專利名稱：Adamts5基因第七號外顯子多態性的制作方法
技術領域：
本發明涉及ADAMTS5基因第七號外顯子的單核苷酸多態性。本發明還涉及分析ADAMTS5基因第七號外顯子的等位基因突變的方法。
背景技術：
ADAMTS蛋白家族是一類金屬蛋白酶，都能在蛋白質水解過程中起作用。其主要成員有ADAMTS1、ADAMTS2、ADAMTS3、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7等等。(J Biol Chem 1999 Sep 3；274(36)25555-63)。
在本申請之前，還沒有ADAMTS5基因第七號外顯子多態性的相關報道。

發明內容
本發明的目的就是提供ADAMTS5基因第七號外顯子的多態性及其檢測方法。
在本發明的第一方面，提供了一種檢測人ADAMTS5基因第七號外顯子的單核苷酸多態性的方法，它包括步驟(a)確定在人ADAMTS5基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第71位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。
在一優選例中，所述的單核苷酸多態性是在第71位存在T。
在本發明的第二方面，提供了一種分離核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第71位為T。
在本發明的第三方面，提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人ADAMTS5基因第七號外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第71位單核苷酸多態性的擴增產物。
在本發明的第四方面，提供了一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人ADAMTS5基因第七號外顯子的SEQ IDNO1所示序列中第71位單核苷酸多態性。
一種試劑盒包括(1)特異性擴增人ADAMTS5基因第七號外顯子的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的ADAMTS5基因第七號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第71位單核苷酸多態性。
另一種診斷試劑盒包括本發明上述的引物和/或本發明上述的寡核苷酸探針。
具體實施例方式
本發明人通過廣泛而深入的研究，已經發現了ADAMTS5基因第七號外顯子所編碼的蛋白序列中第9位Pro(P)->Leu(L)多態(即mRNA上71位C->T多態性)，在此基礎上完成了本發明。
根據對正常人ADAMTS5基因測序結果，發現了該SNP。經分析發現，該SNP導致第9位氨基酸由Pro(P)->Leu(L)。由于這是不同性質氨基酸的置換，因此，會導致ADAMTS5基因第七號外顯子所編碼的蛋白活性發生改變。
ADAMTS5基因第七號外顯子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中開放閱讀框為第46-219位，其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。ADAMTS5基因第七號外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本領域的技術人員知道，有大量的分析技術可用于檢測ADAMTS5基因第七號外顯子中所述位點是否存在單核苷酸多態性。這些技術包括(但并不限于)DNA測序、雜交測序；酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術、分子信標等，變性高效液相色譜法(DHPLC)。
另一方面，本發明的檢測方法被用于評估個體患ADAMTS5基因第七號外顯子相關疾病的易感性。
用于本發明的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于檢測ADAMTS5基因第七號外顯子活性而言，可以任何含有ADAMTS5基因第七號外顯子的樣品，如血液等。
用于本發明方法或檢測試劑盒的引物和探針，根據ADAMTS5基因第七號外顯子的cDNA序列(SEQ ID NO1的序列)或基因組序列進行設計，并可用常規的合成技術進行合成即可。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1基因的抽提和測序用常規酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規PCR擴增。引物是有義引物5’-ctgatgcaaa catttcccac t-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-agccacgtta gacctcctca t-3’(SEQ ID NO4)擴增出的342bp的產物，純化后進行DNA測序。
實施例2SNP的獲得對ADAMTS5基因進行直接測序。將測定的各樣本序列進行比較，從而得出序列的差異，獲得SNP。
實施例3檢測試劑盒制備-檢測ADAMTS5基因相關疾病易感性的檢測試劑盒，其中，含有下列可擴增出71位SNP的引物對有義引物5’-ctgatgcaaa catttcccac t-3’(SEQ ID NO3)反義引物5’-agccacgtta gacctcctca t-3’(SEQ ID NO4)對擴增產物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，可輕易地檢測出71位的C->T型SNP。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
SEQUENCE LISTING<110>上海人類基因組研究中心<120>ADAMTS5基因第七號外顯子多態性<130>030115<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>342<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(46)..(219)<223>
<400>1ctgatgcaaa catttcccactcctaatgcatttgccatga ttcag gtg acc gat ggc 57Val Thr Asp Gly1act gaa tgt agg ccg tac agt aat tcc gtc tgc gtc cgg ggg aag tgt 105Thr Glu Cys Arg Pro Tyr Ser Asn Ser Val Cys Val Arg Gly Lys Cys5 10 15 20gtg aga act ggc tgt gac ggc atc att ggc tca aag ctg cag tat gac 153Val Arg Thr Gly Cys Asp Gly Ile Ile Gly Ser Lys Leu Gln Tyr Asp25 30 35aag tgc gga gta tgt gga gga gac aac tcc agc tgt aca aag att gtt 201Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Ser Cys Thr Lys Ile Val40 45 50gga acc ttt aat aag aaa aggtaatatg atagaacctt tgtctttatg 249Gly Thr Phe Asn Lys Lys55tgaattgaac aaagctttag actcttgcag aattgataaa ggaggattca tattacatca309taagctatct gtatgaggag gtctaacgtg gct 342<210>2<211>58
<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Val Thr Asp Gly Thr Glu Cys Arg Pro Tyr Ser Asn Ser Val Cys Val1 5 10 15Arg Gly Lys Cys Val Arg Thr Gly Cys Asp Gly Ile Ile Gly Ser Lys20 25 30Leu Gln Tyr Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Ser Cys35 40 45Thr Lys Ile Val Gly Thr Phe Asn Lys Lys50 55<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ctgatgcaaa catttcccac t 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4agccacgtta gacctcctca t 2權利要求
1.一種檢測人ADAMTS5基因第七號外顯子的單核苷酸多態性的方法，其特征在于，它包括步驟(a)確定在人ADAMTS5基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第71位的核苷酸；(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態性。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的單核苷酸多態性是在第71位存在T。
3.一種分離核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第71位為T。
4.一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人ADAMTS5基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第71位單核苷酸多態性的擴增產物。
5.一種等位基因特異性的寡核苷酸探針，其特征在于，其長度為15-50bp，且特異性地雜交并檢測含人ADAMTS5基因第七號外顯子的SEQ ID NO1所示序列中第71位單核苷酸多態性。
6.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括(1)特異性擴增人ADAMTS5基因第七號外顯子的引物對，(2)檢測擴增產物與正常的ADAMTS5基因第七號外顯子相比是否存在變化所需的試劑，所述的SEQ ID NO1所示序列中第71位單核苷酸多態性。
7.一種診斷試劑盒，其特征在于，它包括權利要求4所述的引物和/或權利要求5所述的寡核苷酸探針。
全文摘要
本發明涉及ADAMTS5基因第七號外顯子的單核苷酸多態性(SNP)。本發明提供了分析ADAMTS5基因第七號外顯子的SNP或其活性的方法。本發明的SNP是SEQ ID NO1所示序列的人ADAMTS5基因第七號外顯子的第71位的C－＞T多態性。該SNP導致編碼蛋白第9位發生Pro(P)－＞Leu(L)改變，從而改變了蛋白活性。
文檔編號C07H21/00GK1519347SQ0311504
公開日2004年8月11日 申請日期2003年1月22日 優先權日2003年1月22日
發明者黃薇, 施錦繡, 奚慧峰, 金力, 黃 薇 申請人:上海人類基因組研究中心