一種抗結腸癌小葉黑柴胡浸膏粉的規模化制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物化學及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種抗結腸癌小葉黑柴胡浸膏粉的規模化制備方法。
【背景技術】
[0002]小葉黑柴胡(及//??"/??smithii var.parvifolium Shan et Y.Li)為傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(BupIeurum)植物的干燥根，主要分布于青海、甘肅、寧夏及內蒙古等地。現代研究表明小葉黑柴胡中化學成分主要包括黃酮類、皂苷類、木脂素類、留醇類化合物，胡淑婷等證實了小葉黑柴胡乙醚提取液可誘導MGC-803細胞凋亡，細胞死亡率、細胞生長抑制率升高，克隆形成率降低，細胞DNA含量熒光值測定與對照組比較有統計學意義(胡淑婷，奧海航，王英華等.小葉黑柴胡誘導人胃腺癌MGC-803細胞凋亡的實驗研究，寧夏醫學院學報，2007，29 (I):13-15.)。
[0003]目前，中國專利(101579375B)報道采用乙醇提取、大孔吸附樹脂兩步獲得具有治療肝、膽疾病藥物的柴胡提取物，然而從小葉黑柴胡中規模化制備抗結腸癌浸膏粉的研究未見文獻報道。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種工藝簡單、易規模化實施、重復性較好、質量穩定可控的抗結腸癌小葉黑柴胡浸膏粉的規模化制備方法。
[0005]為解決上述問題，本發明所述的一種抗結腸癌小葉黑柴胡浸膏粉的規模化制備方法，包括以下步驟:
⑴提取:將小葉黑柴胡藥材粉碎至30~100目后，加入體積分數為95%的乙醇溶液或甲醇溶液進行醇提，經過濾得到濾液；該濾液經減壓干燥至膏狀，即得小葉黑柴胡醇提物；
⑵液液分配富集:所述小葉黑柴胡醇提物用其質量30~50倍的分析純水分散，得到分散液；該分散液用其30~50倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；所述乙酸乙酯萃取液經減壓干燥得小葉黑柴胡乙酸乙酯部位；
⑶樹脂柱色譜除雜:在所述小葉黑柴胡乙酸乙酯部位中加入其質量2~5倍的體積分數為5~20%的甲醇溶液進行溶解，然后經樹脂柱分離，并依次以水溶液、體積分數為90%的甲醇溶液按2~5倍的柱體積進行梯度洗脫，收集90%甲醇洗脫物；該90%甲醇洗脫物經減壓干燥即得小葉黑柴胡浸膏粗粉；
⑷硅膠柱層析分離:在所述小葉黑柴胡浸膏粗粉中加入其質量2~5倍體積分數為80-100%的甲醇溶液進行溶解，經硅膠柱色譜分離后，用5~10倍柱體積的氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按每份200~500 mL收集餾分，并經薄層色譜檢測，其中展開劑為氯仿、甲醇按5:5的體積比混合而成的混合溶劑，顯色劑為體積濃度10%的濃硫酸乙醇溶液，合并Rf值為
0.2-0.7的餾分；所述Rf值為0.2-0.7的餾分經減壓干燥，即得呈黃色粉末狀的小葉黑柴胡浸膏粉。
[0006]所述步驟⑴中醇提條件是指料液比為Ikg:10~20L、溫度為60°C ~95°C、提取次數為1~3次、每次提取時間為1~3 ho
[0007]所述步驟⑴、所述步驟⑵、所述步驟⑶及所述步驟⑷中的減壓干燥條件均是指真空度為 0.06-0.09 MPa,溫度為 50-65 °C。
[0008]所述步驟⑶中樹脂柱為HP20SS型樹脂柱或MCI型樹脂柱。
[0009]所述步驟⑷中氯仿-甲醇混合溶劑是指氯仿和甲醇按7:3~3:7的體積比混合而成的溶劑。
[0010]所述步驟⑷中娃膠柱的尺寸為30 mm~60 mmX60 mm -100 mm。
[0011]如上所述的一種抗結腸癌小葉黑柴胡浸膏粉的規模化制備方法制得的小葉黑柴胡浸膏粉在制備抗結腸癌藥物或保健食品中的應用，其特征在于:該小葉黑柴胡浸膏粉作為有效組分按常規方法與藥學上可接受的任何載體制成各類抗結腸癌藥用制劑，或作為有效組分按常規方法與食品科學上可接受的任何載體制成各類保健類食品。
[0012]本發明與現有技術相比具有以下優點:
1、本發明采用95%乙醇溶液或甲醇溶液提取，溶解可以回收利用，平均成本廉價，且易規模化實施。
[0013]2、本發明采用液液分配法富集小葉黑柴胡中乙酸乙酯部位，溶劑價格低廉，且可以再生循環使用，易于規模化。
[0014]3、本發明樹脂柱可以再生循環使用，同時樹脂有脫色的功效，且回收率較高。
[0015]4、本發明采用硅膠柱層析分離，可直接將小葉黑柴胡中揮發性類組分與目標化合物分開，同時去除部分強極性雜質。
[0016]5、本發明原料要求不高，一般市場上或野生原材料即可，易于批量備料。
[0017]6、本發明工藝簡單、重復性較好、質量穩定可控，所得到的小葉黑柴胡浸膏粉經二維制備色譜分離純化及NMR氫譜、碳譜分析，依次判定主要含有柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及蘆丁等其他化合物。
[0018]7、本發明所獲得的小葉黑柴胡浸膏粉經測試，具有很好的抗結腸癌的作用。
[0019]⑴實驗方法采用國際通用的MTT測定方法進行:首先，在96孔細胞板上接種2X 14個對數生長期的結腸癌細胞HCT116，3個復孔，細胞貼壁后；再加入不同濃度待測樣品，共設置7個藥物濃度梯度，分別為:1.0 μ g/mL、5.0 μ g/mL、10.0 μ g/mL、20 μ g/mL、30 μ g/mL,40 μ g/mL和50 μ g/mL的該小葉黑柴胡浸膏粉樣品組；72小時后，于96孔板對應孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μ L，繼續培養3 h ;棄去96孔板中上清液，加入100UL DMSO溶解，使用酶標儀檢測570 nm波長下的吸光值并計算待測樣品對結腸癌細胞生長的半數抑制濃度IC5。。
[0020]⑵實驗結果表明，實施例1~3組小葉黑柴胡浸膏粉對結腸癌細胞株均有明顯的抑制作用，依次為 48.2 μ g/mL,47.6 μ g/mL,48.5 μ g/mL，平均值為 48.1 μ g/mL。
【具體實施方式】
[0021]實施例1 一種抗結腸癌小葉黑柴胡浸膏粉的規模化制備方法，包括以下步驟:
⑴提取:將2.0 Kg小葉黑柴胡藥材粉碎至30目后，加入體積分數為95%的乙醇溶液或甲醇溶液進行醇提，經過濾得到濾液；該濾液在真空度為0.06 MPa、溫度為65°C的條件下經減壓干燥至膏狀，即得小葉黑柴胡醇提物378.2 go
[0022]其中:醇提條件是指料液比為Ikg:10L、溫度為95°C、提取次數為3次、每次提取時間為I h。
[0023]⑵液液分配富集:小葉黑柴胡醇提物用其質量30倍的分析純水分散，得到分散液；該分散液用其30倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液；乙酸乙酯萃取液在真空度為0.06 MPa、溫度為65°C的條件下經減壓干燥得小葉黑柴胡乙酸乙酯部位140.8 go
[0024]⑶樹脂柱色譜除雜:在小葉黑柴胡乙酸乙酯部位中加入其質量2倍的體積分數為20%的甲醇溶液進行溶解，然后經樹脂柱分離，并依次以水溶液、體積分數為90%的甲醇溶液按2倍的柱體積進行梯度洗脫，收集90%甲醇洗脫物；該90%甲醇洗脫物在真空度為0.06MPa、溫度為65°C的條件下經減壓干燥即得小葉黑柴胡浸膏粗粉125.2 g。
[0025]其中:樹脂柱為HP20SS型樹脂柱。小葉黑柴胡乙酸乙酯部位與樹脂比例為I g:30 mLo
[0026]⑷硅膠柱層析分離:在小葉黑柴胡浸膏粗粉中加入其質量5倍體積分數為80%的甲醇溶液進行溶解，經硅膠柱色譜分離后，用5倍柱體積的氯仿-甲醇混合溶劑洗脫，按每份200 mL收集餾分，并經薄層色譜檢測，其中展開劑為氯仿、甲醇按5 mL:5 mL的體積比混合而成的混合溶劑，顯色劑為體積濃度10%的濃硫酸乙醇溶液，合并Rf值為0.2-0.7的餾分；Rf值為0.2-0.7的餾分在真空度為0.06 MPa、溫度為65°C的條件下經減壓干燥，即得呈黃色粉末狀的小葉黑柴胡浸膏粉85.9 go
[0027]其中:氯仿-甲醇混合溶劑是指氯仿和甲醇按3:7的體積比(mL/ mL)混合而成的溶劑。
[0028]娃膠柱的尺寸為30 mmX60 mm。
[0029]實施例2 —種抗結腸癌小葉黑柴胡浸膏粉的規模化制備方法，包括以下步驟:
⑴提取:將10.0 Kg小葉黑柴胡藥材粉碎至100目后，加入體積分數為95%的乙醇溶液