一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法及其應用
【專利摘要】本發明涉及一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法及其應用，屬于生物工程技術領域；本發明制備方法的步驟為：取烏賊墨汁，加入PBS，充分研磨后，進行超聲波處理，然后離心去沉淀，于上清液中加入木瓜蛋白酶，水浴孵育，冷卻后，離心去沉淀，上清液中加入氯仿與正丁醇混合液，充分混合后離心，取上層黃色清液，重復混合離心2~3次，合并黃色清液，采用旋轉蒸發儀濃縮，濃縮液中加入無水乙醇，靜置后離心，取沉淀，噴霧干燥后粉碎成細末，填入硬膠囊即可；本發明的烏賊墨制劑能抑制乳腺癌細胞活力與轉移，還能通過抑制順鉑誘導的細胞自噬而協同增強順鉑促進三陰乳腺癌細胞的凋亡而實現殺傷作用，可用于腫瘤化療的輔助治療。
【專利說明】
一種具有乳腺癌化療増效活性的烏賊墨制劑的制備方法及其應用
技術領域
[0001]本發明涉及一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法及其應用，該制劑能增強順鉑對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的殺傷效果，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]在醫學上，癌是指起源于上皮組織的惡性腫瘤，一般人們所說的“癌癥”習慣上泛指所有惡性腫瘤，是一種嚴重危害人們健康的常見病、多發病，統計結果顯示，惡性腫瘤是僅次于心腦血管疾病的人類第二大死因。對于惡性腫瘤的治療，常規療法有手術治療、化療、放療、靶向治療、免疫療法、中醫中藥治療等，目前常用的化療藥物都有較強的副作用，療效也不盡理想，如順鉑、環磷酰胺、5-氟尿嘧啶、門冬酰胺、阿糖胞苷、長春新堿、6-硫嘌呤、阿霉素等，而紫杉醇等天然抗腫瘤藥物不僅價格高昂，且其原料屬于稀有保護樹種，來源稀缺。
[0003]烏賊本名烏鰂，又稱花枝、墨斗魚或墨魚，屬于軟體動物門頭足綱烏賊目烏賊科，與章魚和魷魚(又稱槍烏賊)近緣。烏賊科動物，種類繁多，常見的有:金烏賊(SepiaesculentaHoyle，別名:烏魚、墨魚)、虎斑烏賊(Sepiapharaoni sEhrenberg，別名:花旗、花西、墨姆)、白斑烏賊(Sepia LatimanusQuoy et Gaimard，別名:花斑墨)、擬目烏賊(SepiaLycidasGray、別名:眼墨、花雞姆、墨公)、羅氏烏賊(SepiarobsoniSasaki )、曼氏無針烏賊(Sepiellamaindronide Rochebrune，別名:日本無針烏賊、花拉子、麻烏賊、墨魚、目魚、疴血烏賊、血墨)等。烏賊的營養豐富，除可食用外，還具有很好的藥用價值。
[0004]烏賊像其他的頭足類一樣，通過噴射黑色的墨汁防御外敵，烏賊的墨汁，由細小黑色顆粒構成的粘稠狀的混懸液，含有多種活性成分，具有較高藥用價值，早在《本草拾遺》中就有“腹中墨，主治血刺心痛”的記載。上世紀90年代，日本學者(Sasaki J1Ishita K,Takaya Y,et al.Ant1-tumor activity of squid ink[J].Journal of Nutrit1nalScience and Vitaminology, 1997,43(4):455)從烏賊墨中分離出一種具有很好抗腫瘤作用的提取物。然后，烏賊墨逐漸成為研究者的關注熱點，近年來，烏賊墨中的提取物所具有的功能活性被研究者們廣泛開發研究，比如，抗腫瘤、抗氧化、降血壓、抗菌性、抗潰瘍、止血和延緩衰老的作用等等。科學家們對其抗腫瘤活性進行研究，發現其具有多種抗腫廇機制，比如烏賊墨有提高免疫功能，誘生細胞因子，誘導癌細胞凋亡，抑制癌細胞生長的作用等等。在國內研究烏賊墨抗腫瘤作用的學者有很多，《中國藥師》2003年第6卷第10期，李孝東和袁建華所著的“烏賊墨抗腫瘤機制研究進展”，《福建中醫學院學報》2004年第14卷第I期，黃枚所著的“烏賊墨抗癌活性的實驗研究”，《中國海洋藥物雜志》2012年第31卷第5期，張倩和張建民所著的“烏賊墨抗腫瘤活性研究進展”，都充分顯示了烏賊墨在抗腫瘤藥物開發中具有十分顯著的潛在價值，對充分利用海洋資源、擴大藥源也有深遠意義。
[0005]中國發明“魷魚墨汁提取物的制備及其用于制造預防和治療人類腫瘤的藥物及食品”，申請號200410032014.8公開了魷魚墨汁提取物對癌細胞有顯著抑制作用的提示，但其主要作用是用于預防惡性腫瘤的癌前病變，對用于化療增效活性藥物還未見報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法及其應用，由于烏賊墨制劑能抑制乳腺癌細胞活力與轉移，還能通過抑制化療藥物順鉑誘導的細胞自噬而協同增強順鉑促進三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的凋亡而實現殺傷作用，從而提升順鉑對乳腺癌細胞的殺傷效果，可用于腫瘤化療的輔助治療。
[0007]為實現上述發明的目的，本發明采取的技術方案如下:
一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法，包括如下步驟:
(I)取冷凍烏賊墨囊于4°C解凍，取出墨汁，加入I?3倍體積冰冷的磷酸鹽緩沖液PBS，PBS的pH值為7.2，濃度為0.01M,充分研磨后，進行超聲波處理，處理時間5s，間隔1s，次數20次;
(2 )超聲波處理的懸混液于4 0C攪拌浸泡48?7 2小時，然后4 °C離心60min，離心機轉速為8000rpm；
(3)離心液去沉淀，于上清液中加入木瓜蛋白酶，濃度至0.15%，55°(:水浴孵育60min;
(4)再于100°C水浴加熱20min，冷卻后，4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm;
(5)上述離心液去沉淀，于上清液中加入1/4倍體積氯仿與正丁醇混合液，混合液的體積比為I: I，充分混合，4°C靜置20min;
(6)然后4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm，移出上層黃色清液備用；
(7)重復(5)、(6)步驟2?3次，合并黃色清液，采用旋轉蒸發儀濃縮至1/4體積；
(8 )濃縮液中加入4倍體積的無水乙醇，4 °C靜置60min;
(9)于4°C離心lOmin，離心機轉速為5000rpm，取沉淀，120°C噴霧干燥；
(10)將干燥后的粗粉粉碎成細末，填入硬膠囊，每粒0.20-0.30go
[0008]在烏賊墨制劑和順鉑單獨或聯合作用下，進行以下參數檢測以評估烏賊墨制劑對順鉑乳腺癌細胞殺傷效果的協同增效作用。
[0009]利用中效原理結合CCK8細胞活力檢測法，分析烏賊墨制劑及順鉑使用劑量，結果表明，順鉑和烏賊墨提取物中效濃度分別為4.9yg/ml和1659.6yg/ml，兩藥合用指數小于I，表明，烏賊墨制劑對順鉑的抗腫瘤具有較強的協同增效作用，見圖1。
[0010]利用平板克隆形成技術、細胞劃痕技術以及蛋白質印記技術，檢測在烏賊墨制劑或/順鉑作用下，MDA-MB-231細胞的增殖能力、迀移與轉移能力，結果表明烏賊墨制劑明顯增強了順鉑對該乳腺癌細胞的增殖、迀移與轉移的抑制作用，同時，烏賊墨制劑自身對該細胞的增殖、迀移與轉移能力也具有較好的抑制效果，見圖2、圖3、圖4。
[0011]利用分子生物學技術分析三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡情況，結果表明，烏賊墨制劑與順鉑均能很好的介導該癌細胞發生凋亡，并且兩藥合用，促凋亡效果更佳，見圖5、圖6、圖7、圖8。
[0012]利用分子生物學技術檢測該乳腺癌細胞自噬情況，結果發現，烏賊墨制劑對該細胞的自噬沒發生影響，但順鉑誘導了乳腺癌細胞內高水平自噬，然而，在烏賊墨制劑的干預下，該自噬作用被有效的抑制，見圖9、圖10、圖11。
[0013]本發明的有益效果是: 1.乳腺癌細胞MDA-MB-231對順鉑產生的耐藥作用與順鉑誘導產生的細胞自噬有關；
2.烏賊墨制劑介導乳腺癌細胞凋亡，但對自噬無影響。表明烏賊墨制劑對乳腺癌細胞不能產生保護效應，且產生有效的殺傷效果；
3.烏賊墨制劑能通過抑制順鉑誘導的細胞自噬降低耐藥性而增強順鉑對乳腺癌細胞的殺傷作用；
4.烏賊墨制劑能增強順鉑對乳腺癌細胞增殖與轉移的抑制作用；
5.由于烏賊墨制劑對乳腺癌細胞的殺傷作用弱于順鉑，且能提升順鉑對乳腺癌細胞的殺傷效果，因此，烏賊墨制劑可以作為化療增效藥物或增敏藥物，用于腫瘤化療的輔助治療。
[0014]綜上所述，烏賊墨制劑既能抑制乳腺癌細胞活力與轉移，還能通過抑制化療藥物順鉑誘導的細胞自噬而協同增強順鉑促進三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的凋亡而實現殺傷作用。
【附圖說明】
[0015]圖1烏賊墨制劑與順鉑的合用指數；
圖2烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞活力的抑制效果，其中abed/X0.05，abc/X0.01;
圖3烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞迀移能力的抑制效果，其中abcV0.05, abcV0.01；
圖4烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞轉移關鍵基因表達的抑制效果，其中深色為 MMP-2，淺色為 MMP-9，abc/7<0.05, AB/X0.01；
圖5烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞凋亡的促進作用，其中深色為早期凋亡率，淺色為總凋亡率，ΑΜ/ΧΟ.Οδ/Κ/ΧΟ.ΟΙ;
圖6烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞caspase 3基因表達的促進作用，其中 abed；x0.05, abcV0.01；
圖7烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞bcl-2基因表達的抑制作用，其中abc/X0.05，ABC/7〈0.01;
圖8烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞bax基因表達的促進作用，其中abc/X0.05，ABC/7〈0.01;
圖9烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞自噬的抑制或促進作用，其中 abc77〈0.05，AV<0.01;
圖1O烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞LC蛋白活化的促進或抑制作用，其中 abc7X0.05，AV<0.01;
圖11烏賊墨制劑與順鉑的單用或合用對MDA-MB-231細胞beclin-1基因表達的促進或
【具體實施方式】
[0016]下面通過實例對本發明做進一步詳細說明，這些實例僅用來說明本發明，并不限制本發明的范圍； 實施例1
一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法，包括如下步驟:
(1)取冷凍烏賊墨囊于4°C解凍，取出墨汁，加入I倍體積冰冷的磷酸鹽緩沖液PBS，PBS的pH值為7.2，濃度為0.0lM,充分研磨后，進行超聲波處理，處理時間5s，間隔1s，次數20次；
(2)超聲波處理的懸混液于4°C攪拌浸泡48小時，然后40C離心60min，離心機轉速為8000rpm；
(3)離心液去沉淀，于上清液中加入木瓜蛋白酶，濃度至0.15%，55°(:水浴孵育60min;
(4)再于100°C水浴加熱20min，冷卻后，4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm;
(5)上述離心液去沉淀，于上清液中加入1/4倍體積氯仿與正丁醇混合液，混合液的體積比為I: I，充分混合，4°C靜置20min;
(6)然后4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm，移出上層黃色清液備用；
(7)重復(5)、(6)步驟2?3次，合并黃色清液，采用旋轉蒸發儀濃縮至1/4體積；
(8 )濃縮液中加入4倍體積的無水乙醇，4 °C靜置60min;
(9)于4°C離心lOmin，離心機轉速為5000rpm，取沉淀，120°C噴霧干燥；
(10)將干燥后的粗粉粉碎成細末，填入硬膠囊，每粒0.20g。
[0017]實施例2
一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法，包括如下步驟:
(1)取冷凍烏賊墨囊于4°C解凍，取出墨汁，加入3倍體積冰冷的磷酸鹽緩沖液PBS，PBS的pH值為7.2，濃度為0.01M,充分研磨后，進行超聲波處理，處理時間5s，間隔1s，次數20次；
(2)超聲波處理的懸混液于4°C攪拌浸泡72小時，然后40C離心60min，離心機轉速為8000rpm；
(3)離心液去沉淀，于上清液中加入木瓜蛋白酶，濃度至0.15%，55°(:水浴孵育60min;
(4)再于100°C水浴加熱20min，冷卻后，4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm;
(5)上述離心液去沉淀，于上清液中加入1/4倍體積氯仿與正丁醇混合液，混合液的體積比為I: I，充分混合，4°C靜置20min;
(6)然后4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm，移出上層黃色清液備用；
(7)重復(5)、(6)步驟2?3次，合并黃色清液，采用旋轉蒸發儀濃縮至1/4體積；
(8 )濃縮液中加入4倍體積的無水乙醇，4 °C靜置60min;
(9)于4°C離心lOmin，離心機轉速為5000rpm，取沉淀，120°C噴霧干燥；
(10)將干燥后的粗粉粉碎成細末，填入硬膠囊，每粒0.30g。
[0018]實施例3
一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法，包括如下步驟:
(1)取冷凍烏賊墨囊于4°C解凍，取出墨汁，加入2倍體積冰冷的磷酸鹽緩沖液PBS，PBS的pH值為7.2，濃度為0.01M,充分研磨后，進行超聲波處理，處理時間5s，間隔1s，次數20次；
(2)超聲波處理的懸混液于4°C攪拌浸泡60小時，然后40C離心60min，離心機轉速為8000rpm；(3)離心液去沉淀，于上清液中加入木瓜蛋白酶，濃度至0.15%，55°(:水浴孵育60min;
(4)再于100°C水浴加熱20min，冷卻后，4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm;
(5)上述離心液去沉淀，于上清液中加入1/4倍體積氯仿與正丁醇混合液，混合液的體積比為I: I，充分混合，4°C靜置20min;
(6)然后4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm，移出上層黃色清液備用；
(7)重復(5)、(6)步驟2?3次，合并黃色清液，采用旋轉蒸發儀濃縮至1/4體積；
(8 )濃縮液中加入4倍體積的無水乙醇，4 °C靜置60min;
(9)于4°C離心lOmin，離心機轉速為5000rpm，取沉淀，120°C噴霧干燥；
(10)將干燥后的粗粉粉碎成細末，填入硬膠囊，每粒0.25g。
[0019]在烏賊墨制劑和順鉑單獨或聯合作用下，進行以下參數檢測以評估烏賊墨制劑對順鉑乳腺癌細胞殺傷效果的協同增效作用。
[0020]利用中效原理結合CCK8細胞活力檢測法，分析烏賊墨制劑及順鉑使用劑量，結果表明，順鉑和烏賊墨提取物中效濃度分別為4.9yg/ml和1659.6yg/ml，兩藥合用指數小于I，表明，烏賊墨制劑對順鉑的抗腫瘤具有較強的協同增效作用，見圖1。
[0021]利用平板克隆形成技術、細胞劃痕技術以及蛋白質印記技術，檢測在烏賊墨制劑或/順鉑作用下，MDA-MB-231細胞的增殖能力、迀移與轉移能力，結果表明烏賊墨制劑明顯增強了順鉑對該乳腺癌細胞的增殖、迀移與轉移的抑制作用，同時，烏賊墨制劑自身對該細胞的增殖、迀移與轉移能力也具有較好的抑制效果，見圖2、圖3、圖4。
[0022]利用分子生物學技術分析三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡情況，結果表明，烏賊墨制劑與順鉑均能很好的介導該癌細胞發生凋亡，并且兩藥合用，促凋亡效果更佳，見圖5、圖6、圖7、圖8。
[0023]利用分子生物學技術檢測該乳腺癌細胞自噬情況，結果發現，烏賊墨制劑對該細胞的自噬沒發生影響，但順鉑誘導了乳腺癌細胞內高水平自噬，然而，在烏賊墨制劑的干預下，該自噬作用被有效的抑制，見圖9、圖10、圖11。
【主權項】
1.一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取冷凍烏賊墨囊于4°c解凍，取出墨汁，加入I?3倍體積冰冷的磷酸鹽緩沖液PBS，充分研磨后，進行超聲波處理； (2)超聲波處理的懸混液于4°C攪拌浸泡48?72小時，然后4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm； (3 )離心液去沉淀，于上清液中加入木瓜蛋白酶，濃度至0.15%，55 0C水浴孵育60min; (4)再于100°C水浴加熱20min，冷卻后，4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm; (5)上述離心液去沉淀，于上清液中加入1/4倍體積氯仿與正丁醇混合液，充分混合，4°C 靜置 20min; (6)然后4°C離心60min，離心機轉速為8000rpm，移出上層黃色清液備用； (7)重復(5)、(6)步驟2?3次，合并黃色清液，采用旋轉蒸發儀濃縮至1/4體積； (8 )濃縮液中加入4倍體積的無水乙醇，4 °C靜置60min; (9)于4°C離心1min，離心機轉速為5000rpm，取沉淀，120°C噴霧干燥； (10)將干燥后的粗粉粉碎成細末，填入硬膠囊，每粒0.20-0.30go2.根據權利要求1所述一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法:其特征在于:步驟(I)所述磷酸鹽緩沖液I3BS的pH值為7.2，濃度為0.01M;所述超聲波處理的處理時間5s，間隔I Os，次數20次。3.根據權利要求1所述一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑的制備方法:其特征在于:步驟(5)所述氯仿與正丁醇混合液的體積比為1:1。4.一種具有乳腺癌化療增效活性的烏賊墨制劑在化療增效藥物或增敏藥物中的應用。
【文檔編號】A61K9/48GK105920048SQ201610425694
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月16日
【發明人】劉華忠, 羅萍
【申請人】廣東海洋大學