對于穩定含有蛋白質的制劑有用的組合物和方法
【專利說明】對于穩定含有蛋白質的制劑有用的組合物和方法
[0001] 本申請為2011年3月21日提交的、發明名稱為"對于穩定含有蛋白質的制劑有用 的組合物和方法"的PCT申請PCT/US2011/029206的分案申請，所述PCT申請進入中國國家 階段的日期為2012年9月24日，申請號為201180018192. 3。
[0002] 相關申請
[0003] 本申請是基于37CFR I. 53(b) (1)提交的非臨時申請，基于35USC119(e)要求于 2010年3月22日提交的臨時申請號61/316326的優先權，其內容通過引用整合到本文中。 發明領域
[0004] 本發明涉及非表面活性劑化合物（包括例如聚氧乙烯（POE)山梨聚糖和聚乙二醇 (PEG))用于穩定含有蛋白質的制劑和用于防止此類制劑中的蛋白質聚集的用途。
[0005] 發明背景
[0006] 當需要蛋白質制劑的穩定劑以保護蛋白質免受振蕩、攪拌、剪切作用和凍融，或 在界面上的靜止狀態而造成的變性時，通常使用非離子去垢劑（即，表面活性劑）（參見 例如，美國專利號5, 183, 746)。作為示例的是在許多含有蛋白質的產品中聚山梨酸酯 的用途。例如，聚山梨酸酯2〇和8〇 ( Tween? 20和Tween? 80 )用于生物治療性 產品的制劑中，用于防止表面吸附和作為抵抗蛋白質聚集的穩定劑（Kerwin, J. Pharm. Sci. 97(8) :2924-2936(2008))。聚山梨酸酯是兩親性的、非離子型表面活性劑，由聚氧乙烯 (POE)山梨聚糖的脂肪酸酯組成，聚山梨酸酯20是聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯，而聚山 梨酸酯80是聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯。
[0007] 然而不幸的是，聚山梨酸酯可以通過氧化或水解進行降解。當聚山梨酸酯分子降 解時，產生多種降解副產物，包括例如脂肪酸、POE山梨聚糖、PEG、PEG酯和烷基酸。聚山梨 酸酯降解的這類副產物中的某些（包括游離的脂肪酸）可以導致含有蛋白質的制劑中增加 的濁度和蛋白質聚集。因此，雖然聚山梨酸酯通常作為蛋白質穩定劑使用，但隨時間從聚山 梨酸酯降解中釋放的脂肪酸和其他降解副產物可以不利地影響聚山梨酸酯在含有蛋白質 的制劑中表現出的保護效果。
[0008] 因此，需要對于防止蛋白質在含有蛋白質的水性制劑中聚集的有用的額外的組合 物。
[0009] 發明概沐
[0010] 本發明基于這樣的新發現，即，以某些濃度存在于水性制劑中的聚氧乙烯（POE) 山梨聚糖和聚乙二醇（PEG)對于穩定含有蛋白質或含有肽的制劑，和對于防止蛋白質在此 類制劑中的聚集是有用的。
[0011] 因此，在一個方面，本發明涉及包含抗體或其他蛋白質或肽，和POE山梨聚糖的物 質組合物。在一個實施方案中，聚氧乙稀山梨聚糖以從約20ppm至約100, OOOppm的濃度存 在。在另一個實施方案中，包含抗體或其他蛋白質或肽和POE山梨聚糖的物質組合物不含 非離子型表面活性劑，例如，不含聚山梨酸酯。任選地，物質組合物還可以不含凍干保護劑 (Iyoprotectant)，例如糖、游離氨基酸及其變體等。在某些實施方案中，物質組合物可以是 水性的或固體的形式。
[0012] 在另一個方面，本發明涉及包含抗體或其他蛋白質或肽和聚乙二醇的物質組合 物。在某些實施方案中，聚乙二醇在所述物質組合物中以低于約10, OOOppm的濃度存在，優 選在約20ppm至約10, OOOppm之間。在另一個實施方案中，物質組合物任選地包含至少一 種POE山梨聚糖，所述POE山梨聚糖任選地以從約20ppm至約100, OOOppm的濃度存在于所 述物質組合物中。物質組合物還可以任選地不含非離子型表面活性劑，例如，不含聚山梨酸 酯。任選地，物質組合物還可以不含凍干保護劑（Iyoprotectant)，例如糖、游離氨基酸及其 變體等。在某些實施方案中，物質組合物可以是水性的或固體的形式。
[0013] 在另一個方面，本發明涉及包含裝有任何本文描述的物質組合物的容器的制品。
[0014] 在另一個方面，提供了用于制備含有抗體（或其他蛋白質或肽）的穩定組合物方 法，通過共同混合抗體或其他蛋白質與POE山梨聚糖或PEG。
[0015] 在另一個方面，本發明涉及增加抗體或其他蛋白質或肽在水性制劑中的穩定性的 方法，包括混合抗體或其他蛋白質或肽與起穩定作用的量的POE山梨聚糖，其中POE山梨聚 糖增加抗體或其他蛋白質或肽的穩定性。在一個實施方案中，POE山梨聚糖以從約20ppm至 約100, OOOppm的濃度存在，可任選地不含非離子型表面活性劑（例如，不含聚山梨酸酯）， 或凍干保護劑，例如糖、游離氨基酸及其變體等。
[0016] 在另一個方面，本發明涉及增加抗體或其他蛋白質或肽在水性制劑中的穩定性的 方法，包括混合抗體或其他蛋白質或肽與起穩定作用的量的聚乙二醇，其中聚乙二醇增加 抗體或其他蛋白質或肽的穩定性。在一個實施方案中，聚乙二醇以低于約10, OOOppm，優選 地在約20ppm至約10, OOOppm之間的濃度存在。在另一個實施方案中，物質組合物任選地 包含至少一種POE山梨聚糖，所述POE山梨聚糖可任選地以從約20ppm至約100, OOOppm的 濃度存在，并且可以任選地不含非離子型表面活性劑（例如，不含聚山梨酸酯），或凍干保 護劑，例如糖、游離氨基酸及其變體等。
[0017] 在另一個方面，本發明涉及防止或降低抗體或其他蛋白質或肽在水性制劑中聚集 的方法，包括混合抗體或其他蛋白質或肽與POE山梨聚糖。在一個實施方案中，POE山梨聚 糖以從約20ppm至約100, OOOppm的濃度存在。水性制劑任選地不含非離子型表面活性劑 (例如，不含聚山梨酸酯），或凍干保護劑，例如糖、游離氨基酸及其變體等。在另一個實施 方案中，抗體或其他蛋白質的聚集是由攪拌水性溶液誘導的。
[0018] 在另一個方面，本發明涉及防止或降低抗體或其他蛋白質或肽在水性制劑中聚集 的方法，包括混合抗體或其他蛋白質或肽與聚乙二醇。在一個實施方案中，聚乙二醇以低于 約10, OOOppm，優選地在約20ppm至約10, OOOppm之間的濃度存在。在另一個實施方案中， 水性制劑任選地包含至少一種POE山梨聚糖，所述POE山梨聚糖任選地以從約20ppm至約 100, OOOppm的濃度存在，并且可以任選地不含非離子型表面活性劑（例如，不含聚山梨酸 酯），或凍干保護劑，例如糖、游離氨基酸及其變體等。另一個實施方案中，抗體或其他蛋白 質的聚集是由攪拌水性溶液誘導的。
[0019] 在從重組細胞蛋白質或其他污染性蛋白質中純化蛋白質、肽或抗體的方法中，本 發明的實施方案涉及這樣的改良，所述改良包括在純化過程中向蛋白質、肽或抗體添加 POE 山梨聚糖或聚乙二醇。
[0020] 本發明的另一個方面是通過在包含自我聚集型抗體或其他蛋白質或肽的水性溶 液中混合至少一種POE山梨聚糖或聚乙二醇，然后濃縮所述水性溶液，來制造另外的自我 聚集型抗體或其他蛋白質或肽的非聚集型水性溶液的方法。
[0021] 根據下文詳細的說明和實例，本發明的其他特征和優點是顯而易見的，但所述說 明和實例不應被視為限制。本申請全文引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內 容都明確的通過引用整合到本文中。 附圖簡介
[0022] 圖1顯示了從抗IL13抗體與多種添加物組合的濁度分析中獲得的結果，所述添加 物包括聚山梨酸酯20 (PS)、月桂酸（LA)或POE山梨聚糖20 (POE)。
[0023] 圖2顯示了從抗IL13抗體與多種添加物組合的蛋白質濃度分析中獲得的結果，所 述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種濃度。
[0024] 圖3顯示了從抗IgE抗體與多種添加物組合的蛋白質濃度分析中獲得的結果，所 述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種濃度。
[0025] 圖4顯示了從抗IL13抗體與多種添加物組合的濁度分析中獲得的結果，所述添加 物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種濃度。
[0026] 圖5顯示了從抗IgE抗體與多種添加物組合的濁度分析中獲得的結果，所述添加 物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種濃度。
[0027] 圖6顯示了從抗IL13抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析（大于2 μ m的顆粒） 中獲得的結果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種濃度。
[0028] 圖7顯示了從抗IgE抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析（大于2 μ m的顆粒） 中獲得的結果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種濃度。
[0029] 圖8顯示了從抗IL13抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析（大于10 μπι的顆 粒）中獲得的結果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種 濃度。
[0030] 圖9顯示了從抗IgE抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析（大于ΙΟμπι的顆粒） 中獲得的結果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種濃度。
[0031] 圖10顯示了從抗IL13抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析（大于50 μπι的顆 粒）中獲得的結果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種 濃度。
[0032] 圖11顯示了從抗IgE抗體與多種添加物組合的顆粒大小分析（大于50 μπι的顆 粒）中獲得的結果，所述添加物包括POE山梨聚糖20、PEG 1000或PEG 6000,都具有多種 濃度。
[0033] 優詵實施方案的詳細描沐
[0034] 通過參考下列對具體實施方案和本文囊括的實施例的詳細說明，可以更容易地理 解本發明。
[0035] 除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語都具有與發明所屬領域的普通 技術人員通常理解的相同含義。雖然任何與本文所述相似或等價的方法和材料也可用于實 踐或測試本發明，但本文描述了優選的方法和材料。本文提及的所有出版物都通過引用以 其整體整合到本文中。
[0036] 抗體和其他蛋白質的聚集主要是由疏水性相互作用導致的，最終導致變性。當部 分或完全未折疊的蛋白質的疏水區暴露在水中時，由于通常包埋著的疏水性內部現在暴露 在親水性的水性環境中，導致熱力學不利的情況。因此，來自圍繞疏水區的結構性水分子的 熵減少驅使變性的蛋白質聚集，聚集主要通過已暴露的疏水區。因此，也危及了蛋白質的溶 解度。在一些情況下，蛋白質亞基可在某些條件下發生自我關聯（不論是天然的或錯誤的 折疊），這可能導致沉淀和活性喪失。
[0037] 影響溶液中的蛋白質聚集的因素一般包括蛋白質濃度、pH、溫度、其他賦形劑和機 械脅迫。在純化、配合、生產、儲藏和使用過程中，一些因素（例如，溫度）比其他因素（例 如，機械脅迫）更易于控制。制劑研究將指定對pH和賦形劑的恰當選擇，所述選擇不誘導 聚集和/或實際上幫助防止聚集。蛋白質濃度由所需治療劑量指定，并根據該濃度的多少 將決定是否存在更高關聯狀態（二聚體、四聚體等）的可能性，這可以導致溶液中的聚集。 在制劑開發過程中必須進行仔細的研究，以確定何種因素影響蛋白質聚集，以及之后可以 如何消除或控制這些因素。
[0038] 需要鑒別用于腸道外的或其他施用中的抗體或其他蛋白質的穩定溶液制品，該需 求可以導致開發用于評估多種添加物對物理穩定性的影響的測試方法。基于已知的影響蛋 白質聚集的因素和對此類應用的要求，可以使用涉及攪拌或旋轉蛋白質溶液的機械方法來 評估物理穩定性。用于鑒別多種添加物防止聚集的能力的物理脅迫測試方法可以涉及暴露 于水平面上的振蕩或攪拌，或者距離以n rev/min在垂直面旋轉的輪軸X cm的旋轉。由聚 集導致的濁度通常由視覺觀察或光散射分析確定為時間的函數。備選地，可以通過HPLC測 定，將由于沉淀造成的可溶性蛋白質含量的降低定量為時間的函數。
[0039] 本發明是基于這樣的新發現，即在液體制劑中存在的某些濃度的聚氧乙烯（POE) 山梨聚糖和聚乙二醇（PEG)對于穩定含有蛋白質的制劑，和用于防止此類制劑中的蛋白質 聚集是有用的。
[0040] 因此，在一個方面，本發明描述了包含不論高或低濃度的抗體或其他蛋白質以及 POE山梨聚糖的物質組合物。如本文中使用的，"聚氧乙烯山梨聚糖"或"Ρ0Ε山梨聚糖"指 具有下列化學結構的非表面活性劑化合物：
[0041π
[0042] 其中a+b+c+d優選是從約6至約80,更優選是從約8至約60,更優選是從約10至 約40,和更優選是從約10至約20。如上述，本領域技術人員應理解化合物（例如本文描述 的POE山梨聚糖）的化學合成導致化合物的一定程度的異源混合物，而非完全同源的制品。 由此可見，當本文中描述a+b+c+d是例如優選從約6至約80時，應理解所述定義是指由其 化學合成獲得的異源混合物的主要組分。
[0043] POE山梨聚糖可以單個地用作抗體或其他蛋白質的穩定劑，或者可以與其他POE 山梨聚糖組合使用，用于穩定水性溶液中的抗體或其他蛋白質。在濃度范圍廣泛的水性溶 液中，POE山梨聚糖可用作抗體或其他蛋白質的穩定（或抗聚集）劑。在本發明的某些實施 方案中，在含有抗體或其他蛋白質的水性制劑中，POE山梨聚糖（如果用作單個穩定劑）或 POE山梨聚糖（如果組合使用）能以從約20ppm至約100, OOOppm，更優選以從IOOppm至約 50, OOOppm，更優選以從150ppm至約10, OOOppm，更優選以從200ppm至約5, OOOppm，更優選 以從200ppm至約1，OOOppm的濃度存在。
[0044] 在另一個方面，本發明描述了包含不論是高濃度或低濃度的抗體或其他蛋白質， 以及聚乙二醇的物質組合物。
[0045] 如本文中使用的，"聚乙二醇"、"PEG"及相似的術語意在涵蓋聚乙二醇及其多種衍 生物，例如甲氧基-PEG-胺、二胺-PEG等。更具體而言，在本發明的某些實施方案中，術語 "聚乙二醇"或"PEG"指具有下列化學結構的非表面活性劑化合物：
[0046]
[0047] 其中η是從約5至約240,并可以任選地含有一定程度的不飽和。涵蓋在本發明的 用途中的PEG可以是支化的或線性的，優選線性的。如上述，本領域技術人員應理解化合物 (例如本文描述的PEG)的化學合成導致化合物的一定程度的異源混合物，而非完全同源的 制品。由此可見，當本文中描述η優選從約5至240時，應理解所述定義是指由其化學合成 獲得的異源混合物的主要組分。
[0048] PEG可