專利名稱：一種胸腺五肽液相合成法的制作方法
技術領域：
本發明涉及胸腺五肽的合成方法，特別是液相法合成，并可適用于大規模生產胸腺五肽的方法。
背景技術：
胸腺五肽為胸腺激素—胸腺生成素II的生物活性中心，是由胸腺生成素II第32-36位氨基酸殘基構成，在體內和體外均具有全部胸腺生成素II的生理和藥理活性。而且胸腺五肽現已是臨床藥物。
現階段胸腺肽的生產技術可分為兩類。其中一類是采用生物技術生產，如中國發明專利申請02117757.0所公開的，用新鮮的胸腺漿液加入pH2.0-4.0的緩沖溶液，以抑制酶活性，在10℃以下用超聲波勻質機或超細技術對新鮮的胸腺組織進行處理，破碎細胞，再經冷凍離心和超濾，再對所得粗制品用納濾技術制取胸腺肽生產技術；或者是采用克隆技術以及采用復合的克隆技術進行生產，如中國發明專利96105293.7所公開的技術。另一類技術是采用合成方法生產胸腺肽，如美國專利US005218089所公開的液相合成技術，或者在有關資料中披露的多肽固相合成工藝。現有技術中以生物技術制造胸腺五肽一方面技術較為復雜，技術也不成熟，而且受到原料等因素的制約，另一方面由于原料的原因還可能會造成制品的污染；現有的液相合成生產技術需使用一些較為昂貴的試劑，而且工藝控制也較為困難；現有技術中更多采用的是固相合成技術，但固相合成技術的生產規模較小，合成工藝過程中所用的溶劑耗費量較大，在合成工藝中需要多肽自動合成儀、高效液相色譜儀等大型的儀器設備，除此以外，固相合成時還存在產率偏低和反應產物純化周期過長的不足。

發明內容
本發明提供一種新的液相合成胸腺五肽的技術，這一技術可以克服現有技術存在的不足，在合成工藝中可使用價格較為低廉的試劑，合成產率較高，而且在整個工藝中不需要大量昂貴的儀器。特別是本發明的合成技術可以作為一種大規模生產所采用的技術。
本發明是先將酪氨酸芐酯對甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸反應，然后將產物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Val-Tyr(OBzl)。再用N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應液，再在反應液中加入Val-Tyr(OBzl)進行反應，反應完成后將反應產物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)。再將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應液，在該反應液中加入Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)進行反應。反應完成后將反應產物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)。再將Z-硝基精氨酸與Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)以及2-羥基苯并二氮唑溶于二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，在冰浴下再加入二環己基碳二亞胺進行反應，所得反應清液經洗滌后在甲醇中重結晶，分離出結晶體Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)。最后將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)上的保護基脫去得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
在本發明中是采用將相應產物溶于適量三氟乙酸中反應脫去其上的N-叔丁氧羰基，再依次用堿溶液中和鹽溶液洗滌后用無水硫酸鈉干燥，然后再對產物進行減壓濃縮。
本發明中酪氨酸芐酯對甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸和反應是將酪氨酸芐酯對甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸溶于二氯甲烷中，再在冰浴下加入二環己基碳二亞胺進行反應。
在本發明中N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應液是先將N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸溶于適量(以溶質完全溶解為度，以下相同)的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，在冰浴下加入二環己基碳二亞胺反應得到的。
本發明中N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應液是將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶于適量的二氯甲烷N-N二甲基甲酰胺混合液中，冰浴下加入二環己基碳二亞胺和2-羥基苯并二氮唑反應得到。
采用本發明的方法得到Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)后可用以下述的任一種方法脫去其上的保護基將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)溶于甲醇中，加入鈀碳進行催化氫化，再加入乙醚，析出晶體后用高效液相色譜純化，獲得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH；或者，將Z-Arr(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)適量的1∶1∶1的硫化茴香醚-茴香醚-甲酚混合液中，再通入等容量的無水氟化氫反應，然后再用乙醚進行洗滌，再加入適量的乙酸水溶液，再加入乙醚，析出晶體后用高效液相色譜純化得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
本發明與現有技術相比有如下優點1、生產成本相對較低，以固相合成胸腺五肽為例，其實際產率僅為理論產率的50％，而本發明的產率大于理論產率的80％；2、在整個的生產工藝中所用的試劑價格相對較低；3、在整個的生產過程中所主要采用的是玻璃設備，而不象現有技術中需依賴大型設備，因此其生產費用較低；4、生產工藝較為簡單，反應過程易于控制，生產工藝的可重復性強；5、綜合生產周期較短，進一步減小生產成本，提高生產效率；6、合成規模可大幅度提高，容易實現工業化的大規模生產。
具體實施例方式
以下提供本發明的一個實施例先將L-酪氨酸(L-Tyr-OH，100克)與對甲苯磺酸(TOS，100克)溶于苯(600ml)中，再加入苯甲醇(300ml)，回流反應3～5小時，進行冷卻，再加入石油醚或乙醚(1000ml)，攪拌析晶，再在回流下溶于乙醇(300ml)中，冷卻結晶，濾出固體物得純化的酪氨酸芐酯對甲苯磺酸鹽Tyr(OBzl)·TOS(244克)，再將其與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸反應，然后將產物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Val-Tyr(OBzl)。
將N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸(Boc-Val-OH，117克)與酪氨酸芐酯Val-Tyr(OBzl)溶于二氯甲烷(700ml)中，在冰浴下加入二環己基碳二亞胺(112克)，反應過夜。抽濾得到淺黃色清液，再依次用弱酸溶液，如檸檬酸等，弱堿溶液及鹽溶液洗滌后，再用無水硫酸鈉進行干燥處理后，減壓濃縮反應液，得到白色固體。將這些白色固體物濾出后再放入石油醚-乙酸乙酯體系(900ml∶200ml)中進行重結晶，得到Boc-Val-Tyr(OBzl)(242克)。
將上述所得產物Boc-Val-Tyr(OBzl)(206克)溶于適量的三氟乙酸中(210ml)，反應3～5小時，然后再用堿溶液中和，用鹽溶液洗滌后，用無水硫酸鈉進行干燥處理，再進行減壓濃縮，得到產物Val-Tyr(OBzl)(155克)。
將N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸(Boc-Asp(OBzl)-OH，135克)溶于適量的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液(700ml∶200ml)中，冰浴下加入二環己基碳二亞胺(80克)和2-羥基苯并二氮唑(70克)，反應過夜，制得N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應液。
將Val-Tyr(OBzl)(155克)加入N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應液中，反應過夜。抽濾反應液得清液，依次用弱酸溶液，弱堿溶液及鹽溶液洗滌后，再用無水硫酸鈉進行干燥處理，減壓濃縮反應液，得到白色固體。將這些白色固體物濾出后再放入石油醚-乙酸乙酯體系(550ml∶180ml)中進行重結晶，得到Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)(226克)。
將由上所得反應產物Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)溶于適量的三氟乙酸中(95ml)，反應3～5小時，然后再用堿溶液中和，用鹽溶液洗滌后，用無水硫酸鈉進行干燥處理，再進行減壓濃縮，得到產物Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)(103克)。
將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸(Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，75克)溶于適量的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液(700ml∶200ml)中，冰浴下加入二環己基碳二亞胺(37克)和2-羥基苯并二氮唑(30克)，反應過夜，制得N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應液。
將Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)(103克)加入N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應液，反應過夜，抽濾反應液得清液，依次用弱酸溶液，弱堿溶液及鹽溶液洗滌后，再用無水硫酸鈉進行干燥處理，將濾液低溫靜置，直至析出白色固體，將固體分離出后再置入乙酸乙酯體系中進行重結晶，得到產物Boc-Lys(2-Cl-Z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(161克)。
將以上所得產物Boc-Lys(2-Cl-Z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(161克)溶于適量的三氟乙酸中(70ml)，反應約3小時，然后再用堿溶液中和，用鹽溶液洗滌后，用無水硫酸鈉進行干燥處理，再進行減壓濃縮，得到產物Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(80克)。
將Z-硝基精氨酸(Z-Arg(NO2)，29克)與Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(60克)以及2-羥基苯并二氮唑(14克)溶于二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液(700ml∶200ml)中，在冰浴下再加入二環己基碳二亞胺(18克)，反應過夜，抽濾反應液得清液，依次用弱酸溶液，弱堿溶液及鹽溶液洗滌后，再用無水硫酸鈉進行干燥處理，將濾液室溫靜置，直至析出白色固體，將固體分離出后再置入甲醇體系中進行重結晶，得到產物Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(75克)。
將由上所得產物Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)上的各保護基，即(NO2)、(2-Cl-z)和(OBzl)脫去，就可得到胸腺五肽Z-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。本發明中提供兩種最為有效的脫去保護基的方法第一種方法將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(120克)溶于適量的甲醇中，加入鈀碳，進行催化氫化，再加入乙醚，析出白色晶體后濾出，再用高效液相色譜進行純化后得到純度大于99％的胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(65克)。
第二種方法將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)(120克)溶于適量的的硫化茴香醚-茴香醚-甲酚(100ml∶100ml∶100ml)混合液中，再通入等容量的無水氟化氫(300ml)，反應30分鐘。抽干氟化氫，再用乙醚分3次進行洗滌(每次用200ml乙醚)后，再在體系中加入20ml的乙酸水溶液(濃度為10％)，再加入乙醚(600ml)，析出晶體后濾出，再用高效液相色譜純化得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(67克)。
需說明的是在實際的生產過程中也可直接用商品化的酪氨酸芐酯對甲苯磺酸鹽制品。
權利要求
1.一種胸腺五肽液相合成法，其特征是(a) 將酪氨酸芐酯對甲苯磺酸鹽，與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸反應，然后將產物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Val-Tyr(OBzl)(b) 由N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應液，再在反應液中加入由a所得產物反應，反應完成后將反應產物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)，(c) 將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸制成N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應液，再在反應液中加入由b所得產物Asp(OBzl)-Val-Tyr(OBzl)進行反應，反應完成后將反應產物上的N-叔丁氧羰基脫去，得到Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)，(d) 將Z-硝基精氨酸與由c所得產物Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)以及2-羥基苯并二氮唑溶于二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，在冰浴下再加入二環己基碳二亞胺進行反應，所得反應清液經洗滌后在甲醇中重結晶，分離出結晶體Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)，(e) 將由d所得結晶體Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)上的保護基脫去得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
2.根據權利要求1所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是脫去N-叔丁氧羰基的反應是采用將相應產物溶于適量三氟乙酸中進行反應，然后再依次用堿溶液中和鹽溶液洗滌后用無水硫酸鈉干燥，并對產物進行減壓濃縮。
3.根據權利要求2所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是酪氨酸芐酯對甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸的反應是將酪氨酸芐酯對甲苯磺酸鹽與N-叔丁氧羰基-L-纈氨酸溶于二氯甲烷中，再在冰浴下加入二環己基碳二亞胺進行反應。
4.根據權利要求2所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸活化酯反應液是將N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸溶于適量的二氯甲烷-N和N二甲基甲酰胺混合液中，冰浴下加入二環己基碳二亞胺反應得到。
5.根據權利要求2所述的胸腺五肽液相合成法，其特征是N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸活化酯反應液是將N-叔丁氧羰基-L-賴氨酸溶于適量的二氯甲烷和N-N二甲基甲酰胺混合液中，冰浴下加入二環己基碳二亞胺和2-羥基苯并二氮唑反應得到。
6.根據權利要求1至5所述的任一胸腺五肽液相合成法，其特征是將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)溶于甲醇中，加入鈀碳進行催化氫化，再加入乙醚，等析成晶體后用高效液相色譜純化，獲得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
7.根據權利要求1至5所述的任一胸腺五肽液相合成法，其特征是將Z-Arg(NO2)-Lys(2-Cl-z)-Asp-Val-Tyr(OBzl)溶于適量的1∶1∶1的硫化茴香醚-茴香醚-甲酚混合液中，再通入等容量的無水氟化氫反應，然后再用乙醚進行洗滌，再加入適量的乙酸水溶液和乙醚，析出晶體后用高效液相色譜純化得Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。
全文摘要
本發明涉及胸腺五肽的合成方法。本發明是在酪氨酸芐酯上依次接上纈氨酸、天冬氨酸、賴氨酸和精氨酸，最后將產物Z－Arg(NO
文檔編號C07K1/02GK1513872SQ0313435
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月10日 優先權日2003年6月10日
發明者王銳, 魏潔, 趙倩予, 楊頂建, 張立臣, 許兆青, 王 銳 申請人:蘭州大學