一種組織脫細胞液的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫用材料技術領域，具體涉及一種制備脫細胞基質的組織脫細胞液。
【背景技術】
[0002]脫細胞技術主要是指利用脫細胞技術(物理、化學、酶解等方法)去除組織中各種細胞成分以及遺傳物質從而獲得天然生物支架材料。由于保留了細胞外基質的三維結構和天然成分，有利于細胞粘附、增殖、分化及其生物學功能的發揮，因此，其在組織修復與再生中具有其他支架材料無法比擬的優勢。目前，人們已經能夠從多種組織中得到脫細胞基質支架材料，如小腸、皮膚、血管、角膜以及更為復雜的心、肺、肝、腎等。
[0003]細胞外基質是結構蛋白和功能蛋白的復雜復合物，包含多種纖維蛋白，如膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、蛋白多糖等組分。細胞外基質作為細胞生長支架，在細胞粘附、增殖和分化方面發揮著重要作用。然而，由于當組織受到外界各種因素刺激時會促進活性氧的產生，如物理因素、化學因素(氧化還原反應、電子傳遞、金屬離子催化、藥物)、生物因素(酶的催化)。活性氧會對蛋白質進行氨基酸殘基修飾，從而引起其結構和構象的改變，造成肽鏈斷裂、聚合、交聯等損傷。因此，常規的脫細胞處理會產生大量的活性氧，進而一定程度破壞大網膜脫細胞基質中的蛋白成分，影響其生物學功能。因此，亟需在對大網膜進行脫細胞處理的同時，減少體系中的活性氧，保護細胞外基質蛋白免受活性氧的損傷。
[0004]大網膜是腹膜的一種，是存在于高等動物腹腔中的一層黏膜，是由結締組織形成的膜狀組織。大網膜富有極強的彈性以及高度血管化的結構，這些優點使其在組織工程與再生醫學領域中具有廣泛的應用前景。目前，大網膜脫細胞相關研宄剛剛起步，還存在諸多問題亟待解決。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種組織脫細胞液。該脫細胞液是在常規的組織脫細胞體系中引入了一種抗氧化物成分而制備成的新型脫細胞液。該脫細胞液的配制方法簡單，成本低廉，可實施性強。
[0006]根據本發明的一個方面，提供了組織脫細胞液，其包含溶于緩沖液中的十二烷基硫酸鈉和抗壞血酸。
[0007]本發明的組織脫細胞液利用了抗壞血酸(維生素C)的抗氧化作用，減少大網膜脫細胞基質在脫細胞過程中的氧化損傷，保護大網膜脫細胞基質中的細胞外基質蛋白，進而增加了脫細胞大網膜支架的生物相容性，更有利于接種細胞的存活。
[0008]根據本發明的另一方面，提供了經上述組織脫細胞液處理的大網膜組織。
【附圖說明】
[0009]圖1脫細胞生物網膜I型膠原免疫組織化學染色X200。
[0010]圖2脫細胞生物網膜IV型膠原免疫組織化學染色X 200。
[0011]圖3大網膜脫細胞基質的掃描電鏡觀察。
[0012]圖4不同脫細胞液處理后大網膜脫細胞基質中的生物相容性檢測X200。
【具體實施方式】
[0013]在本申請中，縮寫詞的含義如下:
[0014]DMEM:Dulbecco' s modified eagle medium培養液，是一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養基；
[0015]PBS:磷酸鹽緩沖液；
[0016]SDS:十二烷基硫酸鈉；
[0017]EthD-1I1:溴化乙錠同型二聚體-1II ;
[0018]calcein AM:二乙酰甲醋
[0019]DNA酶:脫氧核糖核酸酶；
[0020]min:分鐘。
[0021]根據本發明的一個方面，提供了組織脫細胞液，其包含溶于緩沖液中的十二烷基硫酸鈉和抗壞血酸。
[0022]在某些實施方案中，所用的緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
[0023]在某些實施方案中，十二烷基硫酸鈉的濃度為1%至2%重量體積比。在具體的實施方案中，十二烷基硫酸鈉的濃度可以為1.0%、1.1%、1.2%Λ.3%ΑΛ%Α.5% Λ.6% ,1.7%Λ.8%,1.9%或2.0%重量體積比。
[0024]在某些實施方案中，抗壞血酸的濃度為0.1%至0.5%重量體積比。在具體的實施方案中，抗壞血酸的濃度可以為0.1%,0.2%,0.3%、0.4%或0.5%重量體積比。
[0025]在某些實施方案中，組織脫細胞液由溶于緩沖液中的十二烷基硫酸鈉和抗壞血酸組成。
[0026]根據本發明的另一方面，提供了經上述組織脫細胞液處理的大網膜組織。
[0027]在本申請中，大網膜是可商購的，可以購自例如屠宰場。
[0028]通過以下實施例對本發明做詳細描述，然而以下實施例僅僅是作為例證，并不對本發明構成任何限制。
[0029]實施例1大網膜脫細胞液的配制
[0030]配制含有SDS與抗壞血酸的大網膜組織脫細胞液，其中，SDS濃度為1.5%重量體積比，抗壞血酸(維生素C)濃度為0.2%重量體積比，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)配制。
[0031]實施例2小型豬來源大網膜的脫細胞處理
[0032]取新鮮的小型豬腹膜大網膜組織(購自屠宰場)，于PBS中清洗3遍。脫脂處理后，將其浸泡于IL大網膜脫細胞液中處理18h，并于PBS中清洗3遍，將經脫細胞液處理后的大網膜組織經冷凍干燥后輻照滅菌，常溫保存。
[0033]實施例3大網膜脫細胞基質的免疫組織化學染色
[0034]使用4%的多聚甲醛溶液固定實施例2中制備的大網膜脫細胞基質，濃度梯度酒精脫水，石蠟包埋，制備厚度為4μπι的切片。切片置于病理組織漂烘儀上烘干2h。隨后，組織切片經過梯度酒精(濃度由高到低)的水化，蒸餾水沖洗切片。加3%雙氧水作用lOmin，去除內源性過氧化物酶；PBS漂洗三次，每次5min ;利用抗原修復液進行微波修復，修復后冷卻室溫，PBS漂洗三次，每次5min ;1%牛血清白蛋白37°C封閉30min ;分別滴加抗Collagen 1(1: 200)、抗 Collagen IV(1: 200) 一抗，4°C過夜。用 0.0lM PBS 清洗 3 次，滴加山羊抗小鼠二抗，37°C孵育30min，PBS清洗3次，每次5min ;避光下DAB顯色lOmin，蒸餾水沖洗切片；梯度酒精脫水(濃度由低到高)，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察染色結果并拍照。
[0035]結果可見，通過本發明制備的脫細胞生物網膜具有典型的網狀結構，且呈現Co 11 agen 1、Co 11 agenIV大量表達，表明本發明制備的脫細胞大網膜基質完好保留了天然細胞外基質的主要蛋白組分。此外，各類組織學染色切片均未見明顯的細胞成分，表明本發明的脫細胞液具有很好的脫細胞效果(圖1-2)。
[0036]實施例4大網膜脫細胞基質的掃描電鏡觀察
[0037]利用2%戊二醛將制備的大網膜脫細胞基質固定24h，常規脫水、真空干燥、噴金，利用掃描電子顯微鏡觀察并攝像。結果未見細胞組分殘留，且大網膜脫細胞基質交織成網狀立體三維支架，孔隙均一(圖3)。
[0038]實施例5不同脫細胞液處理后大網膜脫細胞基質中的生物相容性檢測
[0039]利用不添加抗壞血酸的脫細胞液，即1.5%的SDS溶液以同樣的步驟對大網膜組織進行脫細胞處理，得到大網膜脫細胞基質支架材料。
[0040]將5X 16HiL的皮膚成纖維細胞懸液2mL分別接種于上述制備的大網膜脫細胞基質材料以及實施例2制備的大網膜脫細胞基質材料上，得到復合構建物。將復合構建物培養于37°C、5% CO2孵箱中1.5h，然后添加DMEM培養液10mL，繼續培養至第7天，隨后進行細胞活性檢測。
[0041]用移液槍吸取20 μ I 2mM EthD-1II 溶液加到 1mL PBS 中，得到 4 μΜ EthD-1II工作液，再將5 μ I 4mM calcein AM溶液轉移到EthD-1II工作液中，配制成混合液(2 μ Mcalcein AM和4μΜ EthD-1II)。隨后添加足量的Live/Dead混合液以覆蓋上述構建物，然后于室溫孵育30-45min，PBS溶液清洗三次。在熒光顯微鏡下觀察熒光標記的細胞。
[0042]經染色，由于活細胞具有酯酶活性，可以把非熒光calcein AM轉化成能發綠色熒光的calcein，而由于死細胞的細胞膜失去選擇性，EthD-1進入細胞結合到細胞核上，使死細胞呈現紅色熒光。live/dead染色而結果可見，實施例2中，經添加抗壞血酸的脫細胞液處理獲得的大網膜脫細胞基質中的活性細胞(綠色)比例明顯多于經未添加抗壞血酸的脫細胞處理獲得的大網膜脫細胞基質中的活性細胞，表明本發明的脫細胞增加了脫細胞大網膜支架的生物相容性，更有利于接種細胞的存活(圖4)。
【主權項】
1.一種組織脫細胞液，其包含溶于緩沖液中的十二烷基硫酸鈉和抗壞血酸。
2.如權利要求1所述的組織脫細胞液，其中所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
3.如權利要求1或2所述的組織脫細胞液，其中十二烷基硫酸鈉的濃度為1%至2%重量體積比。
4.如權利要求1至3中任一權利要求所述的組織脫細胞液，其中抗壞血酸的濃度為0.1%至0.5%重量體積比。
5.如權利要求1至4中任一權利要求所述的組織脫細胞液，其由溶于緩沖液中的十二烷基硫酸鈉和抗壞血酸組成。
6.經權利要求1-5中任一權利要求所述的組織脫細胞液處理的大網膜組織。
【專利摘要】公開了一種組織脫細胞液。該脫細胞液包含溶于緩沖液中的十二烷基硫酸鈉和抗壞血酸。還公開了經該組織脫細胞液處理的大網膜組織。利用抗壞血酸(維生素C)的抗氧化作用，減少脫細胞基質在脫細胞過程中的氧化損傷，保護脫細胞基質中的細胞外基質蛋白，進而增加了脫細胞支架的生物相容性。本方法還具有操作簡單、成本低廉、可實施性強的優勢。
【IPC分類】A61L27-36
【公開號】CN104771784
【申請號】CN201510221565
【發明人】饒義偉, 藍德賓
【申請人】北京帝康醫藥投資管理有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年5月5日