Virosaine A的四氫吡咯基和嗎啉基衍生物的組合物在抗急性痛風藥物中的應用
【專利摘要】本發明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其在制備抗急性痛風藥物上的用途。本發明公開了一種組合物及其制備方法。藥理學實驗表明，本發明的組合物具有抗急性痛風的作用，具有開發抗急性痛風藥物的價值。
【專利說明】
Vi rosa i ne A的四氨P比略基和嗎嘟基衍生物的組合物在抗急 性痛風藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發明設及有機合成和藥物化學領域，具體設及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 痛風（gouty)，又稱痛風性關節炎（gouty adhritis)，是體內嚷嶺代謝素亂所致 的疾病，表現為血中尿酸過多，易于使尿酸鹽(MSU)在關節等組織析出結晶。痛風的急性發 作是由于沉積在關節的MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反應。
[0003] 西藥在痛風急性發作期選用Ξ種藥:秋水仙堿、非醬體抗炎藥和腎上腺皮質激素。 秋水仙堿的作用機制是與中性粒細胞的微管蛋白結合，從而妨礙粒細胞的活動，抑制粒細 胞浸潤。非醬體抗炎藥如嗎I噪美辛，抑制環氧酶（C0X)活性而發揮抗炎作用，W及選擇性 C0X2抑制藥。它們雖然消炎止痛作用快，但毒副作用也相當明顯，如秋水仙堿的有效劑量與 產生腹瀉等胃腸道癥狀的劑量相近，非醬體抗炎藥在有活動性消化性潰瘍、胃腸道出血情 況下絕對禁用，而保泰松用藥短至3周也可致嚴重的粒細胞減少癥或再生障礙性貧血。
[0004] 從天然產物中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
[000引本發明設及的化合物I是一個2012年發表（Bing-Xin Zhao et al .， 2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096- 3099)的化合物，我們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物HI和化 合物IV，并用化合物ΠΙ和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗抗急性痛風活性進行了 評價，其具有抗急性痛風活性。

【發明內容】

[0006]本發明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物ΙΠ 和化合物IV組成，該組合物 中化合物ΠI和化合物IV的質量百分數分別為40 %和60 %。
[0007]
[0008] 本發明公開的組合物可W制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
[0009] 本發明用尿酸鋼(MSU)致人血管內皮細胞化UVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示， 本發明組合物對MSU致冊VEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達，可用于制備治療急性 痛風炎癥藥物。本發明的目的在于提供本發明組合物在醫學中的新用途，具體地說是設及 本發明組合物在制備治療急性痛風藥物中的應用。
[0010] 本發明的目的是通過W下的技術方案來實現的：
[0011] 現代醫學病理研究說明，痛風性關節炎是MSU引起中性粒細胞局部浸潤和炎性反 應，急性痛風產生的本質是中性粒細胞(PMN)-血管內皮細胞化UVEC)黏連增強(Terkeltaub 民，et al.The murine homolog of the interleukin-8 receptorcxcr-2 is essential for the occurrence of neutrophilic inflamination in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitis.Arthritis 民heum,1998,41(5):900-909.)， 冊VEC損傷，其分子生物學基礎在于P麗與冊VEC表面黏附分子的相互作用（FujiwaraY，et al.Interleukin-Sstimulates leukocyte migration across amonolayer of cultured rabbit NF-a，IL-Ιβ，IL-8，and IL-1 rain Monosodium Urate Crystal induced rabbit arthritis丄abinvest, 19998,78(5) :559-569.)，其中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)與粘附 功能關系最密切，是急性痛風炎癥的重要指標之一(張春，唐怡，劉軍，等.痛風靈方對尿酸 鋼致大鼠模型關節軟組織ICAM-1表達的影響，重慶醫學，2002,31(12): 1211-1213.)。
[001 ^ 因此，針對急性痛風MSU致冊VEC損傷，ICAM-1表達增多的病理特征，本發明用MSU 致HUVEC損傷的體外急性痛風模型(楊妍華，尹蓮，王明艷，等.尿酸鋼誘導HUVEC損傷的急性 痛風模型研究，中華中醫藥學刊，2010,28(3) :592-594.),評價本發明組合物抗急性痛風炎 癥活性。MSU致人血管內皮細胞化UVEC)損傷的急性痛風模型評價顯示，本發明組合物對MSU 致HUVEC損傷具有保護作用，并抑制ICAM-1表達。
[OOU]有益效果
[0014] 研究結果表明，用Μ洲致冊VEC損傷的急性痛風模型評價顯示，本發明組合物可保 護MSU致冊VEC損傷，減少細胞調亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風炎癥 的活性，本發明組合物可用于制備治療急性痛風炎癥藥物。
[0015] W下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但本發明的保護范圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權利要求加 W限定。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1化合物Virosaine A的制備
[0017] 化合物Virosaine A(I)的制備方法參照Bing-Xin Zhao等人發表的文獻(Bing- Xin Zhao et al.,2012.Virosaines A and B,Two New Birdcage-Shaped Securinega Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Flueggea virosa.Organic Letters 14(2012)3096-3099)的方法。
[001 引
[0019] 實施例2 Virosaine A的0-漠乙基衍生物（II)的合成
[0020] 將化合物I (235mg，1. OOmmo 1)溶于20mL苯，向溶液中加入四下基漠化錠（TBAB) (0.08g)，1，2-二漠乙燒(3.760g，20.0 Ommol)和5mL的50%氨氧化鋼溶液。混合物在35攝氏 度攬拌化。她之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲燒萃取兩次，合并有機相溶液。然后 對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗涂3次，再用無水硫酸鋼干燥，最后減壓濃縮去除溶 劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬=100:1.0，v/v)，收 集棟色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棟色粉末(261mg，78%)。
[00別]iHMffi(500MHz，DMS0-d6)S5.91(s，lH)，4.07(s，lH)，3.81(s，2H)，3.59(s，lH)， 3.43(s，2H)，3.33(s，lH)，2.26(s，lH)，1.58(d J = 9.8Hz，3H)，1.41(s，2H).
[0022] 1化醒R(125MHz，DMS0-d6)Sl71.81(s)，106.71(s)，79.95(s)，74.33(s)，69.81 (s),66.68(s),44.21(s),35.56(s),33.28(s),25.85(s),21.88(s).
[0023] HRMS(ESI)m/z[M+扣+calcd for Cm出7BrN04:342.0:341;found 342.0:343.
[0024]
[00巧]實施例3 Virosaine A的0-(四氨化咯基）乙基衍生物（III)的合成
[0026] 將化合物II(17Img，0.5mmo 1)溶于15mL乙臘當中，向其中加入無水碳酸鐘(345mg， 2.5mmo 1)，艦化鐘(84mg，0.5mmo 1)和化咯燒（1420mg，20mmo 1)，混合物加熱回流化。反應結 束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲燒萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水 洗涂合并之后的有機相，再用無水硫酸鋼干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗品 用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬=100:1.5，v/v)，收集淡黃色集中洗脫帶即得 到Virosaine A的0-(四氨化咯基）乙基衍生物（III)的淡黃色膠狀固體(111.6mg，67% )。
[0027] 1h 醒R(500MHz，DMS0-d6)S5.92(s，lH)，4.11(s，lH)，3.66(s，lH)，3.53(s，2H), 3.45(d J = 66.9Hz，lH)，2.64(s，2H)，2.52(s，4H)，2.29(s，lH)，1.71(s，4H)，1.64(s，2H), 1.61(s,lH),1.50(s,2H).
[002引"C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl71.83(s)，106.73(s)，79.97(s)，74.35(s)，66.72(d, J = 9.2Hz)，54.42(d J = 17.1Hz)，44.23(s)，35.58(s)，25.86(s)，25.23(s)，21.90(s). [0029] HRMS化SI):m/z[M+H]+calcd for Cl姐化化〇4:333.1814;found:333.1811。
[0030]
[0031] 實施例4 Virosaine A的0-(嗎嘟基）乙基衍生物的合成
[0032] 將化合物II(17Img，0.5mmo 1)溶于15mL乙臘當中，向其中加入無水碳酸鐘(345mg， 2.5mmo 1)，艦化鐘（84mg，0.5mmo 1)和嗎嘟（1742mg，20mmo 1)，混合物加熱回流比。反應結束 后將反應液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲燒萃取Ξ次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗涂合并之后的有機相，再用無水硫酸鋼干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油酸/丙酬= 100: l.〇，v/v)，收集黃色集中洗脫帶即得 到Virosaine A的0-(嗎嘟基）乙基衍生物的黃色固體（IV) (125.3mg，72% )。
[0033] 1h 醒R(500MHz，DMS0-d6)S5.95(s，lH),4.12(s，lH),3.68(s，lH),3.63(d，J= 8.4Hz，lH)，3.61(s，4H)，3.57-3.26(m，3H)，2.61(s，2H)，2.56(s，2H)，2.51-2.03(m，5H), 1.70(d J = 3.1Hz，lH)，1.65(d J = 25.6Hz，lH)，1.52(s，2H).
[0034] "C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl71.85(s)，106.73(s)，79.95(s)，74.：M(s)，66.75(t， J=4.細z)，54.46(s)，52.93(s)，44.22(s)，35.55(s)，25.88(s)，21.89(s).
[0035] HRMS化SI):m/z[M+H]+calcd for Cl姐化化〇5:349.1763;found:：M9.1761。
[0036]
[0037] 實施例5組合物抗急性痛風炎癥實驗
[003引 1、溶液配制
[0039] 5g尿酸加1000ml蒸饋水煮沸，加5%化0田容液調PH 7.4，攬拌，冷卻析晶制成尿酸 鋼結晶(MSU)。將制好的MSU lOmg高壓滅菌，加不含血清的DMEM培養液10ml，研磨配成Img/ ml的DMEM溶液。實驗時，此溶液再加 DMEM培養液配成不同濃度DMEM的MSU溶液。
[0040] 組合物的制備：將研磨之后過200目網的40mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網的60mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用滿輪攬拌儀混合即得到lOOmg組合物， 使用時用水溶解運1 OOmg的組合物即得到組合物的溶液。
[0041 ] 組合物、化合物III或者化合物IV 2.5mg，用二甲基亞諷(DMS0)溶解，DMS0終濃度< 0.02 %，再加無血清的DMEM培養液，配制成濃度25ug/ml。
[0042] 2、血管內皮細胞的體外培養
[0043] 人廝靜脈血管內皮細胞冊VEC株由南京中醫藥大學基礎醫學院提供，細胞經支原 體檢測，無支原體污染，細胞經0.25%膜蛋白酶消化，含10 %小牛血清的DMEM培養液中和， 離屯、（100化/min X 6min)，去上清液，加含10%小牛血清的DMEM培養液，移入細胞培養瓶中， 放37 °C、5 % C〇2培養箱中傳代培養。
[0044] 3、對MSU刺激HUVEC活力的影響
[0045] 冊VEC在培養瓶中培養，待生長至70 %~80 %融合時，W0.25%膜蛋白酶消化、離 屯、，10%小牛血清DMM培養液洗涂3次，用10 %小牛血清DMM培養液調成4 X 細胞懸 液，植入96孔板(每孔200ul)，培養24小時后輕吸出原培養液，進行W下實驗，每組各8孔，具 體分組及加液如下：對照組（200ul DMEM培養液）、模型組（lOOug/ml Μ洲溶液）、干預組 (lOOug/ml MSU溶液+2加 g/ml的組合物或者化合物），加液后繼續放37 °C、5 % C〇2培養箱中 培養24小時，收集上清液，剩余的HUVEC用于測定細胞活性，每孔再加5mg/ml MTT液20ul，繼 續放37 °C、5 %C〇2培養箱中培養4小時后，棄MTT液，加入二甲基亞諷200ul溶解，震蕩，于酶 標儀讀取吸光度值，波長490nm。
[0046] 數據統計學處理，細胞活力（％ )=實驗組吸光度值/對照組吸光度值X 100 %，結 果見表1。
[0047] 與對照組相比，模型組細胞活力顯著減小(P<0.05)，組合物干預后細胞活力顯著 提高(P<0.05)，并強于對照組，而化合物ΙΠ 和化合物IV無此活性。
[004引表1組合物對MSU刺激的血管內皮細胞活力的影響(支）
[0049]
[(K)加]注:與模型組相比，沖<0.05;與對照組相比，Ap<〇. 05 [0化1] 4對ICAM-1表達影響
[0052]將處于對數生長期的冊VEC用0.25 %的膜蛋白酶消化，輕輕吹打，制成細胞懸液， 調整細胞密度為5 XIO^L，接種于細胞培養瓶中。待細胞長滿后(約2地），棄去上清液，分為 下列組:對照組、模型組（lOOug/ml MSU溶液）、干預組（lOOug/ml MSU溶液+2加 g/ml組合物 或者化合物），繼續培養24小時，PBS收集細胞，離屯、去上清，加入CD54單克隆抗體，30min后， PBS洗涂，重懸細胞，應用流式細胞儀檢測其陽性細胞百分率(n= 10000 )，重復3次，結果見 表2。
[0化3] 表2組合物對MSU刺激的血管內皮細胞ICAM-1表達的影響(克）
[0化4]
[0化5]
[0化6] 注:與模型組相比，沖<0.05;與對照組相比，Ap<〇. 05
[0化7] 結果顯示，空白組冊VEC幾乎無 ICAM-1表達，模型組ICAM-1的表達最高，與模型組 相比，組合物對ICAM-1的表達有顯著的抑制作用，而化合物ΙΠ 和化合物IV無顯著的抑制作 用。
[0化引結論：用Μ洲致冊VEC損傷的急性痛風模型評價顯示，組合物可保護Μ洲致冊VEC損 傷，減少細胞調亡，提高細胞活性，抑制ICAM-1表達，具有抗急性痛風炎癥的活性，組合物可 用于制備治療急性痛風炎癥藥物。而化合物ΙΠ 和化合物IV不能保護MSU致HUVEC損傷，不能 減少細胞調亡，不能提高細胞活性，不能抑制ICAM-1表達，不具有抗急性痛風炎癥的活性， 不能用于制備治療急性痛風炎癥藥物。
[0059] 實施例6本發明所設及組合物片劑的制備
[0060] 取2克組合物，加入制備片劑的常規輔料18克，混勻，常規壓片機制成100片。
[0061] 實施例7本發明所設及組合物膠囊的制備
[0062] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權項】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質量百分數分別為40%和60%，2. 如權利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質量百分數分別為40%和60%充分混合。3. 如權利要求1所述的一種組合物在治療急性痛風藥物中的應用。4. 如權利要求3所述的組合物在治療急性痛風藥物中的應用，其特征為:所述急性痛風 是由尿酸鈉誘導的。5. 如權利要求3所述的組合物在治療急性痛風藥物中的應用，其特征為:組合物減少人 血管內皮細胞的損傷，提高人血管內皮細胞的活性。6. 如權利要求3所述的組合物在治療急性痛風藥物中的應用，其特征為:組合物減少急 性痛風過程中ICAM-1的表達。
【文檔編號】A61K31/439GK105920013SQ201610278639
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月28日
【發明人】蔣登旭
【申請人】鎮江瑪珂蕘生物醫藥科技有限公司