一種分步式組織工程骨構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及骨組織工程技術領域，特別涉及一種用于骨缺損修復的分步式組織工程骨構建方法。
【背景技術】
[0002]因創傷、腫瘤或老化等因素引起的全身各類型骨缺損是外科系統常見病。臨床上常用治療手段包括使用自體骨、異體骨及生物材料移植進行修復，但存在拆東墻補西墻、潛在疾病傳播、修復效果有限等問題。近年來新興的骨組織工程技術有望克服這些傳統技術的缺陷。
[0003]傳統骨組織工程技術是將種子細胞在體外進行大量擴增后，接種在具有誘導成骨活性的三維可降解生物支架上，通過一定時間體外誘導后植入缺損部位，促進體內自身血管長入吸收及原位骨斷端殘存骨細胞“爬行替代”成骨。當骨缺損體積較小時，憑借種子細胞或者成骨活性因子的刺激作用，通常可以達到完全修復效果。但針對大段骨缺損卻難以達到穩定且長期的修復效果。宄其原因，我們認為有以下五點:1)種子細胞植入后的迅速死亡:常見種子細胞之一骨髓間充質干細胞在移植入骨缺損部位的前2星期即已大量減少，到第4星期時已很難再檢測到，其原因可能是缺乏營養交換，材料孔隙率低等引起。2)微血管長入的時間太慢:通常情況下，斷端毛細血管發芽增生需要I?2星期，此時大段植入組織工程骨中心區域的外源性干細胞早已因缺乏充分氧氣及養分交換大量發生凋亡，沒有起到應有的介導“爬行替代”作用；而尺寸因素也決定微血管不可能迅速長滿整段大塊組織工程骨。3)自體成骨細胞“爬行替代”作用有限:受自身年齡、健康因素影響，個體的細胞生長能力相差顯著，成骨細胞能夠爬行替代的距離也不一，大段骨缺損僅僅依靠自身斷端的成骨細胞爬行，難以完全修復。4)手術引起的炎癥反應:根據部位不同，術后I星期內通常會有較強烈的免疫排斥反應，而修復部位體積越大、創傷越大、炎癥反應則越強，為了抗感染而注射的高劑量抗生素或抗排斥藥物也可能會影響大段骨缺損的修復。5)支架材料強度不足:常見的大段骨缺損通常有四肢骨、下頒骨，均為受力要求高、抗壓能力強的支撐骨組織。常見組織工程骨材料普遍在I年內降解，而大段新生骨達到骨密度與正常骨一致的時間根據年齡不同，最長可需要2?3年，因此一種降解速度慢，抗壓能力強的生物可降解材料亦迫切需求。
[0004]針對以上問題，國內外學者提出了各種方法試圖解決問題:
[0005]I)使用緩釋BMP-2等生長因子的生物材料代替細胞+材料。這樣好處是可以保證成骨生長因子的不斷釋放，不受細胞凋亡影響。但BMP-2緩釋時間仍然有限，無法完全滿足修復大段骨需要，且劑量不好控制、存在一定的安全隱患，如2008年美敦力的BMP2產品就出現幾例致死性的意外。
[0006]2)采用內皮細胞與BMSC共培養、VEGF基因轉染BMSC、或者大血管預埋等方式促血管化。這些方式被證明可以促使微血管在體內較以往有較快生長，但血管生長速度仍然不夠。
[0007]綜上所述，大段骨缺損由于其缺損體積大、缺損部位各異，因而采用傳統的組織工程骨技術對其修復的效果參差不一，也始終無法解決大尺寸骨修復過程中的種子細胞凋亡冋題。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在于提供一種分步式組織工程骨構建方法，該方法可快速構建大段組織工程骨、大大減少修復單位體積骨組織所需要的骨組織工程種子細胞的使用量，提高種子細胞利用率。
[0009]為解決上述技術問題，本發明的實施方式所提供的分步式組織工程骨構建方法，包含下述步驟:(I)支架修復和預血管化:在骨缺損部位構建組織工程骨支架，并進行預血管化；(2)骨組織工程種子細胞后植:將成骨誘導后的種子細胞植入所述骨缺損部位的組織工程骨支架內；且所述步驟(2)骨組織工程種子細胞后植在所述步驟(I)支架修復和預血管化的7?14天后進行。
[0010]本發明的實施方式所提供的分步式組織工程骨構建方法，按時間順序劃分為兩個步驟進行:第一步在骨缺損部位構建組織工程骨支架并進行預血管化；第一步進行完7?14天之后，進行第二步，即對骨缺損部位注射成骨誘導后的種子細胞來進行成骨誘導。與現有技術相比，本發明的創新點在于:(I)改變了傳統的組織工程骨技術中將種子細胞與支架材料一起植入體內骨缺損部位的思路，而是采用了先植入促血管生長的支架，后期再植入成骨的種子細胞。(2)對于“首次修復”(即植入促血管生長的支架)與“后植”(即植入成骨的種子細胞)這兩個步驟之間的時間間隔，本發明提出了 7?14天這個較為合理的時間間隔方案。根據文獻報道結合前期實驗經驗，急性排斥反應在7天時結束，7?14天內血管發芽增生，因此本發明所提供的時間間隔確保了 “后植”時間點是在炎癥期過后、斷端血管開始發芽長入支架材料時，這樣能使得種子細胞避開炎癥反應期間機體炎癥因子的攻擊排斥，存活率達到最大化。總的來說，骨缺損的修復過程是血管長入與成骨細胞爬行兩個互相不斷促進的過程，本發明讓組織工程骨支架在體內預構好微血管后，再將種子細胞植入支架內，一方面可以避免手術初期的炎癥反應殺死種子細胞，另一方面也可與預構的微血管互相促進，提高種子細胞生存率，不斷成骨。此外，“后植成骨”亦可在原位骨斷端爬行替代以及支架材料內部獨立成骨。“后植”的種子細胞有可能既參與自體骨細胞的爬行替代作用，也可能在遠離斷端的組織工程骨中心骨化形成一個個獨立的骨小島(Bone format1nislet)，不同骨小島之間可以互相連接促進，這就保證了不受自體骨細胞爬行替代作用的限制，全尺寸骨缺損均可達到修復。
[0011]本發明的實施方式所提供的分步式組織工程骨構建方法中，步驟(I)的支架修復和預血管化的方法可以為以下兩種方式之一:a)在骨缺損部位植入組織工程骨支架材料，然后植入未經誘導的間充質干細胞；或者b)將具有促血管活性的物質在體外與組織工程骨支架材料結合，然后植入骨缺損部位；上述的促血管活性的物質可以為未經誘導的間充質干細胞，或者也可以為促血管化生長因子如VEGF等，其可代替間充質干細胞促進血管生成。進一步地，將未經誘導的間充質干細胞在體外與組織工程骨支架材料結合的方法為:先將未經誘導的間充質干細胞與藻酸鹽凝膠復合，然后與組織工程骨支架材料進行交聯。具體來說，先將未經誘導的間充質干細胞與藻酸鹽凝膠復合，然后與組織工程骨支架材料進行交聯的方法為:在藻酸鹽凝膠中加入雙蒸水，配置成質量百分含量為I?3%的藻酸鹽凝膠溶液；然后將藻酸鹽凝膠溶液與未經誘導的間充質干細胞沉淀充分混勻，滴加在組織工程骨支架上進行混合，然后以50?200mM的氯化鈣交聯I?5分鐘。藻酸鹽作為一種天然材料，來源廣泛，植入體內的安全性和作用的穩定性均較好，上述將未經誘導的間充質干細胞先與藻酸鹽凝膠復合后再植入組織工程骨支架內的方法中，藻酸鹽凝膠是作為“細胞支架材料”，起到包裹種子細胞的作用。
[0012]本發明的實施方式所提供的分步式組織工程骨構建方法中，步驟(I)中所用到的組織工程骨支架材料可以為任何具有成骨能力的組織工程骨支架材料，例如優選為聚己內酯、脫鈣骨基質、羥基磷灰石或BETA-磷酸三鈣等。進一步地，當選用聚己內酯作為本發明的組織工程骨支架材料時，所述聚己內酯支架材料可采用3D打印方法制備，該材料呈蜂窩狀立體結構且內部形成直徑為0.1?0.5mm的孔隙。常見的大段骨缺損通常發生在四肢骨或下頒骨等部位，這些部位的骨組織均為受力要求高、抗壓能力強的支撐骨組織，而且大段新生骨通常達到骨密度與正常骨一致的時間根據年齡不同，最長可需要2?3年。上述3D打印技術制備而成的蜂窩狀立體結構的聚己內酯，是一種降解速度較慢的生物可降解材料，而且抗壓能力強、具有較好的力學強度，尤其適合于作為組織工程骨支架材料應用于本發明中。
[0013]優選地，本發明的實施方式所提供的分步式組織工程骨構建方法中，步驟(2)中將成骨誘導后的種子細胞植入骨缺損部位的組織工程骨支架內的方法為:在X光引導下，在骨缺損部位的前、中、后三處分別注射成骨誘導后的種子細胞。在骨缺損部位周圍的多處進行成骨誘導后的種子細胞的注射，可確保種子細胞在骨缺損部位的組織工程骨支架內部呈均勻、全面地分布；尤其針對于大段骨缺損的情況，可確保快速地實現修復作用、并提高種子細胞的利用率。
[0014]優選地，本發明的實施方式所提供的分步式組織工程骨構建方法中，所述的種子細胞為間充質干細胞，例如可以為骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞或成骨細胞等。在各類種子細胞中優選為同種異體骨髓間充質干細胞，該種細胞已經被證實是骨來源的，具有相對最佳的成骨能力的間充質干細胞，可以做為原位骨缺損修復的組織工程骨種子細胞來源，結合已有的骨髓種子細胞庫，采用同一批次的種子細胞更能保證日后運用臨床修復時的療效問題以及來源問題，且不用受患者年齡，健康因素影響，符合倫理學的需要。
[0015]最后，本發明的實施方式所提供的分步式組織工程骨構建方法中，在進行步驟(I)支架修復與預血管化之前，先對骨缺損部位包裹聚己內酯復合膜。優選地，該種用于包裹骨缺損部位的聚己內酯復合膜的厚度為0.5?2毫米，呈平面網狀結構，且所述平面網狀結構的網孔孔徑為100?300微米。進一步地，本發明的實施方式還提供該種聚己內酯膜復合膜的制備方法:將聚己內酯與復合添加材料按照質量百分含量分別為80?100%和O?20%的配比混合，然后采用3D打印方法制備得到聚己內酯復合膜。上述制備方法中的復合添加材料可以為BETA-磷酸三鈣、羥基磷灰石或珊瑚。使用聚己內酯復合膜對骨缺損部位進行包裹的效果是:一方面，該聚己內酯復合膜可起到包圍骨缺損部位的作用，成骨誘導后的種子細胞再植入骨缺損部位后，減少因為注入載體的流動而導致干細胞的流失，提高了種子細胞的利用率；另一方面，該種聚己內酯復合膜有較好的強度，能阻止周圍纖維組織的長入，減少因為纖維組織占位而引起的骨不連可能性，達到引導骨再生的作用；再一方面，聚己內酯復合膜屬于惰性材料，與骨缺損部位接觸后不會引起炎癥反應，此外其在X光照射下不顯影，不會影響對實驗效果的觀察比較；同時膜片的包裹起到類似于骨板的內固定作用，對于非承重骨可以較好地保持解剖復位。
【附圖說明】
[0016]圖1是本發明的分步式組織工程骨構建方法的流程圖；