-ATPase的抑制劑及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及中藥丹參作用祀點的發現與拓寬臨床應用范圍，具體地說是丹參中酪 酸類化合物的新作用祀點的發現及此類化合物在臨床上的新應用，所述酪酸類化合物包括 原兒茶醒、丹參素、咖啡酸、紫草酸、丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、丹酪酸D等類結構化合物 及其衍生物、和它們藥學上可接受的成鹽化合物；所述祀點為GPR35和化 2^-ATPase ;所述臨 床新應用為必力衰竭、高血壓、冠狀動脈性必臟病、代謝綜合癥、哮喘、疼痛、炎癥和癌癥等 疾病的預防和治療。
【背景技術】
[0002] 丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根 莖，首載于《神農本草經》，具有巧癒止痛、養血安神、益氣止煩等功效，其有效成分是脂溶 性的二聰類化合物和水溶性的酪酸類化合物。其中酪酸類化合物具有很強的抗過氧化、 清除自由基、抗必肌缺血缺氧的作用，在臨床上主要用來治療冠必病、腦血栓、必肌梗死等 必血管疾病。長期的臨床應用及此類化合物在治療疾病表現出的明顯效果，使此類化合 物作用機制的研究備受關注，目前研究比較集中于粗提物或較簡單的化合物的藥理作用 的研究，但關于此類化合物的作用祀點研究甚少化.M. Zhou, Z. Zuo, M. S. S. Chow, Journal of Clinical Pharmacology 45 (2005) 1345-1359 ;高秀梅，張伯禮，商洪才，王怡，郭 利平，張萌，史紅，劉密新，中國臨床康復7 (2003) 1754-1756 ;趙娜，郭治昕，趙雪，趙利 斌，國外醫藥：植物藥分冊22(2007) 155-160;趙淑娟，章國琪，劉涂，胡之璧，中草藥 35 (2004) 341-344 ;付辛芳，劉曉紅，中國藥業 15 (2006) 76-77.)。
[0003] GPR35受體是一類包含309個氨基酸的孤兒受體，于2004年在胃癌細胞中發現 此受體，研究表明其在調控NIH-3T3細胞的轉錄過程中起作用。GPR35在膜腺、小腸、結 腸、脾和免疫細胞中表達相對比較高，在一些人體癌細胞如HT-29細胞中也有表達。犬 尿哇晰酸、2-醜基溶血磯脂酸、敏喘寧、帕莫酸、色甘酸鋼、木犀草素、搬皮素、尼氣酸等 化合物都是GPR35的激動劑，目前的研究表明GPR35受體與必力衰竭、高血壓、冠狀動 脈性必臟病、代謝綜合癥、哮喘、疼痛、炎癥和癌癥等疾病相關，GPR35的新配體的發現 和確認對于闡明GPR35的生物學和藥理學功能有重要的意義，送將為化合物的新臨床 應用提供導向（A. M曰cKenzie, J. L曰ppin, D. T曰ylor, S.化cklin, G. Milli邑曰n, Frontiers in endocrinology (2011) 1-10 ;H. Y. Deng, H. B. Hu, Y. Fang, Febs Letters 585 (2011) 1957-1962 ;H. Y. Deng, H. B. Hu, Y. Fang, Scientific Reports (2012) 1-12 ; H.Y.Deng,Y.Fang, Pharmacology89(2012)211-219 ;H.Deng, Y. Fang, Pharmaceuticals 6(2013)500-509.) 〇
[0004] 目前關于丹參中酪酸類化合物作用于GPR35受體及丹酪酸A與丹酪酸C的雙革己點 作用尚未報道。

【發明內容】

[0005] 本發明涉及丹參中酪酸類化合物的新作用祀點的發現及此類化合物在臨床上的 新應用，目的之一是提供丹酪酸類化合物中丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸及丹參素 的新作用祀點GPR35 ;目的之二是提供此類化合物中丹酪酸A和丹酪酸C的雙祀點GPR35和 Ca2+-ATPase。目的之H是提供此類化合物在臨床上的新應用范圍。丹酪酸A、丹酪酸B、丹 酪酸C、紫草酸及丹參素的化學結構如下：
[0007] 體外細胞實驗表明，本發明中的丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸及丹參素作 用于GPR35雙體（屬于G蛋白偶聯雙體（GPCR)),此雙體與必力巧竭、局血壓、殖狀動脈性必 臟病、代謝綜合癥、哮喘、疼痛、炎癥和癌癥等疾病相關，據祀點與疾病的關聯關系，可拓寬 送些化合物的臨床應用范圍；丹酪酸A和丹酪酸C呈現雙祀點作用，為臨床應用提供作用機 制的解釋和為拓寬臨床應用提供導向。
【附圖說明】
[000引圖1 A-丹參中酪酸類化合物在HT-29細胞上的DMR響應信號；B-經丹參中酪酸 類化合物預處理Ih后，1 U M敏喘寧在HT-29細胞上的DMR響應信號；C-經丹參中酪酸類化 合物預處理比后，16 U M己醜膽堿在HT-29細胞上的DMR響應信號；
[0009] 圖2 A-丹參中酪酸類化合物在A431細胞上的DMR響應信號；B-經丹參中酪酸類 化合物預處理Ih后，16nM緩激膚在A431細胞上的DMR響應信號；C-經丹參中酪酸類化合 物預處理比后，1 U M組胺在A431細胞上的DMR響應信號；
[0010] 圖3丹酪酸A、丹酪酸B、丹參酸C、紫草酸和丹參素在HT-29細胞上的劑量響應曲 線；
[0011] 圖4經不同濃度丹酪酸A、丹酪酸B、丹參酸C、紫草酸和丹參素預處理比后，1 U M 敏喘寧在HT-29細胞上的劑量響應曲線；
[0012] 圖5經不同濃度ML145預處理IOmin后，丹酪酸A、丹酪酸B、丹參酸C、紫草酸和丹 參素在HT-29細胞上的劑量響應曲線；
[0013] 圖6丹酪酸A、丹酪酸C、毒胡蘿h素和環匹阿尼酸在A431細胞上的劑量響應曲 線；
[0014] 圖7經不同濃度的丹酪酸A、丹酪酸C、毒胡蘿h素和環匹阿尼酸預處理比之后， 16 U M環匹阿尼酸在A431細胞上的劑量響應曲線。
【具體實施方式】
[0015] 現結合實例，對本發明做進一步說明。實例僅限于說明本發明，而非對本發明的限 定。
[0016] 實施例1 ;丹參中酪酸類化合物在HT-29細胞和A431細胞上的初步藥理學表征
[0017] 材料丹酪酸D來源于大連工業大學朱靖國實驗室，其余化合物購于上海源葉生物 科技有限公司；HT-29細胞和A431細胞購于中國科學院上海細胞庫；敏喘寧、己醜膽堿、組 胺、緩激膚、毒胡蘿h素和環匹阿尼酸購于Sigma公司。檢測平臺為康寧第H代Epic''成像 儀，檢測的信號為細胞動態質量重置值MR)引起的波長位移。
[0018] 將處于對數生長期的HT-29細胞和A431細胞，分別接種于384孔的細胞板的不同 孔中，每孔的接種體積為40 U L每孔接種的細胞數目分別為3. 2 X IO4和2. 5 X IO4個，將接 種好的細胞板置于細胞培養箱中培養20-2化，至細胞融合度達95%左右，HT-29細胞進行 活性實驗，A431細胞需要繼續饑餓24h再進行實驗。首先監測丹參中酪酸類化合物（終濃 度為IOuM)作用于HT-29細胞和A431細胞的響應信號；然后使用敏喘寧（終濃度為IyM) 和己醜膽堿（終濃度為16 U M)處理HT-29細胞，使用緩激膚（終濃度為16nM)和組胺（終 濃度為IuM)處理A431細胞，監測待測化合物對探針分子作用于細胞的影響。
[0019] 將丹參中酪酸類化合物迷迭香酸（1)、紫草酸（2)、丹酪酸A(3)、丹酪酸B(4)、丹酪 酸"5)、丹酪酸0化）、丹參素（7)、咖啡酸（8)、異阿魏酸巧）、鼠尾草酪（10)、原兒茶醒（11) 和熊果酸（12) W 10 U M的終濃度作用于HT-29細胞（圖1)，從丹參中酪酸類化合物本身響 應信號圖IA中，可W發現丹酪酸A與丹酪酸C表現出比較強的正DMR信號，并且丹酪酸C 的響應強度大于丹酪酸A的響應強度；迷迭香酸、紫草酸、丹酪酸B和丹參素的響應信號為 較弱的正信號；其他的丹參化合物沒有明顯的DMR信號。經丹參中酪酸類化合物對HT-29 細胞的預處理比后，加入濃度1 U M的敏喘寧繼續監測比，結果如圖IB所示，發現經丹酪酸 A和丹酪酸C預處理之后敏喘寧的響應信號大大降低，由于敏喘寧是GPR35的激動劑，可推 斷丹酪酸A和丹酪酸C對GPR35有較強的激動作用；經紫草酸、丹酪酸B和丹參素預處理之 后，敏喘寧的響應信號也部分的降低，可推斷紫草酸、丹酪酸B和丹參素對GPR35有較弱的 激動作用。經丹參中酪酸類化合物對HT-29細胞的預處理Ih后，加入濃度16 U M的己醜膽 堿繼續監測比，結果如圖IC所示，發現丹酪酸A和丹酪酸C對己醜膽堿的響應信號有微弱 的影響而其他化合物對己醜膽堿的響應信號沒有影響。
[0020] 將丹參中酪酸類化合物W 10 U M的終濃度作用于A431細胞（圖2)，從丹參中酪 酸類化合物本身響應信號圖2A中，可W發現丹酪酸A與丹參酸C表現出比較強的正DMR信 號，并且丹酪酸C的響應強度大于丹酪酸A的響應強度；迷迭香酸、紫草酸、丹酪酸B和鼠尾 草酪的響應信號為較弱的正DMR信號；其他的丹參化合物沒有明顯的響應信號。經過丹參 中化合物對A431細胞的預處理比，分別加入16nM緩激膚和1 U M組胺，結果如圖2B和2C 所示，發現丹酪酸A和丹酪酸C對緩激膚和組胺的響應信號都有一定的脫敏作用。
[0021] 實施例2 ;丹參中某些酪酸類化合物作用于GPR35受體的發現與驗證
[0022] 通過比對圖IA和1B，推斷丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹參素的作用革己 點為GPR35受體，本次實驗從激動、脫敏和枯抗H個角度去驗證分析。
[0023] 首先是激動分析，將丹酪酸A、丹酪酸B、丹酪酸C、紫草酸和丹參素作用于HT-