專利名稱：一種超分辨微分干涉相襯顯微成像系統及顯微成像方法
技術領域：
本發明涉及顯微成像技術領域，特別涉及一種基于結構光照明的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統及成像方法。
背景技術：
基于結構光照明的超分辨顯微成像系統能夠提高顯微成像的分辨率，現有技術中，主要包括兩種成像系統。第一種是將結構光照明應用于熒光顯微成像的成像系統，它具有較好的對比度，但是，其存在的主要問題如下1)要進行熒光成像，就需要對所觀察的樣品進行熒光標記，故需要額外的樣品制備過程；2)在上述樣品制備過程中，需要將染料或熒光團等物質增加到樣品中，因而可能會引入一些副效應，如光漂白效應和光毒性效應。第二種是基于結構光照明的散射光成像系統，它無需對樣品進行熒光標記，但是，它的成像對比度低，往往需要采用金納米顆粒輔助成像，或者，需要具有一定對比度的樣品來實現高對比度的成像，導致它的適用性較差，例如，在對沒有任何處理的生物樣品成像時，由于它的成像對比度低，所以無法適用。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提出了一種無需額外的樣品制備過程，無光漂白效應和光毒性等副效應，且成像對比度高的基于結構光照明的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統及成像方法。本發明提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統包括包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡，所述成像系統還包括光源、第I透鏡、第I反射鏡、空間光調制器、第III透鏡、擋光板、第IV透鏡和CXD，所述空間光調制器的入射角度< 10°，所述空間光調制器每個方向具有三個相位，所述擋光板用于阻擋O級光而允許+1級光和-1級光通過或者阻擋+1級光和-1級光而允許O級光通過，由所述光源發射的光依次經過第I透鏡、第I反射鏡、空間光調制器、第III透鏡、擋光板、第IV透鏡后經過所述包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡后，圖像由所述CXD接收。本發明提供的所述的成像系統的顯微成像方法包括以下步驟步驟S1:對采集到的原始圖像進行圖像亮度均一化處理以消除由于光源強度波動引起的成像亮度的影響；步驟S2 :對圖像邊緣進行輕微切趾，使得由離散傅里葉變換產生邊緣偽像最少；步驟S3 :對圖像進行傅里葉變換操作，獲得相應的頻譜信息；步驟S4 :由各方向的三個相位圖像對應頻譜信息，求解3X3的線性方程組，分離出O級，+1級和-1級頻譜成像信息；步驟S5 由分離出O級與+1級或-1級頻譜的重疊區域的信息確定結構光照明的空間頻率kQ與初始相位Φ ；步驟S6 :將分離出的+1級頻譜平移+Iv將分離出的和-1級頻譜平移-1itl ；步驟S7 :將平移后的+1級和-1級頻譜與O級頻譜疊加合成，并做維納濾波，使得其頻譜擴寬；
步驟S8 :對步驟S7得到的擴寬的頻譜做傅里葉反變換，獲得超分辨的微分干涉相襯圖像。本發明提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統及成像方法無需額外的樣品制備過程，無光漂白效應和光毒性等副效應，且成像對比度高。


圖1為本發明實施例一提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統的原理圖；圖2為本發明實施例二提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統的原理圖；圖3為本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統在光照方向為90°、相位為O時的空間光調制器的控制圖像；圖4為本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統在光照方向為90°、相位為$時的空間光調制器的控制圖像；圖5為本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統在光照方向為
Αητ
90°、相位為+時的空間光調制器的控制圖像；圖6為本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統在光照方向為0°、相位為O時的空間光調制器的控制圖像；圖7為本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統在光照方向為0°、相位為f時的空間光調制器的控制圖像；圖8為本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統在光照方向為0°、相位為*時的空間光調制器的控制圖像；圖9a為本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統對53nm聚苯乙烯小球樣品成像的頻譜圖像；圖9b為本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統對53nm聚苯乙烯小球樣品成像的效果圖像；圖9c為本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統對53nm聚苯乙烯小球樣品成像后，對單個小球的強度分布做高斯擬合得到的曲線圖；圖9d為傳統的微分干涉相襯顯微成像系統對53nm聚苯乙烯小球樣品成像的頻譜圖像；圖9e為傳統的微分干涉相襯顯微成像系統對53nm聚苯乙烯小球樣品成像的效果圖像；
圖9f為傳統的微分干涉相襯顯微成像系統對53nm聚苯乙烯小球樣品成像后，對單個小球的強度分布做高斯擬合得到的曲線圖。
具體實施例方式為了深入了解本發明，下面結合附圖及具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例一參見附圖1，本發明實施例一提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統包括包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡14，包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡14包括依次設
置的第V透鏡15、第II反射鏡16、偏振片17、|波片18、第I棱鏡19、聚光鏡20、樣品臺21、 4
物鏡22、第II棱鏡23、分析片24、筒鏡25。該成像系統還包括光源1、第I透鏡2、第I反射鏡5、空間光調制器7、第III透鏡8、擋光板9、第IV透鏡13和(XD。空間光調制器7的入射角度< 10°，空間光調制器7每個方向具有三個相位，擋光板9用于阻擋O級光10而允許+1級光11和-1級光12通過或者阻擋+1級光11和-1級光12而允許O級光10通過。由光源I發射的光依次經過第I透鏡2、第I反射鏡5、空間光調制器7、第III透鏡8、擋光板9、第IV透鏡13后經過包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡14后，圖像由CXD接收。實施例二參見附圖2，本發明實施例二提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統與本發明實施例一提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統的區別僅在于，于第I透鏡2和第I反射鏡5之間還依次設置有第I光闌3和第II透鏡4，第I反射鏡5和空間光調制器7之間還設置有第II光闌6。由光源I發射的光依次經過第I透鏡2、第I光闌3、第II透鏡4、第I反射鏡5、第II光闌6、空間光調制器7、第III透鏡8、擋光板9、第IV透鏡13后經過包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡14后，圖像由CXD接收。從而提高光源I的有效利用強度。其中，作為光源I的一種具體的實現方式，光源I可以為LED光源。其中，作為空間光調制器7的一種具體的實現方式，空間光調制器7的照明方向包括90° (其三個相位的控制圖像分別如圖3 5所示)和0° (其三個相位的圖像分別如圖6 8所示)。本發明提供的成像系統的顯微成像方法包括以下步驟步驟S1:對采集到的原始圖像進行圖像亮度均一化處理以消除由于光源強度波動引起的成像亮度的影響。步驟S2 :對圖像邊緣進行輕微切趾，使得由離散傅里葉變換產生邊緣偽像最少。步驟S3 :對圖像進行傅里葉變換操作，獲得相應的頻譜信息。步驟S4 :由各方向的三個相位圖像對應頻譜信息，求解3X3的線性方程組，分離出O級，+1級和-1級頻譜成像信息。步驟S5 由分離出O級與+1級或-1級頻譜的重疊區域的信息確定結構光照明的空間頻率kQ與初始相位Φ。步驟S6 :將分離出的+1級頻譜平移+Iv將分離出的和-1級頻譜平移-1v步驟S7 :將平移后的+1級和-1級頻譜與O級頻譜疊加合成，并做維納濾波，使得其頻譜擴寬。
步驟S8 :對步驟S7得到的擴寬的頻譜做傅里葉反變換，獲得超分辨的微分干涉相襯圖像。為了測試本發明提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統及顯微成像方法得到的圖像分辨率的提高，圖9a 9f顯示了 53nm聚苯乙烯小球樣品結構光照明超分辨微分干涉相襯和傳統微分干涉相襯顯微成像同一視場的圖像。其中，傳統微分干涉相襯成像是通過使用上述提到的O級光作為均勻照明光源獲得的。本發明提供實施例提供的超分辨微分干涉相襯成像明顯地擴大了相干傳遞函數(見圖9a和圖9d)，因此相應的頻譜也擴寬了。因此本發明提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統及顯微成像方法得到的圖像顯示了更優的分辨率。在傳統微分干涉相襯成像中無法分辨開的靠的很近的兩個小球，在本發明提供的超分辨微分干涉相襯成像中可以很容易分辨為兩個小球(見圖％和9e中白線框所框出的部分)。為了定量表明分辨率的提高，圖9c和9f顯示了本發明提供的超分辨微分干涉相襯成像與傳統微分干涉相襯成像沿圖％和9e中白虛線框所框出的部分單個小球的強度分布，并做高斯擬合。擬合結果顯示本發明提供的超分辨微分干涉相襯成像的半高全寬為190± 18nm,而傳統微分干涉相襯成像的半高全寬為380±17nm。故本發明提供的超分辨微分干涉相襯成像分辨率突破了衍射極限，約為傳統微分干涉相襯成像衍射極限的兩倍。本發明實施例提供的超分辨微分干涉相襯顯微成像系統及成像方法避免了結構光照明熒光顯微超分辨成像中樣品制備過程及可能由樣品制備帶來光漂白和光毒性等副效應，同時解決了結構光照明散射光成像低成像對比度的問題，從而實現了對沒經過任何處理的生物樣品進行高對比度的超分辨成像。以上所述的具體實施方式
，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施方式
而已，并不用于限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種超分辨微分干涉相襯顯微成像系統，包括包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡，其特征在于，還包括光源、第I透鏡、第I反射鏡、空間光調制器、第III透鏡、擋光板、第IV透鏡和CCD，所述空間光調制器的入射角度< 10°，所述空間光調制器每個方向具有三個相位， 所述擋光板用于阻擋O級光而允許+1級光和-1級光通過或者阻擋+1級光和-1級光而允許O級光通過，由所述光源發射的光依次經過第I透鏡、第I反射鏡、空間光調制器、第III透鏡、擋光板、第IV透鏡后經過所述包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡后，圖像由所述CXD接收。
2.根據權利要求1所述的成像系統，其特征在于，所述第I透鏡和第I反射鏡之間還依次設置有第I光闌和第II透鏡，由所述光源發射的光依次經過第I透鏡、第I光闌、第II透鏡、第I反射鏡、空間光調制器、第III透鏡、擋光板、第IV透鏡后經過所述包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡后，圖像由所述C⑶接收。
3.根據權利要求2所述的成像系統，其特征在于，所述第I反射鏡和空間光調制器之間還設置有第II光闌，由所述光源發射的光依次經過第I透鏡、第I光闌、第II透鏡、第I反射鏡、第II光闌、 空間光調制器、第III透鏡、擋光板、第IV透鏡后經過所述包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡后，圖像由所述CCD接收。
4.根據權利要求1 3中任一所述的成像系統，其特征在于，所述光源為LED光源。
5.根據權利要求1 3中任一所述的成像系統，其特征在于，所述空間光調制器的照明方向包括90°和0°。
6.基于權利要求1 5中任一所述的成像系統的顯微成像方法包括以下步驟步驟S1:對采集到的原始圖像進行圖像亮度均一化處理以消除由于光源強度波動引起的成像亮度的影響；步驟S2 :對圖像邊緣進行輕微切趾，使得由離散傅里葉變換產生邊緣偽像最少；步驟S3 :對圖像進行傅里葉變換操作，獲得相應的頻譜信息；步驟S4 :由各方向的三個相位圖像對應頻譜信息，求解3X3的線性方程組，分離出O 級，+1級和_1級頻譜成像信息；步驟S5 :由分離出O級與+1級或-1級頻譜的重疊區域的信息確定結構光照明的空間頻率kQ與初始相位Φ ；步驟S6 :將分離出的+1級頻譜平移+1 ，將分離出的和-1級頻譜平移-1 ；步驟S7 :將平移后的+1級和-1級頻譜與O級頻譜疊加合成，并做維納濾波，使得其頻譜擴寬；步驟S8 :對步驟S7得到的擴寬的頻譜做傅里葉反變換，獲得超分辨的微分干涉相襯圖
全文摘要
本發明公開了一種超分辨微分干涉相襯顯微成像系統，包括包含微分干涉相襯成像模塊的顯微鏡，還包括光源、第Ⅰ透鏡、第Ⅰ反射鏡、空間光調制器、第Ⅲ透鏡、擋光板、第Ⅳ透鏡和CCD。同時，本發明還公開了基于該成像系統的顯微成像方法。該成像系統及成像方法無需額外的樣品制備過程，無光漂白效應和光毒性效應，且成像對比度高。
文檔編號G02B21/36GK102998789SQ20121059317
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者曾紹群, 陳建玲, 呂曉華 申請人:華中科技大學