專利名稱：用于誘導對病毒免疫性的方法
技術領域：
本發明涉及用于誘導對病毒、且特別是經歷過突變的病毒的免疫性的方法。更為特別地，本發明涉及用表達含有改變或缺失優勢免疫表位的病毒突變形式包被(env)糖蛋白的構建體增加細胞毒T淋巴細胞(CTL)抗病毒反應的方法。
以env糖蛋白免疫HIV-感染的患者是對已形成的逆轉錄病毒感染進行主動免疫治療的實驗方法。然而，成功的HIV疫苗治療臨床試驗不僅不得不克服初級HIV分離物中的env糖蛋白的顯著多樣性，而且必需克服對AIDS病理發生為關鍵性的env-CD4之間相互作用(Siliciano，1996，當前微生物免疫學主題(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)205159-79)。此相互作用不僅提供HIV趨性的分子基礎(Hwang等，1991，科學(Science)25371-74)，而且啟動HIV-感染患者中造成CD4+細胞耗竭和免疫缺陷形成的數種有害事件。
在HIV-感染的患者中，CD4+T細胞喪失的速度超過經胸腺分化和/或成熟T細胞克隆擴增而產CD4+細胞的速度(Siliciano，1996，當今微生物免疫學主題.205159-79)，提示無論直接還是間接的細胞病理學機制均造成AIDS形成過程中CD4+T細胞的耗竭(Oyaizu等，1993，血液(Blood)823392-3400)。這些機制包括與合胞體形成有關的細胞-細胞融合(Sodroski等，1986，自然(Nature)322470-474)，在抗-gp120抗體存在下CD16+細胞裂解性效應細胞的破壞(Lyerly等，1987，美國自然科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)844601-4605)或由gp120特異性CD4+細胞的破壞(Stanhope等，1993，免疫學(Immunol.)1504672-4686)，隨機的VβT細胞缺失(Boyer等.，1993，臨床實驗免疫學(Clin.Exp.Immunol.)92437-441)和由結合gp120與CD4的交聯然后抗原驅動活化所誘導的凋亡(Banda等，1992，實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)1761099-1106；Corbeil，J.，M.Tremblay，和D.D.Richman，實驗醫學雜志18339-48)。
在gp120的可變區域中，V3環稱為HIV優勢中和區(dominantneutralizing domain)，其在不同HIV分離物中表現出高度的可變性(Hwang等，1991，科學25371-74)。V3區也涉及病毒進入過程中en-CD4受體后(postreceptor)結合步驟(Freed等，1991，病毒學雜志(J.Virol.)65190-194)，并且其結構可影響HIV分離物對靶細胞中β-趨化因子受體存在的應答能力(Trkola等，1996，自然384184-181)。后者的相互作用在決定病毒細胞趨性和合胞體形成表型的細胞事件中起重要作用(Lapham等，1996，科學274602-604)。此外，因為在HIV感染患者中的大部分中和抗體(30％-80％)識別線性V3環序列(Vogel等，1994，免疫學雜志.1531895-1904)。這些抗體可能主要造成未感染CD4+T細胞ADCC-介導的細胞裂解。
gp120的V3環是同時誘導體液和細胞介導的抗HIV免疫性的env糖蛋白的優勢區，但也已知其經歷頻繁的突變(Siliciano，1996，當今微生物免疫學主題.205159-79；Hwang等，1991，科學25371-74)。由V3環突變表位在體內誘導的次級反應可能驅動長時間的免疫活化，從而導致由于高的T細胞轉換造成的再生能力的加速耗竭(Wolthers等，1996，科學2741543-1547)。此外，在細胞表面表達或HIV感染細胞釋放的全長env糖蛋白可觸發與env-CD4相互作用有關的有害事件，該相互作用是AIDS病理發生的中心環節(Siliciano，1996，當今微生物免疫學主題.205159-79)。
鑒于前述有關現有技術中免疫患者從而抵抗頻繁突變病毒的方法的缺陷，顯然在本領域中存在這樣的必要，即需要一種重新指導針對這些病毒包膜糖蛋白保守表位免疫反應的方法，這樣誘導對多株病毒的細胞免疫，而不誘導與該包膜糖蛋白與其細胞受體間相互作用有關的有害效應。
因此，本發明的一個目的是提供以足以誘導抗病毒細胞免疫的量施用給病人編碼此病毒包膜糖蛋白核酸而誘導對病毒的細胞免疫的方法，其中的包膜糖蛋白(a)含有修飾的優勢免疫表位；和(b)誘導對該包膜糖蛋白保守表位的細胞免疫。
本發明的另一個目的是提供一種新的誘導抗病毒細胞免疫的方法，包括(a)將編碼此病毒包膜糖蛋白的核酸導入抗原呈遞細胞(APC)，其中的包膜糖蛋白含有修飾的優勢免疫表位，和(b)給有需要的患者施用足以誘導對該病毒保守表位的細胞免疫量的APC。
本發明的另一目的是提供用于制備抗病毒疫苗的方法，包括
(a)將編碼此病毒的包膜糖蛋白的核酸導入載體DNA或脂質體，其中的包膜糖蛋白含有修飾的優勢免疫表位；和(b)將該載體DNA或脂質體與適當的佐劑混合。
本發明的另一個目的是提供用于制備抗病毒疫苗的方法，包括(a)將編碼此病毒的包膜糖蛋白的核酸導入抗原呈遞細胞(APC)，其中的包膜糖蛋白含有修飾的優勢免疫表位；和(b)將此APC與適當的佐劑混合。
本發明的另一個目的是提供用于誘導抗病毒細胞免疫性的疫苗，包括(a)在其表面表達該病毒的包膜糖蛋白的細胞，其中的包膜糖蛋白含有修飾的優勢免疫表位和(b)佐劑。
對于前面和其它的目的，本發明的優勢和特征在下文中將變得顯而易見，通過參照本發明下面優選實施方案的詳細描述和附屬的權利要求，可更為清楚地理解本發明的特性。
附圖簡述當通過參照下面詳細描述且結合附圖可更好地理解本發明，從而可容易地獲得對本發明和其許多附帶的優勢的更為徹地的理解，其中

圖1是顯示HIV env基因的WT和DV3突變體的表達。將以痘苗病毒感染并表達WT與ΔV3突變體env糖蛋白的JA2細胞與HIV-感染患者血清進行免疫沉淀并于SDS-PAGE(8％丙烯酰胺)上加以分析。以CR19痘苗病毒感染的細胞用作陰性對照。
圖2顯示對由vv-WTP-2和vv-7ΔV3-感染的JA2細胞表達的env糖蛋白的免疫熒光染色與免疫沉淀。對于免疫熒光染色，將以重組痘苗病毒感染并表達WTP-2(A)和7ΔV3(B)包膜糖蛋白的細胞與HIV-感染患者血清(HIV+血清)、G3-523或F105mAb孵育，然后用FITC-偶聯的第二抗體染色，并且通過流式細胞術分析(右組)。用CR19株痘苗感染并以HIV+血清染色的細胞用作陰性對照。感染細胞的放射性標記細胞裂解物用相同的抗-gp120抗體加以沉淀并通過SDS-PAGE加以分析(左組)。
圖3顯示由抗-CD3mAb(實心柱)和以vv-WTP-2感染的自體LCLs(空心柱)或以vv-7ΔV3感染的自體LCLs(陰影柱)在HIV-感染患者的PBMC中對env-特異性CTL反應的誘導。通過用vac-感染的細胞作為陰性對照，在抗vv-WTP-2-感染JA2細胞的批量培養物(E∶T比例為20∶1)中51Cr釋放分析(左組)，和通過抗以HIV-1IIIB分離物感染JA2細胞的有限稀釋分析(右組)測定env-特異性CTL效應物。env-特異性CTLp的頻率計為對HIVenv測得的CTLp頻率與未感染對照靶子之間的差異，并且標準化為每106個PBMC中CTLp的數目。
圖4顯示env肽誘導的HIV感染患者417的env肽誘導的PBMC抗JA2細胞的CTL活性(A)和患者HIV分離物與天然病毒變異體中D1、I-10和D2肽的抗原性變化(B)。(A)患者417的PBMC以0.5μM的濃度用env-特異性肽刺激并在第14天在抗以vv-WTP-2(左組)和vv-7ΔV3(右組)感染的靶細胞的51Cr-釋放分析中進行測試。以vac感染的細胞用作對照，并且CTL活性計為CTL對env與對照靶子反應之間的差異。(B)通過RT-PCR擴增從PBMC中分離的病毒env RNA而測定患者417中D1、I-10和D2表位自身病毒序列的抗原性變異。將PCR擴增產物克隆入BlueScript并用引物進行測序。從用下面的登記號可從NCIB EntreZ數據庫中得到的序列獲得HIV分離物的抗原性變異HXB2為K03455；JRFL為U63632；SF2為K02007；并且CM240為U54771。
圖5顯示在HIV-血清反應陰性個體env-特異性抗體與PBMC存在下ADCC介導的以vv-WTP-2和vv-ΔV3感染的同種異體LCL的裂解。通過僅僅從vv-ΔV3或vv-WTP感染靶細胞的百分細胞毒性中減去與vac-感染靶子之間的背景反應性而計算ADCC特異性裂解。E∶T比例為50∶1。以標準差＜5％一式三份進行所有實驗條件三次。結果代表三次獨立的實驗。
圖6顯示在以表達全長和ΔV3突變形式env糖蛋白的痘苗病毒感染后的SupT-1細胞(A和B)中和在抗-CD3mAb-活化的IL-2-依賴性T細胞(C)中對env-介導凋亡的檢測。以vac、vv-WTP-2和vv-7ΔV3感染SupT-1細胞，并且在感染后的16小時的單個培養物中通過DNA含量頻率分布(A)和DNA凝膠電泳(B)分析凋亡。未感染細胞用作陰性對照。為了定量誘導活化的(細胞)凋亡，在以抗-CD3mAb刺激之前2小時將T淋巴細胞與表達env-糖蛋白的固定細胞孵育。72小時后經以PI染色核通過流式細胞術監測凋亡的誘導。
優選實施方案描述通過修飾病毒糖蛋白的優勢免疫表位，本發明者現已確定存在對細胞介導免疫反應的誘導和ADCC-介導的env表達細胞的裂解、合胞體形成和凋亡的減少或喪失。下面的定義進一步闡明本發明。
這里所述的氨基酸殘基優選為“L”異構形式。然而，只要該多肽維持免疫球蛋白結合所需的功能特性，可用任何的D-氨基酸殘基代替“L”異構形式的殘基。NH2指存在于多肽氨基末端的自由氨基。COOH指存在于多肽羧基端的自由羧基。與標準的多肽命名法(生化雜志(J.Biol.Chem.)，2433552-59(1969))保持一致，氨基酸殘基的簡寫形式示于下面的對應表中對應表符號氨基酸單字符 三字符YTyr 酪氨酸GGly 甘氨酸FPhe 苯丙氨酸MMet 甲硫氨酸AAla 丙氨酸SSer 絲氨酸IIle 異亮氨酸LLeu 亮氨酸TThr 蘇氨酸VVal 纈氨酸PPro 脯氨酸KLys 賴氨酸HHis 組氨酸QGln 谷氨酰胺EGlu 谷氨酸WTrp 色氨酸RArg 精氨酸DAsp 天冬氨酸NAsn 天冬酰胺CCys 半胱氨酸應該注意到所有的氨基酸殘基序列在這里用其左右方向為常規的氨基末端到羧基末端方向的形式表示。此外，應該注意到在氨基酸序列的起始端或末端的短線表示與一個或更多個氨基酸殘基其它序列間的肽鍵。列出上表從而將三字符與單字符概念對應起來，它們可能在文中交替出現。
“復制子”為在體內作為DNA復制自主單位，即，能夠在其自身控制下復制而起作用的任何遺傳單位(如，質粒，染色體、病毒)。
“載體”為另一種DNA片段可附著到其上從而導致該附著片段復制的復制子，如質粒、噬菌體或粘粒。
“DNA分子”指單鏈或以雙鏈螺旋形式的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)多聚體形式。該術語僅指此分子的一級與二級結構，并且并不將其限定于任何特定的三級形式。因此，該術語包括特別在線性DNA分子(如限制性片段)、病毒、質粒和染色體中發現的雙鏈DNA。在討論特定雙鏈DNA分子結構過程中，在此可根據常規的方式描述序列，僅給出沿DNA非轉錄鏈(即，具有與mRNA同源序列的鏈)5’到3’方向的序列。
“復制起點”指參與DNA合成的那些DNA序列。
DNA“編碼序列”是當置于適當調節序列控制下在體內被轉錄并翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子所決定。編碼序列可包括但不限于原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核(如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列、甚至為合成的DNA序列。多聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列一般將位于編碼序列的3’端。
轉錄和翻譯控制序列為提供編碼序列在宿主細胞中表達的DNA調節序列，如啟動子、增強子、多聚腺苷酸化信號、終止子等。
“啟動子序列”為能夠在細胞中結合RNA聚合酶并且起始下游(3’方向)編碼序列轉錄的DNA調節區。為了定義本發明的目的，啟動子序列在其3’末端與轉錄起始位點相連接并向上游(5’方向)延伸，包括啟動高于背景的可檢測到水平的轉錄所必需的最低數目的堿基或元件。在啟動子序列內部將發現有轉錄起始點(由核酸酶S1作圖而方便地加以定義)以及負責RNA聚合酶結合的蛋白結合區(共有序列)。真核啟動子將經常但不總是含有“JAJA”盒和“CAT”盒。原核啟動子除了-10到-35共有序列外還含有Shine-Dalgarmo序列。
“表達控制序列”為控制和調節另一種DNA序列轉錄與翻譯的DNA序列。當RNA聚合酶將編碼序列轉錄成mRNA，然后翻譯成由該編碼序列所編碼的蛋白時，此編碼序列在細胞中轉錄和翻譯控制序列的“控制之下”。
“信號序列”可被包括在編碼序列前面。此序列編碼多肽N-末端的信號肽，其與宿主細胞發生通訊從而指導該多肽至細胞表面或將此多肽分泌至培養基中，并且在蛋白離開細胞之前由宿主細胞切下信號肽。可發現信號序列與多種天然原核和真核蛋白有關。
這里用于指本發明探針的術語“寡核苷酸”定義為由2個或更多個核糖核苷酸，優選多于三個核糖核苷酸所組成的分子。其確切的大小將依賴于許多因素，這些因素反過來又依賴于該寡核苷酸的最終功能。
這里所用的術語“引物”指純化限制性消化產物中天然產生的或合成制備的寡核苷酸，當置于誘導與核酸鏈互補的引物延伸產物合成的條件下時，即在核苷酸與誘導劑如DNA聚合酶存在下且在適當溫度與PH時，其能夠作為合成起始點而起作用。此引物可以為單鏈或雙鏈并且必需足夠長以在誘導劑存在時引發所需延伸產物的合成。此引物的確切長度將依賴于多種因素，包括溫度，引物的來源和使用的方法。例如，對于診斷應用，根據靶序列的復雜性此寡核苷酸引物一般含有15-25個或更多個核苷酸，盡管其可以含有更少的核苷酸。
這里的引物被選定為與特定靶DNA序列不同鏈“基本上”是互補的。這意味著該引物必須足夠互補從而與其各自的鏈雜交。因此，該引物序列不一定反映模板的確切序列。例如，可將非互補的核苷酸片段附著到引物的5’末端，該引物序列的其余部分互補于該鏈。作為選擇，如果該引物序列與此鏈序列具有足夠的互補性從而與其雜交且因此形成用于合成此延伸產物模板時，可將非互補堿基或更長的序列分散于此引物中。
如這里所使用的，術語“限制性內切核酸酶”與“限制性酶”指細菌酶，其中的每種酶在特定的核苷酸序列處或其附近切割雙鏈DNA。
當DNA被導入細胞內時，此細胞已被外源或異源DNA所“轉化”。此轉化DNA可能整合(共價連接)或不整合入構成該細胞基因組的染色體DNA中。例如，在原核、酵母及哺乳動物細胞中，轉化DNA可存在于游離體(episomal)元件如質粒上。對于真核細胞，穩定轉化的細胞為轉化DNA整合入染色體中從而其經過染色體復制而由子代細胞遺傳。此穩定性通過該真核細胞建立由含有此轉化DNA子代細胞種群所組成的細胞系或克隆的能力而被證實。“克隆”是通過有絲分裂從單個細胞或常規祖細胞衍生的細胞種群。“細胞系”為能夠在體外穩定生長許多代的原代細胞的克隆。
兩種DNA序列在規定的DNA序列長度內至少有約75％(優選至少約80％，并更為優選至少約90或95％)核苷酸匹配時，則它們“基本上同源”。可通過用可在序列數據庫中得到的標準軟件比較序列，或者，例如，用于該特定系統而制定的嚴格條件下的Southern雜交實驗鑒定基本上同源的序列。制定合適的雜交條件在本領域的技術范圍內。參見，例如，Maniatis等，出處同上；DNA克隆(DNA Cloning)，第I、II卷，出處同上；核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)，出處同上。在此引用供參考。
應該明白同時在本發明范圍內的還有編碼具有與天然包膜糖蛋白具有相同氨基酸序列的包膜糖蛋白，但為天然或野生型DNA序列簡并序列的DNA序列。“簡并”意為用不同的三字母密碼子代表特定的氨基酸。在本領域中眾所周知下面的密碼子可互換使用以編碼每種特定的氨基酸苯丙氨酸(Phe或F) UUU或UUC亮氨酸(Leu或L)UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG異亮氨酸(Ile或I) AUU或AUC或AUA甲硫氨酸(Met或M) AUG纈氨酸(Val或V)GUU或GUC或GUA或GUG絲氨酸(Ser或S)UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC脯氨酸(Pro或P)CCU或CCC或CCA或CCG蘇氨酸(Thr或T)ACU或ACC或ACA或ACG丙氨酸(Ala或A)GCU或GCG或GCA或GCG酪氨酸(Tyr或r)UAU或UAC組氨酸(His或H)CAU或CAC谷氨酰胺(Gln或Q) CAA或CAG天冬酰胺(Asn或N) AAU或AAC賴氨酸(Lys或K)AAA或AAG天冬氨酸(Asp或D) GAU或GAC谷氨酸(Glu或E)GAA或GAG半胱氨酸(Cys或C) UGU或UGC精氨酸(Arg或R)CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG甘氨酸(Gly或G)GGU或GGC或GGA或GGG色氨酸(Trp或W)UGG終止密碼子UAA(赭石)或UAG(琥珀)或UGA(乳白)應該明白上面定義的密碼子為RNA序列。DNA相應密碼子以T代替U。
可在野生型序列中造成突變從而該特定的密碼子變成編碼不同氨基酸的密碼子。一般通過造成盡可能少的核苷酸改變而制備這樣的突變。可以用非保守方式(即，通過將屬于具有特定大小或特征氨基酸組的氨基酸密碼子變為屬于另一組氨基酸的密碼子)或保守的方式(即，通過將屬于具有特定大小或特征氨基酸組氨基酸密碼子變為屬于相同組的氨基酸)制備這種替代突變從而改變得到蛋白中的氨基酸。這種保守改變一般導致得到蛋白結構與功能的較少改變。非保守改變更有可能改變所得蛋白的結構、活性或功能。認為本發明應該包括含有沒有顯著改變所得蛋白活性或結合特征的保守改變的序列。
下面為不同氨基酸分組的一個實例非極性R基團氨基酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸異亮氨酸脯氨酸苯丙氨酸色氨酸甲硫氨酸不帶電極性R基團氨基酸甘氨酸絲氨酸蘇氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰胺谷氨酰胺帶電極性R基因氨基酸(帶負電，Ph6.0)天冬氨酸谷氨酸堿性氨基酸(帶正電Ph6.0)賴氨酸精氨酸組氨酸(pH6.0)另一種分組可以為具有苯基的那些氨基酸苯丙氨酸色氨酸酪氨酸另一種分組可以根據分子量(即，R基因大小)甘氨酸 75丙氨酸 89絲氨酸 105脯氨酸 115纈氨酸 117蘇氨酸 119半胱氨酸 121亮氨酸 131異亮氨酸 131天冬酰胺 132天冬氨酸 133谷氨酰胺 146賴氨酸 146谷氨酸 147甲硫氨酸 149組氨酸(pH6.0時) 155苯丙氨酸 165精氨酸 174酪氨酸 181色氨酸 204特別優選的保守替代有-Lys代替Arg和Arg代替Lys從而可保留正電；-Glu代替Asp和Asp代替Glu從而可保留負電；-Ser代替Thr從而可保留自由-OH；以及-Gln代替Asn從而可保留自由NH2。
也可導入氨基酸替代從而替換成具有特定優選特性的氨基酸。例如，可將Cys導入用于與其它Cys形成二硫橋的潛在位點。His可作為特別的“催化”位點而被導入(即，His可作為酸或堿而起作用并且為生化催化中最為常見的氨基酸)。Pro由于其特定的平面結構而被導入從而誘導該蛋白結構中的β-轉角。
當至少約70％氨基酸殘基(優選至少約80％，且最為優選至少約90或95％)相同或代表保守性替代時則這兩種氨基酸序列為“基本上同源的”。
DNA構建體的“異源”區域為位于較大DNA分子內部且在自然界中沒有發現與此較大分子有關系的可鑒定的DNA片段。因此，當該異源區域編碼哺乳動物基因時，此基因兩側部分一般將不是其來源生物基因組中位于該哺乳動物基因組DNA兩側的DNA。異源編碼序列的另一個實例是其中的編碼序列本身未在自然界中發現的構建體(如，其中的基因組編碼序列含有內含子、具有不同于天然基因密碼子的合成序列的cDNA)。等位變異或天然發生的突變事件不產生這里定義的DNA異源區域。
“抗體”為任何形式的免疫球蛋白，包括結合特異性表位的抗體及其片段。該術語包括多克隆、單克隆和嵌合抗體，最后一種提及的抗體進一步詳細描述于美國專利Nos.4,816,397和4,816,567中。
“抗體結合位點”為由特異性結合抗原的重輕鏈可變區與高變區所組成的抗體分子的結構部分。
以各種語法形式在這里使用的詞語“抗體分子”既涉及完整的免疫球蛋白分子又涉及免疫球蛋白分子的免疫學活性部分。
抗體分子實例有完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和那些含有互補位的免疫球蛋白分子的部分，包括本領域中稱為Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)的那些，這些部分優選用于這里所述的治療方法中。
通過眾所周知的方法分別用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對基本上完整抗體分子的蛋白酶解反應而制備抗體分子的Fab與F(ab’)2部分。參見，例如Theofiloplous等的美國專利No.4,342,566。Fab’抗體分子部分也是眾所周知的并且從F(ab’)2部分中制備，然后用巰基乙醇還原連接2個重鏈部分的二硫鍵，且然后用試劑如碘乙酰胺烷基化得到的蛋白硫醇。含有完整抗體分子的抗體在此是優選的。
詞語“單克隆抗體”在其不同語法形式中指僅具有一種能夠與特定抗原起免疫反應的抗體結合位點的抗體。因此，單克隆抗體一般對與其起免疫反應的任何抗原顯示出單一的結合親和性。因而，單克隆抗體可以含有具有多個抗體結合位點的抗體分子，每個位點對不同的抗原是免疫特異性的；如，雙特異性(嵌合)單克隆抗體，詞語“藥物上可接受”指當施用至人類時在生理上可耐受并且一般不產生變態反應或類似不必要的反應如胃性嘔吐、頭暈等的分子本身和組合物。
詞語“治療有效量”在這里使用意為足以阻止，并且優選減少，其存在或活性相關的體征或病征如升高的血壓、發燒或白細胞升高的量。
當表達控制序列控制和調節DNA序列的轉錄與翻譯時，將此DNA序列“可操作地連接到”表達控制序列上。術語“可接地連接”包括在待表達DNA序列前面具有適當的起始信號(如，ATG)并且維持正確的閱讀框從而允許該DNA序列在該表達控制序列下表達并且產生由該DNA序列所編碼的所需產物。如果一個人們希望將其插入到重組DNA分子中的基因不含有適當的起始信號，可在該基因前面插入起始信號。
術語“標準雜交條件”指鹽和溫度條件基本上相當于同時用于雜交與清洗的5xSSC和65℃。然而，本領域中的技術人員將會明白這樣的“標準的雜交條件”依賴于特定的條件，包括緩沖液中鈉與鎂的濃度、核苷酸長度與濃度、不匹配的百分數、甲酰胺的百分比等。在決定“標準雜交條件”中同樣重要的是雜交的2種序列為RNA-RNA、DNA-DNA還是RNA-DNA。根據眾所周知的方式，本領域的技術人員可容易地制定此標準的雜交條件，如果必要，其中的雜交一般低于預期或測定的Tm 10-20℃，清洗條件更嚴格。
如這里所使用的，“細胞免疫”意為指抗原或含有抗原細胞的T-淋巴細胞的活化與激活。待活化的特別優選的T-細胞為細胞毒T細胞(即，CD8+)，而待保護免受凋亡的特別優選T細胞為輔助T-細胞(即，CD4+)。
“抗原呈遞細胞”(APC)意為在其表面表達抗原、或吞噬抗原、加工該抗原且然后將該加工過的抗原的至少一部分插入到其膜中從而將其暴露于細胞外的任何細胞。APC的實例有單核細胞/巨噬細胞系和樹枝狀細胞的那些。
“優勢免疫表位”意指可能為蛋白中氨基酸線性排列、或氨基酸非線性三維排列的蛋白的一部分，其充分暴露從而誘導出針對它的抗體。這樣的表位可以為抗體與之結合并阻止細胞感染和/或阻細胞融合的“中和”或“融合表位”。
“有需要的患者”意為處于感染風險或已經暴露于病毒或受其感染的人或動物。
含有包膜糖蛋白的病毒優選為經歷抗原性變異如抗原性漂變(如，慢病毒)或抗原性轉變(如流感)的病毒。優選的病毒有逆轉錄病毒，且特別是慢病毒如人類免疫缺陷病毒(HIV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、Caprine關節炎腦炎病毒(CAEV)、類人猿免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)及綿羊病毒性腦膜炎病毒。
如上所述，優選的優勢免疫表位包括包膜糖蛋白的第三個可變環(V3)，中和表位和融合表位。然而，已注意到融合表位可以是高度疏水性的，并且因此沒有很好地暴露于糖蛋白上。在有些情況，前體糖蛋白的切割，如HIV的gp160糖蛋白切割成gp120與gp41需要暴露這樣的表位。
可以使用改變優勢免疫表位的任何方法，包括缺失表位、插入打斷該表位二級與三級結構的序列和通過定點誘變對序列的修飾。將會明白通過保守氨基酸替代的改變將最少打斷表位，而不同大小、結構或電荷氨基酸的替代將對結構具有更為明顯的影響。
可根據本發明，將編碼含有修飾優勢免疫表位的病毒包膜糖蛋白的核酸導入APC可獲得用于治療或預防病毒感染的有效疫苗。優選將此核酸導入能夠表達修飾糖蛋白的載體中。然而，本發明也涉及直接提供修飾的糖蛋白，或經過脂質體、基因槍等僅提供“裸露”的核酸(位于適當介質或佐劑中)。同樣涉及用逆轉錄病毒、腺病毒或其它真核(如哺乳動物)表達載體，包括但不限于牛乳頭瘤病毒、痘苗病毒或腺伴隨病毒(AAV)提供核酸。
含有核酸、多肽、類似物或活性片段或含有前述成分的細胞作為活性成分的治療性組合物的制備在本領域中是眾所周知的。一般地，將這種組合物制備成可注射的液體溶液或懸液，然而，也可制備成在注射之前適于溶解或懸浮于液體中的固體形式。也可將此制品乳化。活性的治療成分經常與藥物上可接受的并且與該活性成分相容的賦形劑混合。適當的賦形劑有，例如，水、鹽、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。此外，如果必要，此組合物可含有次要量的增加該活性成分有效性的輔助物質如增濕或乳化劑、pH緩沖劑。
核酸、多肽、類似物或活性片段或含有前面成分的細胞可制成中和的藥物上可接受鹽形式的治療組合物。藥物上可接受的鹽包括(與多肽或抗體分子自由氨基形式的)酸加成鹽和與無機酸如，鹽酸或磷酸，或有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的鹽。與自由羧基形成的鹽也可衍生自無機堿。如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵及有機堿如，異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
該治療性核酸、多肽、類似物或活性片段或細胞組合物一般通過例如單位劑量注射而靜脈內施用。當用于指本發明治療性組合物時，術語“單位劑量”指適用于人類單位劑量的物理上分離的單位，每單位含有經計算產生所需治療效應的預定量的活性物質與所需的稀釋劑；即，載體或賦形劑。
以可與該制劑相容的方式和以治療上有效量的量施用該組合物。待施用的量依賴于待治療的對象，治療對象利用該活性成分的能力和對所需的特定病毒功能的抑制或中和程度。需要施用的準確的活性成分量依賴于醫生的判斷并且對每個患者是持異性的。然而，適當的劑量可以從每日每千克患者體重約0.1到20，優選約0.5到約10，且更為優選一到數毫克的活性成分并且依賴于施用的途徑。用于初始施用及加強注射的適宜治療方案也是可變的，但典型的是初始施用后以一或更多小時的間隔隨后注射或其它施用而給以重復劑量。作為選擇，可考慮足以維持血液中十納摩爾到十微摩爾濃度的持續靜脈內灌注。
大體上描述本發明后，通過參照在此提供的一些具體實施例可獲得進一步的理解，如果沒有特別說明，則這些實施例僅是為了說明的目的而不意在限制。實施例實施例1細胞的分離從Thomas Jefferson大學醫院(費城，PA)傳染病區臨床辦公室中6位感染HIV成年人施以肝素的血液中獲取PBMC。從血沉棕黃色層中獲取HIV-血清反應陰性供體的PBMC(NABI，miami，FL)。感染HIV患者處于發病早期，CD4+T細胞計數為300到600個細胞/mm3。所有病人正以蛋白酶抑制劑(crixivan)再加上二核苷進行抗病毒治療；2位病人僅接受過齊多夫定或同時接受過拉米夫定(lamivudine)，并且三位患者僅僅用斯塔夫定(stavudime)治療過或同時還用ddI和拉米夫定治療過。一位患者涉及僅斯塔夫定-crixivan-聯合施用這兩種藥物的盲試研究。
所有的感染HIV的患者表達HLA-A2抗原，這由美國紅十字會(費成，PA)用標準的血清學技術測得。
實施例2
重組疫苗病毒的制備HIV-1IIIB分離物為全長env基因的來源并將ΔV3環突變子在合成的早/晚期vv啟動子(Ear1等，1990，從人類免疫缺陷病毒1型包被基因中去除隱蔽痘病毒轉錄終止信號增強重組痘苗病毒的表達與免疫原性，病毒學雜志642448-2451)控制下克隆入基于pSCII的載體中。通過連接用PCR從pSVIII-env質粒(Dana-Farber癌癥研究所，波士賴，MA，J.Sodroski惠贈)擴增獲得的片段構建具有Δ297-329缺失的vv-ΔV3突變體(15，在此整個引用供參考)。用在ATG密碼子前含有SalI位點和CCACC Kozak序列的合成寡核苷酸(5’AGA-AGAGTCGACCCACCACCATGAGAGTGAAGGAGA-3’，有義)(SEQ ID NO1)和含有KpnI位點的寡核苷酸(5’-ACAGGTACCCCATAATAGACTGTGAC-3’，反義)(SEQ IDNO2)通過PCR產生一個片段并且用于與第二個env片段連接。通過KpnI和BamHI消化pSVIII-env質粒而獲得第二個片段，并且用在其5’末端含有BamHI位點的合成寡核苷酸(5’-AACGGATCCTTAGCACTTATCTGGG-3’，有義)(SEQ ID NO3)和含有TAA終止密碼子且其后有NcoI位點的反義引物(5’-TTGCGCGGCCGCTTATAGCAAAATCCTTTCC-3’)(SEQ ID NO4)通過PCR產生第三個片段。將此三個片段連接至基于pSCII的載體(Thomas Jefferson大學(費城，PA)L.Eisenlohr博士惠贈)的SalI和NotI位點處從而構建質粒pSC-ΔV3。用B.Cullen博士(Howard Hughes醫學院，杜克大學醫學中心，Durham，NC)惠贈的重組克隆pIIIB(Hwang等，科學25371-74)通過類似的方法構建具有WT env基因的質粒(pSC-WTP)。按已述方法(Ear1等，1990，病毒學雜志，642448-2451)通過同源重組，用質粒pSC-ΔV3和pSC-WTP構建vv-ΔV3和vv-WTP。
實施例3合成肽的制備以前已描述過env肽D1(KLTPLCVTL，aa.121-129)(SEQ ID NO5)；D2(LLNATAIAV aa.814-822)(SEQ ID NO6)，和I-10(RGPGRAFVTI，aa.318-327)(SEQ ID NO7)(Dupuis等，1995，免疫學雜志1552232-2239；Takahashi等，1996，實驗醫學雜志.183879-889)。在費城(PA)的Wistar研究所通過標準的方法(Otvos，Jr.，等.，生化生物物理學報(Biochim.Biophys.Acta)122468)合成這些肽，通過反相高效液相色譜加以純化并且通過氨基酸分析和激光解吸質譜對其進行特征分析。
實施例4按已述方法(Kozbor等，1981，免疫學雜志，1271275-1280)通過PBMC與來自產生-EBV的絨猴細胞系B95.9(美國典型培養物保藏中心，RockvMle MD)上清液孵育建立自體B-LCL，用作靶細胞。從Linda Sherman博士(The ScrippsResearch Institute，LaJolla，CA)獲得以HLA-A2基因穩定轉染并命名為JA2的Jurkat細胞系(Tsomides等，1994，實驗醫學雜志1801283-1293)。
實施例5細胞毒性分析按已述方法(Luzuriage等，1993，傳染病雜志(J.Infect.Dis.)1671008-1013)進行標準的51Cr-釋放分析。簡言之，僅用5MOI的CR19痘苗病毒(vac)或者表達WT或ΔV3環env基因產物的痘苗病毒感染靶細胞(HLA-A2+LCL或JA2細胞)并以Na251CrO4標記(Dupont NEN，波士頓，MA)。清洗4次后，將104個靶細胞與T細胞系混合，該T細胞系是在以0.5％多聚甲醛處理而失活后通過以抗-CD3 n-mAb或以vvΔV3或vv-WT感染的自體LCL體外刺激而從每位患者建立的(Klein等，1995，實驗醫學雜志1811365)。4小時后，收獲上清液并用1470 Wizard γ-計數器(Wallac，Gaithersburg，MD)測定放射活性。自發51Cr-釋放總是小于最大釋放的15％。特異性裂解計為100×([實驗釋放-自發釋放]/[最大釋放-自發釋放])。通過從vv-env-感染靶細胞的特異性裂解百分數中減去vac-感染靶細胞特異性裂解的百分數而計算HIV-特異性裂解的百分數。如果其超過僅以vac感染細胞的平均裂解3個SD，那么認為此env-特異性反應為陽性(Luzuriaga等，1993，傳染病雜志1671008-1013；Klein等，1995，實驗醫學雜志.1811365)。
實施例6CTL前體的有限稀釋分析用有限稀分析(Klein，1995，實驗醫學雜志1811365；Koup等，1991，實驗醫學雜志，1741593-1600)測定env-特異性CTLP的頻率。簡言之，將PBMC與多聚甲醛處理后用vv-ΔV3或vv-WTP感染的自體LCL一起以每孔18,000到667個細胞稀釋于96-孔微滴定平板的24個雙份的小孔中。向孔中加入104個固定的刺激細胞和104個自體照射(6000拉德)過的PBMC。在第1和第10天，向培養物中補充以含IL-2(50U/ml)的培養基，于第16天分離并測試細胞毒性。將51Cr-標記的靶細胞(5×103)個加入到每孔中，并在4小時后收獲上清液。靶細胞為以HIV-1IIIB連續感染或以1μm濃度env肽D1包被的JA2細胞。未反應孔的部分定義為其中的51Cr-釋放不超過平均值加上24個對照孔自發釋放的3SD的孔的數目。按Strijbosch等的描述(Strijbosch等，1987，免疫學方法雜志(J.Immunol.Meth.)97133-140)進行統計分析。CTLp頻率表示為CTLp數/106個PBMC。HIV-特異性CTLP頻率計為對表達HIV抗原的靶子與對對照靶子測得的CTLp頻率間的差異。
實施例7抗體單克隆抗體(mAb)包括F105，一種針對由4個部分覆蓋CD4受體結合位點的gp120不連續區域所組成表位的人類mAb(HmAb)(Thali等，1991，病毒學雜志.656188-6193)；G3-523，針對V3區域內表位的小鼠mAb(MmAb)(Moore等，1993，病毒學雜志.674785-4796)；670-D，針對位于gp120 C-末端區內表位的HmAb(Forthal等，1995，AIDS研究和人類逆轉錄病毒(AIDS Res.Hum.Retrovir.)111095-1099)；694/98-D，針對位于V3環內的線性表位(GRAF)的HmAbs(Gorny等，1993，免疫學雜志，150635-643)；697-D，一種識別gp120 V2區域內表位的HmAb(Forthal等，1995，AIDS研究和人類逆轉錄病毒.111095-1099)；和50-69II，針對env糖蛋白gp41區域內表位的HmAb(Forthal等，1995)。HmAb F105由M.Posner博士(New England DeaconessHospital，Boston，MA)提供，MmAb G3-523由M.Fung博士(Tanox Biosystems公司.，Houston，TX)提供，HmAb 697-D，694/98-D、670-D和50-69II由S.Zolla-Pazner和M.Gorny博士(紐約獸醫中心，紐約)惠贈。通過在Protein-G柱(Pharmacia Brotech，Piscataway，NJ)上純化而獲得感染HIV供體血清的多克隆Ig。
實施例8免疫沉淀在無半胱氨酸和甲硫氨酸的DMFM培養基中用60μCi/ml的[36S]半胱氨酸與[35S]甲硫氨酸(Dupont NEN公司，波士頓，MA)標記過夜后，用Nonidetp-40(NP-40)緩沖液(0.5％NP-40，0.5M NaCl、10mM Tris HCl[pH7.5]對vv-ΔV3和vv-WTP感染的細胞進行免疫沉淀從而裂解細胞。用來自感染HIV患者的血清(HIV+血清)、G3-523和F105mAb沉淀放射性標記的細胞裂解物。簡言之，用抗-gp120抗體與細胞裂解物孵育然后與多克隆免抗-人Ig(CorganonTeknika公司.，West Chester，PA)孵育，并且用蛋白A-Sepharose CL4B(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)沉淀免疫復合物。用存貯磷光成像儀(Storage Phosphor imager)(Phospho Imager 400S；Molecular Dynamic)分析于8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳的樣品。根據包膜帶中象素(pixel)計數的值確定包膜糖蛋白的相對量。
實施例9間接流式細胞術將以vv-ΔV3或vv-WTP-2感染12小時的LCL與HIV+血清或抗-gp120mAb(1μg/ml)在含有2％FCS和0.1％疊氮化鈉的PBS緩沖液(PBS/FCS)中孵育30分鐘，在PBS/FCS中洗三次，用FITC-偶聯的羊抗人或抗-小鼠Ig F(ab’)2片段(Organon Teknica公司.，West Chester，PA)1∶40的稀釋液染色，并以1％多聚甲醛孵育過夜而加以固定。將細胞在PBS/FCS中洗并于CoulterCytofluorograf System，PROFILE II上加以分析。
實施例10ADCC靶細胞由以vac、vv-ΔV3或vv-WTP感染的JA2細胞組成，并以51Cr標記。將來自HIV-血清反應陰性供體的PBMC用作env-特異性抗體存在下的效應細胞(效應細胞對靶細胞比例為50∶1)。根據公式[(實驗cpm-自發釋放cpm)/(最大cpm-自發釋放cpm))×100計算特異性裂解的百分數。通過從vv-ΔV3或vv-WTP感染靶細胞的百分細胞毒性中減去僅以vac-感染靶細胞的背景活性而計算ADCC-特異性裂解。所有的實驗條件重復三次，標準差＜5％。
實施例11合胞體形成分析和凋亡的誘導為了合胞體形成分析，用vac、vv-WTP、vv-ΔV3感染SupT-1細胞。對照培養物包括單鋪的或以1∶1比例混合的未感染的細胞和以HIV-1III分離物長期感染的細胞。
在以vac、vv-ΔV3和vv-WTP env糖蛋白感染SupT-1細胞過程中以及在表達env糖蛋白細胞存在下以抗-CD3mAb刺激的未感染T淋巴細胞中分析凋亡的誘導。對于活化誘導的凋亡，通過在照射的APC存在下以抗-CD3 mAb反復刺激來自HIV-血清反應陰性供體的富含CD4的PBL而建立IL-2依賴性CD4+7細胞系。用vac、vv-ΔV3、vv-WTP感染單核細胞系THP1(美國典型細胞培養物保藏中心，Rockville，MD)12小時，用0.5％多聚甲醛在冰上固定30分鐘，并以PBS洗三次。在以100ng/ml抗-CD3mAb刺激72小時之前用表達vv-env的THP-1細胞(106個細胞/ml)預沉淀IL-2依賴性T母細胞(5×105個細胞/ml)(Tuosto，L等，1995，歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol.)252907-2916)。
實施例12凋亡相關染色質降解的檢測和DNA含量分析通過用于測定斷裂核的流式細胞術方法，用碘化丙錠(PI)染色和DNA凝膠電泳而定量測定經歷凋亡細胞的百分比。簡言之，用70％的乙醇于4℃固定細胞3小時，于800g離心5分鐘并將細胞沉淀重懸于含有0.1mM EDTA(Na)2、50μg/ml RNA酶(50U/mg)、和PI(50μg/ml)的PBS中。然后在CoulterCytofluorograf System，PROFILE II上通過流式細胞術分析之前，用PBS洗細胞2次。為了分析凋亡性細胞死亡特征性的DNA梯度，按前述(Corbeil.J.，等.，1996，實驗醫學雜志.18339-48)測定低分子量DNA斷裂。簡言之，在pH8.0的0.5ml低滲緩沖液(5mM Tris-HCL，20mM EDTA，0.5％Triton X-100)中裂解細胞沉淀，并于27,000g離心10分鐘。用650μl異丙醇和100μl5M的氯化鈉于-20℃沉淀斷裂的DNA過夜。27,000g離心15分鐘后，將沉淀物干燥并重懸于pH7.4的10mM Tris、1mMEDTA、0.5％SDS中，并用8μl無DNA酶的RNA酶A(5mg/ml)于37℃處理30分鐘。電泳在0.75％瓊脂糖凝膠中進行，并以5μg/ml溴化乙錠染色后在UV光下觀察DNA。
實施例13反轉錄-PCR和序列分析用從感染HIV患者的PBMC中分離的細胞RNA和2套引物通過RT-PCR檢測相應于env肽D1、I-10和D2區域內的天然病毒序列。一套引物擴增相應于env第1-365個氨基酸、跨越一個env區域的1到1095核苷酸的區域(根據HIV-1HXB2序列，登錄號K03455)(5’ACA GAA TTC ATG AGA GTG AAG GAG AAA TAT-3’，有義)(SEQ ID NO8)和(5’-GGT CTA GAC CTG AGG ATT GCT TAA AGA TT-3’。反義)(SEQ ID NO9)，并且第二套物擴增相應于第749-856個氨基酸的2248到2570核苷酸的區域(5’-AAC GGA TCC TTA GCA CTT ATC TGG-3’，有義)(SEQID NO10)和(5’-ACG TCG ACC TCG AGT TAT AGC AAA ATC CTT TC-3’，反義)(SEQID NO11)。將獲得的PCR片段克隆入pBluescript II SK+/-載體并在ThomasJefferson大學Kimmel癌癥研究所核酸中心用Reverse和M13-20引物進行測序。
實施例14ΔV3和WT env糖蛋白在vv-感染細胞中的表達為了檢測HIV env糖蛋白與對其突變基因產物細胞反應之間的結構-功能關系，用完整的和缺失V3環的env基因構建一套重組痘苗病毒。用感染HIV患者的血清對來自代謝標記JA2細胞的env基因產物的免疫沉淀顯示在代表性重組克隆中有少于20％的變異(圖1)。為了功能研究，分別篩選出具有全長和突變env糖蛋白相當表達水平的命名為vv-7ΔV3和vv-WTP-2的2個克隆。
對vv-感染細胞env糖蛋白的免疫熒光染色和免疫沉淀(圖2A和B)顯示表達7ΔV3突變體的細胞不結合G3-523抗-V3環mAb。它們表現出對針對gp120CD4結合位點的F105mAb更低的結合，這與以前證明V3環與gp120糖蛋白C4區域之間結構關系的報告(Wyatt，R.，M.等.，病毒學雜志.666997-7004)相一致。盡管在結合F105 mAb方面的差異，vv-7ΔV3感染細胞與感染HIV患者血清之間的反應性表明寡聚gp120在感染細胞表面上的折疊在缺失V3環的突變體中仍然保留。
實施例15vv-7ΔV3 env突變體對env-特異性CTL反應的誘導通過以抗-CD3 mAb和表達野生型或缺失V3環env糖蛋白的自體LCL刺激而在感染HIV患者的PBMC中誘導env-特異性的CTL活性。因為這些患者為HLA-A2+，故將以vv-WTP-2或HIV-1IIIB分離物感染的JA2細胞用作61Cr-釋放分析中的靶子。所有感染HIV的患者在抗-CD3mAb誘導的PBMC培養物中表現出env-特異性的CTL活性，特異性裂解為11％到26％(E∶T比例為10∶1，圖3，左版)。在6位患者的4位中，以表達env糖蛋白的自體LCL刺激PBMC得到細胞毒反應的顯著增加。然而，裂解活性的程度隨每種培養物而異。例如，在患者417、521和428中，CTL活性在以表達7ΔV3突變體細胞誘導的培養物中更高，而其余患者中，對全長env基因產物的反應高于或等于由7ΔV3基因產物誘導的反應，并且類似于以抗-CD3mAb誘導的非特異性反應。用有限稀釋分析對以HIV-1IIIB分離物感染的JA2細胞檢測到CTT、活性的類似變化。在感染HIV的3位患者中，針對感染HIV-1IIIB的JA2細胞的CTLp頻率為從49到216CTL/106個PBMC(圖3，右版)。在批量培養誘導PBMC中同樣顯示出增高水平CTL活性的患者521與428中檢測到CTLp的最高值。
在誘導的培養物中CTL反應的不均一性表明，完整和突變env基因產物免疫原性的差異可能影響感染HIV患者中擴增的CTL克隆的組成。為了進一步研究這一點，在以代表env糖蛋白至少三個不同表位的合成肽D1(氨基酸.120-128)，D2(氨基酸.814-823)和I-10(氨基酸.318-327)誘導的培養中，測定抗感染vv-7ΔV3和vv-WTP-2的JA2細胞的CTL活性。在能夠誘發對所有三種肽的CTL反應的患者417中，在以肽D1誘導的培養中檢測到抗env的最高活性，相反，對肽I-10和D2的反應下降(圖4A)。對肽I-10和D2低反應的分子基礎可能與在患者優勢HIV分離物顯示出的這些表位中自體病毒序列內增強的差異性有關(圖4B)。這與以前的證明初級HIV分離物env糖蛋白V3環和C-末端區域內序列變化的報導(Hwang，等，1991，科學253.71-74，Dupuis，M，S.1995，免疫學雜志.1552232-2239)相一致。
也可觀察到在裂解表達7ΔV3突變體的JA2方面，以優勢肽D1誘導的培養物較以全長env基因產物誘導的培養物更為有效(即，大于總CD3+T細胞的70％)。與以表達WTP-2 env基因產物的細胞誘導的培養物相比，在以D1肽誘導的培養物中抗突變env基因產物的較高的反應與2位HIV患者的以感染vv-7ΔV3 LCL刺激的PBMC中D1-特異性CTLp頻率的增加相吻合(分別為20和55CTL/106個PBMC對12和32CTLp/106個PBMC)。這些實驗結果表明在有些感染HIV的患者中V3區的缺失重新指導對env糖蛋白保守表位的免疫反應。
實施例16抗感染7ΔV3突變體的靶細胞的ADCC在隨后的研究中，用HIV-血清反應陰性供體的PBMC和從感染HIV患者的血清中純化的多克隆Ig研究表達7ΔV3突變體和WTP-2 env糖蛋白的細胞對ADCC-介導裂解的易感性。3個HIV血清反應陰性個體的PBMC的實驗結果顯示E∶T比例為50∶1時對vv-WTP-2感染的自體LCL具有15％-20％的特異性裂解(圖5)。在對V2和V3環(697-D和694/98-D)、CD4-結合位點(F105)、C-末端(670-D)和gp160的gp41區域(50-69II)內表位特異性的5種mAb中，對感染WTP-2靶細胞的最高ADCC活性由694/98-D和F105 mAb所介導。針對gp120其它區域的抗體對ADCC-介導的裂解具有較少的影響。相反，在多克隆抗-gp120抗體或F105mAb存在下檢測到的對感染vv-7ΔV3靶細胞的特異性裂解少于4％(圖5)。感染vv-7ΔV3的細胞對ADCC介導的裂解的抗性提高可能與由于V3區域缺失而誘導的CD4-結合區域中構象改變以及該分子與存在于大多數感染HIV患者中存在的抗-V3-特異性抗體之間反應性的缺乏有關。
實施例17合胞體形成和7ΔV3突變體對凋亡的誘導在以表達完整和突變env糖蛋白的痘苗病毒感染的CD4+SupT-1細胞中分析V3環在誘導凋亡機制中的作用。在光學顯微鏡下對感染vv-WTP-2的SupT-1細胞的檢查顯示出細胞聚集成團并在感染后12小時出現合胞體，并且通常在感染后24小時80％到90％的細胞形成巨大的細胞。在僅以痘苗病毒或vv-7ΔV3突變體感染的培養物中沒有觀察到合胞體。
在感染后16小時的單個培養物中分析與合胞體形成有關的凋亡過程。通過以PI對核染色的DNA含量分析表明以全長env糖蛋白對細胞的感染導致出現約20％具有代表凋亡細胞的sub-G1 DNA含量的細胞，同時伴隨細胞周期中G1期細胞比例的下降(從39％到15％)。相反，在未感染培養物和以痘苗病毒或7ΔV3突變體感染培養物中凋亡細胞的數目低于5％。通過在瓊脂糖凝膠上大小分離后觀察到180-200bp核小體大小的DNA多聚體形成特征性“步梯”現象，這也征實表達野生型env糖蛋白Sup-T1細胞中的凋亡(圖6B)。以vac感染或表達7ΔV3突變體的Sup-T1細胞在分離的低分子量DNA中未能誘導出超過背景水平的DNA斷裂。
在以vv-WTP-2感染SupT-1細胞過程中對凋亡的誘導與以前的證實全長HIV env糖蛋白導致合胞體形成和凋亡的報導(Corbeil等，實驗醫學雜志.18339-48)；(aurent-Crawford等，1993，AIDS研究和人類反轉錄病毒9761-773)相吻合。然而，已顯示僅僅HIV很少在體內誘導感染細胞的凋亡(Finkel等，1995，自然醫學(Nature Medicine)1129-134)。為了分析V3區域的缺失對未感染細胞凋亡誘導的影響，將IL-2-依賴性CD4+T淋巴細胞在與APC表面上表達的全長和突變env糖蛋白孵育后用TCR/CD3復合物加以誘導。為了誘導凋亡，將感染vv-7ΔV3和vv-WTP-2的THP-1細胞用多聚甲醛固定并與IL2-依賴性T淋巴細胞孵育2小時從而在以抗-CD3mAb刺激之前讓表達于T細胞上的CD4與細胞表面相關的gp120接觸。通過以PI染色核72小時后和流式細胞分析而監測到的對凋亡的誘導顯示，在以vac和vv-7ΔV3突變體感染的培養物中斷裂的DNA不到7％。另一方面，在活化前與全長env糖蛋白預孵育的T細胞顯示DNA斷裂約為對照斷裂水平的3倍(圖6C)。
盡管表達同樣水平全長和突變env糖蛋白的自體LCL，能夠在感染HIV患者的PBMC中誘導CTL活性，但以突變env基因產物刺激的培養物表現出對env糖蛋白保守表位增加的活性。雖然并不意在受理論限制，但是導致ΔV3突變體中保守表位的免疫原性增加的機制可能與由于在該區域內天然序列變異多所致的感染HIV患者對V3較低的反應有關。或者，用表達全長env糖蛋白的APC對CTL反應的誘導比由突變的env基因產物刺激所產生的誘導可能效果較差，因為完整gp120向未感染CD4+T細胞上的結合可能抑制這樣細胞的功能，因而減少對最佳誘導CTL活性所需要的幫助(Giovarelli等，1988，免疫學雜志.1412831；Landolfo等，1985，科學229176；Rornagnani，1991，今日免疫學(Immunol.Taday)12256)。此外，已證明相應于HIV-IIIB分離物V3環內表位的自由I-10肽可通過包括自發占據相同CTL上的MHC I類分子和TCR的自我否決(self-veto)機制滅活鼠CD8+CTL(Takahashi等，1996，實驗醫學雜志.183879-889)。此現象對于人類HIV病理的可能應用是當此病毒感染的細胞被裂解并且消化的細胞內蛋白釋放至T細胞環境中時，V3環有關的自我否決效應可抑制對CTL反應的誘導。
V3區域的缺失導致ADCC約80％的下降的發現可能與V3環缺失有關，此環用作感染HIV患者血清中豐富的抗-V3環特異性抗體的靶子(Vogel等，1994，免疫等雜志.1531895-1904)。其次，在gp120其它表位中的一些構象改變也促進對有些抗-gp120抗體，包括那些針對env糖蛋白C4區域的抗體的低結合。V3環缺失導致既無合胞體形成又不誘導CD4+細胞中凋亡的事實與下面的觀點相一致，即這些過程由表達成熟env糖蛋白的細胞膜與CD4受體間的相互作用所觸發(Corbeil等，1996，實驗醫學雜志.18339-48；Tuosto等，1995，歐洲免疫學雜志.252907-2916)。最近發現的CD4-gp120復合物與細胞膜上CXCR-4和CCR-5共同受體之間的物理結合(Trkola等，1996，自然384184-187；Lapham等，1996，科學274602-604)，表明這些相互作用可以啟動導致誘導特定CD4+細胞群中細胞死亡的事件(Feng等，1996，科學272872-877)，并且其結構可能含有或影響復合物對gp120上趨化因子受體結合位點的性質(Trkola等，1996，自然，384184-187)。例如，已顯示從HXB2 gp120和JR-FL gp120中缺失V3環破壞了CD4-誘導的對于mAb 48d和17b的表位(Wyatt等，1992，病毒學雜志.666997-7004；Thali等，1991，病毒學雜志.656188-6193)，這可能與ΔV3JR-FL gp120不能與CCR-5相互作用有關(Trkola等，1996，自然384184-187)，并且HIV-1 LAI的V3和C4區域中單個氨基酸改變也對這些表位的結構具有重要作用(Moore等，1993，病毒學雜志.674785-4796)。
用ΔV3突變體的免疫接種誘導對env糖蛋白更多的潛在保守區域的免疫反應，這也將減少用HIV病毒株特異性env糖蛋白免疫的必要。為了誘導細胞反應，ΔV3突變體可作為質粒DNA注射(Okuda等，1995，AIDS研究和人類逆轉錄病毒11933943)或在注射至宿主中之前通過細胞內免疫而在自體細胞內表達(Wu等，1996，病毒學雜志703290-7)。在任一種情況中，表達突變env基因產物的細胞有可能在體內逃避ADCC-介導的裂解并且可能不干擾其它CD4+細胞的功能活性。ΔV3突變體與感染HIV患者的抗-gp120抗體相互作用的事實表明其能夠在體內誘導抗體反應。
也應該注意到雖然這些資料顯示ΔV3突變體在表達它的細胞中沒有誘導凋亡，但目前仍不知道表達該突變env糖蛋白的細胞對由全長env糖蛋白誘導的凋亡易感到何種程度。
現已充分描述過本發明，故對于本領域中的普通技術人員來說，很顯然可在其中造成許多變化與修飾而不偏離本文列出的本發明的實質或范圍。
權利要求
1.編碼病毒包膜糖蛋白的核酸在制備用于誘導抗該病毒的細胞免疫的藥物中的應用，其中所述的包膜糖蛋白(a)含有修飾的優勢免疫表位；和(b)誘導對所述包膜糖蛋白保守表位的細胞免疫。
2.權利要求1的應用，其中所述的核酸被導入抗原呈遞細胞(APC)中。
3.權利要求1的應用，其中所述的病毒為慢病毒。
4.權利要求2的應用，其中所述的慢病毒為人類免疫缺陷病毒(HIV)。
5.權利要求1的應用，其中所述的優勢免疫表位為所述包膜糖蛋白的第三個可變環(V3)。
6.權利要求1的應用，其中所述的優勢免疫表位為中和表位。
7.權利要求2的應用，其中所述的APC刺激外周血單核細胞(PBMC)。
8.權利要求7的應用，其中所述的PBMC與以編碼全長包膜糖蛋白的APC刺激的PBMC相比表現出對該包膜糖蛋白保守表位增加的細胞毒T-淋巴細胞(CTL)活性。
9.權利要求2的應用，其中所述的編碼修飾的包膜糖蛋白的APC對抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)具有抗性。
10.權利要求2的應用，其中所述的編碼修飾的包膜糖蛋白的APC不形成合胞體。
11.權利要求2的應用，其中所述的編碼修飾的包膜糖蛋白的APC不經歷凋亡。
12.權利要求2的應用，其中所述的編碼修飾的包膜糖蛋白的APC誘導對所述病毒的細胞免疫而不誘導CD4+T細胞的凋亡。
13.權利要求1的應用，其中的優勢免疫表位被缺失。
14.制備抗病毒疫苗的方法，包括(a)將編碼所述病毒的包膜糖蛋白的核酸導入載體DNA或脂質體中，其中所述的包膜糖蛋白含有修飾的優勢免疫表位；和(b)將所述的載體DNA或脂質體與適當的佐劑混合。
15.權利要求14的方法，其中所述的核酸被導入APC中并將所述的APC與佐劑混合。
16.權利要求14的方法，其中所述的病毒為慢病毒.
17.權利要求15的方法，其中所述的慢病毒為人類免疫缺陷病毒(HIV)。
18.權利要求14的方法，其中所述的優勢免疫表位為所述包膜糖蛋白的第三個可變環(V3)。
19.用于誘導抗病毒細胞免疫的疫苗，包括(a)在其表面表達所述病毒的包膜糖蛋白的細胞，其中所述的包膜糖蛋白含有修飾的優勢免疫表位；和(b)佐劑。
20.權利要求19的疫苗，其中所述的病毒為人類免疫缺陷病毒(HIV)。
全文摘要
本發明涉及用于誘導抗病毒細胞免疫的方法,其中的病毒通過導入具有改變或缺失的優勢免疫表位的突變形式的病毒包膜(env)糖蛋白而進行了突變。還公開了疫苗和制備該疫苗的方法。
文檔編號A61K39/12GK1243751SQ9911089
公開日2000年2月9日 申請日期1999年5月28日 優先權日1998年5月29日
發明者金子有太郎, D·科茲波 申請人:財團法人人類科學振興財團, 味之素株式會社, 托馬斯杰斐遜大學