與免疫球蛋白分子的除互補決定區(CDR)之外的其它區域結合的蛋白，諸如蛋白A，且優選地為葡萄球菌蛋白A的B－結構域。本發明也涉及一種用于親和性分離的基質，其含有作為偶聯于固相載體的配體免疫球蛋白－結合蛋白，在其中的蛋白配體中至少有一個天冬酰胺殘基已突變為除了谷氨酰胺之外的氨基酸。
文檔編號C07K14/735GK1642976SQ03806793
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月20日 優先權日2002年3月25日
發明者S·霍伯 申請人:阿默森生物科學有限公司