專利名稱：2－苯基－1,2－苯并異硒唑－3(2h)－酮用于制備用于治療阿爾茨海默氏病的藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種預防或治療阿爾茨海默氏病的藥物，它含有2-苯基-1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮作活性成分，其作用基于降低由β-淀粉樣蛋白誘發的神經元毒性作用。
在一些國家，用乙酰膽堿酯酶抑制劑如毒扁豆堿或四氫氨基丫啶(THA)作阿爾茨海默氏病的預防或治療藥物。但是，一直沒有獲得成功的效果。人們也嘗試過開發作用于神經系統的5-HT興奮劑，但至今還沒有完全闡明它們的機理。
阿爾茨海默氏病的病理特性包括老年斑和大腦中的PHFs(成對螺旋絲)蓄積。
老年斑的主要成分β-淀粉樣蛋白(本文以后稱作A β)是一種由大約40個氨基酸殘基組成的不溶性肽。人們已經闡明A β自身在生化方面能夠破壞神經元，特別是凝結的A β-沒有溶解的A β對這種效果起作用。
因此，人們需要尋找一種用于預防阿爾茨海默型老年癡呆這種進程或治愈阿爾茨海默型老年癡呆的物質并將其開發為一種以抑制由毒性A β誘發神經元死亡機理為主的藥物。
本發明人在尋找能夠通過腦血流屏障(BBB)并具有降低A β神經元的毒性作用的低分子化合物方面進行了廣泛研究，并且發現了2-苯基-1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮(今后稱作化合物A)具有優異的作用，從而完成了本發明。
在本發明中所用的化合物A具有抑制由A β的存在而引起的神經元死亡的作用。這樣，預計化合物A可用作阿爾茨海默氏病的預防藥或治療藥。
人們已經確認A β是老年斑的一種主要成分，也是阿爾茨海默氏病的病理特性之一。它是由39-43個氨基酸殘基組成的。人們也知道Aβ聚集并顯示神經毒性誘發細胞死亡。最近人們又發現當加入化合物A(ebselen)時能夠抑制在A β存在下神經毒性的A β造成的PC12細胞死亡。所以，可預料到化合物A是一種優異的阿爾茨海默氏病的預防藥或治療藥。
本發明中所用的化合物A可以是通過日本專利公開(kokoku)2-38591(日本專利未審公開(kokai)57-67568)中所公開的方法合成。
用已知制劑技術可以把化合物A與包括載體、粘合劑、崩解劑和增溶劑的添加劑一起轉化成各種形式如片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、糖漿和注射劑。
下列是一種舉例的配方片劑化合物A 50mg羰甲基纖維素25mg淀粉5mg結晶纖維素 40mg硬脂酸鎂2mg總計 122mg以任何一種方式給藥如常規的口服或非經口給藥如注射，化合物A都具有最初所預料的作用。
在口服給藥時，對成人來說化合物A的劑量是在100至2,000mg/天之間，并優選在200至1,000mg/天之間，化合物A的劑量可以根據患者的臨床狀況適當增加或減少。
化合物A的毒性已通過獲得大鼠和小鼠的LD50進行過研究。根據本發明人的試驗，在小鼠上獲得的LD50值口服給藥時是≥6,810mg/kg，腹膜內給藥時是740mg/kg。相似的，在大鼠上獲得的LD50值口服給藥時是≥6,810mg/kg，腹膜內給藥時是580mg/kg。這樣，這些LD50值證實化合物A是一種非常安全的化合物。
而且，即使當給小鼠或大鼠服用高劑量的化合物A時，也沒有發現成問題的不利的副作用。
本發明將在下面通過實施例進行描述，這些實施例不是用來限定本發明的。實施例1化合物A對A β存在下的神經元死亡的抑制作用在一只用聚賴氨酸涂覆的并含有用10％FCS和5％馬血清(Sigma的產品)補加的DMEM培養基的100mm平皿(由Corning制造的)中培養PC12細胞(來自大鼠嗜鉻腫瘤)并傳代培養。簡要地說，把PC12細胞(1×106個細胞/平皿)接種在用聚賴氨酸涂覆的100mm平皿中。為了誘發PC12細胞的分化，讓該細胞在含有5％FCS、50ng/mlNGF和1％馬血清的DMEM培養基中生長7天。然后通過移液剝落PC12細胞并將其懸浮于適當的培養液配制成一種細胞懸浮液。把該細胞懸浮液接種到用聚賴氨酸的96孔平皿的每個孔中(1×104個細胞/孔)。接著，加入A β(Bachem Feinchmikalien AG)使最終濃度達到10μM。也加入化合物A使最終濃度達到0.1,1.0或2.5μM。作為對照，用相同的方法以相同的濃度加入化合物B(用硫取代的化合物A；不具有類谷胱氨肽過氧化物酶的活性；2-苯基-1,2-苯并噻唑-3(2H)-酮；由Nattermann提供)。從加入化合物A或化合物B起將細胞培養48小時。
向這樣處理的細胞中加入MTT試劑(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)，溫育4小時，并溶解該細胞。用稱作MTT的方法進行下一步，這種方法是使用以該試劑的還原反應為主的比色法，由此得到懸浮液中該細胞的成活率(Behl,C.等，Cell,77:817-827,1994)。
化合物A 化合物B表1化合物A和化合物B對PC12神經元的細胞死亡的作用
>*:P≤0.01,**:P≤0.002,***:P≤0.0001,n=6在加有A β的組進行T-試驗。
如表1所示，A β引起了神經元的死亡，并且加入化合物B不能抑制該死亡率。但是，以0.1μM,1μM或2.5μM加入化合物A時，三種情況都顯著地抑制了神經元的死亡(P≤0.01；P≤0.002和P≤0.0001)。實施例2在用聚賴氨酸涂覆的并含有用10％FCS和5％馬血清(Sigma的產品)補加的DMEM培養基的100mm平皿(由Corning制造的)中培養PC12細胞(來自大鼠嗜鉻腫瘤)并傳代培養。簡要地說，把PC12細胞(1×106個細胞/平皿)接種在用聚賴氨酸涂覆的100mm平皿中。為了誘發PC12細胞的分化，讓該細胞在含有5％FCS、50ng/mlNGF和1％馬血清的DMEM培養基中生長7天。然后通過移液剝落PC12細胞并將其懸浮于一種適當的培養液中配制成細胞懸浮液。把該細胞懸浮液接種到用聚賴氨酸涂覆的96孔平皿的每個孔中(1×104個細胞/孔)。確認細胞附著后，進行下列步驟。
把這樣附著的PC12細胞放在DMEM培養基中。向該細胞中加入10μM的SNAP和2.5μM的化合物A。對照組只加入SNPA。把每個樣品溫育3小時。之后，把提前制備好的DCFH-DA(MolecularProbes,Inc.)的DMSO(1mg/413μl)加到含有PC12的各個樣品中得到最終濃度為5μM，然后溫育樣品30分鐘。用胰蛋白酶-EDTA除去該細胞并通過離心分離法(1,000rpm×5分鐘)回收。把回收的細胞懸浮于用冰冷卻的50μlPBS(-)中。用一臺流動的血細胞計數器測定細胞內過氧化氫的量；細胞懸浮液進行FACS(熒光激活的細胞分類)，并測定已被過氧化物氧化的熒光物質2’,7’-二氯氫化熒光素(DCFH)的量。結果，當加入SNAP時，發現比不加SNAP時過氧化氫的產生增加了1.3-1.4倍。而且，加入2.5μM化合物A顯著地抑制了由加入SPAN所引起的過氧化氫產生的增加(P≤0.0015)。表2化合物A對(在加入SNAP的PC12細胞中)由NO誘發的過氧化氫產生的抑制作用
SNAP:S-亞硝-N-乙酰基-DL-青霉胺**:P≤0.0015(就SNAP(10μM)而言按照Student′s T-試驗；n=3)可以認為來自A β的NO依次促進了過氧化氫的產生。但是，從表2中可以看到，加入2.5μM化合物A顯著地抑制了過氧化氫產生。
最近有人已經指出下垂蛋白可能與阿爾茨海默氏病中的神經元的死亡有關。也有報道說A β觸發了神經元的死亡，并且過氧化氫的產生引起了神經毒性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,90:7951-7955,1993)。
如上所述，加入化合物A顯著地抑制了由A β誘發的過氧化氫的產生。所以，這就證實了所預料的化合物A對阿爾茨海默氏病具有極好的預防或治療作用。
這樣，本發明所用的化合物A特別用作對老年性癡呆尤其是阿爾茨海默型癡呆病的預防或治療藥物。
在以上說明書中所用的簡寫是指Polylysine是一種有不同鏈長的賴氨酸-多肽；DMEM是指Delbecco改良型Eagle培養基；DCFH是2’,7’-二氯氫化熒光素；FCS是指胎小牛血清；DMSO是二甲基亞砜；胰蛋白酶EDTA是一種以乙二胺四乙酸為主的絡合劑以及NO是氧化氮。
本發明因此還涉及一種用于治療和/或預防Alzheimer疾病的藥物制劑。本發明的藥物制劑含有作為活性成分的2-苯基-1,2-苯并異硒唑-3-(2H)酮(稱為化合物A)，它藥效是基于降低由β-淀粉樣蛋白誘導的神經元毒性而起作用。
權利要求
1．2-苯基-1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮在制備預防和/或治療癡呆藥物中的用途。
2．根據權利要求1的用途，使用2-苯基-1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮制備預防和/或治療老年性癡呆的藥物。
3．根據權利要求1或2的用途，使用2-苯基-1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮制備預防和/或治療阿爾茨海默型癡呆的藥物。
4．一種藥物，其特征在于該藥物含有2-苯基-1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮作活性成分并可用于預防和/或治療阿爾茨海默氏病。
5．根據上述權利要求中之一的藥物，其特征在于該藥物可以片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、糖漿和/或注射液使用。
全文摘要
本發明涉及預防或治療阿爾茨海默氏病的藥物。該藥物含有2－苯基－1,2－苯并異硒唑－3(2H)－酮(稱作化合物A)作活性成分,該活性成分的作用是以降低由β－淀粉樣蛋白誘發的神經元毒性的作用為基礎的。
文檔編號A61K31/41GK1223580SQ97195890
公開日1999年7月21日 申請日期1997年4月7日 優先權日1996年8月27日
發明者丸山征郎, 阿邊山和浩, 政安裕之 申請人:納特曼和希依有限公司