技術領域

本發明屬于天然藥(yao)物(wu)化學領(ling)域，具體涉及六種三萜類化合(he)物(wu)即(ji)mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)或其可藥(yao)用的(de)鹽在制備糖苷酶抑制劑或藥(yao)物(wu)中的(de)應用，以及它們的(de)制備方(fang)法。

發明背景

糖尿(niao)(niao)病(bing)(bing)為臨床上常見(jian)的(de)內分泌代謝失調性(xing)疾病(bing)(bing)，其與心血管疾病(bing)(bing)和(he)癌癥等逐年(nian)高(gao)發具有(you)重要的(de)相關性(xing)，是人(ren)類健(jian)康重要的(de)殺手(shou)。目前(qian)，在全(quan)球(qiu)范(fan)圍內糖尿(niao)(niao)病(bing)(bing)的(de)發病(bing)(bing)率正(zheng)在提高(gao)，在我國更是有(you)超過(guo)1億人(ren)的(de)患(huan)病(bing)(bing)率，并呈現逐年(nian)增加的(de)趨(qu)勢(shi)。糖尿(niao)(niao)病(bing)(bing)正(zheng)給我國人(ren)民(min)健(jian)康和(he)國民(min)經濟造(zao)成越(yue)來越(yue)重大(da)的(de)損失。

糖(tang)(tang)尿病(bing)西醫(yi)分為Ⅰ型糖(tang)(tang)尿病(bing)(或(huo)稱(cheng)胰島素依賴性，DM1)和Ⅱ型糖(tang)(tang)尿病(bing)(或(huo)稱(cheng)非胰島素依賴性，DM2)，其中Ⅱ型糖(tang)(tang)尿病(bing)發(fa)病(bing)與患病(bing)率均遠高于(yu)Ⅰ型糖(tang)(tang)尿病(bing)，因而(er)(er)危害(hai)更大。競爭性α-糖(tang)(tang)苷酶(mei)抑制(zhi)劑具有推遲糖(tang)(tang)類(lei)物質消化吸收、控制(zhi)飯(fan)后血糖(tang)(tang)急劇升(sheng)高、進而(er)(er)使血糖(tang)(tang)濃度(du)在(zai)一(yi)天內變(bian)化波(bo)動幅度(du)減(jian)小(xiao)等功(gong)能，是可開(kai)發(fa)用(yong)于(yu)治(zhi)療(liao)Ⅱ型糖(tang)(tang)尿病(bing)的潛在(zai)藥物。目前(qian)已開(kai)發(fa)上市正臨床試用(yong)作(zuo)治(zhi)療(liao)Ⅱ型糖(tang)(tang)尿病(bing)的重要(yao)α-糖(tang)(tang)苷酶(mei)抑制(zhi)劑包括(kuo)一(yi)線用(yong)藥acarbose(阿卡(ka)波(bo)糖(tang)(tang))、voglibose、miglitol和emigliate等。

六種三萜化合(he)物(wu)mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)分(fen)別曾自(zi)其(qi)他(ta)植物(wu)中分(fen)離(li)獲(huo)(huo)得(具體見文(wen)獻(xian)：Magina et al.,Quim Nova,2012,35:1184-1188；Huu et al.,J Chem,2007,45:363-367；Kuo et al.,Chem Pharm Bull,1988,36:3619-3622；Ponouet al.,Chem Biodivers,2011,8:1301-1309；Lavaud et al.,Phytochemistry,2001,57:469-478；Khan et al.,J Nat Prod,1993,56:2163-2165)，它們(men)的化學結構式(shi)如(ru)下式(shi)(Ⅰ)所(suo)示，到目前還(huan)未見這些化合(he)物(wu)具有糖苷酶抑(yi)制劑活性的報道，以及未見其(qi)自(zi)闊葉豐(feng)花草(Spermacoce latifolia)植物(wu)中分(fen)離(li)獲(huo)(huo)得的報道。

技術實現要素：

本(ben)發明的(de)第一個目的(de)是提供化合物mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhedera genin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)或它們(men)的(de)可藥用(yong)鹽(yan)，在制(zhi)備α-糖苷酶抑制(zhi)劑藥物中的(de)應用(yong)。

經(jing)體外藥(yao)理實(shi)驗證實(shi)，本發(fa)(fa)明提(ti)供的(de)化合(he)物mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)或3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)均具有強效(xiao)抑(yi)制α-葡萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)的(de)活性，它們抑(yi)制α-葡萄(tao)糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)的(de)活性均顯著強于(yu)糖(tang)(tang)(tang)尿(niao)病(bing)一線(xian)用藥(yao)阿卡波糖(tang)(tang)(tang)，因此可發(fa)(fa)展制備用于(yu)預防和治療α-糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)引起(qi)(qi)或有關的(de)生(sheng)理改(gai)變或疾病(bing)的(de)潛在藥(yao)物候選分子(zi)。其中，與α-糖(tang)(tang)(tang)苷酶(mei)引起(qi)(qi)或有關的(de)生(sheng)理改(gai)變或疾病(bing)包(bao)括但(dan)不限于(yu)Ⅱ型(xing)糖(tang)(tang)(tang)尿(niao)病(bing)。

本發明(ming)所述的(de)六種化合物的(de)可藥用(yong)的(de)鹽，其在人消化道中(zhong)于胃酸等(deng)生理條件(jian)下(xia)可轉化為以上式(Ⅰ)所示(shi)的(de)對應三(san)萜化合物分子，其實質性(xing)抑制α-葡萄糖(tang)苷酶的(de)活性(xing)成分與以上所示(shi)的(de)六種三(san)萜化合物分子相同，因而(er)屬于本發明(ming)的(de)嚴(yan)格保(bao)護(hu)范圍(wei)。

本發明的(de)(de)以上(shang)(shang)所述的(de)(de)六種三萜化合(he)(he)物分(fen)子或其(qi)可(ke)藥(yao)用(yong)的(de)(de)鹽可(ke)與藥(yao)學上(shang)(shang)常用(yong)輔料或載體結(jie)合(he)(he)，制備得到具有以上(shang)(shang)所述六種化合(he)(he)物分(fen)子之任意一種或多種抑(yi)制α-糖(tang)苷酶(mei)活(huo)性(xing)的(de)(de)可(ke)用(yong)于(yu)預防和治療Ⅱ型(xing)糖(tang)尿病(bing)的(de)(de)藥(yao)物或藥(yao)物組合(he)(he)物。該藥(yao)物或藥(yao)物組合(he)(he)物可(ke)采用(yong)可(ke)濕性(xing)粉劑(ji)、片劑(ji)、顆粒劑(ji)、膠(jiao)囊(nang)、口服(fu)液、滴丸等劑(ji)型(xing)，還可(ke)采用(yong)制藥(yao)界(jie)公知的(de)(de)控釋或緩釋劑(ji)型(xing)或納(na)米制劑(ji)。

以(yi)本(ben)(ben)發明(ming)所述的(de)(de)以(yi)上六(liu)種(zhong)三萜化合(he)(he)物(wu)(wu)分(fen)(fen)子(zi)中(zhong)的(de)(de)一種(zhong)或(huo)多(duo)種(zhong)為有(you)效(xiao)成分(fen)(fen)的(de)(de)包(bao)括(kuo)闊葉豐(feng)花草等植物(wu)(wu)的(de)(de)提(ti)取物(wu)(wu)在制(zhi)備(bei)α-糖苷酶抑制(zhi)劑藥物(wu)(wu)中(zhong)的(de)(de)應用，因其是以(yi)本(ben)(ben)發明(ming)所述的(de)(de)六(liu)種(zhong)化合(he)(he)物(wu)(wu)分(fen)(fen)子(zi)中(zhong)的(de)(de)一種(zhong)或(huo)多(duo)種(zhong)為實質性有(you)效(xiao)成分(fen)(fen)，因而屬于本(ben)(ben)發明(ming)的(de)(de)嚴格保護范(fan)(fan)圍范(fan)(fan)疇。

本發明的第二個目的是提(ti)供化(hua)合物(wu)mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)的制備方法，其特征(zheng)在于，所(suo)述(shu)的化(hua)合物(wu)mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)、3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)是從闊葉豐花草(Spermacoce latifolia Aubl.K.Schum.)植株中分離得到(dao)的。

優選，具體步驟為：

將干燥的闊葉豐花草全株(zhu)粉(fen)碎(sui)后(hou)用(yong)乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)或乙(yi)(yi)醇(chun)(chun)水(shui)溶(rong)液提(ti)(ti)取(qu)，提(ti)(ti)取(qu)液經(jing)濃縮后(hou)得(de)到(dao)浸膏，浸膏加水(shui)混懸，依次(ci)(ci)用(yong)石(shi)(shi)油(you)(you)醚和(he)(he)乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯萃(cui)取(qu)，濃縮后(hou)分(fen)(fen)別得(de)到(dao)石(shi)(shi)油(you)(you)醚萃(cui)取(qu)部(bu)分(fen)(fen)和(he)(he)乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯萃(cui)取(qu)部(bu)分(fen)(fen)；石(shi)(shi)油(you)(you)醚萃(cui)取(qu)部(bu)分(fen)(fen)經(jing)正相硅膠柱(zhu)層(ceng)析，以石(shi)(shi)油(you)(you)醚/丙酮(tong)從體積比(bi)100：0-0-100梯度洗(xi)脫，收集石(shi)(shi)油(you)(you)醚-丙酮(tong)體積比(bi)10：1洗(xi)脫的餾分(fen)(fen)E6，餾分(fen)(fen)E6經(jing)MCI柱(zhu)除去色(se)素，用(yong)甲醇(chun)(chun)洗(xi)脫得(de)到(dao)甲醇(chun)(chun)洗(xi)脫部(bu)分(fen)(fen)E6-1，E6-1依次(ci)(ci)通(tong)過反相中壓柱(zhu)層(ceng)析，甲醇(chun)(chun)/水(shui)體積比(bi)從30:70-100:0梯度洗(xi)脫、Sephadex LH-20凝(ning)膠柱(zhu)，以甲醇(chun)(chun)洗(xi)脫，和(he)(he)正相硅膠層(ceng)析，以氯仿/甲醇(chun)(chun)體積比(bi)100:1洗(xi)脫，得(de)到(dao)化合物(wu)1；

乙酸乙酯萃取部分經正相硅膠柱層析，以氯仿/甲醇從體積比100:1-0:100梯度洗脫，收集氯仿/甲醇體積比25:1洗脫的餾分F₅，F₅經反相中壓柱層析，甲醇/水從體積比30:70-100:0,梯度洗脫，收集甲醇/水體積比80:20洗脫的餾分F_5-4和甲醇/水體積比90:10洗脫的餾分F_5-5；餾分F_5-4經Sephadex LH-20凝膠柱以甲醇洗脫，再經正相硅膠層析柱分離純化，以氯仿/甲醇體積比50:1洗脫，得到化合物3，4，5和6；餾分F_5-5經Sephadex LH-20凝膠柱以(yi)甲醇洗脫，得到化(hua)合物(wu)2。

本發(fa)明的第(di)三個目的是提(ti)供闊(kuo)葉豐(feng)花草在(zai)制備化(hua)合物mesembryanthemoidigenic acid(1)、29-hydroxyhederagenin(2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)、scutellaric acid(4)、arjunic acid(5)或3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)中的應用。

本發明的(de)六種具強效抑制(zhi)(zhi)α-糖(tang)苷酶(mei)活性的(de)化(hua)(hua)合物(wu)(wu)為(wei)安(an)全性高(gao)并在環境中能快(kuai)速自(zi)然降解無殘留的(de)天然化(hua)(hua)合物(wu)(wu)，它們(men)可(ke)自(zi)闊葉豐花草等(deng)植物(wu)(wu)材料(liao)(liao)中分離獲得，植物(wu)(wu)材料(liao)(liao)來源豐富(fu)，制(zhi)(zhi)備過程易于操(cao)作(zuo)。所述的(de)六種化(hua)(hua)合物(wu)(wu)的(de)單(dan)體均較(jiao)穩定、易存放，它們(men)的(de)α-糖(tang)苷酶(mei)抑制(zhi)(zhi)活性顯著強于或相當于臨(lin)床用藥阿卡波(bo)糖(tang)，極可(ke)能進一步發展為(wei)有(you)效、安(an)全的(de)預防和治療Ⅱ型糖(tang)尿病的(de)α-糖(tang)苷酶(mei)抑制(zhi)(zhi)劑(ji)類藥物(wu)(wu)，具有(you)較(jiao)好前景。

附圖說明：

圖1是化合物mesembryanthemoidigenic acid(1)的¹³C NMR圖譜。

圖2是化合物29-hydroxyhederagenin(2)的¹³C NMR圖譜。

圖3是化合物3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(3)的¹³C NMR圖譜。

圖4是化合物scutellaric acid(4)的¹³C NMR圖譜。

圖5是化合物arjunic acid(5)的¹H NMR圖譜。

圖6是化合物3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(6)的¹³C NMR圖譜。

具體實施方式：

以下實施(shi)例是對本(ben)發明(ming)(ming)的(de)進一步說明(ming)(ming)，而(er)不(bu)是對本(ben)發明(ming)(ming)的(de)限制，根據本(ben)發明(ming)(ming)的(de)實質(zhi)對本(ben)發明(ming)(ming)進行的(de)簡(jian)單改進都屬于本(ben)發明(ming)(ming)要求保護(hu)的(de)范圍。

實施例1：闊葉豐花草植(zhi)物中(zhong)六(liu)種三萜(tie)化合(he)物的制備

1.1植物來(lai)源與(yu)鑒定

闊葉豐花草(Spermacoce latifolia Aubl.K.Schum.)植物(wu)(wu)全(quan)株于2012年09月采(cai)自(zi)廣東省廣州市華南植物(wu)(wu)園(yuan)，經(jing)中國科學(xue)院(yuan)華南植物(wu)(wu)園(yuan)邢福武研(yan)究員鑒(jian)定。

1.2提取與分離

干燥的闊葉豐花草全株(5.0Kg)粉碎后于室溫用體積分數95％的乙醇水溶液提取，提取液合并后減壓濃縮得無醇浸膏。浸膏加水混懸，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取各4次；減壓濃縮后得到石油醚萃取部分(330g)和乙酸乙酯萃取部分(202g)。所獲石油醚萃取部分(330g)經正相硅膠柱層析(200-300目，1000×105mm i.d.)，以石油醚-丙酮(100:0-0:100,v/v,each 3.0L)梯度洗脫，經TLC薄層層析檢測合并主點相同的流分，共得到9個組分(E₁-E₉)。E₆(5.0g)【石油醚-丙酮(10:1,v/v)洗脫的餾分】經MCI柱【200×40mm i.d.】除去色素，用甲醇洗脫得到甲醇洗脫部分E_6-1。E_6-1(3.0g)依次通過反相中壓柱層析分離純化，甲醇/水(30:70-100:0,v/v,each 1.0L)為流動相梯度洗脫、Sephadex LH-20凝膠柱(1550×13.4mm i.d.)以甲醇洗脫和正相硅膠層析柱(200-300目，400×30mm i.d)分離純化，以氯仿-甲醇(100:1，v/v)恒定梯度洗脫，得到化合物1(3.4mg)。乙酸乙酯萃取部分(202g)經正相硅膠柱層析(200-300目，1000×105mm i.d.)，以氯仿-甲醇(100:1-0:100,v/v,each 3.0L)梯度洗脫，經TLC薄層層析檢測合并主點相同的流分，得到F₁-F₉共9個組分。F₅(3.3g)【氯仿-甲醇(25:1,v/v)洗脫的餾分】繼續經反相中壓柱層析分離純化，甲醇/水(30:70-100:0,v/v,each 1.0L)為流動相梯度洗脫，TLC薄層檢測合并主點相同的流分，得到6個亞組分(F_5-1-F_5-6)。F_5-4(2.5g)【甲醇/水(80:20,v/v)洗脫的餾分】經Sephadex LH-20凝膠柱以甲醇洗脫，再經正相硅膠層析柱(200-300目，400×30mm i.d.)分離純化，以氯仿-甲醇(50:1，v/v)恒定梯度洗脫，得到化合物3(5.6mg)，4(3.6mg)，5(5.0mg)和6(4.0mg)。F_5-5(1.0g)【甲醇/水(90:10,v/v)洗脫的餾分】經(jing)Sephadex LH-20凝膠柱以甲醇洗脫，得到(dao)化(hua)合物(wu)2(4.2mg)。

1.3化合(he)物的結構鑒(jian)定

所獲化合物1為白色粉末，ESI-MS m/z 495[M+Na]⁺,471[M-H]^–對應該化合物的分子式C₃₀H₄₈O₄；其¹³C NMR圖譜如圖1所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.25(1H,t,J＝3.5Hz,H-12),3.19(2H,s,H-29),3.15(1H,dd,J＝11.4,4.7Hz,H-3),2.88(1H,dd,J＝13.0,4.7Hz,H-18),1.17(3H,s),0.97(3H,s),0.94(3H,s),0.93(3H,s),0.82(3H,s),0.78(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ38.5(CH₂,C-1),27.6(CH₂,C-2),79.7(CH,C-3),38.9(C,C-4),56.7(CH,C-5),18.3(CH₂,C-6),32.9(CH₂,C-7),39.8(C,C-8),46.5(CH,C-9),36.8(C,C-10),23.2(CH₂,C-11),123.7(CH,C-12),145.2(C,C-13),42.7(C,C-14),28.7(CH₂,C-15),24.0(CH₂,C-16),47.6(C,C-17),40.6(CH,C-18),40.3(CH₂,C-19),35.5(C,C-20),29.6(CH₂,C-21),38.0(CH₂,C-22),28.3(CH₃,C-23),16.3(CH₃,C-24),15.9(CH₃,C-25),17.7(CH₃,C-26),25.4(CH₃,C-27),181.9(C,C-28),74.4(CH₂,C-29),19.5(CH₃,C-30)。根據(ju)以(yi)上波譜(pu)數據(ju)綜合(he)分析，解析出該化合(he)物1的化學結構為mesembryanthemoidigenic acid，其結構式如式(Ⅰ)中的1所示(shi)。

所獲化合物2為白色粉末，ESI-MS m/z 511[M+Na]⁺,487[M-H]^–，對應該化合物分子式C₃₀H₄₈O₅；其¹³C NMR圖譜如圖2所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.26(1H,t,J＝3.5Hz,H-12),3.60(1H,dd,J＝11.9,4.2Hz,H-3),3.53,3.33,(each 1H,d,J＝11.0Hz,H-23),3.19(2H,s,H-29),2.88(1H,dd,J＝13.9,4.3Hz,H-18),1.19(3H,s),0.98(3H,s),0.93(3H,s),0.82(3H,s),0.70(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ38.2(CH₂,C-1),26.1(CH₂,C-2),75.3(CH,C-3),40.6(C,C-4),49.5(CH,C-5),18.7(CH₂,C-6),32.6(CH₂,C-7),39.7(C,C-8),47.4(CH,C-9),36.7(C,C-10),22.8(CH₂,C-11),122.8(CH,C-12),144.5(C,C-13),41.4(C,C-14),27.7(CH₂,C-15),23.2(CH₂,C-16),47.7(C,C-17),40.7(CH,C-18),40.7(CH₂,C-19),35.6(C,C-20),28.8(CH₂,C-21),32.1(CH₂,C-22),68.3(CH₂,C-23),11.6(CH₃,C-24),15.3(CH₃,C-25),16.8(CH₃,C-26),25.4(CH₃,C-27),182.7(C,C-28),73.4(CH₂,C-29),18.8(CH₃,C-30)。根據(ju)以上波譜數據(ju)綜合(he)分析，解(jie)析出該化(hua)合(he)物2的化(hua)學(xue)結(jie)構為29-hydroxyhederagenin，其結(jie)構式如式(Ⅰ)中的2所示(shi)。

所獲化合物3為白色粉末，ESI-MS m/z 495[M+Na]⁺,471[M-H]^–，對應該化合物分子式C₃₀H₄₈O₄；其¹³C NMR圖譜如圖3所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.30(1H,t,J＝3.6Hz,H-12),4.51(1H,br s,H-6),3.10(1H,dd,J＝11.6,4.1Hz,H-3),2.89(1H,dd,J＝13.7,4.2Hz,H-18),1.32(3H,s),1.18(3H,s),1.15(3H,s),1.11(3H,s),1.06(3H,s),0.96(3H,s),0.93(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ42.0(CH₂,C-1),28.1(CH₂,C-2),80.1(CH,C-3),40.1(C,C-4),57.1(CH,C-5),68.7(CH,C-6),41.6(CH₂,C-7),40.7(C,C-8),49.4(CH,C-9),37.7(C,C-10),24.5(CH₂,C-11),123.9(CH,C-12),144.5(C,C-13),43.4(C,C-14),28.7(CH₂,C-15),24.0(CH₂,C-16),47.7(C,C-17),40.6(CH,C-18),47.3(CH₂,C-19),30.5(C,C-20),33.6(CH₂,C-21),32.0(CH₂,C-22),28.3(CH₃,C-23),17.6(CH₃,C-24),17.3(CH₃,C-25),18.8(CH₃,C-26),26.4(CH₃,C-27),181.9(C,C-28),23.9(CH₃,C-29),31.8(CH₃,C-30)。根據以(yi)上波譜(pu)數據綜合分(fen)析(xi)，解析(xi)出該化合物(wu)3的化學結構為3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid，其結構式如式(Ⅰ)中的3所示。

所獲化合物4為白色粉末，ESI-MS m/z 495[M+Na]⁺,471[M-H]^–，對應該化合物分子式C₃₀H₄₈O₄；其¹³C NMR圖譜如圖4所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.26(1H,t,J＝3.6Hz,H-12),3.63(1H,m,H-3),3.70,3.44,(each 1H,d,J＝11.0Hz,H-23),2.87(1H,dd,J＝13.8,4.2Hz,H-18),1.15(3H,s),1.10(3H,s),1.06(3H,s),0.93(3H,s),0.87(3H,s),0.72(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ33.2(CH₂,C-1),26.1(CH₂,C-2),73.9(CH,C-3),40.6(C,C-4),43.5(CH,C-5),18.7(CH₂,C-6),33.6(CH₂,C-7),39.7(C,C-8),49.4(CH,C-9),37.7(C,C-10),23.5(CH₂,C-11),122.8(CH,C-12),144.5(C,C-13),42.4(C,C-14),28.7(CH₂,C-15),24.0(CH₂,C-16),47.7(C,C-17),42.1(CH,C-18),46.3(CH₂,C-19),31.5(C,C-20),34.2(CH₂,C-21),33.1(CH₂,C-22),68.3(CH₂,C-23),18.6(CH₃,C-24),15.3(CH₃,C-25),17.8(CH₃,C-26),26.4(CH₃,C-27),181.7(C,C-28),23.9(CH₃,C-29),33.8(CH₃,C-30)。根據以上波譜數據綜合分析(xi)，解析(xi)出該化合物4的化學結構為scutellaric acid，其(qi)結構式如式(Ⅰ)中的4所示。

所獲化合物5為白色粉末，ESI-MS m/z 511[M+Na]⁺,487[M-H]^–，對應該化合物分子式C₃₀H₄₈O₅；其¹H NMR圖譜如圖5所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.31(1H,t,J＝3.6Hz,H-12),3.62(1H,m,H-2),3.24(1H,d,J＝3.7Hz,H-19),3.05(1H,d,J＝3.7Hz,H-18),2.90(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),1.31(3H,s),1.03(3H,s),1.00(3H,s),0.96(3H,s),0.93(3H,s),0.84(3H,s),0.76(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ48.2(CH₂,C-1),69.6(CH,C-2),84.9(CH,C-3),40.6(C,C-4),57.0(CH,C-5),19.7(CH₂,C-6),34.0(CH₂,C-7),40.9(C,C-8),49.4(CH,C-9),39.7(C,C-10),25.1(CH₂,C-11),124.8(CH,C-12),144.9(C,C-13),42.7(C,C-14),29.7(CH₂,C-15),28.6(CH₂,C-16),46.7(C,C-17),45.1(CH,C-18),82.3(CH,C-19),36.2(C,C-20),29.5(CH₂,C-21),34.1(CH₂,C-22),29.3(CH₃,C-23),17.5(CH₃,C-24),17.1(CH₃,C-25),17.8(CH₃,C-26),25.4(CH₃,C-27),181.7(C,C-28),25.2(CH₃,C-29),28.8(CH₃,C-30)。根據以上(shang)波譜數(shu)據綜合分析(xi)，解析(xi)出該(gai)化合物5的(de)化學結(jie)構(gou)為arjunic acid，其結(jie)構(gou)式(shi)如式(shi)(Ⅰ)中的(de)5所(suo)示(shi)。

所獲化合物6為白色粉末，ESI-MS m/z 511[M+Na]⁺,487[M-H]^–，對應該化合物分子式C₃₀H₄₈O₅；其¹³C NMR圖譜如圖6所示，¹H-NMR(500MHz,CD₃OD):δ5.29(1H,t,J＝3.6Hz,H-12),4.39(1H,br s,H-6),3.56(1H,m,H-3),3.60,3.47,(each 1H,d,J＝11.0Hz,H-23),2.87(1H,dd,J＝13.7,3.9Hz,H-18),1.33(3H,s),1.14(3H,s),1.10(3H,s),1.06(3H,s),0.96(3H,s),0.91(3H,s)；¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD):δ41.2(CH₂,C-1),28.1(CH₂,C-2),73.5(CH,C-3),44.0(C,C-4),49.5(CH,C-5),68.6(CH,C-6),41.0(CH₂,C-7),39.3(C,C-8),48.7(CH,C-9),36.9(C,C-10),23.7(CH₂,C-11),122.8(CH,C-12),144.5(C,C-13),42.4(C,C-14),28.7(CH₂,C-15),24.0(CH₂,C-16),46.7(C,C-17),42.1(CH,C-18),46.3(CH₂,C-19),31.0(C,C-20),34.2(CH₂,C-21),33.1(CH₂,C-22),66.7(CH₂,C-23),14.6(CH₃,C-24),17.5(CH₃,C-25),18.8(CH₃,C-26),26.4(CH₃,C-27),181.9(C,C-28),23.7(CH₃,C-29),33.2(CH₃,C-30)。根(gen)據以上波譜數據綜合分(fen)析(xi)，解析(xi)出該化合物6的化學結構為3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid，其(qi)結構式如式(Ⅰ)中的6所示(shi)。

實施例2：所述六種三萜化合物的α-糖苷酶抑制(zhi)活性檢測

2.1儀器與試劑

實驗(yan)儀(yi)器(qi)：酶標儀(yi)Genois microplate reader(Tecan GENios,Swizerland)。

試劑樣品：α-葡萄糖(tang)苷(gan)酶購(gou)(gou)自Sigma Chemical Co.(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)；阿卡波糖(tang)(Acarbose)購(gou)(gou)自Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(Japan)；4-硝基酚-α-D-葡萄糖(tang)吡喃(nan)苷(gan)(PNPG)購(gou)(gou)自Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(Japan)；六(liu)種三萜化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)mesembryanth emoidigenic acid(化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)1)、29-hydroxyhederagenin(化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-en e-28-oic acid(化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)3)、scutellaric acid(化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)4)、arjunic acid(化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)5)、3β,6β,23-tr ihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)6)由以上實(shi)驗例1的(de)方法制備(bei)，也可(ke)以按照(zhao)文獻Ma gina et al.,Quim Nova,2012,35:1184-1188；Huu et al.,J Chem,2007,45:363-367；Ku o et al.,Chem Pharm Bull,1988,36:3619-3622；Ponouet al.,Chem Biodivers,2011,8:1301-1309；Lavaud et al.,Phytochemistry,2001,57:469-478；Khan et al.,J Nat Prod,1993,56:2163-2165中的(de)方法制備(bei)得到。

2.2測試方法：

a)配制藥物溶液：將待測化合物和阿卡波糖分別由二甲基亞砜(DMSO)配制10mg/ml的溶液，并配制67mmol/L的磷酸緩沖液(超純水配制)，PNPG底物溶液(5mM，磷酸緩沖液配制)和0.2M的NaCO₃溶液(磷(lin)酸緩沖液配制)。

b)采用比色法，通過96孔板就待測化合物對α-葡萄糖苷酶的半數抑制濃度進行測定。首先將20μl的α-葡萄糖苷酶(0.8U)加入樣品孔，然后將樣品溶液用磷酸緩沖液按比例稀釋，每孔加入樣品溶液120μl，使測試樣品(包含待測化合物和阿卡波糖)的最終濃度為：500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，15.625μg/mL，最后再加入反應底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷20μl(5mM)。37℃水浴反應15min后，每個樣品孔中加入80μl的Na₂CO₃(0.2M)終止反應，在405nm波長處比色測定。相同體積的磷酸緩沖液代替酶溶液。化合物抑制率由樣品OD值對于空白和對照OD值計算，計算公式如下：抑制率(％)＝(OD_control–OD_neg)-(OD_test–OD_{test control})/(OD_control–OD_neg)×100％。其中所測試六種化合物分別對α-葡萄糖苷酶的半數抑制濃度(IC₅₀)由劑量效應曲線得到。

2.3實驗數據參(can)見(jian)表(biao)1：

表1.六種(zhong)三萜化合(he)物(wu)的a-葡萄糖(tang)苷酶抑(yi)制活性

2.4實驗結論：

a-葡萄糖(tang)(tang)(tang)苷(gan)酶是(shi)a-糖(tang)(tang)(tang)苷(gan)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)類(lei)Ⅱ型糖(tang)(tang)(tang)尿病治療藥(yao)物篩選的指標(biao)性測(ce)試酶。本實驗結果表(biao)明，本發明提供的化(hua)合(he)物mesembryanthemoidigenic acid(化(hua)合(he)物1)、29-hydroxyhederagenin(化(hua)合(he)物2)、3β,6β-dihydroxy-olean-12-ene-28-oic acid(化(hua)合(he)物3)、scutellaric acid(化(hua)合(he)物4)、arjunic acid(化(hua)合(he)物5)和3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid(化(hua)合(he)物6)均(jun)具(ju)有(you)顯著強于(yu)糖(tang)(tang)(tang)尿病一線(xian)用(yong)藥(yao)阿卡波糖(tang)(tang)(tang)抑(yi)制(zhi)α-葡萄糖(tang)(tang)(tang)苷(gan)酶的活性，因此(ci)可(ke)發展制(zhi)備(bei)用(yong)于(yu)預(yu)防和治療α-糖(tang)(tang)(tang)苷(gan)酶引起或(huo)有(you)關的生理改變或(huo)疾病的潛在藥(yao)物候選分子，具(ju)有(you)較強的應用(yong)開發潛質，可(ke)望(wang)能進一步(bu)發展成(cheng)為新(xin)的預(yu)防和治療Ⅱ型糖(tang)(tang)(tang)尿病的用(yong)藥(yao)，應用(yong)潛質廣泛。