鰤魚諾卡氏菌誘變弱毒株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種鰤魚諾卡氏菌誘變弱毒株及其應用，屬于菌株誘變【技術領域】；具體為一株鰤魚諾卡氏菌誘變弱毒株，命名為鰤魚諾卡氏菌NSX1(NocardiaseriolaeNSX1)，菌種保藏號為CGMCCNO.9437；一種免疫組合物，包含鰤魚諾卡氏菌弱毒株作為免疫原性組分，其中鰤魚諾卡氏菌弱毒株的濃度為103-109CFU/ml；該鰤魚諾卡氏菌弱毒株用于制造抗魚類諾卡氏菌病的藥物，具有顯著的低毒效果，同時能有效地保護魚類免受諾卡氏菌病致病菌株或毒力株導致的鰤魚諾卡氏菌的侵害，免疫效果顯著，具有非常好的諾卡氏菌病的防治效果。
CGMCC No.9437
2014.07.10
【專利說明】鮞魚諾卡氏菌誘變弱毒株及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種魚類諾卡氏菌的誘變及其應用，具體涉及一種螄魚諾卡氏菌誘變 弱毒株及其應用，屬于菌株誘變【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 魚類諾卡氏菌病是池塘養殖、浮筏式網箱養殖和深水網箱養殖模式中的常見病害 之一，是一種慢性系統性肉芽腫疾病，螄魚諾卡氏菌 seriohe)是其主要的致病 菌。該病能在魚體內及體表形成大量結節，還會引起魚類體表出血及潰瘍，嚴重影響成魚 的商品價值，其感染率和死亡率都較高，自然發病率可達到15?30%，嚴重時可達50? 60%，平均死亡率約20%，人工感染的死亡率可高達90%?100%。近年來魚類諾卡氏菌病 在我國和東南亞地區呈上升趨勢，染病的魚種不斷增加(據不完全統計已有近20種)，造成 的經濟損失也日益嚴重。根據已有報道，在我國螄魚諾卡氏菌感染的魚種既有卵形鯧鰺 {Trachinotus ovatus) {Larimichthys crocea) {Fugu obscurus) ^ 魚盧和花身刪（Tkra/7〇/7 j'ar/wa)等海水魚類，又有烏體（CXa/zaa 大口黑自盧等淡水魚類。
[0003] 傳統意義上，治療和預防魚類細菌病主要依賴其菌株敏感性的抗生素。然而，由于 諾卡氏菌主要存在于患病魚體的結節中，藥物的臨床應用基本無效，目前尚無該病害的有 效防治措施。再加上抗生素的濫用還會引起魚體藥物殘留、造成環境污染、破壞水體有益菌 群平衡等更為嚴重的問題。因此，為避免上述問題的產生，且能有效控制該病的發生與流 行，我們必須不遺余力地研發出實用性和可操性強的免疫防控新技術，其中首當其沖的是 高效疫苗的研制，這代表了當今國際水產業發展的前沿與趨勢。
[0004] 然而從世界范圍來看，魚類諾卡氏菌疫苗的研發進程不甚理想，因為與其他魚類 致病菌不同，研究發現螄魚諾卡氏菌的多種滅活疫苗基本不能提供免疫保護作用，這使得 滅活疫苗的開發路線喪失了可行性。減(弱）毒活疫苗因具有給藥方便(可浸泡給藥)、免疫 效價高(可減少給藥劑量)、成本低廉、可開發廣譜疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保護性）的 技術優勢，已成為當前國際上水產養殖用疫苗研究和開發的熱點和前沿領域。為了打破魚 類諾卡氏菌疫苗的研究困境，篩選弱毒株、研制高效安全的螄魚諾卡氏菌活疫苗應是行之 有效的方法。


【發明內容】

[0005] 本發明旨在提供一種螄魚諾卡氏菌誘變弱毒株、相關制劑及應用，具有顯著的低 毒效果，同時能有效地保護魚類免受諾卡氏菌病致病菌株或毒力株導致的螄魚諾卡氏菌的 侵害，免疫效果顯著，具有非常好的諾卡氏菌病的防治效果。
[0006] 為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案是： 一株獅魚諾卡氏菌誘變弱毒株，命名為獅魚諾卡氏菌NSX1 (/Vocart/ia serio/ae NSX1)，于2014年7月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，菌種保藏號為CGMCC No. 9437。
[0007] -種免疫組合物，包含上述螄魚諾卡氏菌弱毒株作為免疫原性組分。本發明免疫 組合物中，所述螄魚諾卡氏菌弱毒株的濃度為l〇 3_l〇9CFU/ml。本發明免疫組合物，還可包 含磷酸緩沖液。
[0008] 螄魚諾卡氏菌弱毒株可以用于制造抗魚類諾卡氏菌病的藥物。
[0009] 本發明的有益效果在于： 1. 本發明的螄魚諾卡菌株誘變弱毒株是經過紫外和化學試劑多重誘變，篩選后獲得， 相對于野生毒株ZJ0503具有顯著的低毒效果，同時能有效地保護魚類免受諾卡氏菌病致 病菌株或毒力株導致的螄魚諾卡氏菌的侵害，免疫效果顯著，具有非常好的諾卡氏菌病的 防治效果； 2. 本發明的螄魚諾卡菌株誘變弱毒株不攜帶任何抗生素抗性標記和其它標記，對環境 不存在傳播抗生素抗性的潛在危險；無任何外源性基因片段，極大消除向環境傳播大量毒 性病原體的可能性，具有技術上的環境和產品安全性，有實際的商業開發應用價值； 3. 本發明的螄魚諾卡菌株誘變弱毒株為活疫苗的商業化進程提供了現實的開發和應 用前景。

【具體實施方式】
[0010] 下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，并 不限制本發明的范圍。
[0011] 本發明實施方式之一提供了一種螄魚諾卡氏菌誘變弱毒株。具體地說，從患諾 卡氏菌病的卵形鯧鰺中分離獲得了一株螄魚諾卡氏菌ZJ0503，以螄魚諾卡氏菌野生菌株 ZJ0503為基礎，經過紫外和化學多重誘變，篩選得到了一株顏色與ZJ0503不同（ZJ0503菌 落呈淡黃色，而該菌株顏色為黃色）且在斑馬魚模型上具有顯著減毒效果的天然弱毒株，將 其命名為螄魚諾卡氏菌NSX1 OVocart/ia seriohe NSX1，后文簡稱"NSX1"），于2014年7 月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，菌種保藏號為 CGMCC No. 9437。其特點是，它是螄魚諾卡氏菌野生毒株的誘變弱毒株，因此該弱毒株不攜 帶任何外源性基因片段。
[0012] 本發明的螄魚諾卡氏菌誘變弱毒株可按照螄魚諾卡氏菌常規培養方法進行培養。 例如，培養基可選用BHI培養基和螄魚諾卡氏菌改良培養基(夏立群等，螄魚諾卡氏菌培養 條件及培養基的優化，南方水產科學，2013,9(3) : 51-56)，于25-28°C固體或液體培養。本 發明實施例之一選用了螄魚諾卡氏菌改良培養基。
[0013] 本發明的另一實施方式提供了一種免疫組合物，其中包含本發明的螄魚諾卡氏菌 誘變弱毒株NSX1作為免疫原性組分。本發明的免疫組合物還可以包含各種適宜的載體和 免疫佐劑。所述載體例如無菌磷酸緩沖液和生理鹽水。本發明實施例之一采用無菌磷酸緩 沖液作為載體。所述免疫組合物的pH以生理pH、尤其是目標魚類的體內生理pH為宜，例如 pH 6-8 和 pH 7-7. 2。
[0014] 本發明免疫組合物的形式之一是即用組合物，其中作為免疫原性組分的本發明弱 毒株NSX1的濃度可以采用常規技術手段試驗確定，也可參照本領域實踐經驗來試驗確定。 例如，本發明的免疫組合物中，所述螄魚諾卡氏菌弱毒株NSX1濃度的數量級為103-109cfu/ 1111，例如103、104、105、106、10 7、108或1(^^"1111，或者以上所述任意兩兩構成的區間，例如 103-10 8CFU/ml。本發明實施例之一的注射劑型中，所述螄魚諾卡氏菌弱毒株NSX1濃度的數 量級為 l〇4_l〇9CFU/ml。
[0015] 本發明的另一實施方式提供了一種防治魚類諾卡氏菌病的方法，采用本發明的螄 魚諾卡氏菌弱毒株NSX1來免疫魚類。可以將本發明的弱毒株NSX1作為疫苗使用，也可以將 其和合適的免疫組合物配置使用。水產養殖業常規免疫方式均適用于本發明，例如注射、浸 泡和口服。適宜的使用濃度為 l〇3_l〇9CFU/ml，或者 ΙΟ3、ΙΟ4、ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、10 8 或 109CFU/ml，或 者以上所述任意兩兩構成的區間，例如l〇3_l〇8CFU/ml。或者，免疫劑量可以是10 2-109CFU/ 尾，或者102、103、10 4、105、106、107、108或io 9cfu/尾，或者以上所述任意兩兩構成的區間， 例如102-108CFU/尾，10 3-109CFU/尾等。又或者，免疫劑量可以是102-109CFU/g(體重）， 或者10 2、103、104、105、106、10 7、108或109CFU/g，或者以上所述任意兩兩構成的區間，例如 Kf-KfCFU/gaoLKfCFU/g等。例如，注射免疫時，弱毒株亦即疫苗株劑量的數量級可以是 104CFU/g (體重）。
[0016] 本發明用下列實施例來進一步說明。
[0017] 實施例1弱毒活疫苗的制備 (一）螄魚諾卡氏菌誘變弱毒株的誘變、篩選和鑒定 1、螄魚諾卡氏菌野生毒株ZJ0503菌懸液的制備 2005年03月本實驗室從廣東省湛江港和陽江閘坡海水網箱養殖場的患結節病卵形鯧 鰺中分離所得一株螄魚諾卡氏菌野生毒株ZJ0503 (黃郁蔥等，卵形鯧鰺結節病病原的分離 與鑒定，廣東海洋大學學報，2008，28(4): 49-53)。將保存于-80°C冰箱的螄魚諾卡氏菌 ZJ0503菌種劃線于BHI固體培養基上，于28°C恒溫倒置培養7d，挑取單菌落于無菌磷酸緩 沖液中，混勻制成菌懸液。
[0018] 2、紫外誘變 分別吸取〇. lml ZJ0503菌懸液涂布到含有0. 39ΓΟ. 5%氯化鋰（LiCl，是一種誘變劑)的 螄魚諾卡氏菌改良固體培養基平板上。涂布接種后的平板在30W紫外燈、照射距離65cm的 無菌條件下分別紫外誘變lmin、2min、5min、lOmin、15min和30min，每個照射時間設置3個 平行樣品。將經紫外線誘變后的所有平板置于28°C培養24-48h。同時將接種后未經紫外 線誘變的平板在相同條件下培養，作為對照。培養后，統計各皿菌落數和菌落形態突變菌落 數，計算不同劑量紫外誘變處理的菌落致死率和菌落形態突變率。計算公式如下：

【權利要求】
1. 一株螄魚諾卡氏菌誘變弱毒株，其特征在于：命名為螄魚諾卡氏菌NSX1，其菌種保 藏號為CGMCC NO. 9437,保藏日期2014年7月10日。
2. -種免疫組合物，其特征在于：螄魚諾卡氏菌NSX1弱毒株作為免疫原性組分。
3. 根據權利要求2所述的一種免疫組合物，其特征在于，所述螄魚諾卡氏菌NSX1弱毒 株的濃度為l〇3_l〇 9CFU/ml。
4. 螄魚諾卡氏菌NSX1弱毒株的應用，其特征在于：用于制造抗魚類諾卡氏菌病的藥 物。
【文檔編號】A61P31/04GK104232535SQ201410440154
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月2日 優先權日:2014年9月2日
【發明者】夏立群, 陳建林, 魯義善, 簡紀常, 蔡佳, 張紅蓮 申請人:廣東海洋大學