專利名稱：疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可用于對自身(self)抗原免疫的分離的多肽。具體地講，本發明涉及一種自身蛋白，在體內施用時，該蛋白能夠產生自身抗體。本發明特別涉及使人類細胞因子在人體內具有免疫原性。本發明還涉及含有所述化合物的藥用組合物，及其在藥物中的用途，并且涉及其生產方法。
背景技術：
哮喘是由下呼吸道炎癥引起的慢性肺病，并且以反復發作的呼吸問題為特征。患者的呼吸道是敏感的，并且一直存在某種程度的腫脹或炎癥，即使是在沒有癥狀時也是這樣。炎癥會導致呼吸道變窄，并且減弱流入和流出肺部的氣流，使得呼吸困難，并且導致喘息、胸部壓迫和咳嗽。哮喘是由對過敏原(例如塵螨、花粉、霉菌)、刺激劑(例如煙、煙氣、強烈氣味)、呼吸道感染、運動和干燥天氣的過敏性引起的。所述誘發原因刺激呼吸道和呼吸道襯里，使其腫脹加重炎癥，隨后黏液會堵塞呼吸道，并且呼吸道周圍的肌肉收緊，直到呼吸變得困難和窘迫，并且出現哮喘癥狀。
COPD是用于描述呼吸道疾病的涵蓋式術語(umbrella term)，這種疾病表現出類似于哮喘的癥狀，并且是用相同的藥物治療的。COPD的特征是慢性、漸進的、和大部分不可恢復的氣流障礙。個體對這種病的發展過程的作用尚屬未知，不過有人認為這種病90％是由吸煙引起的。其癥狀包括咳嗽、慢性支氣管炎、呼吸困難和呼吸道充血。這種病最終會導致嚴重的殘疾和死亡。
與生產、施用和耐受單克隆抗體相關的各種問題的結果是，越來越關注通過免疫接種指導患者自身的免疫系統產生具有合適專一性的內源抗體的方法。不過，哺乳動物在血清中通常沒有高效價的抗自身蛋白的抗體，因為其免疫系統包括防止所述抗體形成的穩態機制。諸如重癥肌無力的疾病表明了這種耐受機制的重要性，其中，抗骨骼肌的煙酸乙酰膽堿受體的自身抗體引起了虛弱和疲勞(Drachman，1994，NEngl J Med 3301797-1810)。因此，需要一種能夠避開抗體耐受機制，而又不誘導自身抗體介導病理的接種方法。
業已設計了多種技術，以破壞B細胞耐受性，而又不必誘導不可接受的自身免疫毒性。不過，所有這些技術都存在明顯缺陷。
一種技術包括將自身蛋白(或由該蛋白衍生的肽)化學交聯在諸如匙孔血蘭蛋白的強免疫原性載體蛋白上(“AntibodiesA laboratorymanual”，Harlow，E and Lane D.1988.Cold Spring Harbor Press)。該方法是被普遍用于生產抗弱免疫原性靶(如低分子量化合物)的抗體的半抗原載體系統。不過，化學綴合方法可能破壞具有潛在價值的表位，并且所引起的很多抗體反應是針對所述載體蛋白的。另外，該方法僅適用于蛋白免疫接種，并且與核酸免疫原不兼容。
載體蛋白技術的一種變化形式，包括構建編碼包括載體蛋白(例如乙型肝炎病毒蛋白核心蛋白)和自身蛋白的融合蛋白的基因(“作為免疫原性肽的載體的乙型肝炎病毒的核心抗原”，Biological Chemistry.380(3)277-83，1999)。所述融合基因可以作為核酸疫苗的一部分直接施用，或者，它可以在合適的宿主細胞中在體外表達，純化所述基因產物，然后作為常規疫苗給藥，使用或不使用佐劑。不過，將大的載體蛋白融合在自身蛋白上，可能限制或改變自身蛋白的構象，減弱其誘導能與天然分子發生交叉反應的抗體的效率。另外，與傳統交聯載體系統相似，很多抗體反應是針對融合體的載體部分的。抗載體反應可能限制隨后加強施用疫苗的效果或增加過敏反應的機會。
Dalum和同事披露了一種更精細的方法，其中，將單一的II型MHC-限制表位插入靶分子上。他們證實了用該方法能誘導抗遍在蛋白(Dalum等，1996，J Immunol 1574796-4804；Dalum等，1997，MolImmunol 341113-1120)和細胞因子TNF(Dalum等，1999，NatureBiotech 17666-669)的抗體。結果，所有T細胞輔助(help)必須來自該單一表位或接合序列。盡管該方法在具有合適II型單元型MHC的治療對象體內能很好地發揮作用(所述疫苗是針對這種單元型設計的)，或者事實上所述治療對象足夠幸運地具有能夠結合結合表位的II型分子，在任何正常的異族群體中，如典型的人類群體，所述疫苗對相當大比例的群體不起作用。另外，由于所述插入的表位通常來自很不相關的蛋白，如卵白蛋白或溶菌酶，所述額外序列有可能在某種程度上干擾靶蛋白的折疊，阻止所述靶蛋白的全天然構象的形成。
與上述所有技術不同，本發明提供了多種潛在T細胞表位，仍然保留了靶分子的接近天然形式的構象。這種特征使得本發明的疫苗可以作為復雜的異族群體，如由人類患者組成的群體的有效免疫原。所述特征是通過在自身蛋白上產生突變，以便在該位點上產生可以在類似蛋白中找到的序列而實現的。
最近的多份論文業已確定了Th2細胞因子IL-13在啟動過敏原性哮喘的卵白蛋白模型的病理學方面的關鍵作用(Wills-Karp等，1998；Grunig等，1998)。在本研究中，用能結合并且中和IL-13的可溶性IL-13受體注射以前對卵白蛋白過敏的小鼠。在治療組中，被乙酰膽堿刺激的呼吸道過敏反應被完全消除。組織學分析發現，接受治療的小鼠業已恢復了在對照中出現的杯狀細胞組織轉化。在互補實驗中，通過在轉基因小鼠體內的超量表達或通過在野生型小鼠的氣管中使用蛋白，提高了肺IL-13含量。在這兩組實驗中，都出現了呼吸道過敏反應，嗜曙紅性粒細胞入侵和黏膜產生的增加(Zhu等，1999)。以上結果表明，IL-13活性是在成熟的模型中產生過敏性哮喘的若干種主要臨床和病理學特征所必需的，并且足以產生這些特征。
因此，能夠引起對IL-13的中和反應的疫苗構成了一種用于治療人類過敏性哮喘的有用治療劑。還可將其用于治療某些與寄生蟲感染相關的疾病(Brombacher，2000)和IL-13的產生與纖維化相關的疾病(Chiaramonte等，1999)，如慢性阻礙性肺病。本發明滿足了這一需要。
因此，本發明的構思和原理是結合IL-13提出的，不過，可應用于另一種物種中的具有類似蛋白的任何哺乳動物自身蛋白。
發明概述本發明提供了一種與人類蛋白具有至少30％，但低于(less than)100％的相同性的分離的多肽，該多肽(a)包括至少一種突變，該突變是類似的非人類蛋白所特有的；和(b)能夠在人體內產生抗體；和
(c)在結構上與所述人類蛋白足夠相似，使得所述抗體能結合所述人類蛋白和所述多肽；和(d)其中，所述多肽不是抗體。
因此，在一個實施方案中，本發明提供了一種蛋白，其具有來自哺乳動物自身抗原的B細胞表位和來自另一種哺乳動物的能產生類似蛋白的序列的突變，使得所述蛋白能夠在產生所述B-細胞表位的物種中產生能識別產生所述B-細胞表位的天然蛋白的免疫反應。
所述類似蛋白的序列優選超過5個，更優選超過8個連續的氨基酸。因此，本發明的蛋白包括與類似序列的至少5個，優選至少8個連續的氨基酸相同的序列。在另一種實施方案中，提供了具有自身蛋白的B細胞表位的蛋白，它是通過替換而移植到另一種哺乳動物的類似蛋白的構架上的，使得所述蛋白能夠在產生所述B細胞表位的物種中產生能識別產生所述B-細胞表位的天然蛋白的免疫反應。
應當理解的是，本發明的蛋白不是抗體。
所產生的免疫反應優選是抗體反應，最優選是中和抗體反應。
一般地，優選將所述突變導入所述分子的非表面暴露區，使得保留表面暴露區。表面暴露區是免疫系統可以接觸的，因此，通常包括B-細胞表位。因此，本發明提供了一種包括自身蛋白的保守的表面暴露區和導入所述非表面暴露區的突變的蛋白，所述突變能產生一種類似蛋白的序列，使得所述蛋白能產生針對在產生所述自身蛋白的物種中產生的自身蛋白的免疫反應。
所述自身蛋白優選是人蛋白，不過，可以是來自需要在它體內產生自身免疫反應的任何哺乳動物的蛋白。所述免疫反應優選對本發明的天然蛋白和免疫原有專一性。就是說，與其他自身蛋白具有很少的交叉反應性或中和能力。
所述自身抗原優選是細胞因子，更優選是4螺旋細胞因子，更優選IL-4或IL-13，最優選IL-13。因此，在本發明的優選實施方案中，提供了一種包括鼠IL-13主鏈上的來自人IL-13的B細胞表位的嵌合蛋白。這樣一種構建體能夠在人體內產生專一性抗IL-13抗體反應。在圖9中示出了這種構建體(seqID No 21和22)。類似地，在圖13中示出了包括人IL-表位區和鼠構架的IL-4構建體(Seq IDNo 25)。
本發明還提供了-一種表達載體，它包括本發明的多核苷酸，并且能夠表達本發明的多肽；-一種包括本發明的表達載體的宿主細胞；-一種生產本發明多肽的方法，該方法包括將本發明的宿主細胞保持在適合使所述多肽表達的條件下，并且分離所述多肽；-一種疫苗組合物，包括本發明的多肽或多核苷酸，以及可以藥用的載體。
在另一方面，本發明提供了一種設計和制備本發明多肽的方法，該方法包括1.鑒定需要產生針對它的抗體反應的自身蛋白，通常是人類自身蛋白的一個或多個區。
2.鑒定所述自身蛋白的氨基酸序列。
3.鑒定類似蛋白的氨基酸序列，通過重組DNA技術構建包含在步驟1中鑒定的至少一個目標區的嵌合分子，其氨基酸序列來自在步驟2中所鑒定的序列，和來自在步驟3中鑒定的序列的足夠的氨基酸，使得所得到的蛋白能夠折疊成類似于所述自身蛋白的形狀，這樣，突變蛋白能產生識別所述自身蛋白的免疫反應。


GST＝谷胱甘肽S-轉移酶，rmIL-13＝重組小鼠IL-13，rhIL-13＝重組人IL-13，cIL-13＝嵌合IL-13圖1.小鼠嵌合IL-13疫苗構建體的序列。加下劃線的氨基酸符號表示人IL-13序列，未修飾過的符號來自鼠IL-13。
圖2.通過4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠(Novex)分析GSTcIL-13，用考馬斯蘭對所有蛋白進行染色。
圖3.GST-cIL-13的Western印跡分析。
圖4.cIL-13和GST-cIL-13與抗-mIL-13多克隆抗體，抗-hIL-13多克隆抗體和抗-GST多克隆抗體的相互作用的ELISA分析。
圖5.cIL-13和GST-cIL-13與mIL13受體，mIL-13Rα1和mIL-13Rα2的相互作用的ELISA分析。
圖6.A549裂解物的抗-磷酸-STAT6 Westem印跡。
圖7.通過GST-cIL-13(小鼠F5)或cIL-13(小鼠E5)的免疫誘導的抗體反應。
圖8.A549裂解物的抗-磷酸-STAT6 Western印跡分析。
圖9.用于人體的嵌合IL-13疫苗。加下劃線的氨基酸符號表示存在于鼠IL-13中的序列，未修飾過的符號來自人IL-13。
圖10.在施用與各種佐劑組合的cIL-13之后產生的抗-小鼠IL-13抗體曲線。
圖11.在施用cIL-13之后小鼠的血清中和能力。
圖12.用作小鼠免疫原的其他cIL-13。
圖13.用于人抗IL-4疫苗中的嵌合IL-4。
發明詳述在本說明書和所附權利要求書中，除非文中有其他需要，詞語“包括”(“comprise”和“include”或諸如“comprising”，“comprises”，“including”，“includes”等的變化形式)，應被理解成是包含性的，就是說這些詞語的使用意味著可能包括沒有具體引用的整數或因素。
如本文所述，本發明涉及分離的多肽和分離的多核苷酸。在本發明中，術語“分離的”用于表示所述多肽或多核苷酸不是以它的天然狀態存在的，就是說它已經至少被純化到某種程度或者是通過合成生產的，例如，通過重組方法，或機械合成。因此，術語“分離的”包括所述多肽或多核苷酸與其他生物學或非生物學材料(如細胞、細胞懸浮液或細胞片段、蛋白、肽、表達載體、有機或無機溶劑，或其他合適材料)組合的可能性，但是，排除了所述多核苷酸處于其天然存在狀態的情形。
本發明的一個優點是，本發明的多肽包括自身蛋白，例如，人類自身蛋白的、需要針對它的抗體反應的區，所述區與類似蛋白特有的區結合，所述類似蛋白與所述人類蛋白具有足夠的差異，以便提供良好的T細胞輔助，不過，業已通過演化(evolution)進行過優化，以便折疊成與所述人類蛋白高度類似的形狀。由此可以制備能識別所述自身抗原的抗體。通常，所產生的免疫反應包括產生中和抗體反應。
本發明的人類蛋白可以是由人類基因組編碼的完整長度的蛋白，或由人類基因組編碼的完整長度蛋白的結構域或亞基。當需要產生針對自身抗原的功能結構域或受體結合結構域的中和抗體時，可以制備僅包括所述區的嵌合抗原。因此，所述結構域的暴露區或所述結構域的B細胞表位是保守的，并且將類似蛋白的突變導入所述非B細胞表位或暴露結構域。
術語“蛋白”意在包括，例如氨基酸殘基的較短的序列，它可能是指肽，如神經肽。所述人類蛋白通常是翻譯后修飾的對象，如糖基化、蛋白水解裂解、磷酸化和其他為本領域技術人員所熟知的修飾。所述人類蛋白優選是細胞因子、激素、生長因子或細胞外蛋白，更優選4-螺旋細胞因子，最優選IL-13。細胞因子包括例如IL1、IL2、IL3、IL-4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL20、IL21、IL25、TNF、TGF、GMCSF、MCSF和OSM。4-螺旋細胞因子包括IL2、IL3、IL-4、IL5、IL13、GMCSF和MCSF。激素包括例如黃體生成素(LH)、促濾泡激素(FSH)、絨毛膜促性腺素(CG)、VGF、GHrelin、刺鼠、刺鼠相關蛋白和神經肽Y。生長因子包括例如VEGF。細胞外蛋白包括例如APP或B-淀粉樣蛋白。
類似蛋白可以是與所述自身蛋白直向同源或平行同源的蛋白，例如人類蛋白，其中，直向同源蛋白可以向下追蹤到不同生物的共同祖先，因此，有可能在不同生物中發揮類似的保守作用。因此，直向同源基因表示在序列上如此相似的基因，它們源于同一個祖先基因，并且因此是不同物種中的等同基因，并且是通過特化由共同的祖先進化而來。特別是對人類來說，所述直向同源蛋白是非人哺乳動物體內的結構上等同的分子。平行同源蛋白是這樣一種蛋白，通過復制事件它在特定生物中以一個以上拷貝出現(Venter，Science；1336，vol 291；2001)，它是業已通過基因復制多樣化的同源序列(擁有共同的進化祖先)。所述同源蛋白優選是直向同源的。直向同源蛋白通常具有與人類蛋白相同的名稱，并且通常發揮相同的功能，例如，鼠IL-13是人類IL-13的直向同源物。所述類似蛋白通常是哺乳動物的或禽類的，例如牛、綿羊、嚙齒類(如鼠)、豬、猴、貓科動物、犬類動物或人類。所述類似蛋白優選是鼠類的。因此，在本發明中，鼠類IL-13是人類IL-13的類似(或直向同源)蛋白。類似地，猴IL-4是人IL-4的類似(直向同源)蛋白。
本發明的多肽優選包括一種類似蛋白所特有的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多種突變。更優選地，所述多肽至少包括三種突變。每一種突變可能是相同或不同類似蛋白所特有的。因此，第一種突變可能是鼠類類似物所特有的，而第二種突變可能是猴類似物所特有的。根據一種特征，所述多肽包括至少三種突變，其中，每一種突變是一種不同的類似物所特有的。不過，每一種突變優選是同一種類似物所特有的。突變是所述蛋白氨基酸序列的一種改變，并且包括，例如，缺失、插入和替換。所述突變優選是替換。優選替換每一個非表面暴露區上的一個以上的氨基酸。
類似蛋白的特征突變是這樣一種突變在對所述人類蛋白進行所述突變之后，它會導致所述人類蛋白的序列更接近所述類似蛋白的序列。例如，當所述人類序列是ProProArgVal，并且鼠類類似物具有序列ProProTyrVal時，所述類似蛋白的突變特征是用Arg替換Tyr。所述突變優選不是在生理狀態下，在水溶液中，在天然折疊的活性蛋白的表面殘基中的殘基上進行的。所述表面殘基，特別是形成環狀結構的殘基，通常是B細胞表位，并且優選所有這樣的區都是保守的。由此導入的突變，具有破壞所述自身蛋白耐受性的作用，并且在產生所述非突變蛋白的物種中具有免疫原性。
在一個實施方案中，本發明的多肽與人類蛋白，優選在所述人類蛋白的整個長度上的相同性至少為30％，并且低于100％。優選所述多肽與所述人類蛋白的相同性至少為40％，例如至少50％。更優選，所述多肽與所述人類蛋白的相同性至少為60％，例如至少70％。最優選，所述多肽與所述人類蛋白的相同性至少為85％，例如大約90％。所述蛋白能夠在能識別所述人類蛋白的人體內產生免疫反應。
例如，UWGCG包提供了BESTFIT程序，可以利用該程序計算同源性(例如使用其預設參數)(Devereux等(1984)Nucleic AcidsResearch 12，p387-395)。可以將PILEUP和BLAST程序用于計算同源性或排列序列(通常根據其預設參數)，例如由Altschul(1993)J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10所披露的。
用于進行BLAST分析的軟件可以從國家生物技術信息中心公開獲得(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。該程序包括首先通過在查詢序列上鑒定長度為W的短詞語，鑒定高得分序列對(HSPs)，當該短詞語與數據庫中相同長度的詞語比對時，要么匹配，要么滿足某些陽性閾值得分T。T被稱作相鄰詞語得分閾值(Altschul等，1990)。所述起始相鄰詞語作為種子命中，以便啟動尋找包含它的HSPs的檢索。沿著每一個序列的兩個方向延伸所命中的詞語，以便盡可能地提高累計比對得分。當出現以下情況時終止沿每個方向的命中詞語的延伸累計比對得分從它的最大獲得值下降了數量X；由于一個或多個負得分殘基比對的積累，所述累計得分下降到零或更低，或達到了每一個序列的末端。所述BLAST程序參數W，T和X決定了該程序的靈敏度和速度。所述BLAST程序使用的預設詞語長度(W)為11，BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)比對(B)為50，預期值(E)為10，M＝5，N＝4，并且在該程序被用于多核苷酸時比較兩種鏈。
所述BLAST算法對兩種序列之間的相似性進行統計學分析；例如，參見Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787。由BLAST算法所提供的相似性的一種指標是最小總可能性(P(N))，它提供了所述可能性的指標，通過這種可能性，在兩種核苷酸或氨基酸序列之間有可能發生配對。例如，如果比較的第一種序列和第二種序列之間的最小總可能性低于大約1，優選低于大約0.1，更優選低于大約0.01，最優選低于大約0.001的話，就認為一種序列與另一種序列類似。
例如，本發明多肽的成功設計可以通過以下方法驗證，當在合適的宿主細胞中表達時，證實所述多肽采用了與所述自身蛋白的構象足夠相似的構象，所產生的抗體能與所述天然自身蛋白發生交叉反應。這一結果可以使用免疫學技術證實，如通過ELISA結合單克隆或多克隆抗體，或通過物理化學技術，如圓二色性，或通過晶體學技術，如X射線晶體學或通過計算機模擬，或通過本領域技術人員所熟知的多種其他方法。
成功設計的進一步驗證可以通過以下方法實現通過合適的免疫方案，以自身關聯(self-context)方式施用所得到的多肽，并且觀察能夠結合所述誘導蛋白的抗體。可以通過采用重組或純化天然蛋白的ELISA技術評估這種結合，或通過檢查所述蛋白對敏感型細胞或組織的作用的生物測定評估。一種特別優選的評估方法是完整宿主中與所述蛋白活性有因果關系的表型，并且確定由本發明方法誘導的抗體的存在是否能調節所述表型。因此，本發明的蛋白能夠在產生所述天然蛋白的物種中產生針對天然抗原的抗體。
還可以通過突變對本發明的多肽進行進一步的修飾，例如替換、插入或缺失氨基酸，以便增加希望的特征(如增加有利于純化的序列標記或提高免疫原性)，或去掉不希望的特征(如受體上的不希望的刺激活性)或跨膜結構域。具體地講，本發明特別涉及有利于純化的融合配偶體，如聚組氨酸標記或能增強表達的GST表達配偶體。
在一個優選實施方案中，提供了一種具有小鼠IL-13所特有的下列一種或多種突變或保守性替換的人IL-13。以下編號涉及在大腸桿菌中表達的具有其信號序列的IL-13。
第30位R→K第37位V→S第63位Y→F第65位A→V第68位E→D第80位E→Y第81位K→R第85位M→I第87位G→H第113位Q→H第115位V→I第117位D→K更優選的是，所述人IL-13包括上述突變或其保守性替換中的至少兩個，優選至少3、4、5、6或更多個。優選所有十二種突變都存在。
“保守性替換”是這樣一種替換，其中，用一種氨基酸替換了具有類似特性的另一種氨基酸，因此，肽化學免疫的技術人員能夠預料的是，所述多肽的二級結構和親水性基本上沒有改變。
例如，某些氨基酸可以替換一種蛋白結構上的其他的氨基酸，而又不會明顯喪失與諸如抗體的抗原結合區或底物分子上的結合位點的結構的相互結合能力。由于正是所述相互作用能力和蛋白的性質決定了蛋白的生物學功能活性，可以在蛋白序列上進行某種氨基酸序列替換，并且理所當然地改變其DNA編碼序列，并且仍然能獲得具有類似特征的蛋白。因此，可以對所披露組合物的肽序列或編碼所述肽的相應的DNA序列進行各種改變，而又不會明顯喪失其生物學用途或活性。
在進行所述改變時，可能要考慮到氨基酸的親水指數。親水性氨基酸指數在賦予蛋白的相互作用生物學功能方面的重要性為本領域所普遍了解(Kyte和Doolittle，1982，被引入本文作為參考)。人們認為，氨基酸的相對親水特征決定了所得到蛋白的二級結構，這種二級結構又決定了所述蛋白與其他分子，例如酶、底物、受體、DNA、抗體和抗原等的相互作用。根據其疏水性和帶電特征，為每一種氨基酸確定了一個親水指數(Kyte和Doolittle，1982)。所述親水指數為異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本領域公知的是，某些氨基酸可以被具有類似親水指數或得分的其他氨基酸所替換，并且仍然能得到具有類似生物學活性的蛋白，即仍然獲得了生物學功能上等同的蛋白。在產生所述改變時，優選親水性指數在±2范圍內的氨基酸替換，更優選±1范圍內的替換，特別優選±0.5范圍內的替換。本領域中還能理解的是，類似氨基酸的替換可以根據親水性有效進行。美國專利4,554,101(在此引入作為參考)指出，由它的相鄰氨基酸的親水性決定的一種蛋白的最大局部平均親水性與該蛋白的生物學特征相關。
正如在美國專利4,554,101中所披露的，業已為氨基酸殘基確定了以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。可以理解的是，一種氨基酸可以替換具有類似親水性值的另一種氨基酸，并且仍然能獲得生物學等同物，具體地講，獲得免疫學上等同的蛋白。在所述變化中，優選親水性值在±2范圍內的氨基酸替換，更優選在±1范圍內的替換，特別優選在±0.5范圍內的替換。
如上文所述，氨基酸替換因此通常是基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如，其疏水性、親水性、電荷和大小等。考慮了上述各種特征的典型替換為本領域技術人員所熟知，并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。上述替換是優選的保守性替換。
氨基酸替換還可以根據殘基在極性電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性方面的相似性進行。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；而具有類似親水性值的具有不帶電荷的極性首基的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；和絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守性變化的其他氨基酸基團包括(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。
在一種優選實施方案中，本發明的突變IL-13包括具有一種保守性替換的一種或多種下列序列或其變體LKELIEELSN；(SEQ ID No 1)FCVALDSL；(SEQ ID No 2)AIYRTQRILHG；(SEQ ID No 3)KIEVAHFITKLL；(SEQ ID No 4)本發明的多肽是由本發明的多核苷酸編碼的。本領域技術人員可以通過采用遺傳密碼方便地確定編碼所述多肽的多核苷酸序列。一旦確定了需要的核酸序列，就可以按照實施例中所披露的方法生產具有理想序列的多核苷酸。本領域技術人員能夠方便地采用任何需要的參數，如引物和PCR條件。本領域技術人員還可以理解的是，由于遺傳密碼的簡并性，可能有一種以上的多核苷酸編碼本發明的多肽。
本發明的多核苷酸通常是RNA，例如mRNA；或DNA，例如基因組DNA、cDNA或合成DNA。所述多核苷酸優選是DNA，特別優選是cDNA。
本發明還提供了一種表達載體，它是包括本發明多核苷酸的核酸構建體。另外，所述核酸構建體包括合適的起始密碼子、啟動子、增強子和其他因子，例如，聚腺苷酸化信號，這些因子可能是必要的，并且以正確取向定位，以便能夠在哺乳動物細胞內進行蛋白表達。
所述啟動子可以是真核啟動子，例如CD68啟動子、Gal1、Gal10、或NMT1啟動子，原核啟動子，例如Tac、Trc或Lac或病毒啟動子，例如巨細胞病毒啟動子、SV40啟動子、多角體蛋白啟動子、P10啟動子或呼吸道合胞病毒LTR啟動子。所述啟動子優選是病毒啟動子。當所述啟動子是巨細胞病毒立即早期啟動子時，特別優選的是選擇性地包括HCMV IE基因的外顯子1。
所述轉錄調控因子可以包括增強子，例如乙型肝炎表面抗原3’非翻譯區、CMV增強子，內含子，例如CD68內含子或CMV內含子A，或調控區，例如CMV 5′非翻譯區。
在所述核酸構建體上，所述多核苷酸優選可操作地與所述啟動子連接，以便在將該構建體插入哺乳動物細胞中時，所述多核苷酸能夠表達，產生編碼的多肽。所述核酸構建體主鏈可以是RNA或DNA，例如質粒DNA、病毒DNA、細菌DNA、細菌人工染色體DNA、酵母人工染色體DNA、合成DNA。所述核酸構建體還可以是人工核酸，例如硫代磷酸RNA或DNA。所述構建體優選是DNA。當所述構建體是質粒DNA時是特別優選的。
本發明還提供了一種包括本發明的表達載體的宿主細胞。所述細胞包括瞬時的、或者優選穩定的高等真核細胞系，如哺乳動物細胞或昆蟲細胞，舉例來說，所述細胞使用諸如桿狀病毒表達系統，諸如酵母的低等真核細胞或諸如細菌細胞的原核細胞。可以通過插入編碼本發明多肽的載體進行修飾的細胞的具體例子包括哺乳動物HEK293T，CHO，HeLa，NSO和COS細胞。所選擇的細胞系優選是這樣的細胞系，它不僅是穩定的，而且還能進行多肽的成熟糖基化。表達可以在轉化過的卵細胞中進行。本發明的多肽可以在轉基因非人動物的細胞中進行，優選在小鼠細胞中進行，或者表達到諸如山羊、綿羊或牛的大型哺乳動物的乳液中。表達本發明多肽的轉基因非人動物包括在本發明的范圍內。本發明的多肽還可以在爪蟾卵母細胞中表達。
本發明還包括藥用或疫苗組合物，所述組合物包括治療有效量的本發明的核酸構建體或多肽，選擇性地與可以藥用的載體組合，優選與可以藥用的賦形劑組合，如磷酸緩沖的鹽溶液(如PBS)、鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、脂質體或其組合。所述疫苗組合物還可以包括治療有效量的本發明的核酸構建體，所述核酸構建體配制在金屬珠，優選金珠上。本發明的疫苗組合物還包括佐劑，例如，在一種實施方案中，包括咪喹莫特(imiquimod)、tucaresol或明礬。
優選蛋白佐劑制劑，因為這種制劑能誘導高效價抗體反應。
所述佐劑優選與本發明的(組合物)同時施用，并且在優選實施方案中，將其配制在一起。本發明涉及的佐劑包括(但是所列舉的佐劑不是窮舉性的，并且不排除其他制劑)合成咪唑喹啉，如咪喹莫特[S26308，R-837]，(Harrison等，“單獨用咪喹莫特或與糖蛋白疫苗組合減輕HSV疾病的復發”，Vaccine 191820-1826，(2001))，和resiquimod[S-28463，R-848](Vasilakos等，“免疫反應修飾劑R-848的佐劑活性與CpG ODN比較”，Cellular immunology 20464-74(2000))，在抗原呈遞細胞和T-細胞表面上組成型形式表達的羰基和胺的Schiff堿，如tucaresol(Rhodes，J.等，“通過共刺激成Schiff堿藥物治療加強免疫系統”，Nature 37771-75(1995))，細胞因子，趨化因子和共刺激分子，Th1誘導物，如干擾素γ、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18，Th2誘導物，如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13和其他趨化因子和共刺激基因，如MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3、CD80、CD86和CD40L，其他免疫刺激導向配體，如CTLA-4和L-選擇蛋白，細胞程序死亡刺激蛋白和肽，如Fas，(49)，合成脂基佐劑，如vaxfectin，(Reyes等，“Vaxfectin能增強質粒DNA免疫的抗原專一性抗體效價，并且保持Th1型免疫反應”，Vaccine 193778-3786)，角鯊烯，α-生育酚，聚山梨酯80，DOPC和膽甾醇，內毒素，[LPS]，Butler，B.，“內毒素，Toll-樣受體4和天然免疫性的傳入分支”，Current Opinion in Microbiology 323-30(2000))；CpG寡聚-和二-核苷酸，Sato，Y.等，“有效皮內基因免疫所需要的免疫刺激DNA序列”，Science 273(5273)352-354(1996)。Hemmi，H.等，“Toll-樣受體識別細菌DNA”，Nature 408740-745，(2000)和能誘導Toll受體產生Th1-誘導細胞因子的其他潛在配體，如合成的分支桿菌脂蛋白、分支桿菌蛋白p19、肽基聚糖、磷壁酸和脂A。
用于誘導主要為Th1-型反應的某些優選佐劑包括，例如脂A衍生物，如單磷酸脂A，或優選3-脫氧乙酰化單磷酸脂A。MPL佐劑是由Corixa公司出售的(Seattle，WA；例如，參見美國專利號4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中，CpG二核苷酸是非甲基化的)同樣能誘導主要Th1反應。所述寡核苷酸為本領域所公知，并且披露于以下文獻中例如WO 96/02555、WO99/33488和美國專利6,008,200和5,856,462。例如，還披露了免疫刺激DNA序列，Sato等，Science 273352，1996。另一種優選佐劑包括皂苷，如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila BiopharmaceuticalsInc.，Framingham，MA)；七葉樹皂苷；毛地黃皂苷；或翟麥或Chenopodium quinoa皂苷。
本發明還提供了治療或預防IL-13介導的疾病、與它相關的任何癥狀或疾病的方法，包括施用有效量的本發明的蛋白、多核苷酸、載體或藥用組合物。藥用組合物的施用可以采用一個或多個單位劑量形式，例如采用“啟動加強”免疫方案。在某些場合下，“啟動(prime)”免疫可以通過粒子介導的DNA輸送方法輸送本發明的多核苷酸，優選整合到質粒衍生的載體上，并且通過施用包括相同核苷酸序列的重組病毒載體“加強”，或者用存在于佐劑中的所述蛋白加強。相反，所述啟動可以采用病毒載體或采用蛋白制劑，蛋白制劑通常是用佐劑配制的蛋白，并且用本發明的DNA疫苗加強。
為了治療自身抗原，例如IL-13介導的疾病，所述佐劑優選是TH-1反應的優選誘導物。具體地講，所述佐劑包括免疫刺激CpG寡核苷酸，如在WO96102555中所披露的。典型的免疫刺激寡核苷酸的長度為8-100個堿基，并且包括通式X1CpGX2，其中，X1和X2是核苷酸堿基，而C和G是未甲基化的。
用于本發明佐劑或疫苗中的優選寡核苷酸優選包括兩個或兩個以上二核苷酸CpG基序，優選由至少三個基序隔開，更優選6或6個以上核苷酸。本發明的寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一種優選實施方案中，所述寡核苷酸的核苷酸間是二硫代磷酸酯，或者更優選硫代磷酸酯鍵，同樣屬于本發明范圍的磷酸二酯和其他內部核苷酸鍵包括具有混合的核苷酸間連鍵的寡核苷酸。例如，混合的硫代磷酸酯/磷酸二酯。可以采用能穩定寡核苷酸的其他核苷酸間鍵。用于生產硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法披露于以下文獻中US5,666,153，US5,278,302和WO95/26204。
優選寡核苷酸的例子具有以下序列。所述序列優選包括硫代磷酸酯修飾過的核苷酸間連鍵。
OLIGO 1TCC ATG ACG TIC CTG ACG TT(CpG 1826)(SEQ ID NO 5)OLIGO 2TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)(SEQ ID NO 6)OLIGO 3ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG(SEQ ID NO 7)OLIGO 4TCG TCG TIT TGT CGT TIT GTC GTF(CpG 2006)(SEQ ID NO 8)OLIGO 5TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)(SEQ ID NO 9)其他CpG寡核苷酸可以包括上述優選序列，其中，所述序列是不連續地缺失或添加上去的。本發明所使用的CpG寡核苷酸可以通過本領域已知的任何方法合成(例如EP468520)。通常，所述寡核苷酸可以是用自動合成儀合成的。含有CpG寡核苷酸的佐劑制劑可以以“ImmunEasy”商品名從Qiagen公司購買。
本發明的組合物可用于預防和治療。本發明提供了用于醫療的本發明的多肽或多核苷酸。本發明還提供了將本發明的多肽或多核苷酸用于生產用來治療過敏、諸如哮喘和COPD的呼吸道疾病、與寄生蟲感染相關的疾病、肝臟纖維化或硬化的藥品的用途。
本發明還提供了一種免疫方法，該方法包括給患者施用有效量的本發明的疫苗組合物，并且誘導針對所述疫苗組合物的免疫反應。
本發明還提供了本文所披露的疫苗組合物，用于使哺乳動物對IL-13介導的疾病(如過敏、呼吸道疾病、與寄生蟲感染相關的疾病、肝臟纖維化和硬化)進行免疫。呼吸道疾病包括例如哮喘，如過敏性哮喘，和慢性阻礙性肺病(COPD)。具體地講，能夠誘導針對IL-13的中和反應的疫苗組合物，可以構成一種用于治療哮喘，特別是人類過敏性哮喘的有用治療劑。它還可用于治療某些與寄生蟲感染相關的疾病(Brombacher，2000 Bioessays 22646-656)和IL-13的生產與纖維化相關的疾病(Chiaramonte等，1999，J Clin Inv 104777-785)，如慢性阻礙性肺病(COPD)和肝硬化。
本發明的疫苗組合物可以通過多種方法施用，例如通過黏膜，如口腔和鼻腔；肺、肌內、皮下或皮內途徑。當所述抗原要以蛋白型疫苗施用時，所述疫苗通常是用一種佐劑制備的，并且可以冷凍干燥，并且在使用之前重新懸浮在水中，以便注射。所述組合物可以作為注射組合物給個體施用，例如，作為無菌水分散液，優選等滲分散液。通常，所述組合物是肌內施用的，不過，其他施用途徑也是可行的。
皮內施用的一種技術包括粒子轟擊(它又被稱為‘基因槍’技術，并且披露于美國專利5371015中)。蛋白可以與糖類配伍，以便形成小的顆粒，或者可以將編碼所述抗原的DNA包衣在惰性顆粒上(如金顆粒)，并且以能夠使它穿透受體(例如皮膚)表面的速度加速，例如，通過一個發射裝置在高壓下通過發射加速(用本發明的核酸疫苗構建體包衣的顆粒和蛋白糖類顆粒屬于本發明的范圍，在所述裝置上加載所述顆粒)。將含有所述構建體的核酸構建體或組合物直接施用到受體內的其他方法包括超聲波、電刺激、電穿孔和微量接種，這些方法披露于US5,697,901中。
本發明的核酸構建體還可以通過用于基因治療中的特殊輸送載體施用。例如，基因治療方法披露于以下文獻中Verme等，Nature1997，389239-242。可以使用病毒和非病毒系統。基于病毒的系統包括逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和基于痘苗病毒的系統。非病毒型系統包括直接施用核酸和脂質體型系統。例如，所述載體可以用脂質體膠囊化，或者包裹在聚交酯共-乙交酯(PLG)顆粒中。
本發明的核酸構建體還可以通過轉化過的宿主細胞施用。所述細胞包括從受治療對象體內收獲的細胞。可以在體外將所述核酸疫苗構建體導入所述細胞，并且隨后將轉化過的細胞送回所述受治療對象。可以通過同源重組事件，將本發明的核酸構建體整合到業已存在于細胞中的核酸中。如果需要，轉化過的細胞可以在體外生長，并且將一個或多個所得到的細胞用于本發明。可以通過已知的手術或顯微手術技術(例如移植、顯微注射等)將細胞提供給患者體內的合適部位。合適的細胞包括樹狀細胞。
所輸送的疫苗組合物的量可以有顯著變化，使用量取決于要免疫的哺乳動物物種和體重，要治療/預防的疾病狀態的性質，所采用的免疫方案(即一次施用與重復劑量)，施用途徑以及所選擇的佐劑化合物的效力和劑量。根據上述變量，醫生或獸醫師可以方便地確實合適的劑量水平，不過，舉例來說，當所述疫苗是核酸時，所述劑量為0.5-5μg/kg所述核酸構建體或含有該核酸構建體的組合物。具體地講，所述劑量可以根據施用途徑而改變。例如，在使用包衣在金珠上的方式皮內施用時，總劑量優選為1μg-10ng，特別優選的劑量是10μg-1ng。當直接施用所述核酸構建體時，所述總劑量通常更高，例如50μg-1mg或更高。上述劑量是一般情況的代表。
在蛋白疫苗中，每一種疫苗劑量中的蛋白數量是經過選擇的，該用量可以在典型的接種疫苗者體內誘導免疫保護反應，而又不會出現明顯的、不利副作用。所述用量可以根據所使用的特定免疫原以及提供免疫原的方式而改變。一般，預計每一個劑量包括1-1000μg蛋白，優選1-500μg，優選1-100μg，最優選1-50μg。可以通過標準研究確定特定疫苗的最佳用量，包括觀察免疫對象體內的合適的免疫反應。在初步接種之后，受治療對象可以接受適當間隔開的一次或若干次加強免疫。所述疫苗制劑可以是啟動免疫方案或加強免疫方案；可以是系統施用的，例如通過皮內、皮下或肌內途徑，或通過諸如鼻腔或口腔的途徑用于黏膜表面上。
當然，可能存在需要更高或更低劑量的個別情況，并且這種情況屬于本發明的范圍。
對于所述疫苗組合物來說，施用可以是一次性的或者反復施用，例如，施用1-7次，優選1-4次，間隔時間為大約1天-大約18個月，優選間隔1個月。在此之后，可以以1-12個月的有規律的間隔用藥，直到患者生命的終結。在一種實施方案中，所述患者可以通過啟動加強方案接受不同形式的抗原。因此，舉例來說，一種抗原首先是以DNA型疫苗施用的，然后以蛋白佐劑型制劑施用。不過，這種治療方案同樣會根據相關動物的體形和種類，所施用的核酸疫苗和/或蛋白組合物的量、施用途徑、所使用的任何佐劑化合物的效力和劑量以及對獸醫師和醫師來說顯而易見的其他因素而有很大變化。
以下實施例在小鼠中而不是在人體中證實了本發明的理論，因此所述蛋白是具有人類蛋白突變特征的鼠類蛋白，不過，有關結果可方便地外推用于治療人類，其中，所述蛋白將具有帶有鼠類突變特征的人類B細胞表位，或其他類似蛋白。
在本發明的以下實施例中，利用了分子和細胞生物學領域普遍公知和采用的技術。所述技術的操作細節可以在多種教科書中查閱到，包括Sambrook等(1989，2nd edition.Cold Spring Harbor PressNewYork)。氨基酸序列或名稱以一字母代碼或三字母代碼形式提供。前綴‘h’用于表示來源于人的蛋白或基因，‘m’表示來源于鼠類，而‘c’表示嵌合結構，‘r’被用于表示重組蛋白。
實施例1.抗鼠類IL-13疫苗的設計IL-13屬于SCOP(Murzin等，1995，J Mol Biol 247536-540)定義的4螺旋細胞因子折疊家族。該折疊超家族的每一個成員在結構上相關，但是在序列水平上難于比較。IL-13的三維結構尚未確定，不過，業已確定了多種其他4螺旋細胞因子的結構。業已對IL-13直向同源物進行了蛋白的多種序列比對，并且還比對了具有該折疊的多種其他細胞因子，其中，業已決定了至少一個成員的結構(IL-4，GM-CSF，IL-5和IL-2)。用DSC(King和Sternberg，1996，Prot Sci 52298-2310)，SIMPA96(Levin，1997，Prot Eng 7771-776)和Pred2ary(Chandonia和Karplus，1995，Prot Sci 4275-285)對IL-13蛋白多種序列比對進行了二級結構預測。利用序列信息和結構信息(來自已知的晶體結構和來自二級結構預測)，對單個細胞因子蛋白多種序列比對彼此之間進行排比。
利用Cameleon軟件(Oxford Molecular)推測鼠IL-13的抗原位點，特別是B-細胞表位，并且利用蛋白多種序列比對將該位點在IL-4結構上作圖(在Brookhaven數據庫中的登記號為1RCB)，以便提供它們將定位在IL-13上的何種結構部位的信息。通過上述分析，篩選了有可能具有抗原性，并且參與受體結合的暴露區。
根據這一模型，設計了一種嵌合IL-13序列，其中，所推測的抗原環的序列來自鼠IL-13，而所述推測的結構(主要是螺旋形)區的序列來自人IL-13。該設計的目的是鑒定來自鼠IL-13的靶表位，可能產生針對該表位的中和抗體，并且將其提供給在結構上類似于天然蛋白的構架，不過它相對(鼠)仍然包括足夠的序列變異，以便確定存在一個或多個CD4T輔助表位。在圖1中示出了為嵌合IL-13疫苗的這種例子而篩選的核酸和蛋白序列(SEQ ID NO 19和20)。加下劃線的序列相當于存在于人類直向同源物中的序列。為了獲得圖1中的序列，替換了12個氨基酸。應當理解的是，遺傳密碼的簡并性使得很多可能的遺傳序列能編碼相同的蛋白。另外，應當理解的是，在本發明范圍內存在其他可能的嵌合IL-13疫苗設計，這些設計在非暴露區具有其他直向同源突變。
1.2嵌合IL-13的制備用一系列部分重疊的DNA寡核苷酸合成嵌合IL-13(cIL-13)DNA序列，所述寡核苷酸具有表1所示的序列cIL-13-1至cIL-13-6。對所述寡聚體進行退火，并且通過PCR制備IL-13DNA，采用以下循環方案94℃1分鐘，隨后進行25輪94℃30秒，55℃1分鐘，和72℃2分鐘。然后在72℃下進行7分鐘，結束時冷卻至4℃。所述反應產物構成了預期大小為361bp的帶，將其亞克隆到T/A克隆載體pCR2.1(Invitrogen，Groningen，Netherlands)中，并且制備pCR2.1-cIL-13。然后將來自pCR2.1-cIL-13的BamH1和Xho1 cIL-13消化片段亞克隆到pGEX4T3的BamH1和Xho1位點上(Amersham Pharmacia，Amersham，Bucks，UK)，產生pGEX4T3-cIL-13/1。在對pGEX4T3-cIL-13/1構建體進行測序時，我們發現了一個位于GST和cIL-13之間的額外的具有39bp的DNA序列(來自pCR2.1載體)。為了糾正它，我們使用pGEX4T3-cIL-13/1和引物cIL-13Fnew和cIL-13R重復進行cIL-13的PCR。然后利用BamH1和Xho1限制位點將所獲得的PCR產物重新克隆到pGEX4T3上，以便產生表達載體pGEX4T3-cIL-13。通過雙脫氧終止測序證實該構建體的序列。該載體編碼一種遺傳融合蛋白，該蛋白包括谷胱甘肽-S-轉移酶和cIL-13(GST-cIL-13)。所述蛋白的這兩部分是通過一個短的間隔片段連接的，該間隔片段包括凝血酶的識別位點。所述融合蛋白可以通過谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和層析方便地純化，然后直接使用，或使用通過用凝血酶裂解生產的無cIL-13的制劑。
表1.用于構建嵌合IL-13的寡核苷酸。


將pGEX4T3-cIL-13表達載體轉入大腸桿菌BLR菌株中(Novagen，由Cambridge Bioscience提供，Cambridge，UK)。在對數生長期，通過向培養液中添加0.5mM IPTG，在37℃下用4小時誘導GST-cIL-13表達。然后通過離心收獲細菌，并且通過以前所披露的用于純化類似的GST-人IL-13融合蛋白的方法(McKenzie等，1993，Proc NatnAcad Sci 903735-3739)純化GST-cIL-13。
cIL-13特性的表征通過SDS-PAGE電泳分析純化的GST-cIL-13樣品。圖2表示純化的制劑含有GST-cIL-13的預期大小的蛋白。靠下面的帶表示少量的GST，它是由在制備期間所述融合蛋白的部分裂解而產生的。
為了證實所純化的蛋白是GST-cIL-13，通過SDS-PAGE分離樣品，吸印到PVDF膜上，然后通過Westem印跡分析IL-13的存在和GST免疫反應性。由于cIL-13包括來自人和鼠IL-13的序列，預計它能被針對人IL-13或鼠IL-13的抗血清識別。在含有0.05％Tween-20的TBS(50mM trizma hydrochloride，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，pH8.0)(TBST)中，在4℃下，用3％牛血清白蛋白(BSA)封閉印跡，在室溫下(RT)與一級抗體一起搖晃培養1小時，然后用TBST洗滌4次。添加二級抗體，在室溫下搖晃培養1小時。然后洗滌4次，然后用SuperSignal Chemiluminescent Reagent(Pierce，Rockford，Illinois，USA)顯影。
圖3(注釋見下文)表示該分析的結果。分析表明，所純化的蛋白能被抗人IL-13、鼠IL-13和GST的抗體識別，因此證實了其預期結構。

用于本實驗的一級抗體是抗-hIL-13，產品目錄號AF-213-NA，R& D Systems，Abingdon，Oxford，UK，用量為1μg/ml；抗-mIL-13，產品目錄號AF-413-NA，R & D Systems，用量為1μg/ml，和抗-GST，產品目錄號27-4590D，Pharmacia，以1/200的比例使用。在本實驗中所使用的二級抗體是HRP-綴合的抗-山羊IgG，產品目錄號A5420，Sigma-Aldrich有限公司，Poole，Dorset，UK，以1/40,000的比例使用。
所述蛋白樣品是按例2所述方法制備的GST-cIL-13，重組人IL-13(rhIL-13)，產品目錄號CH1-013，Cambridge Bioscience，Cambridge，UK，重組鼠IL-13(rmIL-13)產品目錄號413-ML-025，R & D Systems，和GST，它是按已知方法用由空的pGEX4T3載體轉染過的大腸桿菌制備的(Sambrook等，1989，2nd edition.Cold Spring Harbor PressNewYork)。
1.3嵌合IL-13的構象為了證實溶液中的GST-cIL-13采用了類似于天然IL-13的構象，通過ELISA分析了GST-cIL-13和cIL-13樣品(通過凝血酶裂解由GST-cIL-13制備)。在4℃下用溶解在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中的cIL-13，GST-cIL-13，mIL-13，hIL-13或gst對96孔Maxisorp平板(LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK)進行包衣過夜。然后在室溫下用3％BSA/TBST封閉所述平板1小時，用TBST洗滌3次，在室溫下與一級抗體一起培養1小時，然后用TBST洗滌3次。添加二級抗體培養1小時時間，用TBST洗滌3次，然后用鄰苯二胺二氫氯化物過氧化物酶底物(OPD，Sigma Aldrich)顯影30分鐘。用于本實驗中的一級和二級抗體如上文所述。如圖4所示，GST-cIL-3和cIL-13能夠被抗人IL-13和鼠IL-13的抗體專一性識別。以上結果證實，所述嵌合過程沒有明顯改變所述蛋白的構象。
1.4嵌合IL-13與受體的結合為了證實cIL-13是否能結合任意一種已知的鼠IL-13受體(mIL-13R1或mIL-13R2)，進行了ELISAs。在4℃下用溶解在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中的抗人IgG(產品目錄號1-3382，Sigma Aldrich)對96孔Maxisorp平板進行包衣過夜。然后在室溫下用3％BSA/TBST封閉平板1小時，用TBST洗滌3次，并且在室溫下與mIL-13R1-Fc或mIL-13R2-Fc(產品目錄號分別為491-IR-200和539-IR-100，R+D Systems)一起培養1小時。在洗滌之后，在室溫下用mIL-13或cIL-13或GST-cIL-13的稀釋液培養平板1小時，再次洗滌，并且用生物素化的抗-mIL-13(產品目錄號BAF413，R+D Systems)培養。然后再次洗滌，并且與鏈親和素綴合的辣根過氧化物酶一起培養，用鄰苯二胺二氫氯化物過氧化物酶對一起對所述平板顯影30分鐘。如圖5所示，cIL-13和GST-cIL-13都能結合任意一種mIL-13受體。上述結果再次證實所述嵌合過程沒有明顯改變所述蛋白的構象。
1.5嵌合IL-13的生物活性根據該蛋白在人肺成纖維細胞系A549中磷酸化STAT6的能力，評估GST-cIL-13的生物活性。所述細胞表達對IL-4和IL-13有反應的人II型IL-4受體。用hIL-4，hIL-13或mIL-13刺激所述細胞能誘導信號傳導蛋白STAT6的磷酸化。將存在于RPMI(Life Technologies)中的5×105A549細胞鋪平板到60毫米組織培養皿(Life Technologies)上，并且生長到70％的鋪滿度。然后在37℃下用2-150ng/ml細胞因子或純化的cIL-13培養細胞15分鐘。由于GST融合配偶體的存在會改變細胞因子的生物活性，所述嵌合IL-13是作為GST-cIL-13融合蛋白和通過凝血酶裂解從融合體中釋放出的游離cIL-13形式分析的。作為對照，還測試了rmIL-13和GST。然后制備細胞裂解物，并且使用兔抗-磷酸STAT6多克隆抗體(NEB，Hitchin，Herrs，UK.產品目錄號9361S)通過Western印跡分析磷酸-STAT6的存在。在5％BSA/TBST(BSA必須是購自Sigma公司的A7906，作為一級抗體，它是磷酸專一性的，0.1％Tween-20)中封閉印跡過夜，在室溫下以1/1000的比例添加一級抗體，培養1小時，然后用TBST洗滌3次。然后以1/5000的比例添加抗兔HRP綴合的二級抗體(A-4914，Sigma Aldrich)，在室溫下培養1小時，然后用TBST洗滌4次，然后用HRP化學發光底物ECL試劑(AmershamPharmacia)顯影。該實驗的結果如圖6所示。
在每一個泳道中加載以下蛋白

重組蛋白制劑如圖3所示。
用50或10ng/ml(而不是2ng/ml)rmIL-13處理A549細胞，誘導了STAT6的磷酸化，表明它具有生物活性。用50ng/ml(而不是10或2ng/ml)cIL-13處理A549細胞，誘導了STAT6的磷酸化，表明它具有生物活性。類似地，150ng/ml GST-cIL-13(它在摩爾數量方面大體上等于50ng/ml cIL-13)是具有生物活性的，而30和6ng/ml的沒有生物活性。因此，CIL-13是該受體的刺激劑，不過在上述實驗條件下，其生物活性比mIL-13低大約5倍。
1.6用cIL-13免疫然后用cIL-13和GST-cIL-13作為免疫原，在Balb/c小鼠體內誘導抗小鼠IL-13的自身抗體的形成。在尾巴根處給6-8周大的雌性小鼠皮下(sc)注射1次大約30μg的溶解在完全弗氏佐劑(CFA)中的蛋白。隨后在相同部位進行3次加強免疫，每次免疫包括溶解在用于加強免疫的不完全弗氏佐劑[IFA]中的大約10μg蛋白。每一個處理組包括5只動物，并且按照表2所示方案進行免疫。
表2


血清樣品是通過在表2所示的時間點上對尾靜脈實施靜脈穿刺獲得的。在通過離心澄清之后，通過ELISA分析所述樣品中對小鼠IL-13，人IL-13和GST有反應的專一性IgG的存在。A-D組中的任何動物在任何時間點上都不具備抗小鼠IL-13抗體。B組、D組和F組中的所有動物都能產生對GST的強的IgG反應(E組動物也能產生對GST的強的抗體反應，因為在用于對這些小鼠免疫的cIL-13樣品中殘留有GST)。在F組中的5只動物中的5個和E組的5只動物中的4個誘導了抗小鼠IL-13抗體反應。圖7(a和b)表示對F組動物之一和來自E組7b的動物之一的血清學分析(分別用gst-cIL-13免疫和用cIL-13免疫)。以上結果表明，用GST-cIL-13或cIL-13免疫能夠破壞對mIL-13的耐受性，產生小鼠抗-mIL-13抗體。
在A549/磷酸化-STAT6測定中，測試了來自強的抗-mIL-13IgG反應的2只小鼠(F1d70和F5d97)的血清中和rmIL-13的生物活性的能力。在室溫下，在無血清RPMI組織培養基中將20ng/ml或10ng/ml rmIL-13(R & D Systems)與1％血清一起培養15分鐘，然后在37℃下與A549細胞一起培養15分鐘。制備細胞裂解物，并且通過上文所披露的Western印跡分析分析磷酸STAT6的存在。作為負對照，從用GST-hIL-13免疫的Balb/c小鼠體內獲得了抗-hIL-13血清，并且通過ELISA證實具有強的抗-hIL-13IgG反應，但是沒有抗-mIL-13抗體。作為正對照，將中和抗-mIL-13抗體(R & D Systems，產品目錄號AF-413-NA)摻入正常小鼠血清中，以便得到1μg/ml的最終濃度。
該實驗的結果如圖8所示，其中測試了以下成分

用本發明的嵌合IL-13免疫原免疫能夠誘導抗小鼠IL-13自身抗體的產生，這種抗體能中和小鼠IL-13的生物學活性(泳道4、5、12、13)，其作用方式與外源添加的抗鼠類IL-13抗體相當(泳道15、16)。這種活性不存在于正常小鼠血清中(泳道1、2)，也不存在于來自用GST-hIL-13免疫過的動物血清中(泳道7、8)。
以上數據提供了通過用cIL-13免疫，并因此誘導內源中和抗體活性治療患有IL-13依賴型病理學的哺乳動物的基礎。
1.7其他構建體1.7.1 6his標記的cIL-13設計GST-cIL-13是細菌生產的蛋白，它是不溶性的，并且需要在體外增溶和重新折疊。體積排阻層析證實，所述重新折疊過程產生了若干種不同的折疊形式，這表明所述免疫反應的一部分是針對能產生不結合天然小鼠IL-13的不相關的抗體的形式的。
因此，這種候選物不可能產生可能的最有效中和抗小鼠IL-13抗體反應。
為此，業已將6his-cIL-13克隆到一種哺乳動物表達載體上，哺乳動物表達的6his-cIL-13是可溶性的，并且不需要在體外重新折疊。
1.7.2圖12(SEQ ID NO 23和24)表示一種疫苗抗原，其中，產生了不同的類似突變。按照一種方案對蛋白序列編號，其中，在序列“GPVPR”中的甘氨酸殘基是1號殘基。劃單下劃線的序列相當于來自修正過的結構模型的推測的模型區。劃雙下劃線的粗體殘基表示被整合到所述小鼠序列上的突變的點；11小鼠Leu改變成Val(大鼠)21小鼠Ser改變成Thr(非直向同源)63小鼠Tyr改變成Phe(非直向同源)71小鼠Gly改變成Ala(狗/豬/牛)100小鼠Ser改變成Thr(狗)104小鼠Gln改變成Asn(非直向同源)10小鼠His改變成Arg(非直向同源)1.8用于人類治療圖9表示本發明的一種可能的疫苗抗原，它能誘導在人體內產生抗人IL-13抗體。可將其用于治療以過量或不適當的IL-13為特征的疾病，例如哮喘。在相當于小鼠IL-13的序列上加下劃線。所述構建體包括類似于小鼠IL-13的12個氨基酸替換，它們是
第30位R→K第37位V→S第63位Y→F第65位A→V第68位E→D第80位E→Y第81位K→R第85位M→I第87位G→H第113位Q→H第115位V→I第117位D→K圖13(SEQ ID NO 25)表示基于嵌合IL-4的用于人類的一種可能的疫苗。它是嵌合人IL-4疫苗蛋白的一個例子。加下劃線的氨基酸殘基包括α螺旋結構區，來自小鼠IL-4，并且第21號氨基酸在第一個螺旋中。普通符號(plain symbol)表示來自人IL-4的氨基酸殘基。α螺旋區的位置引自以下文獻Zuegg，J等(2001)Immunol and Cell Biol 79332-339。
實施例2對gst-cIL-13的免疫反應是小鼠IL-13專一性的，并且不能與小鼠IL-4發生交叉反應。
由于小鼠IL-13在結構上類似于小鼠IL-4，通過抗小鼠IL-4 ELISA和體外mIL-4中和生物測定分析來自GST-cIL-13免疫過的小鼠的血清(業已證實它含有高效價的抗小鼠IL-13自身抗體)與小鼠IL-4的交叉反應性。
2.1抗小鼠IL-4 ELISA.
在4℃下，用溶解在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中的IL-4單克隆抗體(產品目錄號MAB404，R+D Systems)對96孔平板進行包衣過夜。然后在室溫下用3％BSA/TBST封閉平板1小時，用TBST洗滌3次，并且在室溫下與小鼠IL-4(產品目錄號404-ML-005，R+D Systems)一起培養1小時。在洗滌之后，在室溫下將平板與小鼠血清一起培養1小時，再次洗滌，并且與HRP綴合的抗小鼠IgG多克隆抗體(產品目錄號A-9309，SIGMA)一起培養。在進一步洗滌之后，用鄰苯二胺二氫氯化物過氧化物酶底物對所述平板進行顯影30分鐘。
所述血清中抗小鼠IL-4抗體的含量是以終點效價形式表示的。終點效價被定義為相當于ELISA背景讀數2倍的血清稀釋度。

在該血清樣品中檢測到極低水平的小鼠IL-4交叉反應性。相反，以前通過抗小鼠IL-13抗體ELISA，在該血清樣品中測定了高的多的抗小鼠IL-13抗體終點效價。通過該ELISA測定的小鼠IL-4交叉反應性的水平預計不會在體內產生小鼠IL-4中和作用。通過體外小鼠IL-4生物測定評估該血清樣品的小鼠IL-4中和能力。
2.2體外小鼠IL-4中和生物測定小鼠IL-4在體外能刺激CTLL細胞的增殖。因此，在所述細胞中開發了一種測定方法，以便評估來自該GST-cIL-13免疫過的小鼠的血清的小鼠IL-4中和能力。
為了測定小鼠血清中和小鼠CTLL細胞(產品目錄號87031904，ECACC)上的重組小鼠IL-4的生物活性的能力，在37℃下，在96孔組織培養平板(Invitrogen)上，將3納克/毫升重組小鼠與各種濃度的血清一起培養1小時。在該預培養期之后，添加CTLL細胞。在潮濕的二氧化碳培養箱中，在37℃下將含有各種血清稀釋度、重組小鼠IL-4和CTLL細胞的測試混合物培養70小時。在培養的最后4小時期間添加MTT底物(產品目錄號G4000，Promega)，然后用酸溶液溶解代謝的蘭色甲產物終止所述反應。在570nm波長下在96孔平板讀數機中讀出每一個孔中溶液的稀釋值。
應當指出的是，該測定方法只能測定高于或相當于1/100的血清稀釋度中的小鼠IL-4中和能力。低于1/100的血清稀釋度能在CTLL細胞中誘導非專一性增殖作用。
血清中和小鼠IL-4生物活性的能力被表達為將特定數量的小鼠IL-4的生物活性中和50％(＝ND50)所需的血清稀釋度。血清樣品越稀，其中和能力越強。
測試過的最高濃度的小鼠C2血清是1/100稀釋度。它不能將3ng/ml的小鼠IL-4的生物活性中和50％，因此，ND50被表達為＜1/100稀釋度。

在測試過的血清稀釋度下，在該血清樣品中未檢測到小鼠IL-4中和能力。相反(在評估小鼠IL-13中和能力時)，該血清樣品能有效中和小鼠IL-13生物活性。
以上結果表明，盡管通過抗小鼠IL-4抗體ELISA在所述血清中能夠檢測到非常低水平的小鼠IL-4交叉反應性，但是沒有相關的小鼠IL-4中和能力。
2.3用新的小鼠IL-13中和生物測定評估小鼠血清樣品的小鼠IL-13中和能力以前的GST-cIL-13生物活性和小鼠IL-13中和能力結果是使用STAT-6磷酸化結果在A549細胞中產生的。該測定方法煩瑣并且不容易產生定量結果。小鼠IL-13在體外能刺激TF-1細胞增殖。因此，在所述細胞中開發了一種測定方法，以便評估來自GST-cIL-13免疫過的小鼠血清的小鼠IL-13中和能力。
2.4體外小鼠IL-13中和生物測定為了測定小鼠血清中和人TF-1細胞(自己獲得的(obtained in-house))上的重組小鼠IL-13的生物活性的能力，在37℃下，在96孔組織培養平板(Invitrogen)中，將5納克/毫升重組小鼠IL-13與各種濃度的血清一起培養1小時。在該預培養期之后，添加TF-1細胞。在潮濕的二氧化碳培養箱中，在37℃下將含有各種血清稀釋度、重組小鼠IL-13和TF-1細胞的測試混合物培養70小時。在培養的最后4小時期間添加MTT底物(產品目錄號G4000，Promega)，然后用酸溶液溶解代謝的蘭色甲產物終止所述反應。在570nm波長下在96孔平板讀數機中讀出每一個孔中溶液的稀釋值。
應當指出的是，該測定方法只能測定高于或相當于1/100的血清稀釋度中的小鼠IL-13中和能力。低于1/100的血清稀釋度能在TF-1細胞中誘導非專一性增殖作用。血清中和小鼠IL-13生物活性的能力被表達為將特定數量的小鼠IL-13的生物活性中和50％(＝ND50)所需要的血清稀釋度。血清樣品越稀，其中和能力越強。
通過上述方法測定了GST-cIL-13免疫的小鼠的血清的小鼠IL-13中和能力。如下文所述，產生了強的IL-13中和反應。

2.5測定在“卵白蛋白刺激”小鼠哮喘模型中發生效力所需要的小鼠IL-13中和水平。
為了標定治療哮喘所需要的IL-13自身疫苗的效力，在“卵白蛋白刺激/小鼠哮喘模型”中，在卵白蛋白刺激期間，用各種劑量的兔抗小鼠IL-13多克隆抗體治療小鼠(通過腹膜內注射被動施用)。在該實驗結束時測定模型參數，如呼吸道過敏反應(AHR)，杯狀細胞組織轉化(GCM)和肺炎性細胞含量。該模型中的效力與在小鼠血清中所獲得的小鼠IL-13中和水平相關。將小鼠IL-13中和生物測定方法用于測定血清樣品中小鼠IL-13中和水平。

治療組提供了最高的三種抗體劑量，所有治療都采用類似方式進行的。上述所有三個組都表現出等于(對于AHR而言)或好于(對于GCM而言)用于本模型的標準治療(地塞米松，通過腹膜內途徑以3×1.5mg/kg的劑量施用)的效力。施用抗體的“最低劑量”表現出介于地塞米松和‘非治療’正對照組之間的效力。
因此，在“中等劑量”治療組中所獲得的IL-13中和水平表示該動物模型所需要的IL-13自身疫苗的效力閾值。所述效力的閾值被定義為在哮喘模型中表現出100％效力(＝ED100)所需要的小鼠血清中IL-13中和的最低水平。因此，1×ED100等于1/476的ND50。
特定效力閾值的意義上面業已定義了在“卵白蛋白刺激”小鼠哮喘模型中有效所需要的IL-13中和水平。在小鼠C1-3和C5中由GST-cIL-13所誘導的IL-13中和水平超過了在所述哮喘模型中發生效力所需要的效力閾值。以上結果如圖11所示。
因此，預計GST-cIL-13疫苗能夠在小鼠哮喘模型中發生效力。
實施例3與各種佐劑組合的GST-cIL-13的免疫原性特征3.1免疫方案用GST-cIL-13作為免疫原，在Balb/c小鼠體內誘導抗小鼠IL-13的自身抗體的形成。給6-8周大的雌性小鼠注射一次存在于佐劑中的大約100μg蛋白。隨后進行4次加強免疫，每一次免疫包括存在于佐劑中的50μg蛋白(有關免疫原+佐劑制劑，參見下文)。每一個治療組包括5只動物，按照下面表格中的方案進行免疫。
在規定的時間點上通過對尾靜脈實施靜脈穿刺獲得血清樣品。在通過離心澄清之后，通過ELISA分析樣品中對小鼠IL-13的專一性IgG反應的存在。


3.2免疫原+佐劑制劑乳化佐劑AS03的制備將Tween 80溶解在磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)中，得到溶解在PBS中的2％的溶液。為了提供100毫升2倍濃度的乳液，將5克DLα生育酚和5毫克角鯊烯重復渦旋攪拌混合。添加90毫升PBS/Tween溶液，并且充分混合。然后使所得到的乳液通過一個注射器，并最后用M110S微流化機微流化。所得到的油狀液滴具有大約為180nm的粒度。
用1∶1的比例混合佐劑和蛋白溶液，短暫地螺旋攪拌(以中等速度混合10秒)，并且在室溫下在軌道搖床上培養10分鐘。進行短暫地渦旋攪拌，然后通過肌內途徑在兩個不同位點給每只小鼠注射和施用100μl總的懸浮液(即每只小鼠2×50μl，在每一個四頭肌上注射一次)，在每次免疫之前制備新的懸浮液。
明礬由SIGMA公司提供(產品目錄號A-1577)。用PBS制備2mg/ml的明礬懸浮液。以1∶1的比例混合佐劑和蛋白溶液，進行短暫地渦旋攪拌，并且在室溫下輕柔搖晃培養10分鐘。進行短暫地渦旋攪拌，然后通過腹膜內途徑給每只小鼠注射和施用100μl總的懸浮液，在每次免疫之前制備新的懸浮液。
CpG-ImmunEasy由Qiagen公司提供(產品目錄號303101)。通過輕柔地渦旋攪拌混合佐劑原液罐，然后以1∶1的比例混合佐劑和蛋白，通過用移液管輕柔地吸入和排出5次。在室溫下培養15分鐘。將移液管將所述混合物輕柔地吸入和排出5次，并且通過肌內途徑在兩個不同的部位給每只小鼠施用100μl懸浮液(即每只小鼠2×50μl，在每一個四頭肌上注射一次)，在每一次免疫之前制備新的懸浮液。
CFA/IFA
由SIGMA公司提供(產品目錄號F-5881，F-5506)。以1∶1的比例與預先混合的CFA配伍用于初次免疫，或者與IFA配伍用于加強免疫。渦旋混合樣品，以便確保產生含有CFA/IFA的均勻的白色懸浮液。在使用之前在冰上保存至少30分鐘，并且在施用之前充分渦旋攪拌。
3.3抗小鼠IL-13抗體反應通過抗小鼠IL-13抗體檢測ELISA，監測血清樣品中抗小鼠IL-13抗體反應。
在4℃下用溶解在碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中的抗小鼠IL-13單克隆抗體(產品目錄號MAB，R+D Systems)對96孔Maxisorp平板進行包衣過夜。然后在室溫下用3％BSA/TBST封閉平板1小時，用TBST洗滌3次，并且在室溫下與小鼠IL-13(產品目錄號413-ML-025，R+DSystems)一起培養1小時。在洗滌之后，在室溫下將所述平板與小鼠血清一起培養1小時，再次洗滌，并且與HRP綴合的抗小鼠IgG多克隆抗體(SIGMA，產品目錄號A-9309)一起培養。在再次洗滌之后，用鄰苯二胺二氫氯化物過氧化物酶底物對所述平板進行顯影30分鐘。
血清中的抗小鼠IL-13抗體的含量是以終點效價形式表示的。終點效價被定義為相當于ELISA背景讀數兩倍的血清稀釋度。

圖10表示對于稀釋度為1/100的血清樣品來說，在第125天，各治療組中抗小鼠IL-13抗體曲線。
用和CpG佐劑組合的GST-cIL-13免疫的所有5只小鼠，都產生了強的抗小鼠IL-13自身抗體反應。它與其他的佐劑不同，其中，抗體反應在每一個組中不太一致，實際上，某些小鼠產生非常弱的反應。
以上結果表明，CpG佐劑在產生一致的高效價抗小鼠IL-13自身抗體反應方面與實驗過的其他佐劑相比更為有效。
通過體外IL-13中和生物測定分析所述血清樣品的IL-13中和能力。
3.4 IL-13中和能力為了測定小鼠血清中和人TF-1細胞(ATCC產品目錄號CRL-2003)上的重組小鼠IL-13的生物活性的能力，將5ng/ml重組小鼠IL-13與各種濃度的血清一起在37℃下，在96孔組織培養平板(Gibco BRL)上培養1小時。在該預培養期之后，添加TF-1細胞。在37℃下，在潮濕的二氧化碳培養箱中，將含有各種血清稀釋度、重組小鼠IL-13和TF-1細胞的測試混合物培養70小時。在培養的最后4小時添加MTT底物(產品目錄號G4000，Promega)，然后用酸溶液溶解代謝的蘭色甲產物終止所述反應。在570nm波長下，在96孔平板讀數器上讀出每一個孔中溶液的吸收值。
應當指出的是，該測定方法只能測定大于或等于1/100的血清稀釋液中小鼠IL-13中和能力。低于1/100的血清稀釋度能在TF-1細胞中誘導非專一性增殖作用。
血清中和小鼠IL-13生物活性的能力被表達為將5ng/ml小鼠IL-13的生物活性中和50％(＝ND50)所需要的血清稀釋度。血清樣品越稀，其中和能力越強。
所測試過的小鼠D5血清的最高濃度為1/100的稀釋度。它不能將5ng/ml小鼠IL-13的生物活性稀釋50％，因此，ND50被表達為＜1/100稀釋度。


在第125天從用與CpG佐劑組合的GST-cIL-13免疫的所有5只小鼠體內采集的血清樣品，在體外生物測定中，都能有效中和小鼠IL-13的生物活性。相反，從小鼠D5(用存在于CFA/IFA中的GST-cIL-13免疫過的)中采集的第125天的血清樣品在測試過的所有稀釋度下都不能中和小鼠IL-13的生物活性。
以上結果表明，與其他測試過的佐劑相比，CpG佐劑在產生中和抗小鼠IL-13自身抗體反應方面更為有效。
序列表<110>葛蘭素集團有限公司<120>疫苗<130>PG4355<160>25<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>突變的表位<400>3Ala Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Ile Leu His Gly1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
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Asp Leu Leu Ser Tyr Thr Lys Gln Leu Phe Arg His Gly Pro Phe100 105 110<210>21<211>399<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于人的嵌合IL13<400>21atggcgcttt tgttgaccac ggtcattgct ctcacttgcc ttggcggctt tgcctcccca60ggccctgtgc ctccctctac agcccttaag gagcttattg aggagctgag caacatcacc120cagaaccaga aggctccgct ctgcaatggc agcatggttt ggagcatcaa cctgacagct180ggcatgttct gtgtagccct ggattccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatctac240aggacccaga ggatattgca tggcttctgc ccgcacaagg tctcagctgg gcagttttcc300agcttgcatg tccgagacac caaaatcgaa gtagcccact ttataacaaa actgctctta360catttaaaga aactttttcg cgagggacgg ttcaactga 399<210>22<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于人的嵌合IL13<400>22Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly1 5 10 15Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Lys Glu Leu20 25 30Ile Glu Glu Leu Ser Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys35 40 45Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Phe Cys50 55 60Val Ala Leu Asp Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Tyr65 70 75 80Arg Thr Gln Arg Ile Leu His Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala85 90 95Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala100 105 110
His Phe Ile Thr Lys Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu115 120 125Gly Arg Phe Asn130<210>23<211>396<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于鼠的嵌合IL13<400>23atggcgctct gggtgactgc agtcctggct cttgcttgcc ttggtggtct cgccgcccca60gggccggtgc caagatctgt gtctctccct gtgaccctta aggagcttat tgaggagctg120accaacatca cacaagacca gactcccctg tgcaacggca gcatggtatg gagtgtggac180ctggccgctg gcgggttctg tgtagccctg gattccctga ccaacatctc caattgcaat240gccatcttca ggacccagag gatattgcat gccctctgta accgcaaggc ccccactacg300gtctccagcc tccccgatac caaaatcgaa gtagcccact ttataacaaa actgctcacc360tacacaaaga acctgtttcg ccgcggcccc ttctaa 396<210>24<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于鼠的嵌合IL13<400>24Met Ala Leu Trp Val Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Gly1 5 10 15Leu Ala Ala Pro Gly Pro Val Pro Arg Ser Val Ser Leu Pro Val Thr20 25 30Leu Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu Thr Asn Ile Thr Gln Asp Gln Thr35 40 45Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly50 55 60Gly Phe Cys Val Ala Leu Asp Ser Leu Thr Asn Ile Ser Asn Cys Asn65 70 75 80Ala Ile Phe Arg Thr Gln Arg Ile Leu His Ala Leu Cys Asn Arg Lys85 90 95
Ala Pro Thr Thr Val Ser Ser Leu Pro Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala100 105 110His Phe Ile Thr Lys Leu Leu Thr Tyr Thr Lys Asn Leu Phe Arg Arg115 120 125Gly Pro Phe130<210>25<211>150<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>用于人的嵌合IL13<400>25Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala1 5 10 15Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Lys Asn His Leu20 25 30Arg Glu Ile Ile Gly Ile Leu Asn Glu Val Thr Gly Glu Lys Thr Leu35 40 45Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr50 55 60Thr Glu Ser Glu Leu Val Cys Arg Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Phe65 70 75 80Tyr Leu Lys His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Lys85 90 95Asn Ser Ser Val Leu Met Glu Leu Gln Arg Leu Phe Arg Ala Phe Arg100 105 110Cys Leu Asp Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser115 120 125Ser Leu Lys Asp Phe Leu Glu Ser Leu Lys Ser Ile Met Gln Met Asp130 135 140Tyr Ser Lys Cys Ser Ser145 150
權利要求
1.一種與人類蛋白具有至少30％，但不低于100％的相同性的分離的蛋白，所述多肽(a)包括至少一種突變，該突變是類似的非人類蛋白所特有的；和(b)能夠在人體內產生抗體；(c)在結構上與所述人類蛋白足夠相似，使得所述抗體能結合所述人類蛋白和所述多肽；并且其中，所述多肽不是抗體。
2.一種蛋白，具有來自哺乳動物自身抗原的B細胞表位和來自另一種哺乳動物的能產生類似蛋白的序列的突變，使得所述蛋白能夠在產生所述B-細胞表位的物種中產生能識別產生所述B-細胞表位的天然蛋白的免疫反應。
3.一種具有自身蛋白的B細胞表位的蛋白，它通過替換而移植到另一種哺乳動物的類似蛋白的構架上，使得所述蛋白能夠在產生所述B細胞表位的物種中產生能識別產生所述B-細胞表位的天然蛋白的免疫反應。
4.如權利要求1-3中任意一項的蛋白，包括導入非表面暴露區的保守的表面區，所述突變能產生類似蛋白的序列，使得所述蛋白能在產生所述自身蛋白的物種中產生針對自身蛋白的免疫反應。
5.如權利要求1-4中任意一項的蛋白，其中所述免疫反應是中和抗體反應。
6.如權利要求1-5中任意一項的蛋白，其中所述人類蛋白或B-細胞表位來自細胞因子。
7.如權利要求6的細胞因子，它是4螺旋細胞因子。
8.如權利要求7的細胞因子，它是IL-4或IL-13。
9.一種突變的人IL-13，它具有一個或多個下列取代或與其保守性取代相關的取代第30位R→K第37位V→S第63位Y→F第65位A→V第68位E→D第80位E→Y第81位K→R第85位M→I第87位G→H第113位Q→H第115位V→I第117位D→K。
10.如權利要求9的突變的人IL-13，它具有多個權利要求9中所給出的取代。
11.如權利要求9或10中任意一項的突變的人IL-13，它具有下列序列中的一種或多種L K E L I E E L S NF C V A L D S LA I Y R T Q R I L H GK I E V A H F I T K L L或所述序列的包括一種或多種保守性取代的變體。
12.如圖9所示的突變的人IL-13。
13.一種編碼權利要求1-12的蛋白的多核苷酸。
14.如權利要求13的多核苷酸，它是DNA，并且可操作地與啟動子連接。
15.一種載體，包括權利要求13或14的多核苷酸。
16.一種用權利要求13或14的多核苷酸或權利要求15的載體轉化的宿主。
17.一種藥用組合物，包括權利要求1-15中任意一項的蛋白、多核苷酸、載體，和可以藥用的載體或賦形劑。
18.如權利要求17的藥用組合物，還包括佐劑。
19.如權利要求18的藥用組合物，包括權利要求1-12中任意一項的蛋白和免疫刺激寡核苷酸。
20.如權利要求19的藥用組合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸選自OLIGO 1(SEQ ID NO1)TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)OLIGO 2(SEQ ID NO2)TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)OLIGO 3(SEQ ID NO3)ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGCACC ACGOLIGO 4(SEQ ID NO4)TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG2006)OLIGO 5(SEQ ID NO5)TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG1668)。
21.權利要求1-20中任意一項的蛋白、多核苷酸、載體、宿主或組合物，用于醫學目的。
22.權利要求1-12中任意一項的蛋白在制備用于治療IL-13介導的疾病的藥品中的用途。
23.如權利要求22的用途，其用于治療哮喘。
24.一種治療或預防IL-13介導的疾病的方法，包括給需要治療或預防的患者施用安全有效量的權利要求17-20中任意一項的組合物。
25.一種用于制備權利要求1-12中任意一項的蛋白的方法，該方法包括(1)鑒定需要針對它的抗體反應的自身蛋白，通常是人類自身蛋白的一個或多個區。(2)鑒定所述自身蛋白的氨基酸序列。(3)鑒定類似蛋白的氨基酸序列，通過重組DNA技術構建包含在步驟1中鑒定的至少一個目標區的嵌合分子，其氨基酸序列來自在步驟2中所鑒定的序列，和來自在步驟3中鑒定的序列的足夠的氨基酸，使得所得到的蛋白能夠折疊成類似于所述自身蛋白的形狀，這樣，突變蛋白能產生識別所述自身蛋白的免疫反應。
全文摘要
本發明涉及一種可用于對自身抗原免疫的分離的多肽。具體地講，本發明涉及一種自身蛋白，在體內施用時，該蛋白能夠產生自身抗體。本發明特別涉及使人類細胞因子在人體內具有免疫原性。本發明還涉及含有所述化合物的藥用組合物，及其在藥物中的用途，并且涉及其生產方法。
文檔編號C07K19/00GK1543504SQ02809324
公開日2004年11月3日 申請日期2002年3月1日 優先權日2001年3月3日
發明者C·阿斯曼, J·S·克羅維, J·H·埃利斯, A·P·路易斯, C 阿斯曼, 克羅維, 埃利斯, 路易斯 申請人:葛蘭素集團有限公司