本發明屬于松花粉(fen)萃取(qu)技術領域(yu)，尤其(qi)涉及一(yi)種從松花粉(fen)中(zhong)提(ti)取(qu)有效成分(fen)的超臨界萃取(qu)方(fang)法(fa)。
背景技術：
松花粉(fen)是(shi)一(yi)種(zhong)(zhong)藥食(shi)(shi)兼用(yong)的花粉(fen)品種(zhong)(zhong)，作為(wei)中國傳統藥材，其藥食(shi)(shi)兼用(yong)的歷史已逾(yu)千年，具有延(yan)年益(yi)壽等多(duo)(duo)種(zhong)(zhong)保健功效。花粉(fen)黃酮(tong)具有多(duo)(duo)種(zhong)(zhong)美容護膚作用(yong)，有研(yan)究表(biao)(biao)明其在抗輻射、延(yan)緩衰(shuai)老和(he)抗氧化(hua)方面都(dou)有良(liang)好的表(biao)(biao)現。
目(mu)前松(song)花(hua)粉(fen)(fen)的(de)(de)(de)提(ti)(ti)取分離(li)工藝(yi)(yi)大(da)都(dou)集中(zhong)在水提(ti)(ti)和(he)醇提(ti)(ti)工藝(yi)(yi)研究，對松(song)花(hua)粉(fen)(fen)中(zhong)的(de)(de)(de)酯類成(cheng)分和(he)生物堿類成(cheng)分難以(yi)達到(dao)分離(li)純化的(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)；利(li)用(yong)超臨界等萃取技術通常是針(zhen)對松(song)花(hua)粉(fen)(fen)中(zhong)的(de)(de)(de)酯類成(cheng)分如甾醇、甘油酸等，但(dan)是對傳統提(ti)(ti)取工藝(yi)(yi)下涉及(ji)的(de)(de)(de)活(huo)性成(cheng)分少有涉及(ji)，因此很難最(zui)大(da)程度的(de)(de)(de)利(li)用(yong)松(song)花(hua)粉(fen)(fen)中(zhong)的(de)(de)(de)有效成(cheng)分。
技術實現要素：
本發明針(zhen)對上(shang)述現有技(ji)術存(cun)在的不(bu)足，提供一種從(cong)松花粉中提取有效成(cheng)分的超臨(lin)界萃取方(fang)法。
本發明(ming)解決上述技術問題的技術方案(an)如下：一種從松花粉中(zhong)提(ti)取(qu)有效成分(fen)的超(chao)臨界萃取(qu)方法，包括(kuo)以下步驟：
(1)提取總酯類成分：將經過干燥、破壁和滅菌的松花粉裝入萃取器中，在溫度為40-50℃、壓力為25MPa、CO2流速為25L/h-35L/h,條件下連續萃取2h；帶著萃取出脂肪類化合物的CO2流體(ti)進(jin)入(ru)分(fen)離(li)(li)釜(fu)(fu)I中(zhong)，在溫度(du)為(wei)40℃-60℃、壓力為(wei)8MPa條件下進(jin)行一級分(fen)離(li)(li)；再進(jin)入(ru)分(fen)離(li)(li)釜(fu)(fu)II中(zhong)，在溫度(du)為(wei)30℃、壓力為(wei)6MPa條件下進(jin)行二級分(fen)離(li)(li)；
(2)提取總黃酮類成分：將步驟(1)得到的藥物殘渣在壓力為20-40MPa、溫度為60-80℃、CO2流速(su)為(wei)25L/h-35L/h的條件下萃取1.5h；
(3)提取總生物堿成分：將步驟(2)得到的藥物殘渣與100mL、濃度為10-20％的氨水溶液混合，堿化1-2h后，在溫度為70℃、壓力為40MPa、CO2流速為35-45L/h的條(tiao)件下萃取1.5h；
(4)將步驟(zou)(1)(2)(3)的萃取成(cheng)分(fen)混合。
其中(zhong)，步(bu)驟(2)的(de)(de)萃(cui)取過(guo)程中(zhong)加入200-400ml、濃(nong)度為(wei)80-90％的(de)(de)乙醇(chun)作(zuo)為(wei)挾帶(dai)劑。
步驟(3)中(zhong)的萃(cui)取(qu)過程中(zhong)加入(ru)300ml無水乙醇(chun)作為挾帶劑。
步驟(1)(2)(3)中所述的CO2純度為99％以上。
本發(fa)明的有(you)益(yi)效果(guo)是(shi)：
1、本發明提取的(de)酯類成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)在(zai)護(hu)膚(fu)品中(zhong)可(ke)以起(qi)到(dao)脂質(zhi)屏障防護(hu)的(de)作用(yong)，并且同(tong)保(bao)濕(shi)抗炎(yan)等功(gong)效息息相關；提取的(de)黃酮類成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)具有抗衰(shuai)老、抗炎(yan)癥等護(hu)膚(fu)活(huo)性(xing)；提取的(de)生物堿類成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)具有與神經酰胺(an)相似的(de)功(gong)能(neng)結構(gou)基團，能(neng)夠(gou)起(qi)到(dao)調節皮(pi)膚(fu)生理功(gong)能(neng)、保(bao)濕(shi)和延緩皮(pi)膚(fu)衰(shuai)老的(de)作用(yong)。三種成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)的(de)功(gong)能(neng)活(huo)性(xing)相輔相成(cheng)(cheng)，達(da)到(dao)協同(tong)增效的(de)目(mu)的(de)，促進松(song)花粉有效成(cheng)(cheng)分(fen)(fen)在(zai)終(zhong)端產品中(zhong)的(de)利(li)用(yong)率。
2、現有的(de)(de)(de)(de)松花粉超聲提(ti)取(qu)多(duo)為一級(ji)提(ti)取(qu)，主要(yao)針對其中(zhong)的(de)(de)(de)(de)脂肪(fang)類(lei)(lei)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)，或是脂質(zhi)合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)前(qian)體物(wu)(wu)(wu)質(zhi)甾(zai)醇(chun)類(lei)(lei)化合(he)物(wu)(wu)(wu)。本(ben)發明(ming)提(ti)取(qu)的(de)(de)(de)(de)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)為總酯(zhi)類(lei)(lei)，除了(le)常見(jian)的(de)(de)(de)(de)脂肪(fang)類(lei)(lei)或是甾(zai)醇(chun)類(lei)(lei)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)，還包(bao)括(kuo)磷(lin)脂類(lei)(lei)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)和(he)揮發油(you)類(lei)(lei)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)等。另外，本(ben)發明(ming)涉(she)及三級(ji)提(ti)取(qu)，借助超臨(lin)界(jie)萃取(qu)技(ji)術(shu)，除了(le)提(ti)取(qu)常見(jian)的(de)(de)(de)(de)酯(zhi)類(lei)(lei)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)外，還利(li)用殘渣進(jin)行(xing)黃酮(tong)和(he)生物(wu)(wu)(wu)堿兩種較難提(ti)純物(wu)(wu)(wu)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)提(ti)取(qu)，提(ti)高(gao)(gao)了(le)黃酮(tong)等成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)的(de)(de)(de)(de)提(ti)取(qu)率，進(jin)而提(ti)高(gao)(gao)了(le)松花粉的(de)(de)(de)(de)利(li)用效率，避免了(le)資源浪費，同(tong)時最大程度的(de)(de)(de)(de)保存(cun)了(le)其中(zhong)的(de)(de)(de)(de)有效物(wu)(wu)(wu)質(zhi)，提(ti)高(gao)(gao)了(le)生物(wu)(wu)(wu)活性(xing)。
具體實施方式
以下(xia)結合實例對本發明(ming)(ming)的原理和特(te)征進行描(miao)述(shu)，所舉實例只用于解釋(shi)本發明(ming)(ming)，并非用于限(xian)定本發明(ming)(ming)的范(fan)圍。
實施例1
一種(zhong)從松(song)花粉中(zhong)提取有效成分的(de)超臨界萃取方法，包(bao)括以下步驟(zou)：
(1)提取總酯類成分：將松花粉裝入萃取器中，在溫度為40-50℃、壓力為25MPa、CO2流速為30L/h條件下連續萃取2h；帶著萃取出脂肪類化合物的CO2流體進(jin)入(ru)分離(li)釜(fu)I中(zhong)，在溫度為50℃、壓力為8MPa條件(jian)下(xia)進(jin)行一級分離(li)；再進(jin)入(ru)分離(li)釜(fu)II中(zhong)，在溫度為30℃、壓力為6MPa條件(jian)下(xia)進(jin)行二級分離(li)；
(2)提取總黃酮類成分：將步驟(1)得到的藥物殘渣在壓力為20-40MPa、溫度為70℃、CO2流(liu)速(su)為30L/h的條件(jian)下萃取1.5h，的萃取過程中(zhong)加入200-400ml、濃度為80-90％的乙(yi)醇作為挾帶(dai)劑；
(3)提取總生物堿成分：將步驟(2)得到的藥物殘渣與100mL、濃度為10-20％的氨水溶液混合，堿化1-2h后，在溫度為70℃、壓力為40MPa、CO2流(liu)速為40L/h的條件下萃取(qu)(qu)1.5h，萃取(qu)(qu)過程中加入300ml無水(shui)乙醇作(zuo)為挾帶劑；
(4)將步驟(1)(2)(3)的萃取(qu)成分混合。
各提(ti)取成分的(de)含量測定(ding)：
1、總甾醇含量測定
對照品標準液的配制：精密稱取豆甾(zai)醇對照品0.022g，用甲醇溶解并(bing)定容至(zhi)50mL容量瓶作為對照品標準溶液。
顯(xian)色劑的配制(zhi)：稱取(qu)0.5g氧化汞，精密(mi)加入(ru)2mL濃硫(liu)酸和10mL蒸餾水，超聲溶(rong)解，量取(qu)1mL該(gai)溶(rong)液(ye)置于(yu)100mL容(rong)量瓶中，用冰(bing)乙酸和濃硫(liu)酸混合溶(rong)液(ye)(1∶2)定容(rong)至刻度。
供(gong)試品溶液的配制(zhi)：精密稱取0.5g一級萃取后(hou)溶液，用甲醇溶解并定量至10mL容量瓶(ping)作為供(gong)試品溶液。
測定方法(fa)：取供試(shi)品溶液2mL置于(yu)10mL容(rong)量瓶中(zhong)用(yong)磺基醋酸汞(gong)試(shi)劑定容(rong)至刻度，在410nm波(bo)長(chang)處，用(yong)甲(jia)醇(chun)作為空(kong)白測定其吸光度。
線性與范圍：精密吸取豆甾(zai)醇標準品溶液(ye)(ye)1.0、2.0、4.0、6.0、10.0mL分別置于10mL容(rong)量瓶中并用甲醇定(ding)容(rong)至刻度，作為對照(zhao)品溶液(ye)(ye)。410nm波(bo)長處(chu)測(ce)定(ding)其吸光(guang)度，以豆甾(zai)醇濃度(C)為橫坐標，吸光(guang)度(A)為縱坐標作回(hui)歸曲(qu)線，得(de)回(hui)歸方程。
實驗(yan)結果:結果測(ce)得(de)溶液中(zhong)甾醇含量為31.69mg/mL,用傳(chuan)統溶劑提(ti)取(qu)同樣(yang)得(de)率提(ti)取(qu)液中(zhong)甾醇含量僅為10.19mg/mL.
2、黃酮含量測定:
最大吸收峰位置確定：準確吸取蘆丁標準溶液(0.55g/L)10mL于50ml容量瓶中，用30％乙醇補至25mL，加入1.4mL、5％NaNO2搖勻，放置5min后加入1.4mL、10％Al(NO3)3，6min后再加入10mL、1mol/L NaOH混(hun)勻，用30％乙醇稀釋至刻度(du)，10min后測(ce)定其λmax，參比為空(kong)白(bai)試劑(ji)。
標準曲線的繪制：分別取上述蘆丁標準溶液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于6只50mL容量瓶中，用30％乙醇補至25mL，加入1.4mL、5％NaNO2搖勻，放置5min后加入1.4mL、10％Al(NO3)3，6min后(hou)再加入10mL、1mol/L NaOH，混勻(yun)，用30％乙醇稀釋(shi)至刻度。于(yu)波長510nm處(chu)測(ce)定測(ce)吸光值，參比為空白試劑(ji)。
樣品溶液的測定：取1mL提取液，于25mL容量瓶中用30％乙醇-水補充至12.5mL，加入0.7mL亞硝酸鈉，搖勻，放置5min后加入0.7mL、l0％Al(NO3)3，6min后再加人5mL、1mol/L NaOH混勻，用(yong)30％乙醇稀釋至刻度，10min后測定(ding)其在(zai)510nm波長下(xia)的吸光度，參比為空白(bai)試劑。
實驗結果(guo)：測得提取液中黃酮含量為2.38mg/mL。
3、生(sheng)物堿含量測定：
標(biao)準曲線(xian)的(de)繪制：用移液管準確量取(qu)氧化苦參堿對照品(pin)溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL,置(zhi)于干(gan)燥的(de)具(ju)塞(sai)三角瓶中,各加(jia)蒸餾水至6mL,分(fen)取(qu)5mL,分(fen)別(bie)加(jia)入pH值7.0緩(huan)沖(chong)液5mL,再依次精密加(jia)入濃(nong)度(du)0.025％溴麝香草酚(fen)藍標(biao)準液2.0mL和氯仿10.0mL,振搖1min,轉移至50mL分(fen)液漏斗放置(zhi)分(fen)層，靜置(zhi)1h,分(fen)取(qu)氯仿層，在417nm波(bo)長處測定吸光度(du)。
另(ling)以(yi)同法操作(不加(jia)氧化苦參(can)堿對照品溶(rong)液(ye))的氯仿(fang)為空白。
以濃度(C)為橫坐(zuo)標(biao)(biao),吸光度(A)為縱(zong)坐(zuo)標(biao)(biao),繪制標(biao)(biao)準曲線。
樣品測(ce)定(ding)：分(fen)別取(qu)稀釋液(ye)5.0mL置(zhi)分(fen)液(ye)漏斗中,依次加入pH值7.0緩沖溶液(ye)5mL、濃度(du)(du)0.025％溴麝香草酚藍標(biao)準液(ye)2.0mL和氯(lv)仿10.0mL,振(zhen)搖(yao)1min,靜置(zhi)1h,分(fen)取(qu)氯(lv)仿層。用(yong)紫外可見分(fen)光(guang)光(guang)度(du)(du)計(ji)于417nm波長處測(ce)定(ding)吸光(guang)度(du)(du)。將測(ce)得的吸光(guang)度(du)(du)值代入回歸(gui)方程(cheng)，計(ji)算(suan)提(ti)取(qu)液(ye)中總生物堿(jian)的含(han)量。
實驗結果：提取(qu)液中生物堿(jian)(jian)含量(liang)為(wei)1.94mg/mL。若不采(cai)用(yong)超臨界萃取(qu)，只能使用(yong)有機(ji)溶劑對生物堿(jian)(jian)進行富集，影響產(chan)品后期利用(yong)。
以上(shang)所(suo)述僅為本(ben)發明的較佳實施例，并不用以限(xian)制本(ben)發明，凡在本(ben)發明的精神(shen)和原則(ze)之內，所(suo)作的任何修(xiu)改(gai)、等同替換(huan)、改(gai)進等，均應(ying)包含在本(ben)發明的保護范圍(wei)之內。