專利名稱：康樂霉素c的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種用于自身免疫溶血性貧血、腎炎、結蹄組織以及臟器移植排斥反應的新免疫抑制劑康樂霉素C的生產方法。
目前開發的免疫抑制劑，其藥物選擇性強，專一性地調節某一免疫細胞的亞族。代表藥物如環孢菌素A，能選擇性抑制T輔助細胞的克隆(無性繁殖系)的增殖，在器官移植方面取得了可喜的成績，并已廣泛用于臨床。然而，也發現一些副作用，如個別患者用藥后出現急性和慢性腎中毒、輕度震顫、神經病變、齒齦肥厚和多毛等副作用。最近發現的FK-506屬于大環內酯類抗生素(C44H69NO12)，雖然實驗研究結果滿意，但因生產復雜，限制了臨床上廣泛應用。
本發明目的在于克服現有免疫抑制劑的各種缺點，尋找更理想替代藥物。康樂霉素C的化學結構新穎，有別于迄今所有的免疫抑制劑，分子量小，結構簡單，便于修飾。研究表明，康樂霉素C的免疫抑制作用與環孢菌素A相似或稍強，同時有抑制腫瘤細胞的作用，有可能成為更有特點的新一代免疫抑制劑。
本發明的特點是用一株奴卡氏菌進行培養發酵，然后用有機溶劑萃取、柱層析分離和純化，其條件為(1)菌種培養基(%)KNO30.1、NaCl 0.5、K2HPO40.05、FeSO40.01、淀粉2、瓊脂1.7、冷開水、PH7.0、28℃培養5～7天;
(2)種子培養基(%)葡萄糖2～5、酵母粉0.1～1.5、kCl 0.1～0.5、黃豆餅粉 0.1～2.5、K2HPO40.01～0.5、(NH4)2SO40.1～2、MgSO40.01～0.1、CaCO30.1～1、自來水100ml、自然PH;
(3)發酵培養基(%)葡萄糖2～5、酵母粉0.5～2、黃豆餅粉0.1～1.5、蛋白胨0.05～0.5、CaCO30.01～1.0、自來水100ml、自然pH。
以上培養基均15磅消毒30分鐘備用。將斜面挖塊接種于種子培養基搖瓶中(30～70ml裝量/250ml)，置180～200轉/(分鐘)旋轉搖床，25～32℃培養24～55小時后，以5～15%接種量轉入發酵培養基搖瓶(30～100ml裝量/500ml)，在180～200轉/(分鐘)旋轉搖床25～32℃培養68～96小時供提取用。將發酵液過濾后，用無機酸調pH值在1～5范圍，再用乙酸丁酯萃取，萃取液濃縮后，在硅膠柱上分離，用苯和甲醇混合液(30∶1)洗脫，收集活性部分并濃縮，在LH-20柱上純化用乙醇洗脫，收集活性部分并濃縮，用乙醇重結晶，即得純品。康樂霉素C為黃色棒狀結晶，在170℃分解變成黑色，分子量為326，旋光度為+150°(10-4)，紫外光譜中在232納米，356納米有最大吸收，紅外光譜中在3400cm-1、1690cm-1、1650cm-1、750cm-1等處有吸收，溶于極性有機溶劑，不溶于水和非極性有機溶劑。
0.5μg/ml的康樂霉素C對小鼠脾淋巴細胞轉化的抑制率達96.9%。在小鼠脾細胞培養時，康樂霉素C(40μg/ml)沒有表現出毒性，在1mg/ml濃度下，對精原細胞無作用。對小鼠靜脈注射(2mg/kg)沒有發生死亡現象，證明毒性較低。抑制k562白血病細胞增值小于0.1μg/ml，對Hela S3細胞的抑制濃度為1μg/ml。
本發明的優點和積極效果是，目前發現的免疫抑制劑中，康樂霉素C的分子量最小，化學結構全新，提取工藝簡單，化學合成及結構改造較方便，免疫抑制作用強，毒性低，因而具有應用推廣價值。


圖1為康樂霉素C的紫外吸收光譜。
圖2為康樂霉素C的紅外吸收光譜。
實施例用一株奴卡氏菌進行培養發酵，然后用有機溶劑萃取、柱層析分離和純化，其條件為(1)菌種培養基(%)KNO30.1、NaCl 0.5、K2HPO40.05、FeSO40.01、淀粉2、瓊脂1.7、冷開水、PH7.0、28℃培養5～7天;
(2)種子培養基(%)葡萄糖2.5、酵母粉0.5、kCl 0.25、黃豆餅粉0.5、K2HPO40.02、(NH4)2SO40.5、MgSO40.02、CaCO30.5、自來水100ml、自然PH;
(3)發酵培養基(%)葡萄糖3、酵母粉1、黃豆餅粉0.5、蛋白胨0.2、CaCO30.1、自來水100ml、自然pH。
以上培養基均15磅消毒30分種備用。將斜面挖塊接種于種子培養基搖瓶中(50ml裝量/250ml)，置180～200轉/(分鐘)旋轉搖床，28℃培養48小時后，以10%接種量轉入發酵培養基搖瓶(50ml裝量/500ml)，在180～200轉/(分鐘)旋轉搖床28℃培養72小時供提取用。將發酵液過濾后，用無機酸調pH值到4，再用乙酸丁酯萃取，萃取液濃縮后，在硅膠柱上分離，用苯和甲醇混合液(30∶1)洗脫，收集活性部分并濃縮，在LH-20柱上純化用乙醇洗脫，收集活性部分并濃縮，用乙醇重結晶，即得純品。康樂霉素C為黃色棒狀結晶，在170℃分解變成黑色，分子量為326，旋光度為+150°(10-4)，紫外光譜中在232納米，356納米有最大吸收，紅外光譜中在3400cm-1、1690cm-1、1650cm-1、750cm-1等處有吸收。溶于極性有機溶劑，不溶于水和非極性有機溶劑。
權利要求
1.一種康樂霉素C的生產方法，其特征是用一株奴卡氏菌進行培養、發酵，然后用有機溶劑萃取、柱層析分離和純化。
2.按權利要求1所述的生產方法，特征是培養和發酵包含菌種培養基、種子培養基、發酵培養基三種培養基和發酵條件。
3.按權利要求2所述的生產方法，其特征是菌種培養條件為KNO30.1%，NaCl0.5%，K2HPO40.05%，FeSO40.01%，淀粉2%，瓊脂1.7%，冷開水，pH7.0，28℃培養5～7天。
4.按權利要求2所述的生產方法，其特征是種子培養基條件為葡萄糖2～5%，酵母粉0.1～1.5%，KCl0.1～0.5%，黃豆餅粉0.1～2.5%，K2HPO40.01～0.5%，(NH4)2SO40.1～2%，MgSO40.01～0.1%，CaCO30.1～1%，自來水100ml，自然pH值。
5.按權利要求2所述的生產方法，其特征是發酵培養基條件為葡萄糖2～5%，酵母粉0.5～2%，黃豆餅粉0.1～1.5%，蛋白胨0.05～0.5%，CaCO30.01～1.0%，自來水100ml，自然pH。
6.按權利要求4、5所述的生產方法，其特征是將斜面挖塊接種于種子培養基搖瓶中(30～70ml裝量/250ml)，在180～200轉/(分鐘)旋轉搖床上，25～32℃培養24～55小時后，以5～15%接種量轉入發酵培養基搖瓶(30～100ml裝量/500ml)，在180～200轉/(分鐘)旋轉搖床上25～32℃培養68～96小時供提取用。
7.按權利要求6所述的生產方法，其特征是將發酵液過濾后，用無機酸調pH值1～5范圍，再用乙酸丁酯萃取，萃取液濃縮后，在硅膠柱上分離，用苯和甲醇混合液(30∶1)洗脫，收集活性部分并濃縮，在LH-20柱上純化，用乙醇洗脫，收集活性部分并濃縮，用乙醇重結晶，即得純品。
全文摘要
康樂霉素C是從一株奴卡氏菌的發酵液中，經過濾去菌絲，用酸調pH值至酸性，用有機酯類萃取，將萃取液濃縮后，在硅膠柱上分離用苯和甲醇混合液洗脫，收集活性部分并濃縮，在LH-20柱上純化，用醇類有機溶劑洗脫，收集活性成分并濃縮，用醇類有機溶劑重結晶即得純品。該化合物溶于極性有機溶劑，免疫抑制作用與環孢菌素A相似，并有抗腫瘤作用，毒性很低。本發明提取工藝簡單，化學合成及結構改造較方便。
文檔編號C12P1/04GK1064504SQ9110112
公開日1992年9月16日 申請日期1991年3月1日 優先權日1991年3月1日
發明者王南金, 楊賢樹 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所