一種可吸收抗菌止血微球、制備方法及其應用
【專利摘要】本發明涉及一種可吸收抗菌止血微球及其可吸收抗菌止血微球的制備方法和應用。可吸收抗菌止血微球包括羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶，對大出血創面快速止血，防止創面細菌感染；生物相容性好，可降解吸收，促進傷口愈合。本發明還公開了上述復合抗菌可吸收止血微球在用于新西蘭兔肝臟半切除止血應用的效果。
【專利說明】
一種可吸收抗菌止血微球、制備方法及其應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種可吸收抗菌止血微球及其可吸收抗菌止血微球的制備方法。
[0002] 發明背景 止血敷料在止血劑中種類最多，應用最為廣泛。其中以干纖維蛋白敷料、沸石敷料、殼 聚糖類敷料等特別具有代表性。
[0003] 干纖維蛋白敷料主要將纖維蛋白和凝血酶加入紗布中制成，改善標準紗布的止血 效果。止血機理是為凝血反應提供外源性底物。材料成分可吸收，止血效果穩定，但造價不 斐，價格在500-1000美元。成份來源、材料本身脆弱性、微生物滅活技術問題和高昂的價格， 限制了該類敷料的應用。
[0004] 沸石敷料主要由內含氧化硅、氧化鋁、氧化鎂、氧化鈉等礦物的分子篩粉末制成， 通過吸收創傷處水分從而提高局部凝血因子、血小板、紅細胞濃度從而促進止血，代表性產 品是QuikClot。優點是效果明顯、穩定、價格低廉，缺點是不適合高壓止血，且發揮止血作用 時會放出熱量，從而造成組織灼傷。
[0005] 殼聚糖類止血敷料目前在敷料市場占據主導地位，其產品止血效果好。其止血機 制是促進血管收縮、激活血紅細胞中的凝血因子、促進血小板聚集到受傷部位從而啟動人 體凝血機制，其止血速度快于纖維蛋白膠。
[0006] 近年國內外研制的止血劑或止血敷料很多，其中也不乏含抗菌性能的止血敷料， 但是大部分產品是利用材料進行抗生素類藥物的載藥復合或是復合抗菌作用的金，銀，碘 等抗菌粒子。然而，抗生素類藥物的復合雖然可以減少口服或注射抗生素的用量，卻不可避 免抗生素長久使用的耐藥性問題;更重要的是以銀、碘等抗菌粒子復合的止血敷料，不可被 人體吸收和降解，僅限于體表皮膚的使用，不適合作為體內使用的止血敷料，從而無法滿足 許多重要臨床手術和醫用急救的特殊止血處理。
[0007] 中國專利201410384076.9公開了一種抗菌促愈合活性的復合止血粉及其制備方 法，涉及一種以埃洛石納米管負載溶菌酶并且復合了殼聚糖的止血粉劑材料。該種材料希 望利用埃洛石和殼聚糖發揮無機、有機材料各自優點起到止血殺菌作用，但正如其所述埃 洛石納米管作為無機材料，主要成分為氧化硅、氧化鋁以及少量其他金屬氧化物，該類成分 在體內很難被降解吸收，也不能被溶菌酶水解從而發揮協同作用，因此不宜作為止血粉劑 用于體內止血。
[0008] 因此，本發明希望通過研制一種復合抗菌止血劑，且止血劑可用于體內并能快速 降解吸收。本發明采用一種羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠、溶菌酶為原料的復合抗菌止血 材料，利用溶菌酶的水解酶特點，既起到抗菌、止血作用同時在止血后的體液環境下，降解 羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉和明膠這些止血抗菌有效成分，利用羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉均 為聚多糖可被水解的性質，以及明膠為氨基酸肽鏈也可被水解的性質，從而起到止血材料 在體內可快速降解吸收的效果。

【發明內容】

[0009] 本發明的一個目的在于提供一種理想的復合抗菌可吸收止血粉劑材料:包括羧甲 基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶，對大出血創面快速止血，防止創面細菌感染;生物相容 性好，可降解吸收，促進傷口愈合。
[0010] 優選地，所述的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為：1~5:0.1~1: 0.005~0.05:0.005~0.1 〇
[0011] 進一步優選，所述的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為：1~5:0.1 ~I:0.005~0.05:0.01~0.02。
[0012] 特別優選，所述的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為：1.5:0.5: 0.025:0.01~0.02。
[0013] 最優選，所述的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為：1.5 :0.5: 0.025:0.01-0.02 本發明的另一個目的在于提供一種復合溶菌酶止血微球的制備方法。
[0014] 本發明提供的各種復合抗菌止血微球，由如下方法制得： (1) 制備基質溶液:稱取一定質量單位比的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠(1~5:0.1~1: 0.005~0.05)，加入10~100倍的蒸餾水，在水浴中加熱至凝膠狀水溶液； (2) 混合:將制備的基質溶液加入到含分散劑的乳化劑中，強力攪拌，分散劑與基質溶 液的體積比或質量比，ml/ml或g/g，為0.1~3.0: 1，乳化劑與基質溶液的體積比或質量比， ml/ml或g/g，為0.01~0.30: 1; (3) 乳化交聯共聚：加入交聯劑，交聯劑與基質液的體積比或質量比，ml/ml或g/g，為 0.05~1.0: 1;反應時間為1~12小時，反應完畢后，停止攪拌，出料； (4) 粗制:料液分層后，傾出油相，加入洗滌劑，反復洗滌;最后抽濾。
[0015] (5)干燥:將過濾后的微球粗樣中加入稀釋液，微球粗樣與稀釋液的質量體積比或 質量比，g/ml或g/g，為1:10~200。將濕樣通過離心噴霧干燥和真空干燥。
[0016] (6)共混:溶菌酶干粉與微球共混合，加入溶菌酶的質量為/g，羧甲基殼聚糖、海藻 酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為g/g: 1~5:0.1~1:0.005~0.05:0.005~0.1，密封包裝，無菌處 理。
[0017] 進一步優選，所述的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為g/g:l~5: 0.1-1:0.005-0.05:0.01-0.02〇
[0018] 特別優選，所述的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為g/g: 1.5: 0.5:0.025:0.01~0.02。
[0019] 最優選，所述的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為g/g: 1.5:0.5: 0.025:0.01~0.02。
[0020] 上述本發明提供的復合抗菌可吸收止血微球所用的分散劑優選如下:不僅限于液 體石蠟、大豆油、乙酸乙酯、乙醇、蓖麻油、甘油酯脂肪酸等，可以單獨或混合適用于本發明。
[0021] 上述本發明提供的復合抗菌可吸收止血微球所用的乳化劑優選如下:不僅限于司 班系列和吐溫系列等，可以單獨或混合適用于本發明。
[0022] 上述本發明提供的復合抗菌可吸收止血微球所用的交聯劑優選如下:不僅限于甲 醛、環氧氯丙烷、氯化鈣、戊二醛、三氯氧磷、三偏磷酸鈉等，可以單獨或混合適用于本發明。 [0023]上述本發明的復合抗菌可吸收止血微球，所述的洗滌劑優選為蒸餾水、乙酸乙酯、 乙醇、丙酮、甲醇和石油醚中的一種以上。
[0024]上述本發明的復合抗菌可吸收止血微球，所述的稀釋劑優選為蒸餾水、乙酸乙酯、 乙醇、丙酮、甲醇和石油醚等，可以單獨或混合適用于本發明。
[0025] 上述步驟(5)中微球干燥完成后，體積平均粒徑5-100 μπι。
[0026] 上述步驟(6)中共混通過鼓風氣流共混。
[0027] 本發明還公開了上述復合抗菌可吸收止血微球在用于新西蘭兔肝臟半切除止血 應用的效果。
[0028]本發明的作用機理為:可吸收抗菌止血微球是一種干燥、無菌、具有微米和納米孔 徑、球狀的微粒，添加易降解的溶菌酶作為抗菌成分，具有極強的吸水性能，通過濃縮血液 的固形成分，提高血小板聚集、粘附，從而激活血小板發揮凝血作用，并激發纖維蛋白原形 成蛋白纖維，加快了蛋白網形成止血塞的過程和穩定性。體外降解實驗表明，材料的降解迅 速，在24小時內即完成降解。材料的抑菌實驗表明，材料的抑菌效果明顯;進行的動物實驗 表明，其止血迅速。
[0029] 本發明可吸收抗菌止血微球具有以下有益效果：1.止血時間短:一般1-2分鐘完成 止血;2.利用溶菌酶水解酶的特點，羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉以及明膠可被水解的性質，止 血材料降解速度快;3.有效抑菌，防止傷口感染;4.使用方便:將止血粉噴灑于創面出血處 即可;5.易儲存，保存時間長。因此，復合抗菌可吸收止血微球將是一種理想的外科止血劑。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液；2、物料混合：250 ml液體石蠟與18 ml吐溫80混合，加入基質溶 液，以及2% w/w氯化媽10 ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分 層后，傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3 次。抽濾，加入30 ml蒸餾水稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球。在微球中加入溶 菌酶0.01 g，鼓風氣流共混，真空干燥、無菌處理后密封包裝。
[0031] 實施例2 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液;2、物料混合:100 g脂肪酸與18 ml吐溫80混合，加入基質溶液，以 及2% w/w氯化鈣10 ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分層后， 傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3次。抽 濾，加入30 ml蒸餾水稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球，真空干燥、無菌處理后 密封包裝(無溶菌酶，空白對照組）。
[0032] 實施例3 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液;2、物料混合:200 ml蓖麻油與18 ml吐溫80混合，加入基質溶液， 以及2% w/w氯化媽10 ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分層 后，傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3 次。抽濾，加入50 ml的5%乙醇稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球。在微球中加入 溶菌酶O. Ol g，鼓風氣流共混，真空干燥、無菌處理后密封包裝。
[0033] 實施例4 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液；2、物料混合：250 ml液體石蠟與18 ml吐溫80混合，加入基質溶 液，以及2% w/w氯化媽10 ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分 層后，傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3 次。抽濾，加入30 ml蒸餾水稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球。在微球中加入溶 菌酶0.02 g，鼓風氣流共混，真空干燥、無菌處理后密封包裝。
[0034] 實施例5 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液；2、物料混合：250 ml液體石蠟與18 ml吐溫80混合，加入基質溶 液，以及2% w/w氯化媽10 ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分 層后，傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3 次。抽濾，加入50 ml的5%乙醇稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球。在微球中加入 溶菌酶0.02 g，鼓風氣流共混，真空干燥、無菌處理后密封包裝。
[0035] 實施例6 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液；2、物料混合：250 ml液體石蠟與18 ml吐溫80混合，加入基質溶 液，以及2% w/w氯化媽10 ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分 層后，傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3 次。抽濾，加入30 ml蒸餾水稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球。在微球中加入溶 菌酶0.005 g，鼓風氣流共混，真空干燥、無菌處理后密封包裝。
[0036] 實施例7 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液；2、物料混合：250 ml液體石蠟與18 ml吐溫80混合，加入基質溶 液，以及2% w/w氯化媽10 ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分 層后，傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3 次。抽濾，加入50 ml的5%乙醇稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球。在微球中加入 溶菌酶0.005 g，鼓風氣流共混，真空干燥、無菌處理后密封包裝。
[0037] 實施例8 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液；2、物料混合：250 ml液體石蠟與18 ml吐溫80混合，加入基質溶 液，以及2% w/w氯化媽10 ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分 層后，傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3 次。抽濾，加入50 ml的5%乙醇稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球。在微球中加入 溶菌酶0.03 g，鼓風氣流共混，真空干燥、無菌處理后密封包裝。
[0038] 實施例9 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液；2、物料混合：250 ml液體石蠟與18 ml吐溫80混合，加入基質溶 液，以及2% w/w氯化媽IO ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分 層后，傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3 次。抽濾，加入30 ml蒸餾水稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球。在微球中加入溶 菌酶0.1 g，鼓風氣流共混，真空干燥、無菌處理后密封包裝。
[0039] 實施例10 1、基質溶液制備:將1.5 g海藻酸鈉、0.5 g羧甲基殼聚糖和0.025 g明膠加入到100 ml 水中溶解，制成基質溶液；2、物料混合：250 ml液體石蠟與18 ml吐溫80混合，加入基質溶 液，以及2% w/w氯化媽10 ml，并伴以快速攪拌，以進行交聯反應制得微球。3、精制:料液分 層后，傾出上層油相，棄去，向下層液體中加入無水乙醇500ml，攪拌，去上清，重復洗滌2~3 次。抽濾，加入50 ml的5%乙醇稀釋進行噴霧干燥，獲得5~60 μπι左右的微球。在微球中加入 溶菌酶0.1 g，鼓風氣流共混，真空干燥、無菌處理后密封包裝。
[0040] 測試例 1)吸水倍率和降解分析 對實施例1-5的產品進行吸水倍率檢測實驗，實驗結果如下表所示。
[0041] 稱取0.01 g樣品分別加入多個離心管中，稱取空管重量(Wo,單位g)，加入I ml PBS混勻在37度下，待止血粉溶脹每10 min后離心去上清留沉淀，瀝干后稱總重（W1, W2. .. .Wn，單位g)，直至材料完全溶脹，重量不再發生明顯變化，即時停止。
[0042]對實施例6-10按照實施例1-5相同的實驗進行吸水率測試，由于實施例6-7中溶菌 酶的加入量較少，其吸水率相對維持在較高的水平，分別為9110和9200,實施例8中制備止 血微球的吸水倍率為5950，相應地實施例9-10中加入的溶菌酶量較多，其吸水率明顯下降， 分別為2800和3180。
[0043]在完成吸水倍率實驗后，立即進行降解實驗。我們記錄隨著時間延長吸收倍率的 變化，我們以每30 min后離心去上清留沉淀，瀝干后稱總重（W'^W'2....W'n，單位g)，直至 材料完全降解或實驗超過48小時。
[0044]從吸水倍率和降解時間實驗可以看出，當溶菌酶加入的質量在0.Olg和0.02g時， 本發明的微球的在止血時其吸水倍率和降解效果均可以維持在較為理想的效果，實施例9-10中溶菌酶用量較大時表現出降解速度過快相應地表現出的吸水效果不夠理想。
[0045])抑菌實驗檢測 目的通過微量肉湯濃度梯度稀釋法檢測評價可吸收抗菌止血微球抗菌活性。
[0046]方法在已滅菌的96孔板中加入100 μL MH肉湯培養基，然后在第1孔中加入100 μL溶菌酶溶液，從第2孔至第10孔加入不同梯度濃度的復合微球溶液，第11孔不加藥作為對 照，第12孔只加培養基做為對照。將培養過夜的菌液用滅過菌的生理鹽水制備成濃度相當 于0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經MHB 1:1000稀釋后，向96孔板每孔加入100 μL。加蓋，37°C 恒溫培養箱中，靜置培養18 h。每種微球設置三個平行實驗。置于分光光度計中測量OD6〇〇 吸收值，以無菌對照組的OD值為參照，測定抗菌蛋白的最低抑菌濃度。結果如下表2: 表2可吸收抗菌止血微球抗菌活性(濃度單位為μg/ml)
3)動物實驗檢測 目的通過觀察、評價可吸收抗菌止血微球對新西蘭兔肝臟局部切除后的創面止血效 果。
[0047] 方法新西蘭兔12只，體重2.5~3.0 kg，隨機分為空白對照組和給藥組，每組6只（3 早/好)，戊巴比妥注射耳緣靜脈麻醉，腹部消毒，于肋弓下沿腹中線作一縱行切口，沿腹中 線剪開腹肌，逐層進入腹腔，暴露肝臟中葉，用無菌紗布將肝中葉表面液體吸干，用手術刀 片在肝中葉切一半肝臟，創面血液迅速外滲且出血活躍著為模型成功;立即將0.50 g止血 材料噴灑創面并開始計時，覆蓋無菌紗布，然后每隔30 s觀察創面出血情況，直至出血停止 或出血超過10 min，以去除紗布不出血為止血。記錄止血時間和出血量，出血量為覆蓋創面 無菌紗布前后重量差，并觀察止血材料與創面的粘合情況。
[0048] 結果與空白對照組比較，用藥組新西蘭兔止血時間明顯縮短，且差異具有統計意 義(p〈〇. 05)，具有良好止血效果。
[0049] 表2可吸收抗菌止血微球在新西蘭兔肝臟半切除模型上的止血試驗(itf，n=6)
【主權項】
1. 一種可吸收抗菌止血微球，包括羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和溶菌酶。2. 如權利要求1所述的可吸收抗菌止血微球，其特征在于，所述的羧甲基殼聚糖、海藻 酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為：1~5:0 · 1~1:0 · 005~0 · 05:0 · 005~0 · 1。3. 如權利要求2所述的可吸收抗菌止血微球，所述的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和 溶菌酶的質量比為：1~5:0 · 1~1:0 · 005~0 · 05:0 · 01~0 · 02。4. 如權利要求3所述的可吸收抗菌止血微球，其特征在于，所述微球的平均粒徑5-100μ m〇5. -種可吸收抗菌止血微球的制備方法，其特征在于具體包括如下步驟： (1) 制備基質溶液:稱取質量比為1~5:0.1~1:0.005~0.05的羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、 明膠，加入10-100倍的蒸餾水，在水浴中加熱至凝膠狀水溶液； (2) 混合:將制備的基質溶液加入到含分散劑的乳化劑中，強力攪拌，分散劑與基質溶 液的體積比或質量比，ml/ml或g/g為0.1~3.0: 1，乳化劑與基質溶液的體積比或質量比ml/ ml或g/g，為0.01~0.30: 1; (3) 乳化交聯共聚：加入交聯劑，交聯劑與基質液的體積比或質量比，ml/ml或g/g為 0.05~1.0: 1;反應時間為1~12小時，反應完畢后，停止攪拌，出料； (4) 粗制:料液分層后，傾出油相，加入洗滌劑，反復洗滌;最后抽濾； (5) 干燥:將過濾后的微球粗樣中加入稀釋液，微球粗樣與稀釋液的質量體積比或質量 比，g/ml或g/g，為1:10~200，將濕樣通過離心噴霧干燥和真空干燥； (6) 共混:溶菌酶干粉與微球共混合，加入溶菌酶的質量為g/g，羧甲基殼聚糖、海藻酸 鈉、明膠和溶菌酶的質量比為:1~5:0.1~1:0.005~0.05:0.005~0.1;密封包裝，無菌處理。6. 如權利要求5所述的可吸收抗菌止血微球的制備方法，其特征在于，羧甲基殼聚糖、 海藻酸鈉、明膠和溶菌酶的質量比為:1.5:0.5:0.025:0.02。7. 如權利要求5所述的可吸收抗菌止血微球的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述 稀釋液為蒸餾水或5%的乙醇溶液。8. 如權利要求5-7所述的可吸收抗菌止血微球的制備方法，其特征在于，步驟(5)中干 燥后獲得的所述微球的平均粒徑為5-100μπι。9. 如權利要求5-7所述的可吸收抗菌止血微球的制備方法，其特征在于，步驟(6)中的 共混合方式為通過鼓風氣流共混。10. 如權利要求1-4中任一項所述的可吸收抗菌止血微球在制備止血材料中應用。
【文檔編號】A61L24/04GK105963766SQ201610526892
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】金甲, 楊玉民, 葉飛
【申請人】浙江理工大學, 浙江三創生物科技有限公司