一種含內通道網絡和定向孔隙結構的仿生組織工程支架及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種含內通道網絡和定向孔隙結構的仿生組織工程支架及其制備方法與應用，屬于組織工程和生物制造技術領域。
【背景技術】
[0002]組織工程(Tissue Engineering)是一門前沿交叉科學，其基本原理為:通過在體外構建細胞與支架的三維復合體，模擬生物體內環境，并加以培養和訓練，得到具備修復或替代功能的組織。目前組織工程已經在皮膚、骨/軟骨、膀胱、血管、肝臟、神經等領域得到迅速發展，為人類面臨的大多數醫學難題帶來了新的希望，如心血管疾病、阿爾茲海默病、帕金森病、先天性遺傳缺陷等疾病和各種組織器官損傷的治療。
[0003]組織工程支架通過仿生細胞外基質，為細胞提供力學支撐，促進細胞黏附、生長、增殖、迀移和新陳代謝，是組織工程的關鍵因素之一。對于一些天然組織(如心肌、骨骼肌、神經)，其中實質細胞定向有序排列、連接，如心肌組織中心肌細胞沿膠原纖維排布并通過閏盤連接，這一組織特性在心肌電信號的傳導方面發揮著重要作用。現有研究表明，具有微觀定向微觀孔隙結構的組織工程支架，在一定程度上通過材料的微觀結構能夠誘導心肌細胞的定向排列和連接(HTH Au, B Cui, et al.Cell culture chips forsimultaneous applicat1n of topographical and electrical cues enhance phenotypeof card1myocytes [J].Lab Chip, 2009, 9:564 - 575.);電場刺激可以促進心肌細胞分別沿著電場方向的生長和排布(Radisic M, Park H, Shing Η, et al.Funct1nal assembly ofengineered myocardium by electrical stimulat1n of cardiac myocytes cultured onscaffolds.Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences of the United Statesof America, 2004, 101 (52): 18129-18134.);體外力學拉伸刺激可以促進細胞沿著應力方向生長和排布(Tandon et al.Alignment and Elongat1n of Human Adipose-DerivedStem Cells in Response to Direct-Current Electrical Stimulat1n.Conf Proc IEEEEng Med B1l Soc.2009，1:6517 - 6521.)，但相應的作用規律尚未見深入的研究報道。傳統的組織工程支架制造方法如溶液澆鑄/致孔劑析出法、熱致相分離法、電紡絲法、氣壓造孔法等，制備的支架多為各向同性、均勻隨機孔隙結構。目前用于成形定向微觀孔隙結構支架的方法主要有定向結晶-熱致相分離法和定向電紡絲兩種。
[0004]另一方面，血管化問題是組織工程研究的共性問題，也是制約組織工程進一步發展的瓶頸。對于代謝旺盛的組織如心肌、肝臟，由于細胞具有很高的物質及能量代謝水平，而氧和營養物質在支架內的傳輸距離有限，因此如何建立有效的血管網絡、解決內層細胞缺氧壞死一直是組織工程所面臨的重要難題。已有的灌注培養、提高周圍環境氧含量、添加氧載體和體內移植等方式可以使構建的人工組織活細胞層厚度達到500 μπι。有研究表明，添加內皮細胞、促血管生長因子等物質可以促進體內移植后毛細血管樣組織生成。但是上述方法并沒有形成類似分級貫通的血管網絡，并不能從根本上解決支架內部細胞的供氧問題。因此，構建含內通道網絡的定向微觀孔隙支架，對于心肌組織工程及骨骼肌、神經組織工程具有重要意義。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種含內通道網絡和定向孔隙結構的仿生組織工程支架及其制備方法與應用，本發明含內通道網絡和定向孔隙結構的仿生組織工程支架充分模擬了某些天然組織如心肌、骨骼肌、神經的特征一 “細胞定向有序排布、含多級血管網絡”的結構，具有定向微觀孔隙結構及多分支通道網絡，其中定向大孔之間存在相互貫通的橫向小孔，而多分支通道網絡結構直接貫通或通過定向微觀孔隙結構接貫通。本發明仿生組織工程支架可以誘導細胞定向排布、連接和生長，為支架內部細胞提供氧和營養物質，促進血管生成，并提高支架內細胞種植密度和深度，形成大塊組織替代物，有望大大提高病損組織器官修復的效率。
[0006]本發明所提供的含內通道網絡和定向孔隙結構的仿生組織工程支架，包括支架主體和設置于所述支架主體內的通道網絡；
[0007]所述支架主體具有定向微觀孔隙結構，且所述定向微觀孔隙結構的定向大孔之間通過橫向小孔實現相互貫通；
[0008]所述支架主體由可降解的天然高分子材料制成；
[0009]所述通道網絡具有分級多分支結構；
[0010]所述通道網絡的分支之間是相互貫通的。
[0011]上述的仿生組織工程支架中，所述通道網絡的分支之間為直接貫通。
[0012]上述的仿生組織工程支架中，所述通道網絡的分支之間通過所述支架主體的孔隙相互貫通。
[0013]上述的仿生組織工程支架中，所述定向大孔的截面直徑可為20 μπι?250 μπι，具體可為 20 ?100 μηι、50 ?200 μπι 或 100 ?250 μm,取向度(Orientat1n Index，01)可為0.8?1，具體可為0.8?0.9，0.9?0.95或0.92?0.95 ；
[0014]所述通道網絡的分支的截面直徑可為50 μ m?3000 μ m，具體可為50?1500 μ m、200 ?1000 μ m 或 1000 ?3000 μ m ；
[0015]所述通道網絡具有1?4級分支結構，如2級或3級分級結構。
[0016]上述的仿生組織工程支架中，所述可降解的天然高分子材料可為膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、明膠、絲素蛋白、透明質酸、纖維蛋白原和白蛋白中的至少一種。
[0017]本發明進一步提供了所述含內通道網絡和定向孔隙結構的仿生組織工程支架的制備方法，包括如下步驟:
[0018]1)通過快速成型法或鑄模法，將內芯材料成型，得到具有所述通道網絡結構的內芯結構；
[0019]2)將所述內芯結構固定于定向支架模具內，然后將所述可降解的天然高分子材料的溶液注滿所述定向支架模具的型腔；將所述定向支架模具置于低于0°c的定向溫度場中，實現所述可降解的天然高分子材料的溶液的定向結晶及熱致相分離，然后經冷凍干燥得到含有內芯結構、具有定向結構的組織工程支架；
[0020]3)去除步驟2)得到的所述組織工程支架中的所述內芯結構，即得到含內通道網絡和定向孔隙結構的仿生組織工程支架。
[0021]上述的制備方法中，步驟1)中，所述內芯材料為具有較好的可溶性、生物相容性及力學性能的材料，具體可為糖類化合物、明膠和堿溶性光敏聚合物中的至少一種；
[0022]所述糖類化合物可為葡萄糖、麥芽糖和蔗糖中至少一種；
[0023]所述明膠的分子量可為15000?250000Da，可以是A型明膠，也可以是B型明膠；
[0024]所述堿溶性光敏聚合物可為二甲基-丙烯酰胺、甲基丙烯酸和聚乙烯基吡咯烷酮的共聚物，三者的質量比為11:11:3。
[0025]上述的制備方法中，步驟1)中，所述快速成型法可采用連續擠出工藝、立體光刻工藝和激光微熔覆燒結等工藝中的一種；所述鑄模法具體為:通過制備含所述通道網絡結構的PDMS模具，在其中澆鑄液態內芯材料，通過冷卻或者光聚合固化，成形多分支形態的可溶性內芯。
[0026]上述的制備方法中，所述內芯材料為所述糖類化合物和/或明膠時，步驟2)之前，所述方法還包括將所述內芯結構置于PLGA溶液(如濃度為0.1?lmg/mL)中的步驟，以在所述內芯結構的表面形成保護薄膜；
[0027]步驟2)中，所述定向溫度場的溫度沿所述定向支架模具的長度方向變化；
[0028]所述定向溫度場的熱端的溫度可為0°C，冷端的溫