一種治療結腸癌的藥物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種藥物，具體涉及一種用川芎乙醇提取物制成的藥物。川芎乙醇提取物是將川芎粉碎成粉末狀后加入乙醇回流提取，冷凍干燥后粉碎所得的粉末狀固體。本發明的作用是：所得藥物能夠治療結腸癌。
【專利說明】
一種治療結腸癌的藥物
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體的涉及一種用于治療結腸癌的藥物，更具體涉及 一種用川芎乙醇提取物制成的藥物。
【背景技術】
[0002] 結腸癌(colon cancer)是臨床上常見的一種惡性消化系統腫瘤。在我國戰國時期 就已經有關于結腸癌的記載。近年來，結腸癌的發病率和致死率在全球范圍均呈上升趨勢。 因此，結腸癌的治療在醫學研究中非常重要。惡性腫瘤由于病因復雜和有侵襲性等原因，因 此一旦被確診，通常會很難徹底清除。但是，腫瘤不是在短期形成的，在腫瘤形成這一漫長 過程中，利用藥物進行有關干預是可行的。因此，尋找純天然中草藥植物阻止有癌變風險的 細胞進一步發展成癌細胞，可以使很多高危人群遠離癌癥。結腸癌的治療手段主要有手術 治療、放射治療、化學治療、生物治療及中醫藥治療等，但手術治療及放化療所引發的副作 用是不容忽視的。中醫認為結腸癌是由機體正氣不足、濕毒內結凝滯而致病，因此，在純天 然中草藥植物中尋找有效且副作用小的抗腫瘤藥物的相關研究，已成為國內外十分重要且 有前景的課題。
[0003] 川芎是中醫治療中常用的活血化瘀藥物。在《中國藥典》(2010年版）的記載中，已 有151個成方制劑中把川芎作為藥材之一，占所載錄的1640個中成藥總數的9.21%。中藥川 考來源于傘形科藁本屬植物川；(Ligusticum chuanxiong Hort)的干燥根莖，主要產于四 川、貴州、云南等地，其中以四川產者質優，為四川的道地藥材。在夏季時，當川芎植株莖上 的節盤突出顯著，并略帶紫色時采挖，之后經除去泥沙，曬后烘干，去須根等工序，即得到川 芎藥材。再經洗凈、潤透、切片、干燥，可以得到中藥飲片。中醫認為川考其味辛微苦、藥性溫 和，歸于肝、膽、心包經。川考活血化瘀、開郁行氣、疏風止痛，可治療月經不調、經閉痛經、胸 脅疼痛、頭痛眩暈、跌打損傷等癥。川芎有效成分的提取方法主要有傳統提取法、溶劑提取 法和超臨界萃取法等。傳統提取法主要有水煎法、回餾法、蒸餾法、滲漉法等，其操作簡便， 對工藝、設備的要求不高，但它們存在提取時間長、耗能大、含雜質多等缺點。超臨界萃取等 現代提取和分離技術雖然提取物的純度高、環保節能，但是由于超臨界萃取使用的是新技 術新設備，目前局限性也比較大，還難以應用于川芎有效成分的工業化大規模生產。經檢索 發現，乙醇和乙醚是川芎提取有效成分的的常用溶劑，而乙醇因對有效成分的提取較完全 而更為常用，是效果較佳的溶劑。因此本發明采取的提取川芎有效成分的方法為乙醇提取 法（以下簡稱醇提法）。川芎主要的化學成分有阿魏酸、川考嗪、蒿本內酯、川考內酯等。其主 要的活性成分為阿魏酸和川芎嗪;主要的揮發油類物質為蒿本內酯、川芎內酯、川芎酚等； 主要的酸性成分為阿魏酸、大黃酚、瑟丹酸等;主要的生物堿類為川芎嗪、黑麥草堿、L-β-丙 烯酸乙酯-7-醛基咔啉等。據有關研究發現，川芎具有一定的抗氧化作用。其中，生物堿類 和酚酸類是活血祛瘀的主要活性成分;阿魏酸能抑制血小板的聚集，促進血小板的解聚和 抗血栓的形成，解除血管平滑肌的痙攣，抗氧化等。國內外學者在川芎的栽培、加工炮制、化 學成分、藥理作用以及臨床應用等方面進行了相當廣泛的研究。
[0004] 體外細胞培養在生物工程研究中占有著不可動搖的地位，可作為代替模型用于藥 理和環境毒理學的研究。體外研究的優點在于可以減少實驗動物的用量、節約實驗時間、排 除體內其他因素的干擾，同時也可進行多種藥物的藥理試驗。實驗室常用來做研究的結腸 癌細胞系有HCT116，HCT8，HT29，LS174T，L0V0，SW480，SW620等。徐修禮等研究發現川芎素能 夠在一定程度上抑制moser大腸癌細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡，并且具有可以增強化療 藥物作用的功能。韓嬌艷研究發現使用不同濃度的鹽酸川芎嗪刺激人前列腺癌PC-3細胞與 人結腸直腸癌HCT-116細胞后，發現PC-3細胞與HCT-116細胞增殖明顯受到抑制(p〈0.05)。 房良華研究發現主要成分為川芎內酯，毛蕊異黃酮葡萄糖苷，芒柄花苷洋，毛蕊異黃酮，芒 柄花黃素，黃芪甲苷，藁本內酯等的透膿散提取液可抑制人結腸癌L0V0細胞的增殖，誘導細 胞凋亡，阻滯細胞停滯在G1期。但暫未發現使用川芎對HT29結腸癌細胞做相關研究的報道。 根據川芎活血化瘀、開郁行氣、疏風止痛的特征，本發明以HT29結腸癌細胞系作為模型，使 用不同濃度的川芎醇提物培養HT29細胞進行實驗，通過細胞增殖實驗、細胞凋亡、細胞迀移 等相關實驗。結果表明，不使用藥物時，HT29結腸癌的細胞存活率為93.59%，凋亡率為 1.03%，用200yg/mL川芎醇提物作用于HT29結腸癌的效果是細胞存活率為63.42%，凋亡率為 13.27%，結腸癌細胞的迀移能力顯著降低，則這種藥物組合效果顯著，從而驗證其有抑制結 腸癌的效果。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種藥物。
[0006] 本發明中的藥物為川芎醇提物。
[0007] 作為優選，所述川芎醇提物為將川芎粉碎成粉末狀后加入乙醇回流提取，冷凍干 燥后粉碎所得的粉末狀固體，其終濃度為200yg/mL。
[0008] 本發明中的藥物可制備用于治療腫瘤的藥物。
[0009] 本發明所述的腫瘤為結腸癌。
[0010] 本發明的有益效果在于：（1)獲得的藥物可抑制結腸癌細胞的增殖、促進其凋亡、 抑制其轉移；（2)采用該方法安全可控，并且便于操作、保管、貯存和運輸。
[0011]
【具體實施方式】： 為使本領域技術人員詳細了解本發明的生產工藝和技術效果，下面以具體的生產實例 來進一步介紹本發明的應用和技術效果。
[0012] 實施例1川芎提取物的制備 首先稱取適量川芎藥材并將其粉碎成粉末狀，然后加入藥材重量10倍量的80%乙醇，加 熱回流提取2次，每次30分鐘，合并提取液后，經過200目篩網過濾并且蒸餾濃縮得到膏體， 再經冷凍干燥后粉碎即得川芎乙醇提取物。
[0013] 實施例2不同濃度川芎醇提物孵育HT29結腸癌細胞 將HT29結腸癌細胞解凍復蘇后加入含有15%胎牛血清(FCS)的DMEM培養基制成細胞懸 液，分種于培養瓶中并置于5% C02,飽和濕度，37°C培養箱中培養。正常培養時約每天更換1 次培養液，等到細胞生長融合度達到70%_80%時進行傳代培養;傳代培養時首先棄去培養瓶 中的舊培養液，加入37 °C磷酸緩沖鹽溶液（PBS)洗瓶2次，在25 cm2培養瓶中加入2mL約 0.25%的胰蛋白酶進行消化。然后在倒置顯微鏡下仔細隨時觀察，當發現細胞質回縮、細胞 間隙變大時終止消化。接下來棄去胰酶溶液，加入含15%血清的DMEM培養基，之后用吸管輕 柔吹打使貼壁細胞懸浮。緊接著將含懸浮細胞的培養液轉移至10mL離心管中，1500r離心 5min，棄上清液。將細胞重新懸浮于5mL含15%血清的完全培養基中。細胞計數結束，選擇合 適濃度將細胞分裝到新的無菌培養瓶進行培養，6h后可見細胞貼壁，以后每2-3天換液次， 待細胞長滿瓶底70%_80%后再次消化傳代。
[0014] 取4-6代的生長良好，融合度約為60%-70%的細胞進行細胞實驗。呈亞融合狀態的 細胞，輕柔吹打配成單細胞懸液并接種于96孔培養板，24孔培養板以及Tranwel 1小室鋪板， 具體分組情況如下： ① 空白對照組 空白對照組:用無血清DMEM培養液孵育細胞24 h; ② 處理組(共設3組）： 每組加入不同終濃度（100，200，300yg/mL)的川芎醇提物孵育細胞24 h。
[0015]實施例3 MTT方法檢測川芎醇提物對HT29結腸癌細胞增殖活性的作用 MTT分析法是一種檢測細胞存活和生長的常用方法，以活細胞代謝物還原劑3-(4,5_ dimethylthiazol_2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide assay (MTT)噻唑藍為基 礎。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源性的MTT還原為不溶性的藍紫色結晶物甲臜 (formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，因此formazan結晶的生成量僅與活細胞 數目成正比。二甲基亞砜(DMS0)能溶解細胞中的甲臜，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測 定其吸光值(0D值），可間接反應活細胞數目。 實驗中MTT溶液的配置配置方法為稱取250mg MTT并放入小燒杯中，然后加入50mL PBS (0.01111〇1凡4!17.4)后使用電磁力攪拌機攪拌3〇111；[11保證其充分溶解。最后用直徑為0.224111 的微孔過濾器經除菌，分裝后，在4°C保存，并在兩周內使用完畢。 取實施例2的96孔培養板藥物孵育72h后的細胞，每孔加入20yL的MTT溶液后再培養4h， 離心去培養液。每孔加入150yL二甲基亞砜，震蕩lOmin使之充分溶解，在酶聯免疫檢測儀 上選擇在波長490nm測定吸光值(A值），比色時空白孔調零，測定各孔光吸收值(0D值），實驗 至少重復三次。記錄結果，計算存活率。
[0016] 細胞存活率(％)=處理組平均0D值/對照組平均0D值X 100%。
[0017] 表1 MTT法檢測HT29結腸癌細胞存活率
*表示與空白對照組比較差異顯著(P〈〇.05) 由表1可知，100yg/mL，200yg/mL和300yg/mL川芎醇提物組的細胞存活率分別是 86.65%，63.42%，63.39%;在使用200yg/mL川芎醇提物濃度時，細胞的存活率較100yg/mL藥 物處理組明顯降低，降至63.42%，而其后隨著濃度的增加，細胞存活率的下降趨勢又趨于平 緩，300yg/mL藥物處理組細胞存活率為63.39%，與200yg/mL處理組無統計學差異，因此200μ g/mL藥物處理組是抑制細胞增殖活性的較佳劑量組。
[0018] 實施例4流式細胞術檢測細胞凋亡 分別取實施例2的24孔板細胞經藥物作用24h后使用0.25%胰蛋白酶消化、離心，棄掉 上清液并用冷PBS洗兩次，70%乙醇固定細胞24h。上機測定之前經離心去乙醇，使用PBS洗兩 次，加 lOOyg/mL核糖核酸酶（RNase)消化30min(37°C )。在使用碘化丙錠（propidium 1〇虹(16，？1)5(^8/11^染色3〇1^11，并且經尼龍網過濾后，用?403了41^&1讓1^型流式細胞儀 (Becton Dickinson，CA，USA)測定。實驗結果經計算機軟件ModFit LT3.0分析軟件分析細 胞周期細胞數，每組實驗至少重復3次。
[0019] 表格2不同濃度川芎醇提物作用24h后HT29結腸癌細胞周期及凋亡率的變化
*表示與空白對照組比較差異顯著(P〈〇.05) 結果表明（見表2)，100,200,30(^8/1^川芎醇提物濃度作用2411后，細胞周期產生了明 顯的變化，尤其是200yg/mL的川芎醇提物與HT29結腸癌細胞作用24h后，細胞周期中S期的 細胞顯著增加，G2/M期比例為7.21%。空白對照組結腸癌細胞凋亡率為1.03%，加入10(^8/1^ 川芎醇提物后，細胞凋亡率達到10.67%，川芎醇提物濃度增加至200yg/mL時凋亡率明顯升 高到13.27%。而當川芎醇提物濃度增加到300yg/mL后凋亡率為13.97%，上升趨勢趨于平緩， 與200yg/mL處理組無統計學差異，可見200yg/mL處理組是川芎促使細胞凋亡的的較佳劑量 組。
[0020] 實施例5 Transwell侵襲實驗檢測藥物對細胞侵襲能力的影響 細胞迀移實驗是將Transwe 11小室放入培養板中，小室內稱為上室，培養板內稱下室， 上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的腫瘤細胞種在上室內，下室加入含FBS或某些特 定的趨化因子的培養液，由于聚碳酸酯膜具有通透性，腫瘤細胞會向營養成分高的下室迀 移，計數進入下室的細胞數量就能反應細胞的迀移能力。
[0021] ①將藥物加入Transwell小室中，與HT29結腸癌細胞共孵育，細胞的終濃度大小約 5Xl〇MVmL; ②24孔板的下室內加入500 yL的含20%胎牛血清的DMEM，在Transwel 1小室內加入100 yL的細胞懸液，常規培養24 h; ③ 24 h細胞培養完成后，輕提Transwell小室，傾倒室內的培養基，用適量的PBS將細胞 洗滌2遍，使用4%的多聚甲醛固定細胞15 min，PBS再清洗3次，每次5 min，再使用0.1%的結 晶紫染色細胞30 min，用roS洗滌3次，每次5 min，使用超純水輕輕沖洗濕潤小室表面的細 胞，最后用濕潤棉簽輕輕擦去未迀移過膜的細胞，風機風干； ④ 倒置Transwell小室，顯微鏡進行觀察和拍照。于顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細 胞，并計數迀移細胞數。
[0022]結果表明，川芎醇提物濃度為200yg/mL時HT29結腸癌細胞相對對照組的迀移能力 顯著降低(見附圖1)。
[0023] 盡管本發明的內容已經通過上述優選實施例作了詳細介紹，但應當認識到上述的 描述不應被認為是對本發明的限制。在本領域技術人員閱讀了上述內容后，對于本發明的 多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發明的保護范圍應由所附的權利要求來限定。
【附圖說明】
[0024]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步產明。
[0025] 圖1 Transwell細胞迀移檢測細胞迀移能力 注：1，空白對照組;2，100yg/mL川芎醇提物組;3，200yg/mL川芎醇提物組;4，300yg/mL 川芎醇提物組。
【主權項】
1. 一種藥物，其特征在于:所述藥物為川芎乙醇提取物。2. 根據權利要求1所述的藥物，其特征在于:所述川芎乙醇提取物為將川芎粉碎成粉末 狀后加入乙醇回流提取，冷凍干燥后粉碎所得的粉末狀固體，其終濃度為200yg/mL。3. 根據權利要求1所述的藥物，其特征在于:利用所述藥物用于治療腫瘤的藥物。4. 根據權利要求3所述的治療腫瘤的藥物，其特征在于，所述的腫瘤為結腸癌。
【文檔編號】A61P35/00GK105832786SQ201610412924
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】孔晶, 周亞楠, 錢國慶, 許璐
【申請人】淮陰工學院