本發明涉及(ji)納(na)米探針(zhen)技(ji)術領域，具(ju)體涉及(ji)一種單分散(san)熒光磁性納(na)米探針(zhen)及(ji)制備和應用。

背景技術：

隨(sui)著(zhu)發病(bing)率和(he)(he)死(si)亡(wang)率的(de)增加，癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)已經成為(wei)中國人群(qun)死(si)亡(wang)的(de)首要原(yuan)因和(he)(he)主(zhu)要的(de)公共健康(kang)問題。統計數據表明(ming)，中國2015年(nian)有(you)4292,000例癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)新(xin)發病(bing)例，2814,000例癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)死(si)亡(wang)，肺癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)成為(wei)最常(chang)見癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)，也是癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)死(si)亡(wang)的(de)首要原(yuan)因。胃癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)、食管癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)和(he)(he)肝癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)也是常(chang)見癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)，在癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)死(si)亡(wang)原(yuan)因中排在前列。由(you)于(yu)癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)沒有(you)指定的(de)位置，它可以發生(sheng)在內臟的(de)任何一(yi)部分，癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)及癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)前病(bing)變的(de)癥(zheng)(zheng)(zheng)(zheng)狀具有(you)隱匿性和(he)(he)無特異性，且潛(qian)伏(fu)期較長，一(yi)旦(dan)發現已到晚期或者(zhe)轉移，導致患者(zhe)無法治愈而死(si)亡(wang)。因此，早(zao)期預警及體內癌(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)(ai)細胞示蹤對潛(qian)伏(fu)期病(bing)人至關重要。

隨(sui)著近現代醫學(xue)技術(shu)的(de)發展，納(na)米材料在(zai)醫學(xue)中的(de)應用已進(jin)入(ru)一(yi)個快速(su)發展時(shi)期。尤其是在(zai)腫瘤學(xue)科的(de)研究不斷(duan)加深，在(zai)成像檢測、靶向給藥、光動力治(zhi)療和光熱(re)治(zhi)療等領域具有廣泛的(de)應用前景。因此開發診斷(duan)-治(zhi)療一(yi)體化多功能納(na)米探針成為了(le)一(yi)個研究熱(re)點。

磁共振成(cheng)像(xiang)(xiang)可對(dui)人體(ti)(ti)各部(bu)位(wei)多角度(du)、多平面成(cheng)像(xiang)(xiang)，能更客觀更具(ju)體(ti)(ti)地定(ding)位(wei)定(ding)性(xing)病灶，對(dui)全(quan)身各系統疾病的(de)(de)診(zhen)斷、早期預(yu)警及術(shu)后觀察均有很大的(de)(de)價(jia)值。相對(dui)于其它的(de)(de)無創傷(shang)成(cheng)像(xiang)(xiang)技術(shu)，如:核(he)醫(yi)學(xue)(xue)成(cheng)像(xiang)(xiang)、光學(xue)(xue)成(cheng)像(xiang)(xiang)、超聲成(cheng)像(xiang)(xiang)等，具(ju)有高空間(jian)分辨力、無射線檢(jian)查、軟組織對(dui)比度(du)好等優點，非常適(shi)合(he)應用于分子成(cheng)像(xiang)(xiang)學(xue)(xue)的(de)(de)研究。但MR成(cheng)像(xiang)(xiang)在腫瘤切除(chu)過程中隨著非切除(chu)部(bu)分的(de)(de)減少，其檢(jian)測的(de)(de)精確(que)度(du)也逐漸降低(di)，且檢(jian)測費(fei)昂貴(gui)、掃描(miao)時間(jian)較長，讓病人難(nan)以耐受。

電(dian)子(zi)激發態光(guang)敏(min)劑(ji)不(bu)僅能產生細胞(bao)毒性作用，還(huan)能在轉變為基(ji)態過程時發出熒光(guang)，形成光(guang)學圖像。因(yin)此光(guang)敏(min)劑(ji)既能作為光(guang)動力(li)療法(fa)用藥(yao)，又能作為成像造影(ying)劑(ji)。光(guang)敏(min)劑(ji)熒光(guang)檢測是一種較為靈敏(min)的技(ji)術，能夠識別組織的微細結(jie)構，且精確度不(bu)會隨(sui)著非切除(chu)部分的減少而(er)降低。但不(bu)具有(you)高空間(jian)分辨力(li)、軟組織對(dui)比(bi)度等(deng)特點。

光(guang)(guang)動(dong)力(li)治療(liao)(liao)是指在光(guang)(guang)敏(min)劑參與下，在光(guang)(guang)的(de)(de)作用下，使有機體(ti)細(xi)(xi)胞或生(sheng)物分(fen)子發(fa)生(sheng)機能或形態變化，導致細(xi)(xi)胞損傷和壞死。光(guang)(guang)動(dong)力(li)療(liao)(liao)法(fa)是一項(xiang)腫(zhong)瘤治療(liao)(liao)的(de)(de)新技術，由于(yu)其獨特的(de)(de)優點和良好的(de)(de)兼容性(xing)，必將成為腫(zhong)瘤診斷(duan)和治療(liao)(liao)中一支新的(de)(de)生(sheng)力(li)軍，在腫(zhong)瘤的(de)(de)綜(zong)合治療(liao)(liao)中發(fa)揮重要(yao)作用。

目(mu)前，有研究(jiu)者(zhe)將(jiang)磁(ci)共振(zhen)顯像與(yu)光(guang)敏劑熒(ying)光(guang)顯像的(de)(de)(de)優(you)勢(shi)結合(he)設(she)計出熒(ying)光(guang)磁(ci)性納米探針(zhen)，但其(qi)沒對(dui)(dui)系列不同(tong)粒(li)徑(jing)的(de)(de)(de)探針(zhen)核形成的(de)(de)(de)探針(zhen)性能(neng)進(jin)行對(dui)(dui)比，如不同(tong)粒(li)徑(jing)的(de)(de)(de)探針(zhen)在病變細胞中的(de)(de)(de)分布的(de)(de)(de)差異(yi)(yi)、在動物體內分布的(de)(de)(de)差異(yi)(yi)、對(dui)(dui)正(zheng)常(chang)組織(如：肝，脾(pi)等)損害的(de)(de)(de)差異(yi)(yi)及(ji)腫瘤(liu)部(bu)位的(de)(de)(de)滯留(liu)時間差異(yi)(yi)等方(fang)面(mian)進(jin)行研究(jiu)。為了尋(xun)找熒(ying)光(guang)磁(ci)性納米探針(zhen)與(yu)細胞微妙作用機理、減(jian)小熒(ying)光(guang)磁(ci)性納米探針(zhen)對(dui)(dui)正(zheng)常(chang)組織(如：肝，脾(pi)等)的(de)(de)(de)損害，增長在腫瘤(liu)部(bu)位的(de)(de)(de)滯留(liu)時間，提高腫瘤(liu)治療效果，需(xu)要對(dui)(dui)不同(tong)粒(li)徑(jing)的(de)(de)(de)熒(ying)光(guang)磁(ci)性納米探針(zhen)進(jin)行比較，充(chong)分發(fa)掘其(qi)在生物醫學(xue)領域(yu)的(de)(de)(de)應用潛力。

技術實現要素：

本發明(ming)的(de)目(mu)的(de)就是為(wei)了克服上述(shu)現有技術存(cun)在(zai)的(de)缺(que)陷(xian)而提(ti)供一種(zhong)制備(bei)簡單(dan)、靶向(xiang)效率高(gao)的(de)單(dan)分散熒光磁(ci)性納米探針及制備(bei)和應用。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：一種單分散熒光磁性納米探針，所述磁性納米探針包括負載光敏劑的Fe₃O₄磁性納米粒子、PEG修飾的靶分子以及超支化大分子NPO，所述負載光敏劑的Fe₃O₄磁性納米粒子、PEG修飾的靶分子以及超支化大分子NPO的摩爾比為(0.0005～1)：(1～10)：(0.5～2)，所述負載光敏劑的Fe₃O₄磁性納米粒子包括光敏劑和Fe₃O₄載體，所述光敏劑和Fe₃O₄載體的質(zhi)量比為(1～5)：(4～20)。

本(ben)發明以尺(chi)寸小、粒徑(jing)分(fen)(fen)布均(jun)勻(yun)、磁(ci)(ci)性(xing)(xing)(xing)能優(you)異的(de)(de)四氧(yang)化(hua)(hua)(hua)三(san)鐵(tie)磁(ci)(ci)性(xing)(xing)(xing)納米(mi)(mi)粒子為(wei)探針核(he)，經兩親性(xing)(xing)(xing)聚合物(wu)修飾，得到(dao)分(fen)(fen)散(san)性(xing)(xing)(xing)優(you)良的(de)(de)羧基化(hua)(hua)(hua)四氧(yang)化(hua)(hua)(hua)三(san)鐵(tie)磁(ci)(ci)性(xing)(xing)(xing)納米(mi)(mi)粒子；再經PEG化(hua)(hua)(hua)的(de)(de)靶(ba)分(fen)(fen)子和一端是(shi)氨基另外支化(hua)(hua)(hua)端是(shi)羥(qian)基的(de)(de)超支化(hua)(hua)(hua)大分(fen)(fen)子修飾，并負(fu)載光敏劑藥(yao)物(wu)，即(ji)構成制備工藝簡單、靶(ba)向效(xiao)率高(gao)、生物(wu)相容性(xing)(xing)(xing)好、提高(gao)疏水(shui)性(xing)(xing)(xing)抗(kang)腫瘤(liu)藥(yao)物(wu)的(de)(de)療效(xiao)及表面尺(chi)寸效(xiao)應(ying)增(zeng)強成像與光動力治(zhi)療的(de)(de)熒(ying)光磁(ci)(ci)性(xing)(xing)(xing)納米(mi)(mi)探針。

相比與傳統方法，采用系列不同粒徑的四氧化三鐵磁性納米粒子，通過共價偶聯將PEG化的靶分子和一端是氨基另外支化端是羥基的超支化大分子連結到磁性納米粒子表面，提高磁性納米粒子的生物相容性和功能性。得到的藥物載體(簡稱：Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc)中PEG和(he)超支化(hua)大分(fen)子NPO構成(cheng)的(de)(de)外殼阻止(zhi)磁性納(na)米(mi)顆(ke)粒的(de)(de)團(tuan)聚和(he)蛋白質吸(xi)附，增加磁性納(na)米(mi)顆(ke)粒血液(ye)循環時間和(he)體內(nei)靶細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)內(nei)在(zai)化(hua)效(xiao)率。癌細(xi)胞(bao)(bao)表(biao)面(mian)(mian)富含靶分(fen)子受體，將靶分(fen)子偶聯(lian)在(zai)納(na)米(mi)探針上，可高效(xiao)地(di)結合癌細(xi)胞(bao)(bao)表(biao)面(mian)(mian)的(de)(de)靶點，定向地(di)進入細(xi)胞(bao)(bao)，準確地(di)示蹤癌細(xi)胞(bao)(bao)或腫瘤的(de)(de)位(wei)置，有助(zhu)于成(cheng)像診斷(duan)和(he)癌癥治療(liao)。

所述的光(guang)敏劑(ji)選(xuan)自二(er)氫卟吩e6、吲哚(duo)菁綠(lv)、青色素5.5及(ji)阿霉素中一種(zhong)或(huo)多種(zhong)；

所述Fe₃O₄載體的的粒徑為3～15nm。

所述的靶(ba)(ba)分(fen)子(zi)選(xuan)自抗體(如：CD44，CD45，Her2等(deng))、抗體片段(duan)、生(sheng)長因子(zi)(如：VEGF)、環狀RGD、奧(ao)曲肽(tai)、AP縮(suo)(suo)氨酸(suan)、tLyp-1縮(suo)(suo)氨酸(suan)、透明質酸(suan)HA或4-氨基(ji)苯(ben)基(ji)β-D-吡喃葡萄糖苷中的一種(zhong)或多種(zhong)。這(zhe)些靶(ba)(ba)分(fen)子(zi)具有特異性(xing)靶(ba)(ba)向作用，在靶(ba)(ba)細胞膜表(biao)面具有高表(biao)達位點，可以使(shi)探針藥物(wu)高效地(di)識別(bie)并殺(sha)傷靶(ba)(ba)細胞。

所述的超支化大分子NPO的分子量為大于等于5000，其一端為氨基，另外的支化端為羥基。超支化大分子NPO一端的氨基與Fe₃O₄@P-COOH納米粒子表面的(de)羧基共價偶聯(lian)后(hou)，形成酰(xian)胺(an)鍵。另外(wai)支化端(duan)的(de)羥基促進納米探針的(de)水溶(rong)性及生物相容(rong)性。

一種如上所(suo)述的單(dan)分散熒光磁(ci)性(xing)納米探針的制備方法，包括以下(xia)幾個步(bu)驟(zou)：

(1)將乙酰丙酮鐵、油酸、油胺、十六烷二醇及二苯醚混合，在N₂保(bao)護下(xia)反應(ying)，反應(ying)結束后冷卻至室溫，過濾得到的磁性(xing)納(na)米(mi)粒子溶于氯仿(fang)中，得到氯仿(fang)溶液，待用；

(2)在步驟(1)所得的氯仿溶液中加入兩親性聚合物，混合均勻后蒸發溶劑，得到的固體溶解于SBB12緩沖溶液中，該SBB12緩沖溶液為50mM硼酸溶液用NaOH溶液調pH至12后的溶液，將溶有固體的SBB12緩沖溶液濃縮離心得到Fe₃O₄@P-COOH納米粒子分散液(ye)；

(3)將Fe₃O₄@P-COOH納米粒子分散液中的羧基活化，然后加入PEG修飾的靶分子，反應一段時間后加入超支化大分子NPO，反應得到帶靶分子和超支化大分子的Fe₃O₄@P-NPO/PEG-TM分散液；

(4)將步驟(3)所得帶靶分子和超支化大分子的Fe₃O₄@P-NPO/PEG-TM分(fen)(fen)散(san)液(ye)(ye)與光敏(min)劑(ji)溶(rong)液(ye)(ye)混合、振蕩反應，然后離(li)心純(chun)化，即得(de)所述(shu)單分(fen)(fen)散(san)熒光磁(ci)性納米探針。

步驟(1)所(suo)述乙(yi)酰(xian)丙酮鐵(tie)、油酸、油胺及十六烷二醇(chun)的摩爾(er)比(bi)為(wei)(0.5～4)：(1.5～12)：(1.5～12)：(2.5～20)，所(suo)述二苯(ben)醚的體(ti)積(ji)與所(suo)述乙(yi)酰(xian)丙酮鐵(tie)的摩爾(er)量之比(bi)為(wei)(5～40)mL：(0.5～4)mol；

所(suo)述反應(ying)分兩個階段，第一階段的(de)反應(ying)溫度為(wei)150～250℃，反應(ying)時(shi)間為(wei)1～3h，第二(er)階段的(de)反應(ying)溫度為(wei)280～350℃，反應(ying)時(shi)間為(wei)0.5～1.5h。

分(fen)步設定反(fan)應溫度，使得反(fan)應可控(kong)，產物更加均勻(yun)。

步驟(2)所述兩親性聚合物的合成步驟為：將聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)、十二胺以(0.05～1)：(0.01～2)的摩爾比混合，溶于四氫呋喃中，超聲10～20s后，加熱至65℃并攪拌8～12h，然后將四氫呋喃蒸發，并溶于氯仿中，得到濃度為0.1M的兩親性聚合物；使用該兩親性聚合物，可以使油相中合成的Fe₃O₄磁性納(na)米(mi)粒(li)子轉(zhuan)入水(shui)相，并且使納(na)米(mi)粒(li)子表面含有大量羧(suo)基，為探針下一步合成(cheng)做好(hao)準備；

所述(shu)氯仿溶(rong)液(ye)中的磁性納米粒子(zi)與加入兩親性聚合物(wu)的摩爾比為(wei)1：(5-100)；

濃縮得到的Fe₃O₄@P-COOH納米粒子(zi)分散液的濃度為3～20μM

一(yi)端(duan)(duan)是(shi)氨(an)基(ji)另外(wai)支(zhi)化(hua)端(duan)(duan)是(shi)羥基(ji)的(de)(de)超支(zhi)化(hua)大(da)分(fen)子的(de)(de)合(he)成步(bu)驟(zou)為：N-BOC乙(yi)二(er)(er)胺與縮水甘(gan)油按照摩爾比(bi)為(0.5～1):(0.5～1)混合(he)于含5～20mL二(er)(er)氧(yang)己烷的(de)(de)三頸燒瓶(ping)中并利用(yong)磁轉子攪拌，混合(he)物(wu)(wu)在90℃下反應(ying)2-5h；反應(ying)結(jie)束(shu)后，加入100～200mgNaH(60％礦物(wu)(wu)油)反應(ying)10～30min；逐滴加入含2.1～8.4mL縮水甘(gan)油的(de)(de)5～20mL二(er)(er)氧(yang)己烷，混合(he)物(wu)(wu)在90℃下反應(ying)過夜(ye)，反應(ying)結(jie)束(shu)后，倒出有機相，剩余物(wu)(wu)質溶(rong)于5～10mL蒸餾水中，用(yong)透(tou)(tou)析袋(dai)(分(fen)子截留量為3K)透(tou)(tou)析24～48h，冷凍干燥得(de)到透(tou)(tou)明狀(zhuang)膠狀(zhuang)產物(wu)(wu)；滴兩滴濃鹽(yan)酸，再加pH＝7.4的(de)(de)PBS溶(rong)液配制成0.5～1g/mL溶(rong)液，得(de)到一(yi)端(duan)(duan)是(shi)氨(an)基(ji)另外(wai)支(zhi)化(hua)端(duan)(duan)是(shi)羥基(ji)的(de)(de)超支(zhi)化(hua)大(da)分(fen)子NPO，備用(yong)。

步驟(3)所(suo)述(shu)活化(hua)的工藝如下：

在Fe₃O₄@P-COOH納米粒子分散液加入EDC/NHS溶液，加入的EDC/NHS的摩爾量與Fe₃O₄@P-COOH納米粒子分散液中羧基的摩爾量(liang)之比為1：(1～1.5)，然后(hou)在5～30rpm/min的轉(zhuan)(zhuan)速下旋轉(zhuan)(zhuan)混合20～30min；

PEG化靶分(fen)(fen)(fen)子(zi)的制備(bei)：在(zai)(zai)PEG的SBB 9(用(yong)NaOH滴定(ding)pH為9的硼酸溶(rong)液(ye)(ye))緩(huan)沖液(ye)(ye)中加入EDC/NHS，使其滿足(zu)與PEG分(fen)(fen)(fen)子(zi)上(shang)羧基的摩(mo)爾比(bi)為1：1.5，在(zai)(zai)XH-1T型多管可調式旋(xuan)(xuan)轉(zhuan)混(hun)合器上(shang)旋(xuan)(xuan)轉(zhuan)30min，轉(zhuan)速(su)為30轉(zhuan)/分(fen)(fen)(fen)；按PEG與靶分(fen)(fen)(fen)子(zi)的摩(mo)爾比(bi)為1：(1～3)加入靶分(fen)(fen)(fen)子(zi)，在(zai)(zai)30～40℃下振蕩(dang)1～3h或20～30℃下在(zai)(zai)旋(xuan)(xuan)轉(zhuan)器上(shang)旋(xuan)(xuan)轉(zhuan)12～24h。

加入PEG修飾的靶分子后反應的條件為30～40℃下振蕩1～3h或20～30℃下在旋轉(zhuan)器上旋轉(zhuan)12～24h；

加入超支化大分子NPO后反應的條件為30～40℃下振蕩1～3h或20～30℃下在旋轉器上旋轉12～24h。選用上述溫和的反應條件，利于反應充分，并且不會造成Fe₃O₄@P-COOH納(na)米粒子分散液團聚(ju)。

步驟(4)所(suo)述光敏劑溶(rong)液的濃度為2-5mg/mL；

加入的光敏劑的加入質量與Fe₃O₄@P-COOH納米粒(li)子分散液的摩爾量之(zhi)比(bi)為：(2.5-5)mg：(0.5-10)mmol；

所述反應的(de)溫度為30～40℃，時間為24～48h，振(zhen)蕩(dang)的(de)速度為80～200rpm。

一種如(ru)上(shang)所(suo)述(shu)的(de)單分散熒光磁性納米探針的(de)應用，所(suo)述(shu)納米探針用于(yu)制備靶向(xiang)(xiang)成像(xiang)癌細胞的(de)成像(xiang)劑或用于(yu)制備靶向(xiang)(xiang)治療癌癥的(de)藥物。

PEG和(he)(he)超支化大分子NPO構成(cheng)的外殼阻止磁性納米(mi)顆(ke)粒的團聚和(he)(he)蛋白質(zhi)吸附，增加(jia)磁性納米(mi)顆(ke)粒血液循環時間和(he)(he)體內靶細(xi)(xi)胞的內在(zai)化效(xiao)率。癌(ai)細(xi)(xi)胞表面富含靶分子受體，將靶分子偶聯在(zai)納米(mi)探(tan)針(zhen)上，可高效(xiao)地(di)(di)結(jie)合癌(ai)細(xi)(xi)胞表面的靶點，定向地(di)(di)進入(ru)細(xi)(xi)胞，準確地(di)(di)示(shi)蹤癌(ai)細(xi)(xi)胞或腫瘤(liu)的位置，有助于(yu)成(cheng)像診斷和(he)(he)癌(ai)癥治(zhi)療。

與現(xian)有(you)技術相比(bi)，本(ben)發明的(de)有(you)益效果體現(xian)在以(yi)下幾方(fang)面(mian)：

(1)備(bei)簡單，快捷，成本(ben)低，只需(xu)使用(yong)幾種(zhong)常見的試劑(ji)即(ji)可(ke)制得：通(tong)過兩親(qin)性(xing)聚合物修(xiu)飾的磁性(xing)納米粒子與PEG化(hua)的靶分(fen)子和一端(duan)的氨基(ji)另外支化(hua)端(duan)是羥基(ji)的超支化(hua)大(da)分(fen)子NPO共價(jia)偶聯(lian)，可(ke)以直(zhi)接制得單分(fen)散(san)生物相容性(xing)優良(liang)的納米探針；

(2)制得(de)的納米(mi)探針平均尺(chi)寸(cun)為3.5-20nm，且粒徑分布(bu)均勻(yun)；

(3)制(zhi)得(de)的(de)納米探針靶(ba)向(xiang)效率高(gao)、提高(gao)疏水性抗(kang)腫瘤藥(yao)物的(de)水溶性及攝取量(liang)；

(4)表面尺寸效應增強雙模態(tai)成(cheng)像與光動力(li)治療效果(guo)。

附圖說明

圖1為本發明的熒光磁性(xing)納米(mi)探針的透射(she)電鏡圖片；

圖2為本(ben)發明的(de)熒光磁(ci)性納米(mi)探針的(de)熒光光譜圖；

圖3為本發(fa)明的熒(ying)光(guang)磁性納米探針的在動物體內的熒(ying)光(guang)成像照片；

圖4為本發(fa)明(ming)的熒光磁(ci)性(xing)納米(mi)探針在荷瘤小鼠組和空白(bai)對照(zhao)組腫瘤部位的核磁(ci)成像照(zhao)片(pian)；

圖(tu)5為本(ben)發明的熒光磁性納米探針對荷瘤小鼠腫瘤的治療曲線；

圖6為本發明(ming)的(de)(de)經熒光(guang)磁性納(na)米(mi)探針治療后的(de)(de)荷瘤(liu)小鼠體(ti)重變化(hua)曲(qu)線。

具體實施方式

下(xia)面對本發(fa)明的(de)(de)實施(shi)例(li)作詳細說明，本實施(shi)例(li)在(zai)以本發(fa)明技(ji)術方(fang)案為(wei)前提下(xia)進行實施(shi)，給出(chu)了(le)詳細的(de)(de)實施(shi)方(fang)式(shi)和(he)具體的(de)(de)操作過(guo)程，但本發(fa)明的(de)(de)保護范圍不限于下(xia)述的(de)(de)實施(shi)例(li)。

實施例1

一種單分散熒光磁(ci)性(xing)納米探針的(de)制(zhi)備，包(bao)括以下步驟：

(1)四氧化三鐵磁性納米粒(li)子的制備：

將摩(mo)爾(er)比為：0.5:1.5:1.5:2.5的乙酰丙酮鐵(III)、油酸、油胺、十六烷二(er)醇及5mL二(er)苯醚混合(he)于三頸燒瓶中并利用(yong)磁轉子攪拌，在(zai)氮氣保護下(xia)混合(he)物加(jia)熱至(zhi)150℃并持(chi)續加(jia)熱1h，隨后(hou)加(jia)熱至(zhi)280℃，并在(zai)該溫度(du)反(fan)(fan)(fan)應0.5h，反(fan)(fan)(fan)應結束后(hou)冷卻(que)至(zhi)室溫，所得黑色(se)溶液利用(yong)無(wu)水乙醇反(fan)(fan)(fan)復(fu)離(li)心沉淀3次(ci)(離(li)心速度(du)2000rpm，5min)，最終所得沉淀重懸于氯仿中。

(2)羧基化四氧化三鐵磁性納米粒子的制備：

取1mmol聚(ju)(ju)(異丁烯-alt-馬來酸(suan)酐)、0.2mmol十二(er)胺溶解(jie)在裝有10mL四氫呋喃的(de)圓(yuan)底燒瓶中，超聲(sheng)20s后，加熱至65℃并(bing)攪拌過夜，次日將四氫呋喃蒸發掉后，聚(ju)(ju)合物定溶于5mL氯仿中獲得0.1M的(de)雙親性聚(ju)(ju)合物；

將步驟(1)所得磁性納米粒子與兩親性聚合物按照摩爾比1:5混合于圓底燒瓶中，利用旋轉蒸發儀緩慢地將溶劑蒸發掉，得到的固體在磁力攪拌下溶解于3mL的SBB 12緩沖溶液中，最終所得分散液采用超濾管濃縮，并利用超高速離心機除去未包被的聚合物，得到羧基化的四氧化三鐵磁性納米粒子，即得到3μM的Fe₃O₄@P-COOH納(na)米粒子分散(san)液(ye)；

(3)偶聯(lian)PEG化靶分子(zi)和一端(duan)是(shi)氨基(ji)另外支化端(duan)是(shi)羥基(ji)的(de)超支化大分子(zi)：

在Fe3O4@P-COOH納米粒子分散液(ye)中(zhong)加入EDC/NHS，使其滿足與Fe3O4@P-COOH上羧基的摩(mo)爾比(bi)為(wei)1：1，在XH-1T型多管可調式旋轉混(hun)合(he)器上旋轉20min，轉速(su)為(wei)5轉/分；

PEG化靶分子(zi)和(he)一端是氨基另外(wai)端是羥基的(de)超(chao)支化大(da)分子(zi)NPO與Fe3O4@P-COOH納米粒子(zi)分散液(ye)混合反應的(de)工藝條件為：在30℃下振(zhen)蕩1h或(huo)20℃下在旋(xuan)轉器上旋(xuan)轉12h，其中，NPO的(de)分子(zi)量為大(da)于等于5000。

PEG化靶(ba)分子的(de)(de)制備：在PEG的(de)(de)SBB 9緩沖液(ye)中(zhong)加入EDC/NHS，使其滿足與(yu)PEG分子上(shang)羧基(ji)的(de)(de)摩爾(er)比為(wei)1：1，在XH-1T型多(duo)管可調(diao)式旋(xuan)轉混(hun)合器(qi)上(shang)旋(xuan)轉20min，轉速為(wei)5轉/分；按(an)PEG與(yu)靶(ba)分子的(de)(de)摩爾(er)比為(wei)1：1加入靶(ba)分子，在30℃下振蕩(dang)1h或(huo)20℃下在旋(xuan)轉器(qi)上(shang)旋(xuan)轉12h。

一端是氨基(ji)另外支化(hua)(hua)端是羥基(ji)的(de)超支化(hua)(hua)大分子(zi)NPO的(de)制(zhi)備(bei)：N-BOC乙二胺與縮(suo)水甘(gan)(gan)油按照摩爾比為0.5:0.5混合(he)于含5mL二氧己烷(wan)的(de)三頸(jing)燒瓶中并利用磁轉(zhuan)子(zi)攪拌(ban)，混合(he)物在90℃下反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)2h；反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)結束后，加入(ru)100mgNaH(60％礦物油)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)10min；逐滴(di)加入(ru)含2.1mL縮(suo)水甘(gan)(gan)油的(de)5mL二氧己烷(wan)，混合(he)物在90℃下反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)過(guo)夜，反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)結束后，倒出有機(ji)相，剩(sheng)余物質溶于5mL蒸餾水中，用透析袋(分子(zi)截(jie)留(liu)量為3K)透析24h，冷凍干燥(zao)得(de)到透明狀膠狀產物；滴(di)兩滴(di)濃鹽酸(suan)，再加pH＝7.4的(de)PBS溶液配制(zhi)成0.5g/mL溶液，得(de)到一端是氨基(ji)另外支化(hua)(hua)端是羥基(ji)的(de)超支化(hua)(hua)大分子(zi)NPO，備(bei)用。

(4)負載光敏劑藥物二(er)氫卟(bu)吩e6：

按2.5g:10mmol的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc載體分散于1mL的去離子水中，在30℃下以200rpm的速度攪拌使其充分混勻，攪拌時間為24h；用15mL的100K超濾管離心，去除未載上的藥物，然后定容到原體積，重復三次離心，將未負載上的藥物去除完全，得到Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc@Ce6。

經檢測，得到的磁性納米探針包括負載光敏劑的Fe₃O₄磁性納米粒子、PEG修飾的靶分子以及超支化大分子NPO，負載光敏劑的Fe₃O₄磁性納米粒子、PEG修飾的靶分子以及超支化大分子NPO的摩爾比為0.0005：1：0.5，負載光敏劑的Fe₃O₄磁性納米粒子包括光敏劑和Fe₃O₄載體，光敏劑和Fe₃O₄載(zai)體(ti)的(de)質量比為1：20。

其中Fe₃O₄載體的(de)的(de)粒徑為3nm。

對上述制得的Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc@Ce6進行檢測，通過氣光學照片可知，熒光納米探針靜置一年以上，仍然分散均勻，且具有很強的熒光；圖1的a、b、c分別為本實施例制得的熒光磁性納米探針在不同分辨率下的透射電鏡圖片，可知，熒光磁性納米探針具有優良的分散性，經共價偶聯后，沒出現團聚現象；圖2本實施例制得的熒光磁性納米探針的熒光光譜圖，可知，在探針載體Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc中包(bao)裹(guo)光敏(min)劑后，具有(you)很(hen)強的(de)(de)熒(ying)光強度(du)，可以用于體內熒(ying)光成像(xiang)；且由(you)于尺寸效(xiao)應(ying)，探針核的(de)(de)粒徑直接影響載藥量和探針的(de)(de)熒(ying)光強度(du)。

將上(shang)述制得的(de)(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)磁(ci)性(xing)(xing)納(na)米(mi)(mi)探針(zhen)尾(wei)靜(jing)(jing)脈注(zhu)射(she)(she)于(yu)荷(he)(he)瘤(liu)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)體(ti)內，進(jin)行靶(ba)向(xiang)雙模態成(cheng)(cheng)像(xiang)與光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)動力治(zhi)療，注(zhu)射(she)(she)后(hou)不(bu)同時間內，觀察(cha)探針(zhen)在(zai)裸鼠(shu)(shu)體(ti)內的(de)(de)(de)分布情況，核(he)磁(ci)成(cheng)(cheng)像(xiang)與熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)成(cheng)(cheng)像(xiang)進(jin)行腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)共定(ding)位(wei)，更準確的(de)(de)(de)示蹤有(you)助(zhu)于(yu)成(cheng)(cheng)像(xiang)診斷(duan)和癌癥(zheng)治(zhi)療，圖(tu)(tu)3顯(xian)示了(le)(le)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)磁(ci)性(xing)(xing)納(na)米(mi)(mi)探針(zhen)在(zai)其(qi)體(ti)內的(de)(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)成(cheng)(cheng)像(xiang)照(zhao)(zhao)片，A為注(zhu)射(she)(she)前(qian)的(de)(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)成(cheng)(cheng)像(xiang)照(zhao)(zhao)片，B為注(zhu)射(she)(she)3天后(hou)的(de)(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)成(cheng)(cheng)像(xiang)照(zhao)(zhao)片，可(ke)(ke)知(zhi)(zhi)，探針(zhen)可(ke)(ke)在(zai)術(shu)前(qian)術(shu)后(hou)準確地示蹤腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)；圖(tu)(tu)4顯(xian)示了(le)(le)空白對(dui)照(zhao)(zhao)組(尾(wei)靜(jing)(jing)脈注(zhu)射(she)(she)150微升PBS溶液3天后(hou)的(de)(de)(de)荷(he)(he)瘤(liu)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu))和實驗組(尾(wei)靜(jing)(jing)脈注(zhu)射(she)(she)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)磁(ci)性(xing)(xing)納(na)米(mi)(mi)探針(zhen)(按(an)5mg/kg包(bao)覆熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)藥物的(de)(de)(de)劑量注(zhu)射(she)(she))3天后(hou)的(de)(de)(de)荷(he)(he)瘤(liu)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu))腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)部位(wei)的(de)(de)(de)核(he)磁(ci)成(cheng)(cheng)像(xiang)照(zhao)(zhao)片，可(ke)(ke)知(zhi)(zhi)，熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)磁(ci)性(xing)(xing)納(na)米(mi)(mi)探針(zhen)具有(you)良好(hao)的(de)(de)(de)造影效(xiao)果，并且(qie)(qie)滯留時間可(ke)(ke)長達3天，為術(shu)前(qian)術(shu)后(hou)觀察(cha)提供準確的(de)(de)(de)信(xin)息。且(qie)(qie)與熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)成(cheng)(cheng)像(xiang)(圖(tu)(tu)3)相結合，共定(ding)位(wei)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)位(wei)置及(ji)示蹤病(bing)灶(zao)邊界；圖(tu)(tu)5顯(xian)示了(le)(le)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)磁(ci)性(xing)(xing)納(na)米(mi)(mi)探針(zhen)對(dui)荷(he)(he)瘤(liu)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)的(de)(de)(de)治(zhi)療曲線(xian)，可(ke)(ke)知(zhi)(zhi)，熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)磁(ci)性(xing)(xing)納(na)米(mi)(mi)探針(zhen)可(ke)(ke)以有(you)效(xiao)地靶(ba)向(xiang)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)并抑制腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)的(de)(de)(de)生長；圖(tu)(tu)6顯(xian)示了(le)(le)經熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)磁(ci)性(xing)(xing)納(na)米(mi)(mi)探針(zhen)治(zhi)療后(hou)的(de)(de)(de)荷(he)(he)瘤(liu)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)體(ti)重變(bian)化曲線(xian)，可(ke)(ke)知(zhi)(zhi)，在(zai)治(zhi)療過程中，裸鼠(shu)(shu)的(de)(de)(de)重量基本保持(chi)不(bu)變(bian)，表明探針(zhen)對(dui)老(lao)鼠(shu)(shu)的(de)(de)(de)副(fu)作(zuo)用很(hen)小(xiao)(xiao)(xiao)。

實施例2

一種單分(fen)散熒(ying)光磁性納(na)米探針的(de)制備，包(bao)括以下步(bu)驟：

(1)四氧(yang)化三鐵磁性納米粒子的制備：

將摩爾比為：4:12:12:20的乙酰丙酮鐵(III)、油酸(suan)、油胺、十(shi)六(liu)烷二醇及40mL二苯醚(mi)(或二芐醚(mi))混(hun)合于三頸燒瓶(ping)中(zhong)并(bing)利用(yong)磁轉子(zi)攪拌，在氮氣(qi)保護(hu)下混(hun)合物加熱(re)至(zhi)250℃并(bing)持續加熱(re)3h，隨后加熱(re)至(zhi)350℃，并(bing)在該溫度(du)反應1.5h，反應結(jie)束(shu)后冷卻至(zhi)室(shi)溫，所得(de)(de)黑色溶液利用(yong)無水乙醇反復(fu)離(li)心沉淀(dian)3次(離(li)心速度(du)3500rpm，20min)，最終所得(de)(de)沉淀(dian)重懸于氯仿中(zhong)。

(2)羧基化(hua)四氧化(hua)三鐵磁性納米粒子的制(zhi)備：

取0.05mmol聚(ju)(ju)(異丁烯-alt-馬來酸酐)、0.01mmol十二胺溶(rong)解在裝有(you)25mL四氫呋喃(nan)的(de)(de)圓底(di)燒瓶中(zhong)，超聲20s后(hou)，加熱至65℃并攪拌(ban)過夜(ye)，次(ci)日將四氫呋喃(nan)蒸發掉后(hou)，聚(ju)(ju)合物定溶(rong)于5mL氯(lv)仿中(zhong)獲得0.1M的(de)(de)雙親(qin)性聚(ju)(ju)合物；

將(jiang)步驟(zou)(1)所得磁(ci)性(xing)納米(mi)(mi)粒子與(yu)兩親性(xing)聚合物按照摩爾比(bi)1:100混(hun)合于圓底燒瓶中，利(li)用(yong)旋轉蒸(zheng)發(fa)儀緩慢地將(jiang)溶劑(ji)蒸(zheng)發(fa)掉，得到的(de)固體在磁(ci)力攪拌下溶解于15mL的(de)SBB 12緩沖(chong)溶液(ye)中，最終所得分散液(ye)采用(yong)超濾管(guan)濃(nong)(nong)縮，并利(li)用(yong)超高速離心機除去未包被的(de)聚合物，得到羧(suo)基化(hua)的(de)四(si)氧化(hua)三(san)鐵磁(ci)性(xing)納米(mi)(mi)粒子，即得到濃(nong)(nong)度為20μM的(de)Fe3O4@P-COOH納米(mi)(mi)粒子分散液(ye)；

(3)偶聯(lian)PEG化靶(ba)分子(zi)和一端是氨基(ji)另外支化端是羥基(ji)的超支化大分子(zi)：

在Fe3O4@P-COOH納(na)米(mi)粒子分散液中(zhong)加入EDC/NHS，使(shi)其滿(man)足(zu)與(yu)Fe3O4@P-COOH上羧基(ji)的(de)摩爾比為1：1.5，在XH-1T型多管可調式旋轉(zhuan)混合(he)器上旋轉(zhuan)30min，轉(zhuan)速為30轉(zhuan)/分；

PEG化靶分子和一端是氨基另外端是羥基的超支化大分子NPO與Fe₃O₄@P-COOH納米粒(li)子(zi)分散液混合反應的工藝條(tiao)件(jian)為：在40℃下振蕩3h或(huo)30℃下在旋轉器上(shang)旋轉24h。

PEG化靶分(fen)(fen)子(zi)的(de)制備：在(zai)PEG的(de)SBB 9緩沖液(ye)中加入(ru)(ru)EDC/NHS，使其滿(man)足(zu)與(yu)PEG分(fen)(fen)子(zi)上(shang)羧(suo)基的(de)摩爾(er)比(bi)為1：1.5，在(zai)XH-1T型多管可調(diao)式旋轉混合器上(shang)旋轉30min，轉速為30轉/分(fen)(fen)；按PEG與(yu)靶分(fen)(fen)子(zi)的(de)摩爾(er)比(bi)為1：1.5加入(ru)(ru)靶分(fen)(fen)子(zi)，在(zai)40℃下振(zhen)蕩3h或30℃下在(zai)旋轉器上(shang)旋轉24h。

一端(duan)(duan)是氨基另(ling)外支化端(duan)(duan)是羥基的(de)(de)超支化大分(fen)子(zi)(zi)NPO的(de)(de)制備：N-BOC乙二(er)胺(an)與縮水(shui)(shui)甘油(you)按(an)照摩(mo)爾(er)比為1:1混合(he)于含20mL二(er)氧己烷(wan)的(de)(de)三頸燒(shao)瓶中并利用(yong)磁(ci)轉子(zi)(zi)攪拌，混合(he)物在90℃下反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)5h；反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)結(jie)束后，加(jia)入200mgNaH(60％礦(kuang)物油(you))反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)30min；逐滴加(jia)入含8.4mL縮水(shui)(shui)甘油(you)的(de)(de)20mL二(er)氧己烷(wan)，混合(he)物在90℃下反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)過夜，反(fan)(fan)(fan)應(ying)(ying)結(jie)束后，倒出有機相(xiang)，剩(sheng)余物質溶(rong)(rong)于10mL蒸餾水(shui)(shui)中，用(yong)透(tou)析(xi)袋(分(fen)子(zi)(zi)截留量(liang)為3K)透(tou)析(xi)48h，冷凍干燥得(de)到(dao)透(tou)明狀(zhuang)膠狀(zhuang)產物；滴兩滴濃鹽(yan)酸，再加(jia)pH＝7.4的(de)(de)PBS溶(rong)(rong)液配制成1g/mL溶(rong)(rong)液，得(de)到(dao)一端(duan)(duan)是氨基另(ling)外支化端(duan)(duan)是羥基的(de)(de)超支化大分(fen)子(zi)(zi)NPO，備用(yong)。

(4)負載光(guang)敏劑(ji)藥物吲哚菁綠(lv)ICG：

按5mg:0.5mmol的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc載體分散于1mL的去離子水中，在40℃下以80rpm的速度攪拌使其充分混勻，攪拌時間為48h；用15mL的100K超濾管離心，去除未載上的藥物，然后定容到原體積，重復三次離心，將未負載上的藥物去除完全，得到Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc@ICG。

經檢測，得到的磁性納米探針包括負載光敏劑的Fe₃O₄磁性納米粒子、PEG修飾的靶分子以及超支化大分子NPO，負載光敏劑ICG的Fe₃O₄磁性納米粒子、PEG修飾的靶分子以及超支化大分子NPO的摩爾比為1：10：2，負載光敏劑的Fe₃O₄磁性納米粒子包括光敏劑和Fe₃O₄載體，光敏劑和Fe₃O₄載(zai)體的質(zhi)量比為(wei)5：4。

其中Fe₃O₄載體的的粒徑為15nm。

實施例3

一種單(dan)分散熒(ying)光磁性納(na)米探針(zhen)的制備，包(bao)括以下(xia)步驟：

(1)四氧化三鐵磁性納(na)米(mi)粒子的(de)制備：

將摩爾比為：2:10:10:15的(de)乙酰(xian)丙酮鐵(III)、油(you)酸、油(you)胺、十六烷二醇及30mL二苯醚(或二芐醚)混合(he)(he)于(yu)三(san)頸燒瓶中(zhong)(zhong)并利用磁轉(zhuan)子攪拌，在(zai)氮氣保護下混合(he)(he)物加熱(re)至(zhi)200℃并持(chi)續加熱(re)2h，隨后(hou)加熱(re)至(zhi)300℃，并在(zai)該(gai)溫度反應(ying)1h，反應(ying)結(jie)束(shu)后(hou)冷卻至(zhi)室溫，所得黑色溶液利用無水乙醇反復離(li)(li)心(xin)沉淀3次(離(li)(li)心(xin)速度3000rpm，10min)，最(zui)終(zhong)所得沉淀重懸(xuan)于(yu)氯(lv)仿中(zhong)(zhong)。

(2)羧基(ji)化四氧化三鐵磁(ci)性納(na)米粒子的(de)制備(bei)：

將(jiang)步驟(1)所得磁性(xing)(xing)納(na)米(mi)粒(li)(li)子與(yu)兩親性(xing)(xing)聚合物按(an)照摩爾比1:50混合于圓底燒瓶中，利用旋轉蒸發儀緩慢地(di)將(jiang)溶(rong)劑蒸發掉，得到(dao)的固體在磁力(li)攪拌下溶(rong)解于10mL的SBB 12緩沖(chong)溶(rong)液中，最終所得分散液采用超濾管濃(nong)縮(suo)，并利用超高速離心機除去未(wei)包被的聚合物，得到(dao)羧基化的四氧化三鐵磁性(xing)(xing)納(na)米(mi)粒(li)(li)子，即得到(dao)Fe3O4@P-COOH納(na)米(mi)粒(li)(li)子分散液；

(3)偶聯PEG化(hua)靶分(fen)子(zi)和(he)一(yi)端(duan)是氨(an)基另(ling)外支化(hua)端(duan)是羥基的超支化(hua)大(da)分(fen)子(zi)：

在(zai)Fe3O4@P-COOH納米粒子分(fen)散液中加(jia)入(ru)EDC/NHS，使其(qi)滿足與Fe3O4@P-COOH上(shang)(shang)羧基的摩爾比為1：1.2，在(zai)XH-1T型多管可(ke)調式旋轉(zhuan)混合器上(shang)(shang)旋轉(zhuan)25min，轉(zhuan)速(su)為20轉(zhuan)/分(fen)；

PEG化靶分(fen)子和(he)一端是氨基(ji)另(ling)外端是羥基(ji)的(de)(de)超(chao)支化大分(fen)子NPO與Fe3O4@P-COOH納(na)米(mi)粒(li)子分(fen)散液(ye)混合反應的(de)(de)工(gong)藝條(tiao)件(jian)為：在(zai)37℃下(xia)振(zhen)蕩2h或室溫(wen)下(xia)在(zai)旋轉器上旋轉20h。

PEG化靶分子(zi)的制備：在PEG的SBB 9緩沖液中加入EDC/NHS，使其(qi)滿足與PEG分子(zi)上(shang)羧基的摩爾(er)比為(wei)1：1.2，在XH-1T型多管(guan)可(ke)調(diao)式旋轉(zhuan)混合器上(shang)旋轉(zhuan)25min，轉(zhuan)速為(wei)20轉(zhuan)/分；按PEG與葡(pu)萄糖的摩爾(er)比為(wei)1：2加入葡(pu)萄糖，在37℃下振蕩2h或室溫(wen)下在旋轉(zhuan)器上(shang)旋轉(zhuan)20h。

一端是氨基(ji)另外支化(hua)端是羥基(ji)的(de)超支化(hua)大分子NPO的(de)制備：N-BOC乙二(er)(er)胺與縮(suo)水甘(gan)油按照摩爾比為0.8:0.8混合于含12mL二(er)(er)氧(yang)己烷(wan)的(de)三頸燒(shao)瓶中(zhong)并利用磁轉子攪拌，混合物在90℃下反應(ying)3.5h；反應(ying)結(jie)束后，加入(ru)150mgNaH(60％礦物油)反應(ying)20min；逐滴加入(ru)含5mL縮(suo)水甘(gan)油的(de)12mL二(er)(er)氧(yang)己烷(wan)，混合物在90℃下反應(ying)過夜，反應(ying)結(jie)束后，倒出有機相，剩余物質溶于5-10mL蒸餾水中(zhong)，用透析(xi)袋(分子截留量為3K)透析(xi)36h，冷凍干燥得(de)到(dao)透明(ming)狀膠狀產(chan)物；滴兩滴濃(nong)鹽酸，再加pH＝7.4的(de)PBS溶液配制成0.8g/mL溶液，得(de)到(dao)一端是氨基(ji)另外支化(hua)端是羥基(ji)的(de)超支化(hua)大分子NPO，備用。

(4)負(fu)載光敏劑(ji)藥(yao)物(wu)DOX：

按3:12的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc載體分散于1mL的去離子水中，以150rpm的速度攪拌使其充分混勻，攪拌時間為36h；用15mL的100K超濾管離心，去除未載上的藥物，冷凍離心機的參數設為：4℃、3000rpm、30min，然后定容到原體積，重復三次離心，將未負載上的藥物去除完全，得到Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc@DOX。

實施例4

一(yi)種(zhong)單(dan)分散(san)熒(ying)光磁性納米探針的制備，包(bao)括以下步驟(zou)：

(1)四氧(yang)化(hua)三鐵(tie)磁(ci)性納米粒(li)子的制備：

將摩爾(er)比(bi)為：1:3:3:5的乙酰丙酮鐵(III)、油酸、油胺(an)、十六(liu)烷二醇(chun)及二苯(ben)醚(mi)(或(huo)二芐醚(mi))混合于(yu)三(san)頸(jing)燒瓶中并(bing)利(li)用磁轉子攪拌(ban)，在(zai)氮氣保(bao)護下混合物(wu)加熱(re)至(zhi)(zhi)(zhi)180℃并(bing)持續加熱(re)1.5h，隨后加熱(re)至(zhi)(zhi)(zhi)300℃，并(bing)在(zai)該溫度反應1h，反應結(jie)束后冷卻至(zhi)(zhi)(zhi)室溫，所得(de)黑色溶液利(li)用無水乙醇(chun)反復離心沉(chen)淀(dian)3次(ci)(離心速度2800rpm，10min)，最終所得(de)沉(chen)淀(dian)重懸(xuan)于(yu)氯仿(fang)中。

(2)羧基(ji)化(hua)四氧化(hua)三鐵磁(ci)性納米粒子的(de)制備：

將步驟(1)所得磁性納米(mi)粒子(zi)與兩(liang)親性聚合物按照摩(mo)爾比(bi)1:20混(hun)合于圓底燒瓶中(zhong)，利(li)用(yong)旋轉(zhuan)蒸(zheng)發儀緩慢(man)地將溶(rong)劑蒸(zheng)發掉，得到的固體在(zai)磁力(li)攪拌下(xia)溶(rong)解于8mL的SBB 12緩沖溶(rong)液中(zhong)，最終(zhong)所得分散(san)液采用(yong)超濾(lv)管濃縮，并利(li)用(yong)超高速離心機除去(qu)未包被的聚合物，得到羧基化的四氧化三(san)鐵磁性納米(mi)粒子(zi)，即得到Fe3O4@P-COOH納米(mi)粒子(zi)分散(san)液；

(3)偶(ou)聯PEG化靶分子和(he)一(yi)端是(shi)氨基另外支化端是(shi)羥基的超支化大(da)分子：

在Fe3O4@P-COOH納米粒子分(fen)散液中(zhong)加入EDC/NHS，使其滿足(zu)與Fe3O4@P-COOH上羧基(ji)的摩爾(er)比為1：1，在XH-1T型多管可調(diao)式旋轉(zhuan)(zhuan)混(hun)合器(qi)上旋轉(zhuan)(zhuan)25min，轉(zhuan)(zhuan)速(su)為10轉(zhuan)(zhuan)/分(fen)；

PEG化靶分子(zi)和(he)一端(duan)(duan)是(shi)氨基(ji)另外端(duan)(duan)是(shi)羥(qian)基(ji)的超支化大分子(zi)NPO與Fe3O4@P-COOH納米(mi)粒子(zi)分散(san)液(ye)混合反應的工藝(yi)條件為：在(zai)37℃下(xia)振蕩(dang)1.5h或室(shi)溫下(xia)在(zai)旋轉(zhuan)(zhuan)器上旋轉(zhuan)(zhuan)15h。

PEG化(hua)靶分子的制備：在PEG的SBB 9緩沖液中加入(ru)EDC/NHS，使其(qi)滿足與PEG分子上(shang)羧基的摩爾(er)比(bi)為1：1，在XH-1T型多管可調式旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)混(hun)合器上(shang)旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)25min，轉(zhuan)(zhuan)速為10轉(zhuan)(zhuan)/分；按PEG與透(tou)明(ming)質酸HA的摩爾(er)比(bi)為1：1加入(ru)透(tou)明(ming)質酸HA，在37℃下振蕩1.5h或室溫下在旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)器上(shang)旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)20h。

一(yi)端是(shi)氨基另(ling)外支(zhi)化端是(shi)羥基的(de)超支(zhi)化大分子(zi)NPO的(de)制(zhi)備：N-BOC乙(yi)二(er)胺(an)與縮水甘油(you)按(an)照(zhao)摩爾比為(wei)0.5:1混(hun)合(he)于含(han)5-20mL二(er)氧己(ji)烷(wan)的(de)三(san)頸燒瓶中并利用(yong)磁轉(zhuan)子(zi)攪拌，混(hun)合(he)物在90℃下(xia)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)3h；反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)結(jie)束后(hou)(hou)，加入(ru)120mgNaH(60％礦物油(you))反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)15min；逐滴加入(ru)含(han)4mL縮水甘油(you)的(de)8mL二(er)氧己(ji)烷(wan)，混(hun)合(he)物在90℃下(xia)反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)過夜，反(fan)(fan)應(ying)(ying)(ying)結(jie)束后(hou)(hou)，倒出有機相，剩余物質溶于5-10mL蒸餾(liu)水中，用(yong)透(tou)析袋(dai)(分子(zi)截留量為(wei)3K)透(tou)析24h，冷(leng)凍干燥得到(dao)(dao)透(tou)明(ming)狀(zhuang)膠狀(zhuang)產(chan)物；滴兩滴濃鹽(yan)酸，再加pH＝7.4的(de)PBS溶液(ye)配制(zhi)成0.5g/mL溶液(ye)，得到(dao)(dao)一(yi)端是(shi)氨基另(ling)外支(zhi)化端是(shi)羥基的(de)超支(zhi)化大分子(zi)NPO，備用(yong)。

(4)負載光敏劑藥物(wu)青色素5.5(Cy5.5)/Ce6：

按3mg:7mmol的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-HA載體分散于1mL的去離子水中，以300rpm的速度攪拌使其充分混勻，攪拌時間為24h；用15mL的100K超濾管離心，去除未載上的藥物，冷凍離心機的參數設為：4℃、3500rpm、20min，然后定容到原體積，重復三次離心，將未負載上的藥物去除完全，得到Fe₃O₄@P-NPO/PEG-HA@Cy5.5/Ce6。

實施例5

一種(zhong)單分散熒光磁(ci)性(xing)納米探針的(de)制備，包括以下步驟：

(1)四(si)氧化三鐵磁性納米粒子(zi)的制備(bei)：

將摩(mo)爾(er)比為(wei)：3:10:10:15的乙酰丙酮(tong)鐵(III)、油酸、油胺、十六烷二(er)醇(chun)及二(er)苯醚(或二(er)芐醚)混(hun)合(he)于(yu)三頸燒瓶中(zhong)并(bing)(bing)利(li)用磁轉子攪拌(ban)，在(zai)氮氣保(bao)護下混(hun)合(he)物加熱至(zhi)230℃并(bing)(bing)持(chi)續加熱2.5h，隨(sui)后(hou)加熱至(zhi)300℃，并(bing)(bing)在(zai)該溫度(du)反(fan)應1.2h，反(fan)應結(jie)束后(hou)冷卻至(zhi)室溫，所得黑色溶(rong)液(ye)利(li)用無水(shui)乙醇(chun)反(fan)復離(li)心沉淀(dian)3次(離(li)心速(su)度(du)3000rpm，15min)，最終所得沉淀(dian)重懸(xuan)于(yu)氯仿(fang)中(zhong)。

(2)羧(suo)基化四氧化三鐵(tie)磁(ci)性納米粒子的制(zhi)備：

將步(bu)驟(1)所(suo)得磁(ci)(ci)性納米粒(li)(li)子與兩親性聚合物按照摩爾比1：30混合于圓(yuan)底(di)燒瓶(ping)中(zhong)，利(li)用(yong)旋轉蒸發(fa)儀緩(huan)慢地將溶劑蒸發(fa)掉，得到的固體在磁(ci)(ci)力攪拌下溶解于12mL的SBB 12緩(huan)沖溶液(ye)中(zhong)，最終所(suo)得分散(san)液(ye)采(cai)用(yong)超濾管濃縮，并(bing)利(li)用(yong)超高(gao)速離心機除去未包被(bei)的聚合物，得到羧基化(hua)的四氧化(hua)三鐵(tie)磁(ci)(ci)性納米粒(li)(li)子，即得到Fe3O4@P-COOH納米粒(li)(li)子分散(san)液(ye)；

(3)偶聯PEG化靶分子和一(yi)端是(shi)氨基(ji)另外支(zhi)化端是(shi)羥基(ji)的超支(zhi)化大分子：

在(zai)Fe3O4@P-COOH納米粒子分(fen)(fen)散液中(zhong)加(jia)入(ru)EDC/NHS，使其滿足與Fe3O4@P-COOH上羧基的摩爾(er)比(bi)為1：1.3，在(zai)XH-1T型多管(guan)可調式(shi)旋轉(zhuan)(zhuan)混合(he)器上旋轉(zhuan)(zhuan)30min，轉(zhuan)(zhuan)速為20轉(zhuan)(zhuan)/分(fen)(fen)；

PEG化(hua)(hua)靶分子(zi)和一端是(shi)氨基另外端是(shi)羥基的(de)超支化(hua)(hua)大分子(zi)NPO與Fe3O4@P-COOH納米粒子(zi)分散液混合反應的(de)工藝條件為(wei)：在(zai)37℃下振蕩2h或室(shi)溫下在(zai)旋轉(zhuan)(zhuan)器(qi)上旋轉(zhuan)(zhuan)20h。

PEG化靶分子的制備：在(zai)PEG的SBB 9緩沖液中加(jia)入(ru)EDC/NHS，使其滿足與PEG分子上(shang)(shang)(shang)羧基的摩(mo)爾比為(wei)1：1.2，在(zai)XH-1T型多管可調式旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)混(hun)合器上(shang)(shang)(shang)旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)30min，轉(zhuan)(zhuan)速(su)為(wei)20轉(zhuan)(zhuan)/分；按(an)PEG與tLyp-1縮氨(an)(an)酸(suan)的摩(mo)爾比為(wei)1：1.3加(jia)入(ru)tLyp-1縮氨(an)(an)酸(suan)，在(zai)37℃下(xia)振蕩(dang)2h或室溫下(xia)在(zai)旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)器上(shang)(shang)(shang)旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)20h。

一端(duan)(duan)是(shi)氨基(ji)(ji)另外支化(hua)(hua)端(duan)(duan)是(shi)羥基(ji)(ji)的(de)(de)超支化(hua)(hua)大分子NPO的(de)(de)制備(bei)：N-BOC乙二胺與縮水(shui)甘(gan)油按照(zhao)摩爾比為1:0.5混(hun)合(he)(he)于含15mL二氧(yang)己烷的(de)(de)三(san)頸燒瓶中(zhong)并利用(yong)磁轉子攪拌，混(hun)合(he)(he)物(wu)在90℃下反(fan)應4h；反(fan)應結束后，加(jia)入180mgNaH(60％礦物(wu)油)反(fan)應25min；逐(zhu)滴加(jia)入含6mL縮水(shui)甘(gan)油的(de)(de)20mL二氧(yang)己烷，混(hun)合(he)(he)物(wu)在90℃下反(fan)應過(guo)夜，反(fan)應結束后，倒出(chu)有(you)機相，剩余(yu)物(wu)質溶(rong)于8mL蒸(zheng)餾水(shui)中(zhong)，用(yong)透析袋(dai)(分子截留量為3K)透析40h，冷凍(dong)干燥得到(dao)透明狀膠(jiao)狀產物(wu)；滴兩滴濃鹽(yan)酸，再加(jia)pH＝7.4的(de)(de)PBS溶(rong)液(ye)配制成1g/mL溶(rong)液(ye)，得到(dao)一端(duan)(duan)是(shi)氨基(ji)(ji)另外支化(hua)(hua)端(duan)(duan)是(shi)羥基(ji)(ji)的(de)(de)超支化(hua)(hua)大分子NPO，備(bei)用(yong)。

(4)負載光(guang)敏劑(ji)藥物Ce6：

按4:18的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-tLyp-1載體分散于1mL的去離子水中，以100rpm的速度攪拌使其充分混勻，攪拌時間為40h；用15mL的100K超濾管離心，去除未載上的藥物，冷凍離心機的參數設為：4℃、3200rpm、35min，然后定容到原體積，重復三次離心，將未負載上的藥物去除完全，得到Fe₃O₄@P-NPO/PEG-tLyp-1@Ce6。

實施例6

一(yi)種單分散(san)熒光磁(ci)性(xing)納米探針的制備(bei)，包(bao)括(kuo)以(yi)下(xia)步驟：

(1)四氧化三鐵磁性納米粒(li)子的(de)制(zhi)備：

將(jiang)摩爾比為：0.5:1.5:12:20的乙(yi)酰丙(bing)酮鐵(III)、油(you)酸、油(you)胺(an)、十六烷二(er)(er)醇及二(er)(er)苯醚(或二(er)(er)芐(xia)醚)混(hun)合于三頸燒瓶中(zhong)并(bing)利(li)(li)用(yong)磁轉(zhuan)子攪拌，在氮氣保護下混(hun)合物加熱(re)至250℃并(bing)持續加熱(re)1h，隨后加熱(re)至280℃，并(bing)在該溫度(du)反(fan)(fan)應(ying)0.5h，反(fan)(fan)應(ying)結束后冷(leng)卻至室溫，所得黑色(se)溶液(ye)利(li)(li)用(yong)無水乙(yi)醇反(fan)(fan)復離(li)心(xin)沉淀3次(ci)(離(li)心(xin)速度(du)2000rpm，5min)，最終所得沉淀重懸于氯仿中(zhong)。

(2)羧基化四氧化三(san)鐵磁性納(na)米粒子的制備：

將步(bu)驟(1)所(suo)得(de)(de)磁性(xing)(xing)納米(mi)粒子(zi)與兩(liang)親性(xing)(xing)聚合物(wu)按照摩爾(er)比1:45混合于圓(yuan)底燒瓶中(zhong)，利用旋(xuan)轉(zhuan)蒸發儀緩慢(man)地將溶劑蒸發掉，得(de)(de)到的(de)(de)固體在磁力(li)攪拌(ban)下溶解于10mL的(de)(de)SBB 12緩沖溶液(ye)中(zhong)，最終所(suo)得(de)(de)分散液(ye)采用超濾(lv)管濃縮，并利用超高速離心機除去未包(bao)被的(de)(de)聚合物(wu)，得(de)(de)到羧基化(hua)的(de)(de)四氧(yang)化(hua)三鐵磁性(xing)(xing)納米(mi)粒子(zi)，即得(de)(de)到Fe3O4@P-COOH納米(mi)粒子(zi)分散液(ye)；

(3)偶聯(lian)PEG化靶分子(zi)和一端(duan)是(shi)氨基(ji)另外支化端(duan)是(shi)羥基(ji)的超支化大分子(zi)：

在Fe3O4@P-COOH納米粒子分散液中加入(ru)EDC/NHS，使(shi)其滿足(zu)與Fe3O4@P-COOH上羧基的摩(mo)爾比為1：1，在XH-1T型(xing)多管可調式旋轉(zhuan)混合器上旋轉(zhuan)20min，轉(zhuan)速為5轉(zhuan)/分；

PEG化靶分子和一端(duan)是(shi)氨基另外(wai)端(duan)是(shi)羥基的(de)超支化大分子NPO與Fe3O4@P-COOH納(na)米粒子分散液(ye)混合反(fan)應的(de)工藝(yi)條件為(wei)：在(zai)37℃下(xia)振蕩1h或(huo)室溫(wen)下(xia)在(zai)旋轉器上(shang)旋轉12h。

PEG化靶分(fen)子(zi)的(de)制備(bei)：在(zai)PEG的(de)SBB 9緩沖液中加入EDC/NHS，使其滿(man)足(zu)與(yu)PEG分(fen)子(zi)上(shang)羧基的(de)摩爾(er)比為(wei)1：1，在(zai)XH-1T型多管可(ke)調式旋轉(zhuan)混(hun)合器上(shang)旋轉(zhuan)30min，轉(zhuan)速為(wei)30轉(zhuan)/分(fen)；按PEG與(yu)AP縮氨(an)酸的(de)摩爾(er)比為(wei)1：1加入AP縮氨(an)酸，在(zai)37℃下(xia)振蕩1h或室溫下(xia)在(zai)旋轉(zhuan)器上(shang)旋轉(zhuan)12h。

一端(duan)是(shi)氨(an)基另外支(zhi)化(hua)端(duan)是(shi)羥基的(de)超支(zhi)化(hua)大分(fen)子(zi)NPO的(de)制備：N-BOC乙(yi)二(er)胺(an)與(yu)縮(suo)水甘油按照(zhao)摩爾(er)比(bi)為0.5:0.5混(hun)合(he)于(yu)含(han)5mL二(er)氧己(ji)烷的(de)三(san)頸(jing)燒(shao)瓶中并(bing)利用(yong)磁轉子(zi)攪(jiao)拌(ban)，混(hun)合(he)物在90℃下反(fan)(fan)應(ying)(ying)2h；反(fan)(fan)應(ying)(ying)結束(shu)后(hou)，加(jia)(jia)入(ru)(ru)100mgNaH(60％礦(kuang)物油)反(fan)(fan)應(ying)(ying)10min；逐滴加(jia)(jia)入(ru)(ru)含(han)2.1mL縮(suo)水甘油的(de)5mL二(er)氧己(ji)烷，混(hun)合(he)物在90℃下反(fan)(fan)應(ying)(ying)過夜，反(fan)(fan)應(ying)(ying)結束(shu)后(hou)，倒出有機相，剩余物質溶于(yu)5mL蒸(zheng)餾水中，用(yong)透析(xi)袋(分(fen)子(zi)截留量為3K)透析(xi)24h，冷凍干燥得到透明狀膠狀產物；滴兩滴濃鹽酸，再(zai)加(jia)(jia)pH＝7.4的(de)PBS溶液配制成0.5g/mL溶液，得到一端(duan)是(shi)氨(an)基另外支(zhi)化(hua)端(duan)是(shi)羥基的(de)超支(zhi)化(hua)大分(fen)子(zi)NPO，備用(yong)。

(4)負載光敏劑藥物Ce6和Cy5.5：

按3mg:6mmol的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-AP載體分散于1mL的去離子水中，以200rpm的速度攪拌使其充分混勻，攪拌時間為24h；用15mL的100K超濾管離心，去除未載上的藥物，冷凍離心機的參數設為：4℃、2000rpm、20min，然后定容到原體積，重復三次離心，將未負載上的藥物去除完全，得到Fe₃O₄@P-NPO/PEG-AP@Ce6/Cy5.5。

實施例7

一種單分(fen)散熒(ying)光(guang)磁性納米探針的制備，包括(kuo)以下(xia)步驟：

(1)四氧化三鐵(tie)磁性納米(mi)粒子(zi)的制備：

將(jiang)摩爾比為(wei)：2:10:12:15的乙(yi)酰丙酮(tong)鐵(III)、油酸、油胺、十六烷二醇及二苯醚(mi)(或二芐醚(mi))混合于三頸燒(shao)瓶中并(bing)(bing)利(li)用磁轉(zhuan)子攪拌，在氮氣保護(hu)下混合物加熱至200℃并(bing)(bing)持(chi)續加熱1.5h，隨后加熱至300℃，并(bing)(bing)在該溫(wen)度反(fan)應1h，反(fan)應結束后冷(leng)卻至室溫(wen)，所(suo)得(de)黑色溶液利(li)用無水乙(yi)醇反(fan)復(fu)離心沉淀3次(離心速度3500rpm，20min)，最終所(suo)得(de)沉淀重懸于氯仿中。

(2)羧基化(hua)四氧化(hua)三鐵(tie)磁性納(na)米粒子(zi)的制備：

將步驟(1)所得(de)(de)(de)磁性(xing)納米(mi)粒子(zi)與(yu)兩親(qin)性(xing)聚合物按照摩爾(er)比1:60混合于(yu)圓底燒瓶(ping)中(zhong)，利(li)用旋轉(zhuan)蒸(zheng)發儀緩慢地將溶(rong)劑蒸(zheng)發掉，得(de)(de)(de)到的(de)(de)固體在(zai)磁力攪(jiao)拌下(xia)溶(rong)解于(yu)10mL的(de)(de)SBB 12緩沖溶(rong)液中(zhong)，最(zui)終所得(de)(de)(de)分散(san)液采用超(chao)濾(lv)管濃縮，并利(li)用超(chao)高速離心機除去未包被的(de)(de)聚合物，得(de)(de)(de)到羧基化的(de)(de)四氧(yang)化三鐵磁性(xing)納米(mi)粒子(zi)，即得(de)(de)(de)到Fe3O4@P-COOH納米(mi)粒子(zi)分散(san)液；

(3)偶聯PEG化(hua)靶分(fen)子和(he)一(yi)端(duan)是氨基另(ling)外(wai)支化(hua)端(duan)是羥基的(de)超支化(hua)大(da)分(fen)子：

在Fe3O4@P-COOH納米(mi)粒子分(fen)散液中加(jia)入EDC/NHS，使其滿(man)足與Fe3O4@P-COOH上羧基的摩(mo)爾比為1：1.5，在XH-1T型多(duo)管可調式(shi)旋(xuan)轉(zhuan)混合(he)器(qi)上旋(xuan)轉(zhuan)30min，轉(zhuan)速為30轉(zhuan)/分(fen)；

PEG化靶分(fen)子(zi)和一端是氨基(ji)另(ling)外端是羥基(ji)的超支(zhi)化大分(fen)子(zi)NPO與(yu)Fe3O4@P-COOH納米粒子(zi)分(fen)散(san)液混(hun)合反應的工(gong)藝條(tiao)件(jian)為：在37℃下振蕩3h或(huo)室(shi)溫下在旋(xuan)(xuan)轉器上旋(xuan)(xuan)轉24h。

PEG化靶分(fen)子的制備：在PEG的SBB 9緩(huan)沖(chong)液(ye)中加入(ru)EDC/NHS，使其滿(man)足與PEG分(fen)子上(shang)羧基的摩爾(er)比為1：1.5，在XH-1T型多管可調式旋轉(zhuan)混合器上(shang)旋轉(zhuan)30min，轉(zhuan)速(su)為30轉(zhuan)/分(fen)；按PEG與環狀RGD的摩爾(er)比為1：3加入(ru)環狀RGD，在37℃下振(zhen)蕩3h或室(shi)溫下在旋轉(zhuan)器上(shang)旋轉(zhuan)24h。

一端是(shi)(shi)氨(an)基另外支(zhi)(zhi)化(hua)端是(shi)(shi)羥基的(de)超支(zhi)(zhi)化(hua)大分(fen)子(zi)NPO的(de)制(zhi)備(bei)：N-BOC乙二(er)胺與(yu)縮(suo)水(shui)甘油按照摩爾比為(wei)1:0.5混合(he)于含20mL二(er)氧(yang)己烷的(de)三頸燒瓶中(zhong)并利(li)用磁轉(zhuan)子(zi)攪(jiao)拌，混合(he)物(wu)在(zai)(zai)90℃下(xia)反(fan)應(ying)(ying)5h；反(fan)應(ying)(ying)結束后，加入200mgNaH(60％礦物(wu)油)反(fan)應(ying)(ying)30min；逐(zhu)滴加入含6mL縮(suo)水(shui)甘油的(de)5-20mL二(er)氧(yang)己烷，混合(he)物(wu)在(zai)(zai)90℃下(xia)反(fan)應(ying)(ying)過夜，反(fan)應(ying)(ying)結束后，倒出有機相，剩余物(wu)質溶(rong)于10mL蒸餾水(shui)中(zhong)，用透析袋(分(fen)子(zi)截留(liu)量為(wei)3K)透析48h，冷凍干燥得到透明狀膠狀產物(wu)；滴兩滴濃鹽酸(suan)，再(zai)加pH＝7.4的(de)PBS溶(rong)液配制(zhi)成1g/mL溶(rong)液，得到一端是(shi)(shi)氨(an)基另外支(zhi)(zhi)化(hua)端是(shi)(shi)羥基的(de)超支(zhi)(zhi)化(hua)大分(fen)子(zi)NPO，備(bei)用。

(4)負載光敏劑藥物(wu)Ce6和(he)阿霉素DOX：

按5mg:7mmol的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-RGD載體分散于1mL的去離子水中，以400rpm的速度攪拌使其充分混勻，攪拌時間為36h；用15mL的100K超濾管離心，去除未載上的藥物，冷凍離心機的參數設為：4℃、3000rpm、30min，然后定容到原體積，重復三次離心，將未負載上的藥物去除完全，得到Fe₃O₄@P-NPO/PEG-RGD@Ce6/DOX。

實施例8

一種(zhong)單(dan)分散(san)熒光磁性納(na)米探針(zhen)的(de)制(zhi)備，包括(kuo)以下步驟：

(1)四氧化三鐵磁(ci)性納米粒子的制備：

將摩爾(er)比為：4:1.5:3:10的乙酰(xian)丙(bing)酮鐵(III)、油酸、油胺、十(shi)六烷(wan)二醇(chun)及二苯醚混合(he)于(yu)(yu)三頸(jing)燒(shao)瓶(ping)中(zhong)并(bing)利用磁轉子攪拌，在氮氣保護下混合(he)物加熱(re)至(zhi)250℃并(bing)持續加熱(re)3h，隨后(hou)加熱(re)至(zhi)350℃，并(bing)在該溫度反(fan)應1h，反(fan)應結束后(hou)冷卻(que)至(zhi)室溫，所(suo)得黑色溶液利用無水乙醇(chun)反(fan)復離心(xin)沉(chen)淀(dian)3次(離心(xin)速度3500rpm，20min)，最(zui)終所(suo)得沉(chen)淀(dian)重懸于(yu)(yu)氯(lv)仿中(zhong)。

(2)羧(suo)基化四氧化三鐵磁(ci)性納米粒子的制備：

將步驟(1)所得(de)磁(ci)(ci)性納(na)米(mi)粒(li)子與兩(liang)親(qin)性聚(ju)合物按照摩爾比1:80混合于(yu)圓底(di)燒瓶(ping)中，利用旋轉蒸發儀緩慢地將溶劑蒸發掉，得(de)到的固(gu)體在磁(ci)(ci)力攪拌下溶解于(yu)15mL的SBB 12緩沖溶液中，最終所得(de)分(fen)散(san)液采用超(chao)濾(lv)管濃縮，并利用超(chao)高速離心機除去未包(bao)被的聚(ju)合物，得(de)到羧基化的四氧(yang)化三(san)鐵磁(ci)(ci)性納(na)米(mi)粒(li)子，即得(de)到Fe3O4@P-COOH納(na)米(mi)粒(li)子分(fen)散(san)液；

(3)偶聯PEG化靶分子和一(yi)端(duan)(duan)是(shi)氨基另外支化端(duan)(duan)是(shi)羥基的(de)超(chao)支化大分子：

在Fe3O4@P-COOH納米粒(li)子分散(san)液中加入EDC/NHS，使其滿足與Fe3O4@P-COOH上羧(suo)基的摩爾比為1：1，在XH-1T型多(duo)管可調式旋轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)混合(he)器上旋轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)30min，轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)速為20轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)/分；

PEG化靶分子和(he)一端(duan)是氨基(ji)另外(wai)端(duan)是羥基(ji)的(de)超支化大分子NPO與Fe3O4@P-COOH納米粒子分散液(ye)混合(he)反(fan)應的(de)工藝(yi)條件為：在37℃下振蕩2h或(huo)室溫(wen)下在旋轉(zhuan)(zhuan)器上(shang)旋轉(zhuan)(zhuan)20h。

PEG化(hua)靶分子的制備：在PEG的SBB 9緩沖液(ye)中加(jia)入EDC/NHS，使其滿足與PEG分子上羧(suo)基的摩(mo)爾(er)比(bi)為1：1，在XH-1T型多管可調式旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)混合(he)器上旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)30min，轉(zhuan)(zhuan)速為20轉(zhuan)(zhuan)/分；按(an)PEG與生長(chang)因子的摩(mo)爾(er)比(bi)為1：1加(jia)入生長(chang)因子，在37℃下振蕩3h或室溫下在旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)器上旋(xuan)轉(zhuan)(zhuan)24h。

一端是(shi)氨基另(ling)外支(zhi)化(hua)端是(shi)羥基的(de)超支(zhi)化(hua)大分子NPO的(de)制(zhi)備：N-BOC乙二胺與縮(suo)水甘油按照摩爾比(bi)為(wei)0.5:1混(hun)合于含10mL二氧己(ji)(ji)烷的(de)三頸(jing)燒瓶中(zhong)并(bing)利(li)用(yong)磁(ci)轉子攪拌，混(hun)合物(wu)在90℃下反(fan)應(ying)5h；反(fan)應(ying)結(jie)束后，加(jia)入150mgNaH(60％礦物(wu)油)反(fan)應(ying)20min；逐滴加(jia)入含8mL縮(suo)水甘油的(de)20mL二氧己(ji)(ji)烷，混(hun)合物(wu)在90℃下反(fan)應(ying)過夜，反(fan)應(ying)結(jie)束后，倒出有機相，剩(sheng)余物(wu)質(zhi)溶于10mL蒸餾(liu)水中(zhong)，用(yong)透(tou)析袋(dai)(分子截留量為(wei)3K)透(tou)析24h，冷(leng)凍干燥得到(dao)透(tou)明狀(zhuang)膠(jiao)狀(zhuang)產物(wu)；滴兩滴濃鹽酸，再(zai)加(jia)pH＝7.4的(de)PBS溶液(ye)配(pei)制(zhi)成0.8g/mL溶液(ye)，得到(dao)一端是(shi)氨基另(ling)外支(zhi)化(hua)端是(shi)羥基的(de)超支(zhi)化(hua)大分子NPO，備用(yong)。

(4)負載光敏劑藥物DOX和Cy5.5：

按2.5mg:6mmol的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-生長因子載體分散于1mL的去離子水中，以500rpm的速度攪拌使其充分混勻，攪拌時間為48h；用15mL的100K超濾管離心，去除未載上的藥物，冷凍離心機的參數設為：4℃、3500rpm、20min，然后定容到原體積，重復三次離心，將未負載上的藥物去除完全，得到Fe₃O₄@P-NPO/PEG-生長因(yin)子@DOX/Cy5.5。

實施例9

一(yi)種單分散(san)熒光磁性(xing)納米探針(zhen)的制備，包括(kuo)以下步驟：

(1)四氧化(hua)三鐵(tie)磁(ci)性納米粒子的制備(bei)：

將摩(mo)爾比(bi)為(wei)：4:1.5:5:18的乙(yi)酰丙酮鐵(III)、油酸、油胺、十(shi)六烷(wan)二(er)醇及(ji)二(er)苯(ben)醚混(hun)合(he)于三頸燒瓶中并利(li)(li)用磁轉子攪拌，在(zai)氮氣保護下混(hun)合(he)物(wu)加熱至200℃并持續加熱1.5h，隨后(hou)加熱至300℃，并在(zai)該溫度(du)反(fan)應1h，反(fan)應結(jie)束后(hou)冷(leng)卻至室溫，所得黑色溶液(ye)利(li)(li)用無水乙(yi)醇反(fan)復離心沉淀3次(離心速度(du)2000rpm，20min)，最終所得沉淀重懸于氯仿中。

(2)羧基(ji)化四(si)氧化三鐵磁性納米粒子的制(zhi)備：

將(jiang)步驟(zou)(1)所得(de)磁(ci)性(xing)納米(mi)(mi)粒子(zi)與兩(liang)親性(xing)聚合物(wu)按(an)照摩爾比1:60混合于圓底燒瓶中，利(li)用(yong)旋(xuan)轉蒸(zheng)發(fa)儀(yi)緩(huan)慢地將(jiang)溶劑蒸(zheng)發(fa)掉，得(de)到的固體在磁(ci)力攪拌下溶解于10mL的SBB 12緩(huan)沖(chong)溶液中，最終(zhong)所得(de)分(fen)散液采用(yong)超濾管濃(nong)縮，并利(li)用(yong)超高(gao)速(su)離心機除去未(wei)包被(bei)的聚合物(wu)，得(de)到羧基化(hua)的四氧(yang)化(hua)三鐵磁(ci)性(xing)納米(mi)(mi)粒子(zi)，即得(de)到Fe3O4@P-COOH納米(mi)(mi)粒子(zi)分(fen)散液；

(3)偶(ou)聯PEG化靶分(fen)子和(he)一(yi)端是氨基另外(wai)支(zhi)化端是羥基的超支(zhi)化大分(fen)子：

在Fe3O4@P-COOH納米(mi)粒(li)子分散(san)液中加入EDC/NHS，使其滿足與Fe3O4@P-COOH上(shang)羧(suo)基的摩(mo)爾比(bi)為1：1.5，在XH-1T型多管可調式旋轉(zhuan)混合器上(shang)旋轉(zhuan)25min，轉(zhuan)速為20轉(zhuan)/分；

PEG化靶(ba)分子(zi)和一端是氨基另外端是羥基的(de)超支化大分子(zi)NPO與Fe3O4@P-COOH納米粒子(zi)分散液(ye)混合反應的(de)工(gong)藝(yi)條件(jian)為：在37℃下振(zhen)蕩3h或室(shi)溫下在旋轉(zhuan)器上旋轉(zhuan)24h。

PEG化靶分子(zi)(zi)的(de)(de)制備：在(zai)PEG的(de)(de)SBB 9緩沖(chong)液中加入(ru)EDC/NHS，使其(qi)滿足與(yu)PEG分子(zi)(zi)上(shang)羧基的(de)(de)摩爾比為1：1.5，在(zai)XH-1T型多管可(ke)調式旋轉混合(he)器(qi)上(shang)旋轉30min，轉速(su)為5轉/分；按PEG與(yu)奧曲肽(tai)的(de)(de)摩爾比為1：1.5加入(ru)奧曲肽(tai)，在(zai)37℃下振蕩(dang)2h或室(shi)溫下在(zai)旋轉器(qi)上(shang)旋轉20h。

一端是氨基另(ling)外(wai)支化(hua)(hua)(hua)端是羥基的(de)超支化(hua)(hua)(hua)大分子(zi)NPO的(de)制備(bei)：N-BOC乙二胺與縮水(shui)(shui)甘(gan)油(you)(you)按(an)照(zhao)摩(mo)爾比為1:1混(hun)合于(yu)含15mL二氧己烷(wan)的(de)三頸燒瓶中(zhong)并利用磁轉子(zi)攪拌，混(hun)合物(wu)在90℃下反(fan)應(ying)(ying)(ying)3h；反(fan)應(ying)(ying)(ying)結束(shu)后(hou)(hou)，加入(ru)150mgNaH(60％礦物(wu)油(you)(you))反(fan)應(ying)(ying)(ying)25min；逐滴(di)加入(ru)含5mL縮水(shui)(shui)甘(gan)油(you)(you)的(de)5-20mL二氧己烷(wan)，混(hun)合物(wu)在90℃下反(fan)應(ying)(ying)(ying)過夜(ye)，反(fan)應(ying)(ying)(ying)結束(shu)后(hou)(hou)，倒出有機相，剩余(yu)物(wu)質溶于(yu)8mL蒸(zheng)餾(liu)水(shui)(shui)中(zhong)，用透析袋(分子(zi)截(jie)留量(liang)為3K)透析24-48h，冷凍干燥得到透明狀膠狀產(chan)物(wu)；滴(di)兩滴(di)濃鹽酸(suan)，再加pH＝7.4的(de)PBS溶液(ye)配制成1g/mL溶液(ye)，得到一端是氨基另(ling)外(wai)支化(hua)(hua)(hua)端是羥基的(de)超支化(hua)(hua)(hua)大分子(zi)NPO，備(bei)用。

(4)負載光敏劑(ji)藥物ICG和Cy5.5：

按3mg:10mmol的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-奧曲肽載體分散于1mL的去離子水中，以300rpm的速度攪拌使其充分混勻，攪拌時間為40h；用15mL的100K超濾管離心，去除未載上的藥物，冷凍離心機的參數設為：4℃、3500rpm、25min，然后定容到原體積，重復三次離心，將未負載上的藥物去除完全，得到Fe₃O₄@P-NPO/PEG-奧曲肽@ICG/Cy5.5。

實施例10

一種單(dan)分散熒(ying)光(guang)磁性納米探針的制(zhi)備，包括以(yi)下(xia)步驟(zou)：

(1)四氧化(hua)三(san)鐵磁性納米粒(li)子的制備：

將摩爾比為(wei)：2:10:10:15的乙酰(xian)丙酮(tong)鐵(tie)(III)、油(you)酸、油(you)胺(an)、十(shi)六烷二醇(chun)(chun)及(ji)二苯醚混合(he)于三頸燒瓶中并(bing)利(li)用磁轉子攪拌(ban)，在氮氣保護(hu)下混合(he)物加(jia)熱(re)至(zhi)(zhi)250℃并(bing)持續(xu)加(jia)熱(re)2h，隨后(hou)加(jia)熱(re)至(zhi)(zhi)350℃，并(bing)在該溫(wen)度反應1h，反應結束(shu)后(hou)冷(leng)卻至(zhi)(zhi)室溫(wen)，所得黑色溶液利(li)用無水乙醇(chun)(chun)反復離(li)(li)心(xin)沉(chen)淀3次(ci)(離(li)(li)心(xin)速度3500rpm，20min)，最終所得沉(chen)淀重懸于氯仿中。

(2)羧基(ji)化(hua)四(si)氧化(hua)三(san)鐵磁性納米粒子的(de)制(zhi)備：

將(jiang)步(bu)驟(zou)(1)所(suo)得(de)磁(ci)性納米(mi)粒(li)子與兩親性聚合(he)物按照摩爾比1:70混合(he)于(yu)圓底(di)燒瓶中，利用(yong)(yong)旋轉蒸(zheng)發儀緩慢地將(jiang)溶劑(ji)蒸(zheng)發掉，得(de)到(dao)的固(gu)體在磁(ci)力(li)攪(jiao)拌下溶解于(yu)10mL的SBB 12緩沖溶液中，最終所(suo)得(de)分散(san)液采用(yong)(yong)超濾管濃縮，并(bing)利用(yong)(yong)超高速離心(xin)機(ji)除去未包被的聚合(he)物，得(de)到(dao)羧(suo)基化的四氧化三鐵(tie)磁(ci)性納米(mi)粒(li)子，即得(de)到(dao)Fe3O4@P-COOH納米(mi)粒(li)子分散(san)液；

(3)偶聯PEG化靶分(fen)子(zi)和一端是氨基另外支化端是羥基的(de)超支化大分(fen)子(zi)：

在(zai)Fe3O4@P-COOH納米粒(li)子分散液中加入(ru)EDC/NHS，使(shi)其滿足(zu)與Fe3O4@P-COOH上羧基的摩(mo)爾比(bi)為1：1.2，在(zai)XH-1T型多管(guan)可(ke)調式(shi)旋轉(zhuan)混(hun)合器上旋轉(zhuan)25min，轉(zhuan)速為10轉(zhuan)/分；

PEG化靶分子和一端是氨(an)基另外端是羥基的(de)超支化大(da)分子NPO與(yu)Fe3O4@P-COOH納米(mi)粒子分散液混合反應的(de)工藝(yi)條件為：在37℃下(xia)振蕩2h或(huo)室溫下(xia)在旋(xuan)轉器(qi)上(shang)旋(xuan)轉20h。

PEG化靶分(fen)子的(de)(de)制備：在PEG的(de)(de)SBB 9緩沖液(ye)中加入(ru)EDC/NHS，使其滿足與PEG分(fen)子上羧(suo)基的(de)(de)摩(mo)爾(er)比為1：1.2，在XH-1T型多管可調式(shi)旋(xuan)轉混(hun)合器上旋(xuan)轉25min，轉速(su)為20轉/分(fen)；按(an)PEG與抗體(ti)的(de)(de)摩(mo)爾(er)比為1：3加入(ru)抗體(ti)，在37℃下振蕩(dang)2h或室溫下在旋(xuan)轉器上旋(xuan)轉22h。

一端是(shi)(shi)氨基(ji)另(ling)外(wai)支(zhi)化(hua)(hua)端是(shi)(shi)羥(qian)基(ji)的(de)(de)超(chao)支(zhi)化(hua)(hua)大分(fen)子NPO的(de)(de)制備(bei)：N-BOC乙二(er)(er)胺(an)與縮(suo)水甘油按照摩爾比為1:1混合于(yu)含(han)15mL二(er)(er)氧己(ji)烷的(de)(de)三頸燒瓶中(zhong)并利用(yong)磁轉(zhuan)子攪(jiao)拌，混合物在90℃下(xia)(xia)反(fan)(fan)應2h；反(fan)(fan)應結(jie)束(shu)(shu)后(hou)，加入200mgNaH(60％礦物油)反(fan)(fan)應30min；逐滴(di)(di)加入含(han)7mL縮(suo)水甘油的(de)(de)15mL二(er)(er)氧己(ji)烷，混合物在90℃下(xia)(xia)反(fan)(fan)應過夜，反(fan)(fan)應結(jie)束(shu)(shu)后(hou)，倒出(chu)有(you)機相，剩余(yu)物質溶于(yu)6mL蒸餾水中(zhong)，用(yong)透析袋(分(fen)子截留(liu)量為3K)透析48h，冷凍干(gan)燥得到透明(ming)狀膠(jiao)狀產物；滴(di)(di)兩滴(di)(di)濃鹽(yan)酸，再加pH＝7.4的(de)(de)PBS溶液配制成(cheng)1g/mL溶液，得到一端是(shi)(shi)氨基(ji)另(ling)外(wai)支(zhi)化(hua)(hua)端是(shi)(shi)羥(qian)基(ji)的(de)(de)超(chao)支(zhi)化(hua)(hua)大分(fen)子NPO，備(bei)用(yong)。

(4)負載光敏(min)劑藥物Ce6、DOX和Cy5.5：

按5:20的質量比將光敏劑藥物與Fe₃O₄@P-NPO/PEG-Glc載體(ti)分散于1mL的(de)去離(li)子水(shui)中(zhong)，以500rpm的(de)速度(du)攪拌(ban)使其(qi)充分混(hun)勻，攪拌(ban)時間為(wei)48h；用15mL的(de)100K超(chao)濾管離(li)心(xin)，去除(chu)未載上的(de)藥物，冷(leng)凍離(li)心(xin)機(ji)的(de)參數設為(wei)：4℃、3500rpm、30min，然后定容(rong)到原體(ti)積，重復三(san)次離(li)心(xin)，將未負載上的(de)藥物去除(chu)完全，得到Fe3O4@P-NPO/PEG-抗體(ti)@Ce6/DOX/Cy5.5。

上述的(de)(de)(de)對實(shi)(shi)(shi)施例(li)的(de)(de)(de)描述是為便于該(gai)(gai)技(ji)術領域(yu)(yu)的(de)(de)(de)普通技(ji)術人(ren)員(yuan)能理解和(he)使用發明。熟悉(xi)本(ben)(ben)領域(yu)(yu)技(ji)術的(de)(de)(de)人(ren)員(yuan)顯然可以容易地對這些實(shi)(shi)(shi)施例(li)做出各種(zhong)修(xiu)改，并把在(zai)(zai)此說明的(de)(de)(de)一般原理應用到其他實(shi)(shi)(shi)施例(li)中而(er)不必(bi)經過創(chuang)造性的(de)(de)(de)勞(lao)動。因(yin)此，本(ben)(ben)發明不限于上述實(shi)(shi)(shi)施例(li)，本(ben)(ben)領域(yu)(yu)技(ji)術人(ren)員(yuan)根據本(ben)(ben)發明的(de)(de)(de)揭示，不脫離(li)本(ben)(ben)發明范疇(chou)所做出的(de)(de)(de)改進(jin)和(he)修(xiu)改都應該(gai)(gai)在(zai)(zai)本(ben)(ben)發明的(de)(de)(de)保護范圍(wei)之內。