治療重癥肌無力的方法
【專利摘要】本發明涉及結合補體蛋白C5的藥劑在治療與不適當的補體激活有關的疾病尤其是在治療重癥肌無力中的用途。
【專利說明】治療重癥肌無力的方法
[0001]本申請是申請號為200680037667.2的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請PCT/GB2006/003265的中國國家階段申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及結合補體蛋白C5的藥劑在治療與不適當的補體激活有關的疾病尤其是在治療重癥肌無力中的用途。
[0003]在本文中提及的以及在說明書結尾所列的所有文獻通過參考并入本文。
【背景技術】
[0004]補體系統是身體抵抗外來入侵的天然防御機制的基本組成部分，并且還參與炎癥過程。在血清中和細胞表面有超過30種蛋白質參與補體系統功能和調節。最近，已經清楚，有~35種已知的補體系統成員可以與有益過程和病理過程相關聯，補體系統本身與至少85種具有不同功能的生物學途徑相互作用，比如血管發生、血小板活化、葡萄糖代謝和精子發生(Mastellos, D.，et al.，Clin Immunol, 2005.115 (3)p.225-35)。
[0005]外源抗原的存在激活補體系統。存在三種激活途徑:(I)通過IgM和IgG復合物或者通過糖類識別激活的經典途徑；(2)通過非自身表面(缺少特異性調節分子)和通過細菌內毒素活化的旁路途徑；和(3)通過結合甘露聚糖的凝集素(manna-binding lectin,MBL)與病原表面上的甘露糖殘基結合激活的凝集素途徑。這三種途徑包括并行級聯事件，其通過在細胞表面上形成相似的C3和C5轉化酶導致產生補體激活，從而導致急性炎癥介質(C3a和C5a)釋放和膜攻擊復 合物(MAC)的形成。在圖1中顯示涉及經典和旁路途徑的并行級聯。
[0006]在某些情形下補體可以被不適當地激活，導致不希望的局部組織破壞。已顯示出不適當的補體激活在許多種疾病和病癥中起作用，所述疾病和病癥包括急性胰腺炎、阿耳茨海默氏病、變應性腦脊髓炎、異體移植、哮喘、成人型呼吸窘迫綜合征、燒傷、克羅恩氏病、腎小球腎炎、溶血性貧血、血液透析、遺傳性血管性水腫、缺血再灌注損傷、多系統器官衰竭、多發性硬化、重癥肌無力、缺血性卒中、心肌梗塞、銀屑病、類風濕性關節炎、感染性休克、系統性紅斑狼瘡、中風、血管滲漏綜合征、移植排斥和心肺旁路術中不適當的免疫應答。因此，多年以來不適當激活的補體系統被作為治療性介入的靶標，靶向補體級聯反應不同部分的多種補體抑制劑正在開發用于治療用途。
[0007]在缺血性卒中和心肌梗塞中，身體識別腦或心臟中的死組織作為外源物并且激活補體，從而引起進一步的局部損傷。相似地，在心肺轉流術中，身體將儀器中的塑料表面識別為外源物，激活補體，可導致血管損傷。在自身免疫疾病中，身體可以錯誤地將自身識別為外源物，激活補體，并引起局部組織損傷(例如，在類風濕性關節炎中的關節破壞和在重癥肌無力中的肌無力)。
[0008]重癥肌無力是一種慢性自身免疫病，導致進行性疲勞(progressive fatigue)、肌肉張力喪失和麻痹增加。這些癥狀是由補體的不適當激活所引起的，其導致針對煙堿型乙酰膽堿受體(AchR)的免疫應答，其進而導致神經肌肉傳導減少。重癥肌無力的發生可與其它疾病相關聯，比如胸腺腫瘤或甲狀腺毒癥，以及類風濕性關節炎和紅斑狼瘡。
[0009]目前對于重癥肌無力還不能治愈。起初通常應用幫助改善神經肌肉傳導和增加肌肉力量的抗膽堿酯酶劑比如溴新斯的明(Prostigmin)和溴吡斯的明(Mestinon)治療該病。然而，應用抗膽堿酯酶劑的治療與由乙酰膽堿累積引起的有害副作用相關，包括胃腸不適和支氣管和口腔分泌物增加。此外，盡管抗膽堿酯酶劑通常提供癥狀上的改善，但是它們對該疾病的病程沒有作用。對抗膽堿酯酶劑沒有反應的患者還可以應用長期免疫抑制藥物比如皮質類固醇潑尼松或者其它免疫抑制藥物比如環孢霉素、硫唑嘌呤和環磷酰胺進行治療。不過，這些免疫抑制藥物與嚴重的副作用有關。皮質類固醇類的副作用包括體重增加、骨質疏松、高血壓和青光眼。硫唑嘌呤和環孢霉素與肝功能障礙和惡性腫瘤風險增加相關。在一些情形中，推薦胸腺切除術作為藥物的替代方案，但是其反應是不可預測的并且在術后所述疾病癥狀可持續數月或數年。
[0010]通過用純化的AChR或抗AChR抗體免疫可以在動物模型中誘導實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG),這些模型可用于評價補體抑制劑對所述疾病進展的作用。補體抑制劑可溶性補體受體I (sCRl)已經顯示出延遲體重減少和減輕EAMG的臨床體征,這表明這種分子可用于治療重癥肌無力(Piddlesden etal.，J.Neuroimmunol.，1996，71:173-177)。然而，為達到這些效果必需每天注射sCRl，并且盡管sCRl降低了體重減輕，但是不能完全地阻止。因此sCRl不能完全地阻止重癥肌無力的癥狀。
[0011]此外，sCRl通過結合補體級聯反應的早期產物C3b和C4b發揮作用。補體系統在防御病原體中發揮重要的和有價值的作用，該級聯反應的許多早期副產物在病原微生物的識別和調理作用中是重要的。因此，認為在經典和旁路途徑的較早階段進行治療性介入具有增加微生物感染易感性的風險(Roos, A., et al., Immunobiology, 2002, 205 (4-5):P.595-609)ο
[0012]因此，非常需要用于改 善目前可用的重癥肌無力治療的藥劑。

【發明內容】

[0013]因此，本發明提供了一種治療或預防重癥肌無力的方法，其包括向有此需要的對象施用治療或預防有效量的結合補體C5的藥劑。
[0014]本發明還提供治療或預防有效量的結合補體C5的藥劑在制備用于治療或預防重癥肌無力的藥物上的用途。優選地，所述藥劑具有阻止C5轉化酶將補體C5切割成補體C5a和補體C5b-9的作用。
[0015]補體C5蛋白，在本文也被稱為C5，由C5轉化酶所切割，其本身是從C3a形成的，C3a是所述旁路途徑的一種較早期產物(圖1)。這種切割產物包括過敏毒素C5a和裂解復合物C5b_9,其也被稱為膜攻擊復合物(membrane attack complex,MAC)。C5a是一種高活性肽，其涉及許多病理炎癥過程，包括嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞趨化性、嗜中性粒細胞活化、毛細血管通透性增加和嗜中性粒細胞凋亡抑制(Guo，R.F.and P.A.Ward，Annu RevTmmunol,2005,23:p.821-52)。
[0016]MAC與其它一些重要的病理過程相關,包括類風濕性關節炎(Neumann, E., et al.,Arthritis Rheum,2002.46(4):p.934-45 ；ffilliams, A.S., et al., Arthritis Rheum,2004,50(9):p.3035-44)、增生性腎小球腎炎(Quigg, R.J.，Curr Dir Autoimmun, 2004.7:p.165-80)、特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy) (Papagianni, A.A.,et al., Nephrol Dial Transplant, 2002,17 (I):p.57-63)、蛋白尿(proteinurea) (He, C,et al., J Immunol, 2005.174(9):p.5750-7)、急性軸突損傷后的脫髓鞘病(Mead, R.J.,et al.，J Immunol, 2002.168(1):p.458-65)并且還引起異種移植后的急性移植物排斥(Nakashima, S.，et al.，J Tmmunol , 2002.169(8):ρ.4620-7)。[0017]C5a已成為補體相關病癥領域中特別關注的祀標(Mizuno, Μ.and D.S.Cole,Expert Opin Investig Drugs, 2005.14(7):p.807-21)。盡管 C5a 具有許多被充分認可的病理學相關性，但是在人體中去除C5a的影響似乎比較有限。已經開發出結合并抑制C5a或C5a受體的單克隆抗體和小分子來治療多種自身免疫疾病。然而，這些分子不能阻止MAC的釋放。
[0018]相對而言,根據本發明第一方面施用結合C5的藥劑既抑制C5a肽又抑制MAC。意想不到的是，發現對C5a和MAC的抑制完全地減輕了與重癥肌無力有關的臨床癥狀。此外，因為C5是經典和旁路補體途徑的晚期產物，所以對C5的抑制更少可能與并發感染的風險相關，而這種風險在祀向所述級聯反應的較早期產物時是存在的(Allegretti,M.,et al.,Curr Med Chem,2005.12(2):ρ.217—36)。
[0019]通過本領域已知的標準體外測定，例如在將凝膠上的蛋白質與已標記的C5 —起孵育之后進行western印跡，可以確定藥劑結合C5的能力。優選地，根據本發明的藥劑以小于0.2mg/ml、優選小于0.lmg/ml、優選小于0.05mg/ml、優選小于0.04mg/ml、優選小于
0.03mg/ml、優選0.02mg/ml、優選小于I μ g/ml、優選小于100ng/ml、優選小于10ng/ml、更優選小于lng/ml的IC5tl結合C5。
[0020]優選地，結合C5的所述藥劑來自食血節肢動物。術語“食血節肢動物”包括所有從適合的宿主攝血為食的節肢動物，比如昆蟲、蝶(ticks)、風(lice)、跳蚤(fleas)和螨(mites) ο優選地,所述藥劑來自于蝶、優選源于毛白鈍緣蝶(Ornithodoros moubata)。
[0021]根據本發明的一個實施方案，結合C5的所述藥劑是一種包含圖2中氨基酸序列第19至168位氨基酸的蛋白質，或者是此蛋白質的功能等價物。結合C5的所述藥劑可以是由圖2中氨基酸序列第19至168位氨基酸組成的蛋白質，或者是此蛋白質的功能等價物。
[0022]根據一個替代實施方案，根據本發明此實施方案使用的蛋白質可以包含圖2中氨基酸序列第I至168位氨基酸或者由其組成，或者是其功能等價物。在圖2中給出的蛋白質序列的前18個氨基酸形成對于C5結合活性并非必需的信號序列，因此，可以任選地將其舍棄，例如為了重組蛋白質生成的效率。
[0023]具有圖2中給出的氨基酸序列的蛋白質，在本文中也被稱為EV576蛋白，分離自毛白鈍緣蝶的唾液腺。EV576是脂質運載蛋白(Iipocalin)家族的較遠成員(outlyingmember)，是第一個顯示出抑制補體激活的脂質運載蛋白家族成員。通過結合C5并阻止C5轉化酶將其切割成補體C5a和補體C5b-9，從而抑制C5a肽和MAC的作用，EV576蛋白抑制旁路、經典和凝集素補體途徑。本文使用的術語“EV576蛋白”是指有或沒有信號序列的圖2中給出的序列。
[0024]在W02004/106369中公開了 EV576蛋白和這種蛋白質抑制補體激活的能力，其中EV576蛋白被稱為“OmCI蛋白”。現已發現EV576蛋白在治療和預防重癥肌無力中出乎意料的有效。本文給出的數據證明，單注射EV576在至少7天中完全地減輕了 EAMG小鼠的體重降低和肌無力。因此，EV576比sCRl在治療和預防EAMG中更加有效，如上所述，sCRl在每天施用時只減輕重癥肌無力的臨床癥狀(Piddlesden et al, J.Neuroimmunol.,1996,71:173-177)。EV576在治療重癥肌無力中出乎意料的有效似乎是由于它通過結合C5因此抑制C5a和MAC的活性發揮作用。此外，本文給出的數據證明rEV576在早期輕度重癥肌無力和晚期嚴重重癥肌無力危象模型中是有效的。
[0025]根據本發明的另一實施方案，所述藥劑可以是編碼EV576蛋白或其功能等價物的核酸分子。例如，可以應用基因療法實現在體內或者離體由對象的相關細胞內源性產生EV576蛋白。另一方法是施用“裸DNA”，其中治療基因被直接注入血流或肌肉組織中。
[0026]優選地，這種核酸分子包含圖2中核苷酸序列的第53至507位堿基，或者由其組成。該核苷酸序列編碼沒有信號序列的圖2中的EV576蛋白。圖2中核苷酸序列的前54個堿基編碼對于補體抑制活性不是必需的信號序列。或者，所述核酸分子可以包含圖2中核酸序列的第I至507位堿基，或者由其組成，所述核酸分子編碼具有信號序列的所述蛋白質。
[0027]已證明EV576蛋白在大鼠、小鼠和人血清中結合C5并阻止C5轉化酶對其的切割，其具有約0.02mg/ml的IC5(I。優選地，EV576蛋白的功能等價物保留有結合C5的能力，其IC50值小于0.2mg/ml、優選小于0.lmg/ml、優選小于0.05mg/ml、優選小于0.02mg/ml、優選小于I μ g/ml、優選小于100ng/ml、優選小于10ng/ml、更優選小于lng/ml。
[0028]已發現在大鼠中125I標記的EV576的血清β半衰期為30-38小時。優選地，EV576蛋白和其功能等價物保留大于20小時、優選大于25小時、優選大于30小時、優選大于40小時、優選大于50小時、優選大于100小時的半衰期。
[0029]在一個方面，本文使`用術語“功能等價物”描述EV576蛋白的同源物和片段，其保留結合C5并阻止C5轉化酶將補體C5切割成補體C5a和補體C5b_9的能力。術語“功能等價物”也表示在結構上相似于EV576蛋白的或者含有相似或相同三級結構(尤其是在結合C5的EV576蛋白的一個或多個活性位點環境中)的分子，比如合成的分子。
[0030]術語“同源物”意指包括由圖2明確所示的EV576序列的旁系同源物(paralogues)和直系同源物(orthologues)，包括例如來自其它蜱物種的EV576蛋白序列，所述蜱物種包括具尾扇頭蝶(Rhipicephalus appendiculatus)、血紅扇頭蝶(R.sanguineus)、囊狀扇頭蝶(R.bursa)、美洲鈍眼蝶(A.americanum)、卡延鈍眼蝶(A.cajennense)、希伯來鈍眼蝶(A.hebraeum)、微小牛蝶(Boophilus microplus)、具環牛蝶(B.annulatus)、消色牛蝶(B.decoloratus)、網紋革蝶(Dermacentor reticulatus)、安德遜氏革蝶(D.andersoni) >邊緣革蝶(D.marginatus)、變異革蝶(D.variabilis)、鐵角血蝶(Haemaphysalisinermis)、Ha.leachi1、Ha.punctata、小亞璃目艮蝶(Hyalomma anatolicum anatolicum)、駱馬它璃眼蝶(Hy.dromedarii)、邊緣璃眼蝶(Hy.marginatum marginatum)、蓖子硬蝶(Ixodes ricinus)、全溝硬蝶(1.persulcatus)、肩突硬蝶(1.scapularis)、六角形硬蝶(1.hexagonus)、波斯銳緣蝶(Argas persicus)、鴻銳緣蝶(A.reflexus) > Ornithodoroserraticus、毛白純緣蝶(0.moubata moubata)、0.m.porcinus、和 0.savignyi。術語“同源物”意思包括來自蚊物種，所述蚊物種包括庫蚊屬(Culex)、按蚊屬(Anopheles)和伊蚊屬(Aedes)、尤其是致乏庫蚊(Culex quinquefasciatus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和網比亞按蚊(Anopheles gambiae);跳蚤(flea)物種，比如貓蚤(Ctenocephalides felis)(貓跳蚤);馬妮(horseflies);白嶺(sandflies);墨蚊(blackflies);舌妮(tsetse flies)；風(lice);螨(mites);蛭(leeches);和扁蟲(flatworms)、的等價EV576蛋白序列。天然的EV576蛋白被認為以約18kDa的另外三種形式存在于毛白鈍緣蜱(0.moubata)中，術語“同源物”意思還包括EV576的這些替代形式。
[0031]鑒定圖2所示EV576序列的同源物的方法對于本領域技術人員是顯而易見的。例如，可以通過對公共和私人序列數據庫的同源搜索鑒定同源物。便利地是，可以應用公共數據庫，但是私人或商用數據庫同樣是可用的，尤其是如果它們包含公用數據庫所沒有的數據時。一級數據庫是保存一級核苷酸或氨基酸序列數據的網站并且可以是公用或商用的。公用的一級數據庫的實例包括GenBank數據庫(//www.ncb1.nlm.nih.gov/)、EMBL 數據庫(//www.eb1.ac.uk/)、DDBJ 數據庫(//www.ddbj.nig.ac.jp/)、SffISS-PROT 蛋白質數據庫(//expasy.hcuge.ch/)、PIR(//pir.georgetown.edu/)、TrEMBL (http: //www.eb1.ac.uk/)、TIGR 數據庫(見 //www.tigr.0rg/tdb/index, html)、NRL-3D 數據庫(//www.nbrfa.georgetown.edu)、the Protein DataBase (//www.rcsb.0rg/pdb)、NRDB 數據庫(ftp://ncb1.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README)、OffL 數據庫(//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OffL/)以及二級數據庫 PR0SITE (//expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)、PRINTS (//iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints, html)、Prof iIes (//ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html)、Pfam (http: //www.sanger.ac.uk/software/pfam)、Identify(//dna.Stanford, edu/identify/)和 Blocks(//www.blocks, fhcrc.0rg)數據庫。商用數據庫或私人數據庫的實例包括PathoGenome (Genome TherapeuticsInc.)和 PathoSeq(Incyte Pharmaceuticals Inc.)。
[0032]典型地，兩個多肽之間(優選特定區域比如活性位點)大于30%的一致性被認為標志著功能上等價，因此標志著兩個蛋白質是同源物。優選地，同源蛋白質具有與圖2中確定的EV576蛋白大于60%的序列一致性。更優選的同源物分別具有與圖2中給出的EV576蛋白大于70%、80%、90%、95%、98%或99%的一致性。本文所指的一致性百分率是使用 2.1.3 版 BLAST 并米用 NCBI` (the National Center for Biotechnology Information ；http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/)指定的默認參數[B1sum 62 矩陣；缺口罰分(gap openPenalty) = 11 和缺口延伸罰分(gap extension penalty) = I]所確定的。
[0033]圖2中給出的EV576蛋白序列的同源物包括含有對野生型序列的氨基酸替換、插入或缺失例如I個、2個、3個、4個、5個、7個、10個或更多個氨基酸的突變體，前提是這樣的突變體保留結合C5的能力。因此突變體包括含有不以有害形式影響所述蛋白質功能或活性的保守氨基酸替換的蛋白質。該術語意思還包括天然生物學變體(例如，EV576蛋白來源物種中的等位基因變體或地理變異)。還可以通過在所述蛋白質序列中對特定殘基進行系統性或定向突變來設計具有改善的結合C5能力的突變體。
[0034]只要EV576蛋白和EV576蛋白同源物的片段保留結合C5的能力，這樣的片段也包含在術語“功能等價物”的范圍內。片段可以包括例如源于EV576蛋白序列的多肽，其小于150個氨基酸、小于125個氨基酸、小于100個氨基酸、小于75個氨基酸、小于50個氨基酸、或甚至等于或小于25個氨基酸，只要這些片段保留結合補體C5的能力。所包括的這些片段不但可以是本文圖2中明確給出的毛白鈍緣蜱(0.moubata)EV576蛋白的片段，還可以是如上所述的此蛋白質同源物的片段。這樣的同源物的片段通常與圖2的EV576蛋白序列片段具有大于60%的一致性，更優選的同源物的片段分別與圖2的EV576蛋白序列片段具有大于70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或99 %的一致性。當然，可以通過對野生型序列的系統性突變或者片段化接著通過適當的活性測定來合理設計有改善的片段。片段對C5可以展示出與EV576相似的或更大的親和性，并且對C5可以具有相等的或更大的IC5(I。
[0035]根據本發明使用的功能等價物可以是融合蛋白質，其可通過例如將編碼EV576蛋白的多核苷酸框內(in frame)克隆至編碼異源蛋白質序列的序列中獲得。本文使用的術語“異源”意指不同于EV576蛋白或其功能等價物的任何多肽。可包含在可溶性融合蛋白質N-或C-端的異源序列的實例如下:膜結合蛋白質的細胞外結構域、免疫球蛋白恒定區(Fe區)、多聚化結構域、細胞外蛋白質結構域、信號序列、輸出序列、或允許通過親和色譜純化的序列。許多這些異源序列可在表達質粒中商品化供應，因為這些序列通常包含在融合蛋白質中以提供其它特性而又不明顯損害它們融合的蛋白質的特定生物活性(Terpe K，ApplMicrobiol Biotechnol，60:523_33，2003)。這些其它特性的實例有在體液中持續更長的半衰期、細胞外定位、或者允許依靠標簽(tag)(比如組氨酸或HA標簽)進行較容易的純化步驟。
[0036]可以通過在宿主細胞中表達，以重組形式制備EV576蛋白和其功能等價物。這樣的表達方法對于本領域的技術人員是眾所周知的，并且Sambrook et al (2000)和Fernandez&HoeffIer (1998)進行了詳細的描述。EV576蛋白和其功能等價物的重組形式優選是未糖基化的。
[0037]還可以使用蛋白質化學的常規技術制備本發明的蛋白質和片段。例如，可以通過化學合成制備蛋白質片段。生產融合蛋白質的方法在本領域中是標準的，并且對于本領域技術人員是公知的。例如，在Sambrook et al.(2000)或Ausubel et al.(1991)中可以找到大多數常規的分子生物學、微生物學重組DNA技術和免疫技術。
[0038]按本發明的方法或用途施用結合C5的藥劑的對象優選是哺乳動物，優選人。施用結合C5的藥劑的對象還可以患有與重癥肌無力相關的其它疾病比如胸腺腫瘤、甲狀腺毒癥、類風濕性關節炎和紅斑狼瘡。
[0039]以治療或預防有效量施用所述藥劑。術語“治療有效量”意指治療或改善目標疾病所需的藥劑的量。本文使用的術語“預防有效量”意指預防目標疾病所需的藥劑的量。
[0040]優選地，所述藥劑的劑量足以結合對象中盡可能多的可利用C5、更優選所有可利用的C5。優選地，所提供藥劑的劑量是結合對象中所有可利用C5所需摩爾劑量的至少兩倍。所提供藥劑的劑量可以是結合對象中所有可利用C5所需摩爾劑量的2.5倍、3倍或4倍。在一個實施方案中，所述劑量是從lmg/kg至15mg/kg。優選地,所述劑量是從lmg/kg(藥物質量比患者質量)至10mg/kg、優選2mg/kg至8mg/kg。
[0041]需要施用藥劑的頻率將取決于所涉及藥劑的半衰期。當所述藥劑是EV576蛋白或其功能等價物時，施用劑量可以基于每天一次、每天兩次、或每兩天、三天、四天、五天、六天、七天、10天、15天或20天或更多天一次。
[0042]確切的劑量和施用頻率還可取決于患者在施用時的狀態。確定劑量時可以考慮的因素包括患者疾病狀態的嚴重程度、患者的整體健康情況、年齡、體重、性別、飲食、施用時間和頻率、藥物組合、反應敏感性和患者對治療的耐受性或反應。通過常規試驗可以確定準確的量，但是最終可取決于臨床醫生的判斷。
[0043]通常所述藥劑作為藥學可接受載體的一部分來施用。本文使用的術語“藥學可接受載體”包括基因、多肽、抗體、脂質體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和無活性病毒顆粒，或者實際上任何其它藥劑，只要所述載體本身不誘導毒性作用或致使產生對接受所述藥物組合物的個體有害的抗體即可。藥學可接受載體可另外含有液體比如水、鹽水、甘油、乙醇或輔助物質比如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物等。因此，所用的藥物載體將取決于施用途徑而有所不同。載體能夠使所述藥物組合物配制成片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿劑、膏劑(slurries)、混懸劑，以幫助患者的攝取。在Remington Pharmaceutical Sciences (MackPub.C0.，N.J.1991)中可以找到對藥學可接受載體的詳細論述。
[0044]可以通過任何已知的施用途徑遞送所述藥劑。可以通過胃腸外途徑(例如，通過皮下、腹膜內、靜脈內或肌肉內注射，或者遞送至組織間隙)遞送所述藥劑。還可以將所述組合物施用至損傷中。其它施用模式包括口服和肺部施用、栓劑、和透皮或經皮施用、針和無針注射(hypospray)。
[0045]結合C5的藥劑可以單獨施用，或者作為治療方案一部分施用，所述治療方案還包括施用目前用于治療重癥肌無力患者的其它藥物。例如，可以聯合抗膽堿酯酶劑(比如新斯的明和吡斯的明)或免疫抑制藥物(比如潑尼松、環孢霉素和硫唑嘌呤)施用所述藥劑。聯合藥物治療對治療所述疾病可具有加和或協同作用。
[0046]因此，本發明提供⑴結合C5的藥劑，優選EV576蛋白或其功能等價物，和(ii)抗膽堿酯酶劑和/或免疫抑制藥物，用于治療用途。
[0047]本發明還提供⑴結合C5的藥劑，優選EV576蛋白或其功能等價物，和(ii)抗膽堿酯酶劑和/或免疫抑制藥物在`制備治療重癥肌無力藥物中的用途。
[0048]可以與其它藥物同時、依次或者分別地施用結合C5的藥劑。例如，可以在施用其它藥物之前或之后施用結合C5的藥劑。
[0049]因此本發明提供了結合C5的藥劑，優選EV576蛋白或其功能等價物，在制備用于治療對象中重癥肌無力的藥物中的用途，其中所述對象之前已用抗膽堿酯酶劑和/或免疫抑制藥物預先治療過。本發明還提供了抗膽堿酯酶劑和/或免疫抑制藥物在制備用于治療對象中重癥肌無力的藥物中的用途，其中所述對象已用結合C5的藥劑，優選EV576蛋白或其功能等價物預先治療過。
[0050]結合C5的藥劑還可以作為治療方案的一部分施用，所述治療方案還包括施用目前用于治療與重癥肌無力相關的其它疾病的其它藥物，所述其它疾病比如胸腺腫瘤、甲狀腺毒癥、類風濕性關節炎和紅斑狼瘡。可以與所述其它藥物同時、依次或分別地施用結合C5的藥劑。例如，可以在施用所述其它藥物之前或之后施用結合C5的藥劑。
[0051]現將更詳細地舉例說明本發明的多個方面和實施方案。應當理解，對本發明細節的修改并不脫離本發明的范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1:補體激活的經典和旁路途徑的示意圖。暗灰色表示酶組分。過敏毒素被星狀圖所圍繞。
[0053]圖2:EV576的一級序列。下劃線表示信號序列。粗體表示半胱氨酸殘基。在右側指示核苷酸和氨基酸數目。
[0054]圖3:從蜱唾液腺提取物(SGE)純化EV576。A)陰離子交換色譜。B)級分的常規溶血測定。C)還原 SDS-PAGE。D) RP-HPLC。
[0055]圖4:EV576的作用機制。A)對C3a生成沒有作用。B)阻止C5a生成。C)直接結合C5。
[0056]圖5:重組EV576。A)重組EV576 (rEV576)與天然EV576同樣有效地抑制補體。B)EV576的結構。
[0057]圖6:rEV576在實驗性重癥肌無力模型中的作用。A)與對照動物相比，rEV576阻止體重減輕。B)與對照動物相比，用rEV576治療的動物的臨床評分。C)臨床評分的原始數據。
[0058]圖7:rEV576在慢性實驗重癥肌無力模型中的作用。A)與對照動物相比，在具有嚴重EAMG的動物中，rEV576阻止體重減輕和死亡。B)與對照動物相比，在具有嚴重EAMG的動物中，rEV576治療對臨床評分和握力(grip strength)有明顯的改善。C)與對照動物相比，在具有輕度EAMG的動物中，rEV576阻止體重減輕。
[0059]圖8:rEV576在慢性實驗性重癥肌無力模型中的作用。A)在經過治療的、未經治療的、輕度的EAMG或嚴重的EAMG組之間，AchR抗體未顯示出差異。B)來自表現出嚴重和輕度EAMG大鼠的大鼠血清中總補體溶血活性。
`[0060]圖9:rEV576在慢性實驗性重癥肌無力模型中的作用。A)來自表現出嚴重EAMG大鼠的大鼠血清的細胞毒性。B)來自表現出輕度EAMG大鼠的大鼠血清的細胞毒性。
【具體實施方式】
[0061]實施例
[0062]1.作用機制和抑制濃度
[0063]如W02004/106369所公開的，通過對經常規溶血測定發現含有補體抑制活性的唾液腺提取物級分進行SDS-PAGE和RP-HPLC (圖3)，從軟蜱(soft tick)毛白鈍緣蜱(Orthinodoros moubata)的唾液腺提取物中純化EV576。
[0064]EV576抑制人和豚鼠的經典和旁路途徑。它對C3a生成的速率沒有影響(圖4A)，但是阻止將C5切割成C5a(圖4B)。
[0065]EV576抑制經典的和旁路補體途徑的能力是由于該分子與補體C5結合所致，其中C5是C5a和C5b-9的前體。EV576直接結合C5 (圖4C)，IC50約為0.02mg/ml。確切的結合機制和血清因子所起的輔助作用(如果有的話)正在研究之中。
[0066]去除糖基化位點(否則在酵母表達系統中發生糖基化)的重組EV576 (rEV576)與天然非糖基化蛋白質一樣有活性(圖5A)。
[0067]EV576的結構確認它是脂質運載蛋白家族的一種較遠的成員(圖5B),與moubatin具有46%的一致性，后者是來自毛白鈍緣蜱(0.moubata)的一種血小板凝集抑制因子。月旨質運載蛋白是一大組的軟蜱蛋白質，除了很少的幾種之外它們的功能是未知的。
[0068]2.半衰期[0069]發現在大鼠中125I標記的rEV576的血清β半衰期約為30-38小時。
[0070]3.EV576對實驗性自身免疫性重癥肌無力的作用
[0071]試驗1
[0072]按照Piddlesden et al.(如上)的方法，在雌性Lewis大鼠中誘導實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)。
[0073]在第O天給Lewis大鼠腹膜內注射lmg/kg的抗-AchR mAb35,并連同注射:i)3.25mg rEV576(經計算為結合所有可用C5所需要的摩爾劑量的2.5倍)；或者ii)PBS。在7天中評價大鼠的體重和臨床評分的變化。(圖6)
[0074]與對照相比，注射3.25mg的rEV576完全地減輕了 mAb35誘導的體重減輕和肌無力。
[0075]在誘導后72小時所有對照動物都變得瀕臨死亡并且不得不實施安樂死，而所有經rEV576治療的動物都存活下來，體重增加并且在實驗期間(183小時)沒有表現出肌無力(圖6)。
[0076]因此單次注射rEV576在至少7天中完全地減輕了 EAMG的癥狀。
[0077]試驗2
[0078]在慢性EAMG模型中進一步對rEV576進行分析。在該模型中，動物接受完全弗氏佐劑(CFA)中的乙酰膽堿受體蛋白并且在約30天的過程中產生它們自己的抗體。該模型模擬人的情形，其中癥狀的發生和發展相對緩慢。
[0079]通過皮下注射純化的乙酰膽堿受體蛋白(2 X 100 μ I PBS中20 μ g乙酰膽堿受體蛋白，所述蛋白溶液在等體積的完全弗氏佐劑+滅活的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)-0.5mg中乳化)免疫18只Lewis大鼠。對照大鼠只注射PBS。
[0080]疾病發作(EAMG臨床評分I或2并且體重減輕< 15% )之后，給9只大鼠腹膜內(1.P.)注射3.25mg的rEV576，治療持續10天，每12小時注射lmg。在這9只大鼠中，三只大鼠被評價為具有嚴重的肌無力(S-EAMG)和六只大鼠具有輕度的肌無力(M-EAMG)。
[0081]余下的9只大鼠未經處理。這9只大鼠中，四只大鼠被評估為具有嚴重的肌無力(S-EAMG)，五只大鼠具有輕度的肌無力(M-EAMG)。
[0082]在10天中，評價這兩組大鼠的體重、握力和臨床評分的變化。
[0083]在嚴重EAMG組中的大鼠，它們的體重減輕12%并且在用rEV576治療開始時起的24小時內死亡。未經治療的大鼠在24時內全部死亡。經rEV576治療的大鼠顯示出在體重減輕方面明顯的減少。在第33天開始用rEV576治療時，平均臨床評分是2.0。10天的rEV576注射減輕了臨床癥狀的嚴重性并且還阻止了體重的減輕(圖7A)。這些大鼠還顯示出在握力方面的明顯改善(圖7B)。
[0084]在顯示出輕度早期EAMG的大鼠中，在第33天剛開始出現臨床征象并且體重剛開始降低。rEV576治療阻止大鼠體重的減輕并且大鼠體重平均增加3.43%。具有同樣臨床評分的未經治療的動物體重減輕約4.59% (圖7C)。與表現出輕度早期EAMG的未經治療的大鼠相比，在經過治療的大鼠中握力沒有改善(數據未顯示)。
[0085]從所述大鼠中收集血，用于檢測AchR抗體和評價補體溶血活性。在各實驗組之間，通過直接ELISA檢測的AchR抗體沒有差異(圖8A)。來自經rEV576治療的顯示嚴重和輕度EAMG大鼠的大鼠血清完全抑制補體的活性(圖8B)。[0086]此外，在橫紋肌肉瘤細胞系(ATCC，CCL-136)上應用ToxiLight Bioassay Kit測定來自顯示嚴重和輕度EAMG大鼠的大鼠血清的細胞毒性。如在圖9A和9B中所能看到的，在具有嚴重EAMG的未經治療的大鼠中檢測到最高的細胞毒性。用rEV576治療的動物顯示出細胞毒活性明顯降低。
[0087]該數據表明rEV576可以有效用于治療早期輕度重癥肌無力和嚴重晚期疾病(例如肌無力危象)。
[0088]以下部分對應于母案申請中的權利要求:
[0089]1.一種治療或預防重癥肌無力的方法，其包括向有此需要的對象施用治療或預防有效量的結合補體C5的藥劑。
[0090]2.治療或預防有效量的結合補體C5的藥劑在制備治療或預防重癥肌無力的藥物中的用途。
[0091]3.根據項I的方法或根據項2的用途，其中所述藥劑用于阻止C5轉化酶將補體C5切割成補體C5a和補體C5b-9。
[0092]4.根據項I至3中任一項的方法或用途，其中所述藥劑以小于0.2mg/ml的IC50
2:口口 IO ο
[0093]5.根據項I至4中任一項的方法或用途，其中所述藥劑來源于食血節肢動物。
[0094]6.根據項I至5中任一項的方法或用途，其中所述結合C5的藥劑是蛋白質，其包含圖2中氨基酸序列的第19至168位 氨基酸或者由其組成，或者是該蛋白質的功能等價物。
[0095]7.根據項I至5中任一項的方法或用途，其中所述結合C5的藥劑是蛋白質，其包含圖2中氨基酸序列的第I至168位氨基酸或者由其組成，或者是該蛋白質的功能等價物。
[0096]8.根據項I至5中任一項的方法或用途，其中所述藥劑是編碼如項6或7所述蛋白質的核酸分子。
[0097]9.根據項8的方法或用途，其中所述核酸分子包含圖2中核苷酸序列的第53至507位堿基或者由其組成。
[0098]10.根據項9的方法或用途，其中所述核酸分子包含圖2中核苷酸序列的第I至507位堿基或者由其組成。
[0099]11.根據項I至10中任一項的方法或用途，其中所述對象是哺乳動物，優選人。
[0100]12.根據項I至11中任一項的方法或用途，其中以足以結合對象中盡可能多的可利用C5、更優選所有可利用C5的劑量施用所述藥劑。
[0101]13.根據項I至12中任一項的方法或用途，其中以足以減少體重減輕和/或肌無力的劑量施用所述藥劑。
[0102]14.根據項I至13中任一項的方法或用途,其中以lmg/kg至15mg/kg的劑量施用所述藥劑。
[0103]15.根據項I至14中任一項的方法或用途，其中以13mg/kg的單劑量腹膜內施用所述藥劑。
[0104]16.根據項I至13中任一項的方法或用途，其中以13mg/kg的劑量腹膜內施用所述藥劑，接著每12小時以4mg/kg的劑量施用。
[0105]17.根據項I至16中任一 項的方法或用途，其中作為治療方案的一部分施用所述結合C5的藥劑，所述治療方案還包括施用治療重癥肌無力的其它藥物。
[0106]18.根據項17的方法或用途，其中所述的其它藥物是抗膽堿酯酶劑，比如新斯的明和吡斯的明，或者是免疫抑制藥物，比如潑尼松、環孢霉素、和硫唑嘌呤。
[0107]19.根據項17或18的方法或用途，其中與所述其它藥物同時、依次或分別地施用所述結合C5的藥劑。
[0108]20.根據項I至19中任一項的方法或用途，其中所述重癥肌無力是輕度重癥肌無力或重度重 癥肌無力。
【權利要求】
1.治療或預防有效量的結合補體C5的藥劑在制備治療或預防重癥肌無力的藥物中的用途，其中所述藥劑是 (a)由圖2中氨基酸序列第19至168位氨基酸組成的蛋白質； (b)由圖2中氨基酸序列第I至168位氨基酸組成的蛋白質； (c)由圖2中核苷酸序列第53至507位堿基組成的核酸分子；或 (d)由圖2中核苷酸序列第I至507位堿基組成的核酸分子。
2.根據權利要求1的用途，其中所述對象是哺乳動物，優選人。
3.根據權利要求1或2的用途，其中以足以結合對象中盡可能多的可利用C5、更優選所有可利用C5的劑量施用所述藥劑。
4.根據權利要求1至3中任一項的用途，其中以足以減少體重減輕和/或肌無力的劑量施用所述藥劑。
5.根據權利要求1至4中任一項的用途,其中以lmg/kg至15mg/kg的劑量施用所述藥劑。
6.根據權利要求1至5中任一項的用途，其中以13mg/kg的單劑量腹膜內施用所述藥劑。
7.根據權利要求1至4中任一項的用途，其中以13mg/kg的劑量腹膜內施用所述藥劑，接著每12小時以4mg/kg的劑量施用。`
8.根據權利要求1至7中任一項的用途，其中作為治療方案的一部分施用所述結合C5的藥劑，所述治療方案還包括施用治療重癥肌無力的其它藥物。
9.根據權利要求8的用途，其中所述的其它藥物是抗膽堿酯酶劑，比如新斯的明和吡斯的明，或者是免疫抑制藥物，比如潑尼松、環孢霉素、和硫唑嘌呤。
10.根據權利要求8或9的用途，其中與所述其它藥物同時、依次或分別地施用所述結合C5的藥劑。
11.根據權利要求1至10中任一項的用途，其中所述重癥肌無力是輕度重癥肌無力或重度重癥肌無力。
【文檔編號】A61P21/04GK103505721SQ201310352827
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2006年9月5日 優先權日:2005年9月9日
【發明者】約翰·哈默, 溫·韋斯頓-戴維斯 申請人:瓦內免疫藥物有限公司