一種制備聚乙二醇-蛋白質纖維復合人工心臟瓣膜的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫用材料技術領域，具體涉及一種制備聚乙二醇-蛋白質纖維復 合人工心臟瓣膜的方法。
【背景技術】
[0002] 心臟瓣膜疾病是危及人類健康的一種重要疾病，心臟瓣膜的鈣化及纖維化導致左 心室流出道梗塞和主動脈瓣重度狹窄，至今未有任何外科手術及藥物可治愈鈣化瓣膜病變 等疾病，唯一可行的辦法是瓣膜置換，現在應用于臨床的人工瓣膜包括機械瓣膜和生物瓣 膜。然而機械瓣膜置換術后需終生服用抗凝血藥物，否則會出現血栓等并發癥。考慮到機 械瓣膜植入體內會引起不良反應，生物瓣膜于20世紀70年代產生并逐漸發展起來。現在， 可行的生物心臟瓣膜有以下幾種類型：豬異種瓣膜、牛心包瓣膜、同種異體瓣膜（也叫同種 移植，來源于捐贈人）和自身移植物（源于自體患者的組織）。同種異體移植和異種移植能 夠誘發纖維組織的生長，可以將阻塞性血栓的發病率控制在〇. 2-1. 8%之間，將瓣膜功能性 障礙疾病發病率控制在2~4%之間。但隨著移植時間的增加，生物瓣膜極易發生衰敗和鈣 化，平均壽命僅為7-20年，特別是對于青少年移植受體人群而言，將面臨著多次手術的痛 苦。因此，需要研制具有更好的結構和生物性能的人工瓣膜，以滿足置換受體對瓣膜耐久性 強、組織相容性良好及無需終生抗凝血的需求。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的是針對當前臨床上常用的人工機械瓣膜需終生服用抗凝藥及生物 瓣膜的鈣化和免疫排斥等問題，提供一種制備聚乙二醇-蛋白質纖維復合人工心臟瓣膜的 方法，利用力學性能優良的雞蛋膜蛋白質纖維和生物相容性良好的聚乙二醇為原材料制備 復合層狀人工心臟瓣膜，并可通過調節蛋膜的層數、聚乙二醇溶液的體積和濃度來控制復 合層狀人工心臟瓣膜的厚度和強度，具有重要的臨床應用價值。
[0004] 為實現上述目的，本發明的技術方案如下：
[0005] -種制備聚乙二醇-蛋白質纖維復合人工心臟瓣膜的方法，該方法是以雞蛋膜和 聚乙二醇為原材料，首先通過光交聯方法制備聚乙二醇水凝膠包敷蛋白質纖維的層狀復合 材料，然后利用分子交聯劑進行化學交聯，獲得所述聚乙二醇-蛋白質纖維復合人工心臟 瓣膜。該方法具體包括如下步驟：
[0006] (I)PEGDA的制備：由聚乙二醇（poly (ethylene glycol)，簡寫PEG)與丙稀酰氯 經化學反應合成并純化制備可光交聯的聚乙二醇雙丙稀酸酯（poly(ethylene glycol) diacrylate，簡寫 PEGDA);
[0007] (2)雞蛋膜的預處理：將清潔后的雞蛋膜浸泡在PBS溶液中并置于4°C冰箱中儲 存，光交聯前將雞蛋膜剪裁成所需形狀和尺寸的樣品，并置于PEGDA預成膠溶液中浸泡30 分鐘以上；
[0008] (3)制備所需尺寸與厚度的聚二甲基硅氧烷（PDMS)模板，在PDMS模板中央挖 空一個與雞蛋膜樣品相同形狀和尺寸的空白區域，將該PDMS模板放在一片有Sigraacot# 涂層的載玻片上，然后在PDMS模板上的空白區域放置預處理后的雞蛋膜樣品，樣品上再 補充PEGDA預成膠溶液將PDMS模板中央空白區域填滿，在PDMS模板上面蓋上另一片有 SigmacoteK涂層的載玻片密封；
[0009] (4)利用冷白光或紫外光交聯，雞蛋膜表面的PEGDA預成膠溶液交聯形成PEG水 凝膠，最終形成PEG水凝膠包敷雞蛋膜的復合層狀材料；若采用的冷白光交聯，交聯時間為 1-2分鐘；若米用紫外光交聯，交聯時間為10-30分鐘。
[0010] (5)將步驟（4)所得復合層狀材料浸泡在分子交聯劑（如戊二醛）溶液中，化學交 聯后即獲得聚乙二醇-蛋白質纖維復合人工心臟瓣膜。
[0011] 上述步驟（2)中，雞蛋膜的清潔過程為：去除生雞蛋中的蛋黃和蛋清，從雞蛋氣室 處將雞蛋膜與蛋殼剝離后，使用去離子水清洗；然后使用酸液浸泡方法去除雞蛋膜上殘留 的碳酸鈣（CaCO 3)顆粒，再用去離子清洗干凈。使用酸液浸泡方法去除雞蛋膜上的0&〇)3顆 粒時，所采用的酸為濃度l-Smol/L的醋酸溶液，處理時間為2-12小時，處理溫度為4°C ;采 用該工藝保證酸處理后雞蛋膜蛋白質纖維能夠完好保存下來，并且力學性能不受影響。
[0012] 上述步驟⑵中，將步驟（1)得到的PEGDA先制備成PEGDA預成膠溶液，所制備 的PEGDA預成膠溶液中，用于冷白光交聯的PEGDA預成膠溶液是含質量百分比10-30% PEGDA(分子量 1000-3400g/mol)、體積百分比 1-2 % 三乙醇胺（triethanolamine， 簡寫ΤΕ0Α)、10 μ mol/L曙紅（Eosin Y)和體積百分比0. 375 % N-乙烯基吡咯烷酮 (N-vinylpyrrolidone，簡寫NVP)的PBS溶液；用于紫外光交聯的PEGDA預成膠溶液是含 3g/L Irgacure2959(2_hydroxy-4〇-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophe-none)的PBS 溶液。
[0013] 上述步驟（3)中，制作PDMS模板的厚度由所采用雞蛋膜的層數決定（單層雞蛋膜 的厚度為60-100 μ m)，PDMS模板厚度0· 3-lmm〇
[0014] 上述步驟（5)中，所述分子交聯劑為戊二醛溶液，戊二醛質量百分比濃度為 0. 25-2% ;化學交聯時間為2-12小時。
[0015] 本發明設計原理如下：
[0016] 本發明通過光交聯聚乙二醇水凝膠包敷雞蛋膜蛋白質纖維制成復合材料，進一步 利用分子交聯劑（如戊二醛）交聯而制備復合層狀人工心臟瓣膜。本發明以雞蛋膜和聚乙 二醇為原料，其中雞蛋膜來源豐富，由蛋白質纖維組成；而聚乙二醇是較為常用的具有良好 生物相容性和生物惰性的高分子材料，另外通過光交聯法制得聚乙二醇水凝膠不僅保證了 人工瓣膜材料的一體性，而且保護了包敷的蛋白質纖維阻止其體內被酶解降解，且防止人 工瓣膜的鈣化。此外，可通過改變包覆的雞蛋膜數量以及聚乙二醇水凝膠的濃度和體積來 控制瓣膜材料的厚度和強度，以滿足不同患者的個體需求。該種方法所制備的人工心臟瓣 膜材料模仿了人體主動脈瓣的層狀結構，實現了與其相近的力學性能，同時保證了良好的 生物相容性，可滿足置換受體對瓣膜耐久性強、組織相容性良好及無需終生抗凝血的需求。
[0017] 與現有心臟瓣膜制備技術相比，本發明的有益效果體現在：
[0018] 1、本發明以雞蛋膜作為內層材料實現與人體瓣膜相似的機械性能；外層包敷 PEGDA水凝膠提供良好的生物相容性和生物惰性，且保護內層的蛋白質纖維不被酶降解。
[0019] 2、本發明提出的聚乙二醇-蛋白質纖維復合人工心臟瓣膜，可以克服現有機械瓣 需要終生使用抗凝藥以及生物瓣膜體內降解和鈣化等問題。
[0020] 3、本發明可以實現依據所加蛋膜層數和聚乙二醇溶液體積來制備不同厚度和強 度的復合層狀人工心臟瓣膜。所制備瓣膜材料的厚度可以根據需求制成厚度為〇. 3-1_。 所制備瓣膜材料的力學強度由所加入的雞蛋膜的層數、PEGDA水凝膠的體積和濃度決定。所 制備瓣膜材料的彈性模量多3. 3MPa，延伸率大于35%。
【附圖說明】
[0021] 圖1為原始雞蛋膜的蛋白質纖維的掃描電鏡照片；其中：(a)為雞蛋膜外層；(b) 為雞蛋膜內層。
[0022] 圖2為PDMS模版法制備聚乙二醇-蛋白質纖維復合層狀結構示意圖。
[0023] 圖3為采用4層雞蛋膜與質量百分比濃度為20% PEGDA溶液制備600 μm厚的聚 乙二醇-蛋白質纖維復合層狀材料（分子交聯劑處理前）。
[0024] 圖4為采用4層雞蛋膜與質量百分比濃度為20% PEGDA溶液制備600 μm厚的人 工心臟瓣膜（分子交聯劑處理后）。
[0025] 圖5為4層雞蛋膜與質量百分比濃度為20% PEGDA溶液制備600 μm厚的人工心 臟瓣膜經戊二醛交聯后在小鼠皮下包埋2周后周圍組織切片的HE染色照片；其中：（a)為 4倍放大圖；(b)為10倍放大圖。
[0026] 圖6為4層雞蛋膜與質量百分比濃度為20% PEGDA溶液制備400 μm厚的人工心 臟瓣膜經戊二醛交聯后及在I型膠原酶中浸泡2周之后的彈性模量。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合實施例和附圖對本發明的技術方案做進一步說明。
[0028] 本發明是以雞蛋膜和聚乙二醇為原材料，蛋膜是由富含膠原蛋白和角蛋白的纖維 組成的網狀膜結構。通過將蛋膜的蛋白質纖維與聚乙二醇水凝膠復合制備人工心臟瓣膜。 本發明主要工藝流程為：蛋膜原材料一去除CaCO 3顆粒一PDMS模版制作一雞蛋膜纖維與 PEGDA水凝膠光交聯一分子交聯劑化學交聯一人工心臟瓣膜。具體過程如下：由聚乙二醇 (PEG，平均分子量3350g/mol)與丙烯酰氯反應制備聚乙二醇雙丙烯酸酯（PEGDA) [Zhang Xj Xu B，Puperi DSj Yonezawa AL, Wu Yj Tseng H，Cuchiara ML，West JLj Grande-Alien KJ. Integrating Valve-Inspired Design Features Into Poly (ethylene glycol) Hydrogel Scaffolds for Heart Valve Tissue Engineering. Acta Biomaterialia 2015 ； 14:11-21.]。去除生雞蛋中的蛋黃和蛋清，從雞蛋氣室處將雞蛋膜小心剝離，去離子水清 洗3次，將蛋膜浸泡在醋酸溶液去除蛋膜上的CaCO 3顆粒（保存了雞蛋膜原始蛋白質纖維 結構，圖I)，4°C下儲存于PBS溶液中。光交聯前將上述雞蛋膜浸泡于PEGDA溶液中30分 鐘以上。采用常規方法制備不同厚度