恢復排泄物微生物群的組合物及其制造和使用方法
【專利說明】恢復排泄物微生物群的組合物及其制造和使用方法 發明領域
[0001] 本發明大體涉及醫學和胃腸病學，藥理學和微生物學。在可選的實施方案中，本發 明提供了用于治療哺乳動物中各種疾病和病癥的組合物和方法，所述疾病和病癥包括在胃 腸道中存在異常微生物群或微生物群落異常分布的慢性疾病。在可選的實施方案中，本發 明提供了源自經處理（例如過濾和/或離心）的人排泄物（例如糞便）的流體制劑或配制 物，所述處理使得去除了所有細菌、真菌孢子和病毒，但是保留了來自于排泄物的天然生物 活性分子。在可選的實施方案中，本發明提供了"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾 的微生物群，其仍包含細菌的天然生理成分或營養因子，例如，保留了天然生物活性成分或 營養活性成分。在可選的實施方案中，本發明提供了與本發明的流體制劑或配制物相組合 的高度過濾的或基本上純化的微生物群，或者添加回本發明的流體制劑或配制物的高度過 濾的或基本上純化的微生物群。在可選的實施方案中，本發明提供了在其中培養，或在厭氧 條件下培養，或在厭氧條件下收獲、保存和/或培養細菌或微生物群組分的組合物或配制 物。在可選的實施方案中，本發明提供了用于治療這些病癥疾病和病癥的各種添加物，組合 物和供體限制條件。
[0002] 發明背景
[0003] 人胃腸（GI)微生物菌群落，又被稱為微生物群，與人微生物組包含約25, 000個基 因相比，包含大約330萬基因。總的這些基因組合物被稱為人腸道微生物組。野生型，或正 常的GI微生物群包含超過1，200-1，500種不同的細菌物種和少量病毒及一些真菌。GI微 生物群中有其他組分，包括纖維蛋白，少量未吸收的碳水化合物，粘液，灰分，礦物鹽，微量 元素，脂肪，微量營養素，死菌和偶爾未消化的食物。
[0004] 在細胞數目方面，微生物群組成了非常大的活的人體結構組分。據說，GI微生物 群內活菌細胞的絕對數目超過人體所有活細胞約9倍。確實，按照細胞計數，我們為10%人 和90 %細菌群落。
[0005] 因此，人GI微生物群被認為是"虛擬器官"，其在我們體內具有"活的"人體器官的 特征，并且產生后具有解剖學、生理學、病理學和其他特點的器官形成特征。GI微生物群具 有發育不良或被各種寄生蟲、病毒、真菌或細菌感染的可能性。因此，需要開發對于此類器 官的治療。除了抗生素之外，正如其他器官，移植是一種可能的治療。
[0006] 當受到可暫時或長期停留，甚至在菌群中終身存活的各種病原體侵入時，就是這 種GI微生物群構成了我們以前沒有意識到的與小腸和大腸有關的各種疾病，這些疾病由 "超級感染"我們的最大器官引起，例如引起腸易激綜合征（IBS)，艱難梭狀芽胞桿菌感染 (CDI)，腹瀉，假膜性結腸炎等等。
[0007] 最近在我們對于腸道菌群相關病癥的理解方面有了極大的擴展。這些病癥中一些 易于理解為由異常細菌所引起，例如沙門氏菌腸炎，而諸如肥胖的其他病癥在機制方面更 難于理解，所述機制可能在肥胖的因果關系中起作用但仍起源于腸道菌群。然而，目前與GI 微生物群例如腸微生物組相關的各種病癥的名單正在增長。目前認為，僅舉幾個例子來說， 諸如IBS，結腸炎，克羅恩氏病，便秘，代謝綜合征的病癥在很大程度上是由異常的腸道菌落 或異常的GI微生物群引起。
[0008] 在研宄界活躍著試圖修復菌群并且嘗試和改善或治愈可能由異常的GI微生物群 (即定居在腸道的異常細菌組合物）介導的此類病癥。抗生素可產生暫時的改善，但是經常 失效（例如，復發的⑶I)，而這些失效表明對新的治療方法的需求。
[0009] 所有此類病癥共有的常見基本因素是它們的發作是在一些外來侵入GI感染之 后，即使父母可能不記得這個，因為它可能發生在十幾年前，例如，正如IBS或便秘。在這些 病癥中有許多不能通過培養來證明感染，因為人GI微生物群（GI菌落）中存在著超過330 萬個不同的微生物基因和數量相當大的亞種，因此微生物亞種水平組合物的多樣性是相當 巨大的，而在這些中只有很小的百分比可被培養。因此，大多數這些病癥不可能是簡單超級 感染特定單一病原體的結果，例如，正如CDI，并且也不可能很快就可以測定哪種特定物種 和/或亞種是任何具體疾病或病癥（病原）的原因或參與了任何具體疾病或病癥。因此， 目前的想法是，可能最有效的療法（例如，對CDI而言）應當是僅僅找到用于輸注供體菌群 的適當組合物和遞送系統，從而可以逆轉或改善隱藏的或病原菌過度生長的狀態。
[0010] 糞便微生物群移植（FMT)以前又被稱為"糞便細菌療法"（例如，參見 Borody (2004) J. Clin. Gast. 38:475-483)，其代表允許結腸微生物群落正常組分最迅速重 建的治療方法。它是患有重度CDI尤其是復發CDI的患者最新的治療手段。現在FMT在 醫學上越來越被認可；然而，存在對改進基于FMT療法的不足的需求。雖然有良好供體FMT 物質的廣泛實用性，仍需要設計臨床活性組分的復合物，該復合物是患者可接受的，例如不 類似于未加工的有氣味的糞便，而是將獲得更廣泛的患者和醫師接受度的更可接受的藥 物樣"生物"組合物。為廣泛的患者和醫師團體更為接受的臨床活性FMT組合物的需求在 非絕癥的患者范圍是有需求的（其中接受度是很高的）。未加工的均質化人糞便的植入 (例如移植）已消除⑶I，并且供體菌群植入長時間段，例如，參見Grehan (2010) J. Clin. Gastroenterol. 44(8):551-561〇
[0011] 發明概述
[0012] 在可選的實施方案中，本發明提供了組合物，包括配制物，藥物組合物，食物，飼 料，補充劑，制造產品等，其包含處理的或未處理的人GI微生物群，或部分、基本上或完全 分離的人GI微生物群；以及制備和使用它們的方法。
[0013] 在可選的實施方案中，本發明提供了以下組合物及其制備、保存和使用方法，并且 本發明提供了以下組合物的方法和用途：
[0014] (1)流體制劑
[0015] 在可選的實施方案中，本發明提供了源自經處理（例如過濾和/或離心）的人排 泄物（例如糞便）的流體制劑或配制物，所述處理使得去除了所有細菌、真菌孢子和病毒， 但是保留了來自于排泄物的天然生物活性分子，所述流體制劑或配制物包括，例如細菌分 泌產物，如，例如細菌素（包括大腸桿菌素，troudulixine或putaindicine，或小菌素或 subtilosin A)，Ianbiotics (包括蘇云金菌素，乳酸鏈球菌肽，枯草菌素，表皮素，變鏈素 (mutacin)，美殺菌素（mersacidin)，阿肽加定（actagardine)，肉桂霉素），乳鏈球菌素和 其他成孔肽毒素；其中流體制劑的這些和/或其他組分可以用作抗孢子（例如，抗艱難梭狀 芽孢桿菌孢子），抗菌和/或抗炎化合物（例如，白細胞介素，細胞因子）；并且還包括由微 生物群的細菌或其他微生物產生的其他生物活性分子（BAMs)。然而，這種過濾水平保留了 亞病毒大小的噬菌體，并將有助于這種濾液的治療能力。
[0016] (2) "耜"討濾，"不完全"討濾或中等稈度討濾的微牛物群
[0017] 在可選的實施方案中，本發明提供了"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾的 微生物群，其仍包含細菌的天然生理成分或營養因子，例如，保留了天然生物或營養活性成 分，例如，如以上所述的細菌分泌產物，包括例如，抗菌（例如，抗孢子）和抗炎產物。在一 實施方案中，取排泄物（例如，糞便），使其溶解和均質化，并通過孔徑逐漸變小的過濾器或 濾網，在0.1 mm篩孔/濾孔處停止；由此保留了生物和營養活性的天然流體組分。
[0018] 這種"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾的微生物群示例性實施方案與高度 純化的制劑形成對比，例如，如Sadowsky等在WO 2012/122478 Al中所述，他通過繼續通過 更小的篩孔過濾，直到糞便通過濾網直至〇. 020_而制備出FMT物質，由此產生極高度純化 的微生物群團塊，具有遠遠超過95%單獨的細菌細胞，然而丟棄了周圍天然的"生物和營養 活性"流體物質。
[0019] 在可選的實施方案中，通過保持它的天然流體組分和小的纖維分子以為微生物群 落提供營養物，這種示例性"粗過濾"或"中等程度過濾"的組合物保持它的生理學狀態，還 有重要的營養狀態。在這種示例性實施方案中，"不完全"過濾如最終直至約〇. Imm的篩孔， 留下了供體菌群，從而允許為細菌殘留了一些生理"食物"，并保留了具有其抗微生物（例 如，抗孢子）和抗炎產物的流體組分。
[0020] (3)高度討濾或基本h純化的微牛物群添加回流體制劑或配制物
[0021] 在可選的實施方案中，本發明提供了與本發明的流體制劑或配制物（如上文（1) 組中所概述）相組合的高度過濾或基本上純化的微生物群，或者添加回本發明的流體制劑 或配制物（如上文（1)組中所概述）的高度過濾或基本上純化的微生物群。通過將高度過 濾或基本上純化的微生物群"添加回"或復原本發明的流體制劑或配制物，最終的組合物或 配制物的性質被極大地增強，例如，高度過濾或基本上純化的微生物群現在具有本發明的 流體制劑或配制物的性質，例如，如（1)組中所概述。
[0022] 在可選的實施方案中，該實施方案使用基本上分離或純化的糞便菌群或整個（或 基本上整個）微生物群，所述微生物群為（或包含）至少約90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%分離或純的糞便 菌群分離物，或者具有不超過約 〇. l%、〇. 2%、0. 3%、0. 4%、0. 5%、0. 6%、0. 7%、0. 8%、 0. 9 %或I. 0 %或更多的非糞便菌群物質的糞便菌群分離物。在可選的實施方案中，該實施 方案使用基本上分離、純化、或基本上整個微生物群，如Sadowsky等在WO 2012/122478A1 中所述，或如Borody等在WO 2012/016287 A2中所述。
[0023] (4)培養的和/或厭氣的微牛物群
[0024] 在可選的實施方案中，本發明提供了組合物或配制物，其中將高度過濾或基本上 純化的微生物群組合物與如以上（3)所述的添加回的流體組分置于富集培養物中，任選地 在厭氧條件下，或任選地在厭氧條件下收獲，保存和/或培養。
[0025] 在可選的實施方案中，培養細菌或微生物群組分約2小時至約72小時，或約1小 時至24小時，或約30分鐘至12小時，從而增加細菌數目及其產物，而不需要使用大量供 體。
[0026] 在可選的實施方案中，本發明提供了配制物或藥物制劑，其包含：
[0027] (a)⑴獲取自排泄物的流體制劑，其中所述流體制劑能夠通過至少約0. 22微米 的過濾器，并且不含任何或基本上所有的完整病毒、真菌孢子和細菌，但是保留了噬菌體； 或
[0028] (ii)通過包括以下的方法制備的流體制劑：（1)提供排泄物；和（2)使排泄物通 過至少約0. 22微米（μ )的過濾器，從而使得濾液不含任何或基本上所有的完整病毒、真菌 孢子和細菌，
[0029] 其中任選地，在所得到的流體制劑最終通過至少約0. 22微米的過濾器之前，使排 泄物通過一系列尺寸逐漸變小的過濾器，
[0030] 和任選地，在使排泄物通過至少約0. 22微米的過濾器之前，首先離心排泄物，并 將上清液用作步驟（i)或（ii)中流體制劑的起始物質，
[0031] 和任選地，在排泄物通過至少約0. 22微米的過濾器之前和/或在離心之前，首先 用鹽水或緩沖液使排泄物均質化，
[0032] 和任選地，在排泄物通過至少約0. 22微米的過濾器之前，用一個或幾個過濾器來 過濾起始排泄物或離心后的上清液，從而最終從流體制劑去除所有（或基本上所有）細菌 來源的細胞，或最終從流體制劑去除所有（或基本上所有）直徑小于約5微米（μ m)的細 胞；
[0033] (b) (a)的流體制劑，其中所述排泄物由人排泄物組成；
[0034] (c) (a)或（b)的流體制劑，還包括添加至所述流體制劑的以下成分：纖維，生物活 性蛋白或肽，微量營養素，脂肪，糖或小碳水化合物，微量元素，礦物鹽，灰分，粘液，氨基酸， 營養物，維生素或礦物質，或其全部或其任意組合，任選地，"添加回"以復原"野生型"健康 菌群或人微生物群環境；
[0035] (d) (a)至（C)中任一所述的流體制劑，其用于冷凍或冷凍-干燥而進一步處理或 配制成粉末或等同物，和任選地，還包含冷凍保護劑、凍干保護劑或防腐劑；或者
[0036] (f) (d)中的流體制劑，其通過在液體中復原冷凍或凍干的粉末來進一步處理或配 制，其中任選地，所述液體為無菌鹽水。
[0037] 在可選的實施方案中，本發明提供了包含以下的配制物或藥物制劑：
[0038] (a) (i)高度過濾或基本上純化的微生物群，和（ii)本發明所述的流體制劑或配 制物；
[0039] (b) (a)的配制物或藥物制劑，其中高度過濾或基本上純化的微生物群包含基本上 分離或純化的糞便菌群或整個（或基本上整個）微生物群，或由基本上分離或純化的糞便 菌群或整個（或基本上整個）微生物群組成；
[0040] (c) (a)或（b)的配制物或藥物制劑，其中高度過濾或基本上純化的微生物群包 含糞便菌群分離物或由糞便菌群分離物組成，所述糞便菌群分離物為至少約90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%、99· 6%、99· 7%、99· 8%或 99. 9%分 離或純的糞便菌群分離物，或者具有不超過約0. l%、〇. 2%、0. 3%、0. 4%、0. 5%、0. 6%、 0. 7%、0. 8%、0. 9%或1. 0%或更多的非糞便菌群物質；
[0041] (d) (a)至（c)中任一所述的配制物或藥物制劑，其中高度過濾或基本上純化的微 生物群包含以下或由以下組成：如Sadowsky等在WO 2012/122478 Al中所述或者如Borody 等在WO 2012/016287 A2中所述的基本上分離、純化或基本上整個微生物群；
[0042] (e) (a)至（d)中任一所述的配制物或藥物制劑，其中通過使用血漿除去法，離心 法，細胞分離法（celltrifuge)，柱色譜法，親和色譜法，免疫沉淀法，或固定在固體表面、珠 或平板的抗體來制備高度過濾或基本上純化的微生物群；
[0043] (f) (a)至（e)中任一所述的配制物或藥物制劑，其中本發明所述的流體制劑或配 制物組成最終配制物或藥物制劑體積的約1 %至99 %，或者約1 %、10 %、20 %、30 %、40 %、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 或更多；
[0044] (g) (a)至（f)中任一所述的配制物或藥物制劑，其用于冷凍或冷凍-干燥以進一 步處理或配制成粉末或等同物，和任選地，還包含冷凍保護劑、凍干保護劑或防腐劑；或者
[0045] (h) (g)中所述的流體制劑，其通過在液體中復原冷凍或凍干的粉末來進一步處理 或配制，其中任選地，所述液體為無菌鹽水。
[0046] 在可選的實施方案中，本發明提供了配制物或藥物制劑，其包含：
[0047] (a) (i) "粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾的微生物群，其包含糞便樣品或 分離物，所述糞便樣品或分離物包含或保留微生物群細菌的天然或野生型生理成分或營養 因子，
[0048] 其中任選地，所述樣品或分離物能夠通過約0.1 mm的篩孔或濾孔；或者
[0049] (ii)通過包括以下的方法制備的包含糞便樣品或分離物的"粗"過濾，"不完全" 過濾或中等程度過濾的微生物群：（1)提供排泄物；和（2)使排泄物通過約0.1 mm的篩孔或 濾孔；
[0050] (b) (a)的包含糞便樣品或分離物的"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾的 微生物群，其中所述糞便樣品或分離物由人排泄物組成；
[0051] (C) (a)或（b)的包含糞便樣品或分離物的"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度 過濾的微生物群，其還包含加入以下成分：纖維，生物活性蛋白或肽，微量營養素，脂肪，糖 或小碳水化合物，微量元素，礦物鹽，灰分，粘液，氨基酸，營養物，維生素或礦物質，或其全 部或其任意組合，任選地，"添加回"以復原"野生型"健康菌群或人微生物群環境；