異土木香內酯在制備抗慢性粒細胞性白血病藥物中的應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種天然小分子化合物異土木香內酯在制備抗慢性粒細胞性白血病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]白血病(Leukemia)是一類造血干細胞異常的惡性克隆性疾病。在我國白血病發病率逐年上升，約占總癌癥發病率的5%。其中，慢性粒細胞白血病(Chronic myelogenousleukemia, CML)占成人白血病的20%。大約90%以上的CML患者可檢出特異性的費城染色體(Philadelphia，Ph)，即t (9 ；22) (q34 ；qll)染色體易位，9號染色體長臂的C-Abl基因移位至22號染色體上長臂斷裂點集中區(BCR)產生致癌的BCR-ABL融合基因，有95%的慢性粒細胞性白血病患者被檢測有此染色體易位，該融合基因編碼的Bcr-Abl融合蛋白(Bcr-Abl fus1n protein)具有很強的絡氨酸蛋白激酶活性，是CML發病的分子生物學基礎。
[0003]基于對Bcr-Abl蛋白分子結構及其絡氨酸殘基功能的研宄，以它作為靶標尋找治療CML的特效藥物成為相關領域研宄的重要熱點。上世紀90年代，Zimmermann研宄組經過篩選發現，小分子化合物伊馬替尼(Imatinib，Gleevec)能夠通過競爭性抑制Bcr-Abl蛋白與ATP結合來特異阻斷該融合蛋白的絡氨酸激酶活性，從而抑制CML細胞增殖并促使其凋亡，2001年美國FDA批準其用于臨床治療CML。隨著Imatinib臨床療效獲得肯定的同時，也漸漸發現它的缺陷:Imatinib主要針對CML早期患者，中晚期患者對Imatinib完全緩解率低于30% ;部分患者可出現Imatinib耐藥且比例逐年上升，主要與BCR-ABL突變或基因擴增過表達導致其對Imatinib敏感性降低有關。針對這些問題，沿著既有的思路繼續開發新一代的革G向Bcr-Abl融合蛋白的絡氨酸激酶抑制劑，諸如Nilotinib，Dasatinib和Ponatinib新一代抑制劑的開發和上市，這固然是解決問題的一種選擇，但是鑒于既往的經驗，這種選擇并不能從根本上治愈CML。因為在這種策略中，只是選擇性抑制Bcr-Abl的絡氨酸激酶活性，而沒有除去Bcr-Abl蛋白。
[0004]隨著細胞分子生物學知識的積累，現在通過特定的化合物誘導細胞內的某種蛋白酶活性定點清除特定蛋白已成為可能，所以，尋求可誘導Bcr-Abl融合蛋白降解的小分子化合物已成為一種優于只抑制它的活性的治療策略。這種策略不僅可以克服Bcr-Abl當前各種點突變造成的對絡氨酸激酶抑制劑的耐藥性，同時它也是靶向Bcr-Abl融合蛋白治療CML的一種新策略，是一條充滿希望值得探索的新治療途徑。

【發明內容】

[0005]本發明為解決現有技術中的上述問題提出的。
[0006]本發明利用建立的GFP-Bcr-Abl篩選細胞系，提供了一種異土木香內酯在制備抗慢性粒細胞性白血病藥物中的應用，發明人發現異土木香內酯抗CML活性是通過特異性誘導K562細胞內自噬溶酶體活性來實現降解Bcr-Abl融合蛋白的，同時發現異土木香內酯能夠顯著抑制慢性粒初診患者及耐藥患者中Bcr-Abl陽性干細胞克隆的形成，這為通過異土木香內酯天然小分子化合物誘導Bcr-Abl融合蛋白降解治療耐藥或復發CML患者提供了可能性。
[0007]本發明解決的技術問題包括:
[0008]1、篩選出能夠降解Bcr-Abl蛋白的單體化合物-異土木香內酯；
[0009]2、驗證異土木香內醋對Bcr-Abl蛋白的降解效應；
[0010]3、異土木香內酯對CML細胞的效應；
[0011]4、異土木香內酯降解Bcr-Abl的可能機制；
[0012]5、異土木香內酯抗CML耐伊馬替尼細胞的效應。
[0013]本發明創造性解決其技術問題所采用的技術方案是:構建GFP-Bcr-Abl融合蛋白質粒轉入K562細胞中，不同化合物處理轉染的細胞，然后檢查熒光強度來篩選降解GFP-Bcr-Abl的化合物，得到可能誘導Bcr-Abl蛋白降解的化合物一異土木香內酯。通過Western bloting技術檢測異土木香內醋處理或未處理的K562細胞、伊馬替尼耐藥細胞中的Bcr-Abl，以Bcr-Abl蛋白量是否減少或消失來判斷異土木香內醋對Bcr-Abl蛋白的降解效應。通過CCK-8檢測異土木香內酯處理的K562細胞來判斷它對細胞活力的影響；Annex-V、PI染色異土木香內酯處理的K562細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡！Westernbloting檢測異土木香內醋處理的K562細胞中的調亡Maker:Caspase_3和PARPtlReal timePCR檢測異土木香內酯處理不同時相Bcr-Abl的mRNA水平；蛋白酶體抑制劑(MG132)、Caspase-3抑制劑(Z-VAD)、自噬抑制劑(3_MA，CQ)，對異土木香內酯誘導Bcr-Abl蛋白降解效應的影響。磁珠分選CML患者骨髓⑶34陽性細胞，Western bloting檢測異土木香內酯對CML干細胞中Bcr-Abl蛋白的降解效應；克隆形成實驗檢測異土木香內酯對CML患者中干細胞形成克隆能力的影響。
[0014]本發明采用上述技術方案，與現有技術相比，具有如下技術效果:
[0015]異土木香內酯單體化合物降解Bcr-Abl蛋白具有以下特點:
[0016]I)分子量較小；
[0017]2)毒性較低；
[0018]3)容易獲取；
[0019]4)可用于耐伊馬替尼CML患者。
【附圖說明】
[0020]圖1為異土木香內醋(IsoA)的結構(A)，IsoA分別處理轉染GFP-Vector (B)和GFP-BCR-ABL(C)的K562細胞，導致GFP-Bcr-Abl熒光信號減弱；
[0021]圖2為異土木香內醋下調Bcr-Abl蛋白水平:(A) 5，10 μ M異土木香內醋處理K562細胞不同時間，Western blot檢測Bcr-Abl蛋白；(B，C) 10 μ M異土木香內酯處理K562R(B)和轉染T315I突變BCR-ABL(C)的32D細胞，檢測Bcr-Abl蛋白；
[0022]圖3為異土木香內酯誘導K562細胞凋亡:(A)K562細胞經異土木香內酯處理24、48小時檢測生長抑制率；(B)K562細胞經異土木香內酯處理24、48小時檢測細胞凋亡率；(C)Western blot檢測凋亡相關蛋白水平。
[0023]圖4為異土木香內酯不改變Bcr-Abl的mRNA水平；
[0024]圖5為自噬抑制劑抑制異土木香內酯引起的Bcr-Abl蛋白的降解:蛋白酶體抑制劑⑷和caspase抑制劑⑶不能抑制異土木香內醋引起的Bcr-Abl