一種氮含量高且穩定的腦蛋白水解物的制備方法
【專利摘要】本發明公開一種氮含量高且穩定的腦蛋白水解物的制備方法，通過制備脫脂腦漿、胃蛋白酶酶解、胰酶酶解、配液濃縮得到腦蛋白水解物組合物。該組合物不補加外源氨基酸，氮含量達到6～20mg/mL，并含有適宜的輔料，在保證高氮含量的同時，能防止天然腦蛋白水解物溶液產生不溶物，保證相似度大于0.9。本發明提供的方法及組合物符合國家標準，能達到生產凍干粉針的制劑要求。
【專利說明】一種氮含量高且穩定的腦蛋白水解物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥【技術領域】，具體涉及一種高氮含量的天然腦蛋白水解物組合物的制備方法。
【背景技術】
[0002]腦蛋白水解物是用豬腦蛋白經酶水解所制得的特異性氨基酸混合物，無蛋白質，含有多種人體必需氨基酸、非必需氨基酸、活性多肽、唾液酸等，為天然全提取，無任何外添加物。
[0003]上世紀70年代，腦蛋白水解物最早由奧地利EBEWE藥廠以CerebroIysin(施普善)為商品名出售。1995年，國家衛生部批準國內生產腦蛋白水解物注射液，但是國內現有制備方法得到的腦蛋白水解物中氮含量偏低，達不到國家規定的標準。眾多腦蛋白水解物產品需要通過補加外源性氨基酸來達到國家規定的標準。為此，國家藥監辦【2008】734號文件要求腦蛋白水解物不得補加外源性氨基酸。另外，2012年7月20日國家藥典委員會發布《關于腦蛋白水解物系列品種質量標準修訂稿征求意見的通知》(國藥典化發2012[2012]400號)，所附標準明確規定了腦蛋白水解物系列品種生產過程中也不得添加非水解產物，如各種氨基酸。
[0004]目前，在不補加外源性氨基酸的情況下，可通過濃縮來提高腦蛋白水解物的氮含量，但濃縮液不穩定，會產生沉淀，并導致相似度下降，不符合國家規定，也達不到生產凍干粉針劑要求。
[0005]因此，有必要研發一種符合上述技術要求的制備方法，使天然腦蛋白水解物氮含量高且穩定，以達到制劑生產要求。

【發明內容】

[0006]為解決目前生產的天然腦蛋白水解物含氮量低、不穩定等問題，本發明提供一種氮含量高且穩定的腦蛋白水解物的制備方法。
[0007]本發明通過下列技術方案實現:一種氮含量高且穩定的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于經過下列各步驟:
(O取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，加豬腦質量的2~4倍的水，加熱至80~100°C，保溫10~20分鐘，然后冷卻至10~40°C，以3200~3700轉/分的轉速進行離心分離I~5分鐘，收集下層沉淀物，得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質量的0.5~5%的胃蛋白酶，調節pH值2.0~5.0,加熱升溫至40~60°C進行水解3~8小時，調節pH值7.0~9.0，然后經300目尼龍篩網過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至40~60°C，調節pH值7.0~9.0，再加入新鮮豬腦質量的0.5%~5%的胰酶進行水解3~8小時，然后經陶瓷膜循環過濾得澄清溶液，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液；(4)在步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液中加入輔料至其濃度為3~65mg/mL，并加熱至輔料溶解，于50~60°C下減壓濃縮至氮含量為6~20mg/mL，即得到腦蛋白水解物。
[0008]所述步驟(4)的輔料為右旋糖酐、聚維酮、硬脂酸聚乙二醇酯中的任意一種或幾種。
[0009]所述右旋糖酐為右旋糖酐40,加入至其濃度為15~65mg/mL。
[0010]所述聚維酮為聚維酮K12或聚維酮K17，加入至其濃度為3~20mg/mL。
[0011]所述硬脂酸聚乙二醇酯加入至其濃度為3~17mg/mL。
[0012]本發明提供的是氮含量高且穩定的腦蛋白水解物，該腦蛋白水解物中不含補加的外源性氨基酸，生產過程中也不添加非水解產物，該腦蛋白水解物的氮含量達到6~20mg/mL，并含有適宜的輔料，在保證高氮含量的同時，能有效防止天然腦蛋白水解物溶液產生不溶物，保證相似度大于0.9。本發明提供的方法及所得腦蛋白水解物完全符合國家標準，能達到生產凍干粉針劑的要求。
【具體實施方式】
[0013]通過以下實施例對本發明的上述內容作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。 [0014]實施例1
(1)取凍存新鮮豬腦2kg，加水浸泡自然解凍，用水清洗后研磨成漿液，再加4倍的水8kg，加熱至80°C，保溫20分鐘，然后冷卻至32°C，再以3500轉/分進行離心分離3分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿1.216kg ；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質量的1.5倍的水3.0Okg并攪勻，再加入新鮮豬腦質量的1%的胃蛋白酶20.0g，用50% (w/w)稀鹽酸調節pH值為3.0，然后加熱升溫至40°C進行水解7小時,用50% (w/w)氫氧化鈉液調節pH值為8.0,然后經300目尼龍篩網過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至50°C，調節pH值為8.0，再加入新鮮豬腦質量的
1.5%的胰酶30.0g進行水解5小時，然后經陶瓷膜循環過濾得澄清溶液，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.76mg/mL ；
(4)在步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液中加入右旋糖酐40至濃度為12mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度為2.0mg/mL,再加熱至溶解,然后于55°C下減壓濃縮至氮含量為18.8mg/mL,即得到腦蛋白水解物，其中的右旋糖酐40濃度為60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為10mg/ml。取所得腦蛋白水解物冷卻至室溫，冷凍過夜，室溫自然解凍復溶后，溶液澄清，沒有產生不溶物。
[0015]實施例2
(1)取新鮮豬腦2kg，用水清洗后研磨成漿液，再加3倍質量的水6kg，加熱至100°C，保溫10分鐘，然后冷卻至40°C，再以3200轉/分進行離心分離5分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質量的1.5倍的水3kg攪勻，再加入新鮮豬腦質量的0.5%的胃蛋白酶10g，調節pH值為2.0，然后加熱升溫至50°C進行水解8小時，調節pH值為9.0，然后經300目尼龍篩網過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至40°C，調節pH值為9.0，再加入新鮮豬腦質量的5%的胰酶100g進行水解3小時，然后經陶瓷膜循環過濾使溶液澄清，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.40mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度20mg/mL、聚維酮K12至16.67mg/mL,再加熱至溶解,然后于60°C下減壓濃縮至氮含量為10.2mg/mL,即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為60mg/ml、聚維酮K12濃度為50mg/ml。該腦蛋白水解物組合物冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復溶，溶液澄清，沒有產生不溶物。
[0016]實施例3
(1)取新鮮豬腦2 kg，用水清洗后研磨成漿液，再加2倍質量的水4kg，加熱至90°C，保溫15分鐘，然后冷卻至30°C，再以3700轉/分進行離心分離I分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質量的3%的胃蛋白酶，調節pH值為5.0，然后加熱升溫至50°C進行水解5小時，調節pH值為7.0，然后經300目尼龍篩網過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至60°C，調節pH值為7.0，再加入新鮮豬腦質量
2.5%的胰酶進行水解6小時，然后經陶瓷膜循環過濾使溶液澄清，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.84mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度38.4mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度為6.4mg/mL,再加熱至溶解,然后于55°C下減壓濃縮至氮含量為6mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為10mg/ml。該腦蛋白水解物組合物冷卻至室溫,冷凍過夜后,室溫自然解凍復溶，溶液澄清，沒有產生不溶物。
[0017]實施例4
(1)取新鮮豬腦2kg，用水清洗后研磨成漿液，再加2倍質量的水4kg，加熱至80°C，保溫20分鐘，然后冷卻至10°C，再以3500轉/分進行離心分離5分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質量的5%的胃蛋白酶，調節pH值為5.0，然后加熱升溫至60°C進行水解3小時，調節pH值為7.0，然后經300目尼龍篩網過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至60°C，調節pH值為7.0,再加入新鮮豬腦質量
0.5%的胰酶進行水解8小時，然后經陶瓷膜循環過濾使溶液澄清，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.84mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度28.8mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度為4.8mg/mL,再加熱至溶解,然后于55°C下減壓濃縮至氮含量為8.0mg/mL,即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為10mg/ml。該腦蛋白水解物組合物冷卻至室溫,冷凍過夜后,室溫自然解凍復溶，溶液澄清，沒有產生不溶物。
[0018]實施例5(1)取新鮮豬腦2kg，用水清洗后研磨成漿液，再加3倍質量的水6kg，加熱至90°C，保溫12分鐘，然后冷卻至30°C，再以3600轉/分進行離心分離4分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質量的3%的胃蛋白酶，調節pH值為6.0，然后加熱升溫至50°C進行水解4小時，調節pH值為7.0，然后經300目尼龍篩網過濾，得到酶解液；
(3)將步驟(2)所得酶解液加熱升溫至60°C，調節pH值為7.0,再加入新鮮豬腦質量
3.5%的胰酶進行水解3小時，然后經陶瓷膜循環過濾使溶液澄清，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.84mg/mL ； (4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度25.6mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度為10.24mg/mL，再加熱至溶解，然后于45°C下減壓濃縮至氮含量為15.0mg/mL,即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為100mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為40mg/ml。該腦蛋白水解物組合物冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復溶，溶液澄清，沒有產生不溶物。
[0019]實施例6
(1)取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，再加3倍質量的水加熱至80°C，保溫15分鐘，然后冷卻至30°C，再以3500轉/分進行離心分離3分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦1.5倍質量的水并攪勻，再加入新鮮豬腦質量3%的胃蛋白酶，調節pH值為2.5，然后加熱升溫至50°C進行水解6小時，調節pH值為
7.5，然后經300目尼龍篩網過濾，得到胃酶酶解液；
(3)將步驟(2)所得胃酶酶解液加熱升溫至40°C，調節pH值為8.0，再加入新鮮豬腦質量2%的胰酶進行水解4小時，然后經陶瓷膜循環過濾使溶液澄清，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.68mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度9.2mg/mL、聚維酮K17至濃度11.04mg/mL、硬脂酸聚乙二醇酯(巴斯夫Kolliphor HS 15)至濃度9.2mg/mL,再加熱至溶解，然后于50°C下減壓濃縮至氮含量為20mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為50mg/ml、聚維酮K17至濃度為60mg/ml、硬脂酸聚乙二醇酯濃度為50mg/ml。冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復溶，溶液澄清，沒有產生不溶物。
[0020]實施例7
(1)取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，再加4倍質量的水加熱至90°C，保溫10分鐘，然后冷卻至15°C，再以3500轉/分進行離心分離I分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦1.5倍質量的水并攪勻，再加入新鮮豬腦質量4%的胃蛋白酶，調節pH值為4.0，然后加熱升溫至55°C進行水解6小時，調節pH值為9.0，然后經300目尼龍篩網過濾，得到胃酶酶解液；
(3)將步驟(2)所得胃酶酶解液加熱升溫至40°C，調節pH值為8.0，再加入新鮮豬腦質量4%的胰酶進行水解6小時，然后經陶瓷膜循環過濾使溶液澄清，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.45mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入右旋糖酐40至濃度38.34mg/mL，再加熱至溶解，然后于60°C下減壓濃縮至氮含量為18mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物，其中右旋糖酐40濃度為200mg/ml。冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復溶，溶液澄清，沒有產生不溶物。
[0021]實施例8
(1)取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，再加3倍質量的水加熱至88°C，保溫20分鐘，然后冷卻至40°C，再以3500轉/分進行離心分離5分鐘，收集下層沉淀物，即得脫脂腦漿；
(2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦1.5倍質量的水并攪勻，再加入新鮮豬腦質量2.5%的胃蛋白酶，調節pH值為4.5，然后加熱升溫至60°C進行水解3小時，調節pH值為7.0，然后經300目尼龍篩網過濾，得到胃酶酶解液；
(3)將步驟(2)所得胃酶酶解液加熱升溫至50°C，調節pH值為7.0，再加入新鮮豬腦質量5%的胰酶進行水解5小時，然后經陶瓷膜循環過濾使溶液澄清，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液，檢測總氮含量為3.70mg/mL ；
(4)將步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液加入聚維酮K17至濃度為15.42mg/mL、再加熱至溶解，然后于55°C下減壓濃縮至氮含量為12mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物，其中聚維酮K17濃度為50mg/ml。冷卻至室溫，冷凍過夜后，室溫自然解凍復溶，溶液澄清，沒有產生不溶物。
[0022]對比例I
取與實施例1相同的新鮮豬腦，按現有技術的方法制得氮含量3.32mg/ml的腦蛋白水解物，取所得腦蛋白水解物三份，分別于55°C下減壓濃縮至氮含量為6mg/ml、10mg/ml和15mg/ml,得高氮含量的腦蛋白水解物。
[0023]對比例2
取與實施例1相同的新鮮豬腦，按現有技術的方法制得氮含量3.14mg/ml的腦蛋白水解物，取所得腦蛋白水解物三份，分別于55°C下減壓濃縮至氮含量為6mg/ml、10mg/ml和15mg/ml,得高氮含量的腦蛋白水解物。
[0024]對比例3
取與實施例1相同的新鮮豬腦，按現有技術的方法制得氮含量3.76mg/ml的腦蛋白水解物，取所得腦蛋白水解物三份，分別于55°C下減壓濃縮至氮含量為6mg/ml、10mg/ml和15mg/ml,得高氮含量的腦蛋白水解物。
[0025]取上述對比例1、2、3的高氮含量的腦蛋白水解物各四份，其中一份置于室溫下，其余三份冷凍過夜，室溫自然解凍復溶，再用0.22濾膜過濾后，檢測各份的相似度，數據如下表:
【權利要求】
1.一種氮含量高且穩定的腦蛋白水解物的制備方法，其特征在于經過下列各步驟: (1)取新鮮豬腦，用水清洗后研磨成漿液，加豬腦質量的2~4倍的水，加熱至80~100°C，保溫10~20分鐘，然后冷卻至10~40°C，以3200~3700轉/分的轉速進行離心分離I~5分鐘，收集下層沉淀物，得脫脂腦漿； (2)在步驟(1)所得脫脂腦漿中加入新鮮豬腦質量的1.5倍的水攪勻，再加入新鮮豬腦質量的0.5~5%的胃蛋白酶，調節pH值2.0~5.0，加熱升溫至40~60°C進行水解3~8小時，調節pH值7.0~9.0，然后經300目尼龍篩網過濾，得到酶解液； (3)將步驟(2)所得酶解液加熱溫至40~60°C，調節pH值7.0~9.0，再加入新鮮豬腦質量的0.5%~5%的胰酶進行水解3~8小時，然后經陶瓷膜循環過濾使溶液澄清，再經10000道爾頓分子量濾膜超濾，即得腦蛋白水解物溶液； (4)在步驟(3)所得腦蛋白水解物溶液中加入輔料至濃度為3~65mg/mL，并加熱至輔料溶解，于50~60°C下減壓濃縮至氮含量為6~20mg/mL，即得到腦蛋白水解物組合物。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)的輔料為右旋糖酐、聚維酮、硬脂酸聚乙二醇酯中的任意一種或幾種。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述右旋糖酐為右旋糖酐40，加入至濃度為15~65mg/mL。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述聚維酮為聚維酮K12或聚維酮K17,加入至濃度為3~20mg/mL。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述硬脂酸聚乙二醇酯加入至濃度為 3 ~17mg/mL。
【文檔編號】A61K9/19GK103919807SQ201410187868
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月6日 優先權日:2014年5月6日
【發明者】馬維波, 陳雪江 申請人:云南盟生藥業有限公司