黑曲霉全細胞催化降解造紙白水中聚半乳糖醛酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及全細胞催化技術領域，具體涉及一種用黑曲霉全細胞生物催化降解造紙白水中的聚半乳糖醛酸的方法及應用條件的優化。
【背景技術】
[0002]紙廠一直都是用水和污水排放大戶，從環境和生產成本方面考慮，都要求紙廠白水系統封閉循環，減少清水的使用和廢水排放。但隨著白水封閉循環程度的提高和白水循環次數的增加，白水中的有害物質也逐漸積累，以致影響紙機效率和成紙質量。研究表明，白水中的有害物質主要是溶解和膠體物質(簡稱DCS)。這些物質帶有很高的負電性，會降低陽離子助劑的效率，并且樹脂成分往往會聚集污染造紙網、毛毯、烘缸、壓光輥、使紙面產生孔洞、斑點等紙病，引起斷紙、濾水性能降低、漿料腐爛、泡沫產生到生產設備的腐蝕和結垢，引起生產效率下降以及成紙質量差等。
[0003]因此，必須尋找一種經濟高效去除這些溶解與膠體物質的有效方法。果膠分子是羧基完全游離的多聚半乳糖醛酸長鏈，大量存在于植物的細胞壁與細胞液中，是一種較強的有機酸，在水中容易發生電離作用而帶有大量負電荷。隨著制漿技術的快速發展，高得率漿(HYP)不僅生產成本低，而且具有較好的漿料性能，因而得到了廣泛的應用。但HYP含有較高含量的果膠類物質，果膠在堿性H2O2漂白中發生脫甲基反應使其酯化的羧基游離出來，此類物質的積累容易對紙機的濕部造成嚴重的影響，是DCS的主要組分之一。
[0004]全細胞催化是指利用完整的生物有機體(即全細胞、組織甚至個體)作為催化劑進行化學轉化，其本質是利用細胞內的酶進行催化全細胞催化是指利用完整的生物有機體(即全細胞、組織甚至個體)作為催化劑進行化學轉化，其本質是利用細胞內的酶進行催化。全細胞催化是介于發酵法和提取酶催化法之間的一種生物催化技術。相比發酵法，全細胞催化克服了發酵法生產周期長、代謝產物復雜、底物轉化率低、產物分離提取困難及能耗高等缺點。相比提取酶的催化反應，全細胞中各酶系保持原有生活細胞所處的狀態和特定位置，酶穩定性更好，半衰期更長，適應性更強，更易實現能量和輔酶的原位再生；細胞內完整的多酶體系可以實現酶的級聯反應，從而彌補酶法催化中級聯催化過程不易實現的不足，提高了催化效率，同時，又省去了繁瑣的酶純化過程，制備更加簡單，生產成本更低。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是為了解決上述現有技術存在的不足，提供一種環境友好、生產成本低、酶穩定性更好、半衰期更長、適應性更強的黑曲霉全細胞生物催化降解造紙白水果膠類物質(主要是聚半乳糖醛酸)的新方法。
[0006]本發明的目的通過如下技術方案實現:
黑曲霉全細胞生物催化降解聚半乳糖醛酸的方法，其包括如下步驟:
(I)在斜面培養基內(PDA)，接種一環黑曲霉種子，30~50 °C培養48~120 h后，用無菌水水洗，收集得到活化的黑曲霉； (2)得到活化黑曲霉后發酵擴大培養，最適培養基的配制:加入麩皮1%~10%(以下均是基于蒸餾水的質量)，果膠0.1%~0.5%，(NH4)2SO4固體1%~4%，K 2ΗΡ04固體0.06%~0.12%，KCl 固體 0.03%~0.08%，MgSO4.7H20 0.03%~0.08%，Na2SO4 0.03%~0.08%，FeSO4.7H200.000001%~0.000003%，溶于裝有蒸餾水的錐形瓶中作為發酵培養基；
(3)調節發酵培養基pH為6.0-8.0，接種占蒸餾水重量的3~5%活化黑曲霉，視工藝要求的不同，在30~50°C條件下150~300 r/min振蕩培養5~10 d后，用濾網過濾發酵液后，收集的黑曲霉冷凍干燥10~24 h，即可得到黑曲霉全細胞催化劑(以下稱黑曲霉全細胞)；
(4)用得到的黑曲霉全細胞催化劑處理造紙白水中果膠類物質的模型物，過濾后測定濾液所需的陽離子需求量。
[0007]進一步地，步驟(4)中用3，5- 二硝基水楊酸比色法(DNS法)測定并對比黑曲霉產生果膠酶活性和商品堿性果膠酶活性。在甲、乙兩只25 ml比色管中分別加入5 g/L果膠底物5 ml ο并置于50 °C水浴中預熱5 min后，分別加入5 mL pH為8的磷酸緩沖；再向甲管中加入0.065 g黑曲霉、乙管中加入0.065 g商品堿性果膠酶，立即搖勾，并置于50 °〇水浴中準確反應30 min;最后將甲、乙兩管立即置于沸水浴中煮沸5 min，終止反應，冷卻后分別用DNS法測定酶活性；
利用0.1 mo I/L NaOH溶液溶解聚半乳糖醛酸(PGA)配制成0.5-1.0 g/L的PGA溶液，用稀鹽酸調節溶液至pH為6.0-8.0 ；
黑曲霉在不同條件下處理PGA溶液，過濾反應液后，測定濾液所需的陽離子需求量(CD值)并優化反應條件。
[0008]上述黑曲霉全細胞生物催化降解聚半乳糖醛酸的方法中，果膠酶來源于黑曲霉發酵培養，發酵液中及黑曲霉細胞內和細胞外壁。
[0009]上述黑曲霉全細胞生物催化降解聚半乳糖醛酸的方法中，用聚半乳糖醛酸(PGA)作為造紙白水中果膠類物質的模型物。
[0010]上述黑曲霉生物全細胞催化降解聚半乳糖醛酸的方法中，黑曲霉酶活性測定為119.67 U/g,商品堿性果膠酶酶活性32.5 U/g。相同條件下黑曲霉酶活性大于商品堿性果膠酶酶活性。
[0011]上述曲霉生物催化分解聚半乳糖醛酸的方法中，反應最優條件為黑曲霉用量0.25-2.0 g，反應溫度 40~60 °C，反應時間 10-120 min。
[0012]與現有的技術相比，本發明具有如下的優點:
(I)全細胞催化克服了發酵法生產周期長、代謝產物復雜、底物轉化率低、產物分離提取困難及能耗高等缺點。
[0013](2)全細胞催化中各酶系保持原有生活細胞所處的狀態和特定位置，酶穩定性更好、半衰期更長、適應性更強、更易實現能量和輔酶的原位再生。
[0014](3)細胞內完整的多酶體系可以實現酶的級聯反應，彌補酶法催化中級聯催化過程不易實現的不足，提高了催化效率，又省去了繁瑣的酶純化過程，制備更加簡單，生產成本更低。
[0015](4)與傳統的采用陰離子垃圾捕集劑和絮凝劑去除白水DCS破壞白水原有平衡相比，黑曲霉能較好催化降解白水中的果膠類物質，徹底去除白水中的陰離子垃圾，不會破壞白水中原有的電荷平衡，最終處理效果較好。
[0016](5)反應條件溫和，催化效率高，環境友好等優點。
【具體實施方式】
[0017]為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，但本發明要求保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。
[0018]實施例1
在 100 mL 蒸饋水中加入麩皮 1.0g、商品果膠(pectin, from citrus fruits) 0.3 g、(MM)2SO4固體 2.0 g、K2HP04固體 0.I g、KCl 固體 0.05 g、MgS04.7Η20 0.05 g^Na2SO4 0.05g,FeSO4.7Η200.0001 g，調節pH為6.0，形成擴大培養基，接入4 ml濃度為I X 10s/L黑曲霉(Aspergillus niger GIM3.462購自中國科學院微生物研究所)孢子懸浮液，在30 °C，180 r/min的搖床上培養5 d后離心收集黑曲霉，并冷凍干燥24 h制成全細胞催化劑；用3，5- 二硝基水楊酸比色法(DNS法)測定并對比黑曲霉產生果膠酶活性和商品堿性果膠酶活性；在甲、乙兩只25 ml比色管中分別加入5 g/L果膠底物5 ml ;并置于50 °(:水浴中預熱5 min后，分別加入5 mL pH為8的磷酸緩沖液；再向甲管中加入0.065 g黑曲霉、乙管中加入0.065 g商品堿性果膠酶，立即搖勾，并置于50 °C水浴中反應30 min;最后將甲、乙兩管立即置于沸水浴中煮沸5 min，終止反應，冷卻后分別用DNS法測定酶活性；利用0.1mo I/L NaOH溶液溶解聚半乳糖醛酸(PGA)配制成I g/L的PGA溶液，用稀鹽酸調節溶液至pH為7.0 ;把50 mL pH為7.0的PGA (I g/L)溶液和2.0 g黑曲霉全細胞催化劑放入錐形瓶中，置于60 °C水浴恒溫箱中反應10 min后，用無菌過濾器過濾后取濾液測量陽離子需求量(⑶)，測得⑶值為0.77。
[0019]實施例2
在 100 mL 蒸饋水中加入麩皮 2.0g、商品果膠(pectin, from citrus fruits) 0.2 g、(NH4)2SO4固體 2.0 g、K2HP04固體 0.I g、KCl 固體 0.05 g、MgS04.7H20 0.05 g、Na2SO4 0.0