用于生長因子的多相釋放的系統和方法
用于生長因子的多相釋放的系統和方法
【專利摘要】一種用于至少一種生長因子在治療部位的多相遞送的系統，包括用于以最初釋放模式來釋放至少一種生長因子的遞送載劑，和用于以持續釋放模式來釋放至少一種生長因子的載體。最初釋放模式在數小時至數天的時間內釋放至少一種生長因子，其中所述生長因子最初大量釋放，剩余物以逐漸降低的量釋放。持續釋放模式在數天至數周的時間內釋放至少一種生長因子，其中所述生長因子在這樣的時間段內以通常恒定的量進行釋放。本發明的系統特別適合于對生物植入物的應用。本發明還包括用于至少一種生長因子的多相遞送的方法和試劑盒。
【專利說明】用于生長因子的多相釋放的系統和方法
[0001]在先申請的交叉引用
[0002]該申請根據巴黎公約要求2011年4月11日提交的美國申請61/474，049號的優先權,其全部內容通過引用并入本文。
【技術領域】
[0003]本發明涉及用于釋放生物物質的系統和方法。具體地，本發明涉及與生物植入物相關的生長因子的釋放。更具體地，本發明提供一種用于產生至少一種生長因子的多相釋放模式以改善生物植入物的性能的系統和方法。
【背景技術】
[0004]生長因子(GF)是通過GF與特定細胞表面受體的相互作用來刺激細胞的生長和/或分化的肽和蛋白質。生長因子在組織的修復和再生中起著必不可少的作用，GF的外源性應用可以用于刺激各種組織和器官的修復，所述組織和器官包括骨、軟骨、皮膚和粘膜，以及用于通過在修復部位的血管再生的刺激增強組織的修復。[0005]哺乳動物中分泌的生長和分化因子的轉化生長因子β (TGF β )總科有超過30個成員。這些二聚蛋白質的特征在于保守的七胱氨酸結基結構。它們調節許多細胞種類的增殖、分化和遷移，并在形態發生、器官發生、組織維護和創傷愈合方面具有重要作用。生長因子的TGFii總科可以細分為幾個亞科，包括轉化生長因子β亞科、骨形態發生蛋白(BMP)和生長分化因子(⑶F)科(也叫做BMP亞科)，以及抑制素和激活素亞科。
[0006]TGF β總科的BMP亞科包含至少二十種蛋白質，包括ΒΜΡ_2、ΒΜΡ-3 (也稱作成骨素)、BMP-3b (也稱作生長分化因子10，ffl)F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也稱作成骨蛋白-1，0Ρ-1)、ΒΜΡ-8 (也稱作成骨蛋白-2，OP-2)、BMP-9、BMP-10、BMP-1I (也稱作生長分化因子_8，⑶F-8，或者肌肉生長抑制素)、BMP-12 (也稱作生長分化因子_7，OTF-7)、BMP_13(也稱作生長分化因子6，⑶F-6)、BMP-14 (也稱作生長分化因子5，⑶F-5)和BMP-15 (關于綜述，參見例如 Azari 等，Expert Opin Invest Drugs2001 ; 10:1677-1686)。
[0007]BMP已經顯示出在成軟骨細胞中刺激基質合成；在成骨細胞中刺激堿性磷酸酶活性和膠原蛋白合成，誘導早期間質祖細胞分化為成骨細胞(骨誘導)，調節單核細胞和間質細胞的趨化性，以及調節神經細胞的分化(關于綜述，參見例如Azari等，Expert OpinInvest Drugs2001 ；10: 1677-1686 和 Hoffman 等，Appl.Microbiol.Biotech2001 ；57:294-308)。
[0008]BMP蛋白質的許多功能之一是在脊椎動物中誘導軟骨、骨和結締組織的形成。BMP總科的最具有骨誘導能力的成員是BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8和BMP-9 (參見例如Hoffman等，Appl.Microbiol.Biotech2001 ;57_294_308 ;Yeh等,J Cellular Biochem.，2005:95-173-188 ;和 Boden，0rthopaedicNursing2005, 24:49_52)。已經長期認為 BMP 的該骨誘導的能力對于各種治療和臨床應用非常有希望，所述治療和臨床應用包括骨折修復；脊柱融合；骨骼疾病的治療，頭骨、下頜骨和骨缺損的再生；以及在口腔和牙科應用中，例如在牙周創傷再生期間的牙齒發生和牙骨質發生中，拔牙窩移植、牙槽嵴增高和上頜竇增高。目前，由美敦力(Medtronic)以INFUSE?銷售的重組人類BMP-2被FDA批準用于脊柱融合手術，用于骨折不愈合的修復以及用于口腔手術，而由史賽克(Stryker)以OP-1?銷售的重組人類BMP-7被批準作為頑固的長骨不愈合中自體移植的替代，以及用于翻修后外側腰椎融合，其中自體移植和骨髓收獲是不可行的，或者預期不會促進融合。
[0009]已經外源地用于增強骨修復的其他重組生長因子包括各種TGFP (參見Clokie&Bell, J.Craniofacial Surg.2003，14:268_77)、成纖維細胞生長因子總科(FGF)的成員(參見 Kawaguchi 等，(2007) J.0rthopaedic Res.25 (4):480_487)、血小板衍生的生長因子總科(PDGF)的成員(參見Hollinger等，2008JBJS90 (si):48-54)和血管內皮細胞生長因子(VEGF)(參見 Street 等，2002PNAS99:9656-61 )。
[0010]為了使這些生長因子有效，當在修復部位存在適當的應答細胞的臨界密度時，它們必須是活性的并且同時以足夠的濃度可得。GF的短的半衰期、熱不穩定性、對蛋白酶的靈敏度和/或溶解度要求它們與載體組合施用，以滿足該要求。
[0011]已經對用于GF遞送的大量載體進行了評價。這些載體包括纖維膠原海綿，明膠水凝膠，纖維蛋白凝膠，肝素，反相聚合物(例如泊洛沙姆)，由聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)或其共聚物(PLGA)構成的支架，肝素接合的PLGA支架和無機材料(例如磷酸鈣)。例如，用于牙周再生的生物植入物(GEM-21S? )使用β -磷酸三鈣(β -TCP)作為rhroGF-BB的載體(參見 http: //www.0steohealth.com/GEM21S.aspx)。
[0012]然而，這些載體具有有限的有效性，這是由于當與載體結合時生長因子活性的損失，GF在植入部位無效率的釋放，和/或對蛋白質水解和降解差的防護。例如，生物植入物Infuse?使用I型膠原海綿作為rhBMP-2的載體。rhBMP-2從載體突然釋放，BMP在創傷部位內的半衰期為 I 至 3 天(Winn 等，1998, Adv.Drug Del.Rev.31:303 ；Friess 等，1999，Intl.J.Pharm.，187:91 )。到使骨再生的間充質干細胞已經遷移進入創傷部位的時候，僅裝載的初始量百分比的BMP的一 部分存在以刺激這些細胞制造骨。目前用于確保在這之后的時間內保持有效水平的BMP的解決方案是明顯地增加最初裝載的BMP的量。這些增加的劑量增加并發癥的風險，包括超越移植部位的骨形成、自身免疫應答和可能的癌癥。另外，這急劇地增加了移植的成本。
[0013]因此，本領域中存在對以一定模式釋放生長因子的材料和方法的需求，所述模式最小化需要裝載以實現要求的治療效果的生長因子的量。
[0014]一種策略是在生物可降解的聚合物基體中包封GF，所述生物可降解的聚合物基體以持續的釋放模式釋放GF許多天。例如，BMP已經與聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)組合以產生持續的釋放模式。然而，在PLA或PLGA中引入BMP能使BMP變性，降低其活性，并且難以控制釋放模式以優化生物植入物的有效性。另外，這些載體的降解速率一般使得大量的GF在愈合完成很久后保持封藏。
[0015]另一種策略是將GF直接化學固定到載體上，保持其在移植部位。然而，這也可能導致部分或全部的GF活性的損失，并且限制GF活性使得僅直接與載體接觸的那些細胞能夠與 GF 相互作用并應答(參見 Steinmuller-Nethl, D.等，Biomaterials, 2006, 27:4547-56)，因為效果限于與載體的直接界面處而不遍及創傷部位，這是不期望的。
[0016]實際上，在創傷愈合期間，多重GF在不同的時間以變化的濃度存在于創傷部位和周圍組織中。例如，骨折之后即刻，在受傷部位的血小板最初會在接下來的日子里在骨折部位內隨著蛋白質水平的急劇下降釋放大量的F1DGF (參見Tyndall等，ClinicalOrthopaedics and Related Research, 2003,408:319 - 330)。相反地，BMP-2 在骨折愈合過程的所有階段表達(參見 Rasubala 等，British Journal of Oral and MaxillofacialSurgery, 2003, 41:173 - 178)。估計這些生長因子的濃度在低于外源性GF的治療應用期間所使用的那些的數量級，這是由于濃度與細胞要求的匹配以及多重生長因子的協同效應。產生允許具有多相釋放模式的生長因子的遞送和具有不同的釋放模式的多重生長因子的釋放的系統將允許使用具有GF釋放模式的生物植入物，所述GF釋放模式比目前以突然釋放或持續釋放來釋放單一生長因子的生物植入物更接近地模擬在自然愈合過程中的GF釋放。
[0017]該背景信息是為了使本 申請人:認為的已知信息能夠與本發明相關聯而提供的。既不必意欲承認也不應解釋為任何前述信息構成針對本發明的現有技術。
【發明內容】
[0018]在一個方面，本發明提供一種用于至少一種生長因子在例如治療部位的多相釋放的系統、方法和 試劑盒。為此目的，本發明的系統可以提供為生物植入物等。在一個方面，本發明的方法以最初釋放來遞送至少一種生長因子，隨后以“持續釋放模式”遞送至少一種生長因子。本發明利用一種用于最初釋放的遞送系統和一種用于持續釋放的載體。
[0019]在一個方面，相同的生長因子以最初釋放模式和持續釋放模式進行釋放。在一個方面，釋放不同的生長因子，其中第一生長因子以最初模式釋放，第二生長因子以持續釋放模式釋放。如會被本領域技術人員所知的，認為兩種不同的生長因子以這種不同的方式的釋放更接近地模擬在治療部位自然的生長因子釋放系統。
[0020]根據本發明的一個方面，提供一種提供至少一種生長因子的持續釋放的載體，其與提供至少一種生長因子的最初釋放的遞送載劑組合。載體和遞送載劑的組合產生生長因子的多相釋放模式。
[0021]在優選實施方案中，生長因子(“GF”)是轉化生長因子β (TGFii)總科的成員。在特別優選的實施方案中，生長因子是骨形態發生蛋白(BMP)。
[0022]在本發明的一個方面，載體(“CAR”)由分散在聚合物支架或基體內的磷酸鈣顆粒形成。在一個方面，支架或基體進一步用羥磷灰石包覆。
[0023]在一個實施方案中，至少一種的生長因子以液態施用到鈣顆粒，然后在與聚合物基體組合前被凍干到顆粒上。
[0024]在本發明的另一個方面，載體通過混合一種或更多種磷酸鈣粉末與含有至少一種生長因子的液態溶液以產生磷酸鈣粘合劑來形成。在一個方面，然后粘合劑被研磨成顆粒。
[0025]在優選實施方案中，遞送載劑是反相聚合物。在特別優選的實施方案中，反相聚合物是泊洛沙姆，更具體地是泊洛沙姆407 (也叫做PluronicTMF127)。
[0026]如上文所指出的，在一個方面，載體和遞送載劑適合于釋放相同的生長因子，而在另一個方面，載體和遞送載劑適合于釋放不同的生長因子。在本發明的再一方面，載體和遞送載劑各自適合于釋放兩種或更多種生長因子的組合，其中各自所釋放的組合是相同或不同的。[0027]因此，在一個方面，本發明提供一種用于生長因子在治療部位的多相釋放的系統，所述系統包括:
[0028]-遞送載劑，其包含至少一種第一生長因子；和
[0029]-載體，其包含至少一種第二生長因子；
[0030]-其中:
[0031]-所述遞送載劑適合于在第一時間段以最初釋放模式來釋放至少一種第一生長因子;
[0032]-所述載體適合于在第二時間段以持續釋放模式來釋放至少一種第二生長因子。
[0033]在另一方面，本發明提供一種用于生長因子的多相釋放的方法，所述方法包括:
[0034]-以最初釋放模式來遞送至少一種第一生長因子；
[0035]-以持續釋放模式來遞送至少一種第二生長因子。
[0036]在另外的方面，本發明提供一種用于生長因子的多相遞送的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0037]-遞送載劑組分；
[0038]-與所述遞送載劑相關聯的至少一種第一生長因子；
[0039]-載體組分；和
[0040]-與所述載體相關聯的至少一種第二生長因子。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]現在，將參考【專利附圖】
【附圖說明】本發明，所述附圖在下文進行簡單說明。
[0042]圖1示出了本發明的載體所展現的持續釋放模式。
[0043]圖2示出了本發明的遞送載劑所展現的最初釋放模式。
[0044]圖3示出了基于在遞送載劑和載體中生長因子的量的不同的釋放模式。當生長因子并入遞送載劑和載體兩者中時(50-50 )，觀察多相釋放模式。
[0045]圖4示出了生物植入物的體內活性，其中生長因子根據本發明的方法如圖3中所示進行釋放。
[0046]圖5示出了當根據本發明的方法所制備的生物植入物移植到小鼠中時，新骨(骨)在磷酸鈣顆粒(CaP)上的形成。
[0047]圖6示出了當根據本發明的方法所制備的生物植入物移植到小鼠中時，在載體(載體)上所形成的新骨(骨)的組織學外觀。
[0048]圖7示出了根據本發明的方法所制備的載體所產生的短持續的生長因子釋放模式。
[0049]圖8示出了持續釋放模式如何能夠通過改變根據本發明的方法所制備的載體的性能來進行變化。
【具體實施方式】
[0050]生長因子(GF)在組織的修復和再生中起著必不可少的作用，外源性GF可以用于刺激各種組織和器官的修復。為了使外源性生長因子在刺激修復中有效，它們必須保持在需要修復的部位，并防止失活、隔絕或降解。為此使用載體。然而，生長因子從這些載體的釋放不理想，并且不能容易地改變。本發明基于生長因子從生物植入物的多相釋放增加植入物的功效的發現。
[0051]本發明人已經發展了用于通過改善生長因子在移植部位的釋放動力學或釋放模式同時保持生長因子的活性來增強例如生物植入物的功效的方法和材料。在一個方面，本發明提供一種生長因子遞送系統和方法，包括含有至少一種生長因子的載體，其與也含有至少一種生長因子的遞送載劑組合。由載體和遞送載劑所釋放的至少一種生長因子可以是相同或不同的。
[0052]本發明的系統和方法能用于各種治療和臨床應用，包括骨折修復；骨移植；脊柱融合；以及頭骨、下頜骨和骨缺損的再生。對于這些應用，本發明的系統優選提供在生物植入物上或以生物植入物的形式提供。
[0053]定義
[0054]除非下文另外定義，本文所使用的所有技術與科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的意思。
[0055]如本所所用，術語“生物植入物”是指適合于移植的材料，并且含有外源性生長因子或生物活性因子。如本文進一步討論的，本發明的系統優選通過對生物植入物施加所述物質來使用。然后在對象體內提供生物植入物，其中所述系統以多相釋放模式釋放至少一種生長因子。
[0056]如本文所用，術語“生長因子”是指通過GF與特定細胞表面受體的相互作用來刺激細胞的生長和/或分化的肽和蛋白質。生長因子的實例包括骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子β (TGFi3 )、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)和血管內皮細胞生長因子。在優選實施方案中，生長因子是BMP。
[0057]“重組的”表示由瞬時轉染的、穩定轉染的或轉基因的宿主細胞或者由含有關于所述蛋白質的cDNA的表達結構所指示的動物所產生的蛋白質。術語“重組的”還包括這種多肽的藥物可接受鹽。
[0058]如本文所用，術語“多肽”或“蛋白質”是指氨基酸單體的聚合物，其為通過酰胺鍵連接在一起的α氨基酸。因此，多肽的長度為至少兩個氨基酸殘基，并且通常更長。一般地，術語“肽”是指長度上僅有很少氨基酸殘基的多肽。與肽相反，多肽可以包含任意數量的氨基酸殘基。因此，術語多肽包括肽以及更長的氨基酸序列。
[0059]如本文所用，術語“骨形態發生蛋白”或“骨形態生成蛋白”或“BMP”可相互交換地使用，并且是指生長分化因子的轉化生長因子β (TGFii)總科的骨形態發生蛋白(BMP)亞科的任何成員，包括BMP-2、ΒΜΡ-3 (也稱作成骨素)、BMP_3b (也稱作生長分化因子10，⑶F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也稱作成骨蛋白-1，0P-1)、BMP-8 (也稱作成骨蛋白-2，OP-2)、BMP-9、BMP-10, BMP-1l (也稱作生長分化因子_8，⑶F-8，或者肌肉生長抑制素)、BMP-12 (也稱作生長分化因子_7，GDF-7)、BMP-13 (也稱作生長分化因子6，⑶F-6)、BMP-14 (也稱作生長分化因子5，⑶F-5)和BMP-15。
[0060]術語“骨形態發生蛋白”和“BMP”還包括BMP的等位基因變異體、BMP的功能保守變異體和保持BMP活性的突變BMP。這種變異體和突變體的BMP活性可以通過本領域眾所周知的任何方法(參見下文中測量BMP活性的分析的章節)或如實施例1所說明的進行確定。[0061]在優選實施方案中，BMP是 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8 或 BMP-9。在特別優選的實施方案中，BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7。
[0062]在優選實施方案中，BMP是哺乳動物的BMP (例如哺乳動物的BMP-2或哺乳動物的BMP-7)。在特別優選的實施方案中，BMP是人類的BMP (hBMP)(例如hBMP_2或hBMP_7)。
[0063]如本文所用，術語“支架”是指其目的為提供支持細胞附著、遷移以及向內生長到組織修復部位內的結構的材料。
[0064]如本文所用，術語“載體”是指包含單一或多種組分的材料，并且適合于在一段時間內以“持續釋放”模式在治療部位釋放至少一種生長因子。在一個方面，載體釋放至少一種生長因子的時間段在幾天和幾周之間。優選地，載體適合于在幾周的時間內釋放至少一種生長因子。
[0065]在優選實施方案中，載體也可以用作支架或基體。如上所述，在本發明的一個方面，載體由分散在大孔的聚合物支架或基體內的磷酸鈣顆粒形成。在一個方面，支架或基體進一步包覆有羥磷灰石層。在一個實施方案中，至少一種生長因子以液態施用到鈣顆粒，然后在與聚合物基體組合前被凍干到顆粒上。
[0066]如本文所用，術語“遞送載劑”是指包含或含有至少一種生長因子的材料，并且適合于在一段時間內以最初釋放模式在治療部位釋放至少一種生產因子。在一個方面，形成遞送載劑的材料為凝膠的形式。在一個方面，遞送載劑釋放至少一種生長因子的時間段在幾小時和幾天之間。在本發明的一個優選實施方案中，遞送載劑以持續幾小時時間的“最初釋放”或“最初釋放模式”釋放大部分的至少一種生長因子。優選地，遞送載劑適合于在72小時的時間內釋放至少80%的其中所包含的(與其相關聯的)生長因子。
[0067]在優選實施方案中，遞送載劑是反相聚合物。如本文所用，術語“反相”是指憑借其聚合物進行從液體到凝膠的可逆溫度依賴轉變的性能。在一個方面，轉變溫度在15°C和37°C之間。優選地，轉變溫度在15°C和25°C之間。如本領域技術人員會知道的，“正相”材料隨著溫度降低其粘度增加。相反地，反相材料隨著溫度降低到其轉變溫度以下顯示出粘度降低。
[0068]在特別優選的實施方案中，反相聚合物是泊洛沙姆，更具體地是Pluronic?F127(也叫做泊洛沙姆407)。
[0069]如本文所用，術語“持續釋放”或“持續釋放模式”是指在幾天或幾周的時間內通過載體的至少一種生長因子的釋放，其中在最初時間段內釋放的量相似于或低于移植的幾天或幾周后相同時間段內釋放的量。優選地，持續釋放模式持續至少一周。如本領域技術人員會理解的，一般地，在前三天內以持續釋放模式釋放的生長因子的量會低于在隨后七天內釋放的量。
[0070]如本文所用，術語“最初釋放”或“最初釋放模式”是指通過遞送載劑的大量的至少一種生長因子的最初釋放，然后在幾小時或幾天的時間段內釋放逐漸降低的量。在一個方面，最初釋放模式導致在大致72小時的時間內至少80%的裝載的生長因子的遞送。最初釋放模式圖示于圖2中。
[0071]如本文所用，術語“多相釋放”是指在最初釋放時間段內至少一種生長因子的最初釋放，然后在第二時間段內至少一種生長因子的“持續”釋放。優選地，最初時間段是大致幾個小時，第二時間段是大致幾天到幾周。這種釋放模式還可以稱為“雙相釋放”，這是由于其在兩個階段進行。在優選實施方案中，最初釋放由本發明的遞送系統提供，“持續”釋放由本發明的載體提供。
[0072]在本發明的一個方面，遞送載劑組分包含總量的至少10%并不超過50%的由本發明的系統遞送的生長因子，載體組分包含總量的至少50%的由所述系統遞送的生長因子。
[0073]測暈BMP活性的分析
[0074]對重組的BMP的體外和體內功能進行表征的分析在本領域是眾所周知的(參見例如美國專利4，761,471號；美國專利4，789，732號；美國專利4，795, 804號；美國專利4，877，864號；美國專利5，013，649號；美國專利5，166,058號；美國專利5，618，924號；美國專利5,631, 142號；美國專利6，150，328號；美國專利6，593，109號；Clokie和Urist,Plast.Reconstr.Surg.2000 ；105:628-637 ;Kirsch等，EMBO J2000 ；19:3314-3324 ；Vallejo 等，J.Biotech.2002 ；94: 185-194 ；Peel 等，J.Craniofacial.Surg.2003 ； 14:284-291 ；以及 Hu 等，Growth Factors, 2004 ；22:29-33)。
[0075]這種分析包括:對移植(例如植入后腿及臀部肌肉或胸的區域)入嚙齒動物(例如大鼠或小鼠)后BMP的骨誘導活性進行定量的體內分析(參見例如美國專利4，761,471號；美國專利4，789，732號；美國專利4，795，804號；美國專利4，877，864號；美國專利5，013，649號；美國專利5，166,058號；美國專利5，618，924號；美國專利5,631, 142號；美國專利 6，150，328 號；美國專利 6，503，109 ；Kawai 和 Urist.,Clin.0rthop.Relat.Res.，1988 ；222:262-267 ;Clokie 和 Urist, Plast.Reconstr.Surg.2000 ；105:628-637 ;以及 Hu等，Growth Factors, 2004 ；22:29-33);對再生哺乳動物中頭骨環鋸缺損的BMP活性進行定量的體內分析(例如大鼠、狗或猴)(參見例如美國專利4，761，471號和美國專利4，789，732號)；對誘導體外培養的軟骨細胞增殖的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如美國專利4，795，804號)；對誘導體外培養的肌肉細胞(例如C2C12細胞，ATCC編號CRL-1772)或骨髓基質細胞(例如鼠的W-20細胞，ATCC編號CRL-2623)中堿性磷酸酶活性的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如美國專利6, 593, 109號；Ruppert等，Eur J Biocheml996 ；237:295-302 ；Kirsch 等，EM`BO J，2000 ；19:3314-3324 ;Vallejo 等，J Biotech,2002；94:185-194 ;Peel 等,J Craniofacial Surg., 2003 ； 14:284-291 ;以及Hu等,Growth Factors,2004 ；22:29-33);對誘導培養的間質祖細胞系(例如鼠的C3H10T1-2細胞)中FGF-受體2(FGFR3)表達的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如Vallejo等，J Biotech2002 ；94:185-194);對誘導雞枝芽細胞中蛋白多糖合成的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如Ruppert等，Eur J Biocheml996 ；237:295-302);以及對誘導骨髓基質細胞(例如鼠的W-20細胞；ATCC編號CRL-2623)中骨鈣素治療的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如美國專利 6，593，109 號)。
[0076]測暈BMP結合與釋放的分析
[0077]各種分析可以用于測量來自載體的重組BMP的結合與釋放。例如，重組BMP蛋白質的量可以通過本領域中眾所周知的任何技術進行定量，包括斑點印跡、免疫分析(例如酶聯免疫吸附分析，ELISA)、當生物植入物包含放射標記的BMP時釋放緩沖劑中出現的放射性增加的測量以及色譜法(例如高壓液相色譜、HPLC和離子交換色譜)。
[0078]這類方法在本領域中是眾所周知的(參見例如Harlow和Lane，UsingAntibodies:A Laboratory Manual,冷泉港實驗室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press).1999 ;Gosling 編著，Immunoassays:A Practical Approach,牛津大學出版社(Oxford University Press).2000 ;01iver 編著，HPLC of Macromolecules:A Practical Approach.,牛津大學出版社，1998 ；Millner 編著，High ResolutionChromatography:A Practical Approach.牛津大學出版社，I999 ;Hockf ield 等，SelectedMethods for Antibody and Nucleic Acid Probes.冷泉港實驗室出版社.1993 ；Gore 編著，Spectrophotometry and Spectrofluorimetry:A Practical Approach.牛津大學出版社，2000)。
[0079]例如已經描述了 BMP蛋白質的放射免疫實驗分析的方案(參見例如美國專利4，857，456號)。例如已經描述了 BMP蛋白質的免疫印跡分析的方案(參見例如Wang等，ProcNatl Acad Sci USA1990 ;87:2220_2224)。例如用于人類、大鼠或小鼠BMP-2的蛋白質水平的定量的ELISA試劑盒是可以商業購買的，例如從R&D Systems(目錄#DBP200、roBP200或SBP200)。例如用于人類BMP-7的蛋白質水平的定量的ELISA試劑盒是可以商業購買的，例如從 R&D Systems (目錄#DY354 或 DY354E)。
_0] 試劑盒
[0081]在一個方面，本發明提供一種用于包含本文所描述系統的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含用于制造遞送載劑和載體以及所需的生長因子的必需組分。即本發明的試劑盒會包含用于制造遞送載劑和載體以及與遞送載劑相關聯的至少一種生長因子和與載體相關聯的至少一種生長因子的必需組分。
[0082]優選地，遞送載劑和相關聯的生長因子保持在分開的容器中，待在使用時組合。這在遞送載劑可以包括液體或凝膠的情況下會是特別優選的。在這種情況下，相關聯的生長因子可以以凍干粉末保持在分開的容器中。在使用時，粉末形式的生長因子可以與液體或凝膠遞送載劑組合。
[0083]試劑盒優選地包含·另外的包含載體的容器，相關聯的生長因子可以裝載或包覆到所述載體上。在一個實施方案中，載體材料還可以保持與相關聯的生長因子分開。
[0084]在一個優選的實施方案中，本發明的試劑盒會包含至少三個容器用于以下的每一個:1)遞送載劑組分；2)至少一種第一生長因子(即與遞送載劑相關聯的生長因子)；和3)載體和至少一種第二生長因子(即與載體相關聯的生長因子)。使用時，粉末形式的至少一種第二生長因子與液體或凝膠形式的遞送載劑組合，然后混合物施用到載體，至少一種第二生長因子預裝載到所述載體上。
[0085]在一個方面，本發明的試劑盒根據可能的需要可以包含任何必需的試劑和/或說明書和/或器皿。
[0086]實施例
[0087]現在，將通過以下實施例說明本發明。這些實施例說明了本發明人的新發現，即生長因子例如rhBMP-2的多相釋放模式比僅產生突然釋放或持續釋放的載體更有效，所述多相釋放模式通過在以持續釋放來釋放BMP的載體內裝載部分的BMP和在以最初釋放來釋放BMP的遞送載劑內裝載部分的BMP而產生。
[0088]如會對本領域技術人員明顯的，能夠在載體內放置一種生長因子，在遞送載劑內放置不同的生長因子，產生各生長因子不同的釋放模式。
[0089]將會理解，本文所提供的實施例僅意欲說明本發明，并不以任何方式限制本發明的范圍。同樣地，本發明不限于本文所描述的任何特別優選的實施方案。事實上，在閱讀本說明書后，本發明的許多修改和變化對本領域技術人員可以是明顯的。因此，本發明僅受所附的權利要求以及權利要求享有權利的等同物的完整范圍限制。
[0090]實施例1:通過在PLGA中包封制造含有BMP的持續釋放復合載體
[0091]該實施例示范如何形成含有rhBMP-2的載體，其以持續釋放模式釋放生長因子。
[0092]材料和方法
[0093]本征粘度為1.33dL/g 的 PLGA75/25 (MW=)購自 Birmingham Polymers Inc.(伯明翰，AL)。憐酸四鈣(TTCP)從 Taihei Chemical Industrial C0.(大阪，日本)獲得，無水憐酸二鈣(DCPA)和二甲亞諷(DMSO)從Taihei Chemical Industrial C0.(MO, USA)獲得。糖顆粒購自 Tate&Lyle North America Inc.(多倫多，加拿大)。
[0094]可再吸收的磷酸鈣顆粒通過在100%的相對濕度混合等摩爾的TTCP和DCPA與去離子蒸懼水(ddH20) 24小時進行制備。反應物進行研磨并通過45 y m的篩進行篩分。
[0095]重組的人類BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制緩沖劑(1.5mg/ml， pH4.5 ;5mm谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%鹿糖和0.01%Tween?80與ddH20)中進行制備。蛋白質溶液被添加到含有CaP粉末的小瓶中，并攪拌至少15分鐘。然后，粉末進行冷凍并凍干。
[0096]然后，具有(CaP-BMP)或沒有(CaP)BMP的顆粒用于通過如下的相轉化/顆粒浙濾來制造CaP顆粒-PLGA支架塊:將PLGA以11.5% (w/v)的濃度溶于DMSO。CaP和CaP-BMP 顆粒按照2:1的CaP/PLGA比例(w/w)徹底混合入該溶液。尺寸范圍為0.85至1.18mm的糖晶體分散于CaP/PLGA中，混合物在_18°C下在模具中進行固化。PLGA沉淀，糖晶體通過三次更換ddH20浸洗來濾出。
[0097]—層羥磷灰石如下沉積到大孔復合支架上并遍及大孔復合支架:干燥的PLGA/ CaP圓柱，測量直徑2mm和長2mm，在70%的乙醇中預濕潤，并在37°C下浸入60ml的3XSBF 中9天時間。SBF如下制備:在劇烈攪拌下，向1.8L的ddH20中依次加入以下鹽:29.711g NaCl, 2.206g CaCl2_2H20，IOmllM HCl, 0.852Na2HP04。最終體積達到 2L。每天更換 SBF 溶液。包覆之后，3PCC樣品在ddH20中進行漂洗，并空氣干燥。
[0098]這導致形成能夠在至少七天內以持續釋放模式釋放rhBMP-2的大孔復合載體 (3PS)。這些結果圖示于圖1中。
[0099]實施例2:通過在磷酸鈣粘合劑中包封制造含有BMP的持續釋放載體
[0100]本實施例示范如何形成具有持續釋放模式的包含rhBMP-2的磷酸鈣粘合劑(CPC) 載體。
[0101]材料和方法
[0102]磷酸四鈣(TTCP)從Taihei Chemical Industrial C0.(大阪，日本)獲得,無水磷酸二IiiKDCPA)從Sigma Chemical Co獲得。大孔雙相磷酸|丐顆粒(Eclipse)購自Citagenix (Laval Qc,加拿大)。重組的人類 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制緩沖劑 (1.5mg/ml,pH4.5 ；5mm 谷氛酸，2.5% 甘氛酸,0.5% 鹿糖和 0.01%Tween?80 與 ddH20)中進行制備。
[0103]可再吸收的磷酸鈣粘合劑顆粒通過混合等摩爾的TTCP和DCPA與rhBMP-2溶液來制備。反應物進行研磨，并通過300和100 u m的篩進行篩分，保留在100和300 u m之間的顆粒。[0104]這導致形成rhBMP-2并入其中的磷酸鈣粘合劑載體顆粒。在移植入動物中后，BMP 在至少幾周的時間內以持續的方式進行釋放。[0105]為了生成也用作大孔支架的基于CPC的持續釋放載體，CPC顆粒(0.1至0.3mm)與大孔磷酸鈣顆粒(1至2mm)以1:1的比例(w/w)進行混合。_6] 實施例3:通過使用結合BMP的涂層制造含有BMP的持續釋放載體[0107]本實施例示范如何通過應用結合BMP的涂層來形成具有持續釋放模式的載體。一個這樣的方法是如在我們的共同待決的申請號美國申請13/002，444號(其全部內容通過引用并入本文)中所述的用抗體或結合BMP的蛋白包覆支架。[0108]材料和方法[0109]純凈的多克隆兔抗人類BMP-2抗體購自Cell Sciences (Canton MA.,目錄 #PA0025)o 大孔雙相磷酸|丐(BCP)顆粒(Eclipse)購自 Citagenix (Laval, Qc,加拿大)。[0110]在生物安全柜中稱出無菌BCP顆粒，并置于無菌TPP管(Mandel Scientific, Guelph 0N，加拿大)中。抗體溶液在磷酸鹽緩沖的鹽水中稀釋至最終濃度為Iml PBS中150、 300和600ng抗體,過濾滅菌,并以l:lv/v的比例應用到支架。在進行冷凍和凍干前，樣品在室溫下攪拌至少15分鐘。然后，BMP溶液應用到顆粒，允許在室溫下浸15分鐘，然后進行冷凍和再凍干。[0111]這導致形成覆蓋有結合并以持續方式緩慢釋放rhBMP-2的抗體的BCP顆粒。[0112]能夠結合的rhBMP-2的量能通過增加所用抗體的量來增加。釋放的速率能夠通過使用具有更低的親和性和親和力的抗體來增加。[0113]實施例4:俥用F127牛產含BMP的遞送載劑[0114]本實施例示范如何使用F127制備含有rhBMP-2的遞送載劑。[0115]材料和方法[0116]泊洛沙姆如下進行制備:100ml的蒸餾水冷卻到4°C，隨著攪拌在幾個小時的時間內緩慢添加各種量的泊洛沙姆407，直到所有固體顆粒都溶解，使最終溶液在12和33%之間。然后，泊洛沙姆溶液在高壓釜中進行滅菌(121°C，20分鐘，30psi )。在滅菌后，泊洛沙姆溶液在4°C下保存直到使用。[0117]凍干的重組人類BMP-2粉末(rhBMP-2, Induce Biologies Inc)添加到泊洛沙姆溶液，并緩慢地混合。[0118]或者，rhBMP-2以 1/10 或 1/20 的比例(v/v)從溶液(lmg/ml, pH4.5 ;5mm 谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%蔗糖和0.01%吐溫80)添加。[0119]這導致形成在前兩天釋放超過80%的rhBMP-2的遞送載劑(如圖2中所示)。[0120]實施例5:具有多相釋放模式的生物植入物的生產[0121]本實施例示范如何形成以多相釋放模式來釋放rhBMP-2的含有rhBMP-2的 3PS-F127生物植入物。[0122]材料和方法[0123]制備每5mg載體含有0、4.55或9.1 y g的rhBMP-2的3PS載體(如實施例1所述)， 并儲存于Eppendorf管中。在45.5 的F127中含有0、4.55或9.1 y g的rhBMP-2的遞送載劑(如實施例4所述制備的)在4°C儲存于Eppendorf管中。緊接著使用之前，F127移液到3PS載體上，并且載體混合到遞送載劑中。[0124]然后，該3PS-F127生物植入物如下文所述用于測量體外BMP釋放以及體內骨形成活性。
[0125]載體與遞送載劑的比例能夠變化以產生凝膠(1:1比例v:v)或油灰(2:1比例 v:v)0另外，BMP與載體的比例或載體的顆粒尺寸能夠變化以改變持續釋放模式。最終，載體和遞送載劑中rhBMP-2的量能夠變化以改變與之后幾周釋放的量相比在前幾個小時最初釋放的rhBMP-2的量。
[0126]實施例6:來自牛物棺入物的BMP釋放的體外分析。
[0127]本實施例描述了如何測量來自實施例1至5中所述的各種生物植入物的rhBMP-2 的釋放。
[0128]材料&方法
[0129]如實施例1至5中所制備的含有已知量的rhBMP-2的生物植入物轉移到 Eppendorf管。所用的rhBMP-2的總量為相對于每5mg載體以及45.5 的F127的9.1 y g 的rhBMP-2，或者相對于每IOmg載體以及100 U I的F127的20 y g的rhBMP-2。
[0130]然后，樣品在37°C在攪拌下利用Iml包含磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)+1%BSA的釋放緩沖溶液進行培養。在不同時期(例如1、2、5、7和10天)后，緩沖劑被移除，并替換為新鮮的釋放緩沖劑，并且收集的溶液在_20°C下儲存于1.5ml的小瓶中用于進一步的分析。
[0131]使用商業的ELISA (Quantikine?hBMP-2ELISA, RnD Systems)測量釋放到緩沖劑中的BMP-2的量。ELISA根 據制造商的說明來實施。
[0132]益果
[0133]在從任何未裝載BMP的生物植入物中所收集的釋放緩沖劑中沒有可以檢測到的 BMP。已經裝載rhBMP-2的載體樣品證實在研究期間持續釋放rhBMP-2，而單獨的遞送載劑中的樣品以“最初釋放模式”進行釋放。
[0134]當載體和遞送載劑組合時，根據BMP裝載入的組分獲得各種釋放模式。當100%的 rhBMP-2 (9.1iig)裝載在之后與33%的F127 (45.5 yl)混合的3PS (5mg)載體內時，BMP 釋放模式與持續形式匹配，其中在前兩天釋放的BMP的量為5ng，在3天和5天之間其為 8ng，在5天和7天之間其為IOng (圖3 ; 100-0)。
[0135]當100%的rhBMP-2 (9.1 u g)裝載在33%的F127 (45.5 yl)內，然后與其中沒有 BMP的3PS載體(5mg)混合時，BMP被釋放，其中釋放的BMP的量在第一天為2363ng，在第二天為381ng，然后在第三天為12ng (圖3 ;0_100)。
[0136]當BMP分布在載體和遞送載劑之間時，生物植入物證實雙相釋放模式，其中在中等最初釋放之后是BMP的持續釋放(圖3 ;50-50)。
[0137]實施例7:測試釋放的BMP的活性的體外分析。
[0138]本實施例描述了如何確定從生物植入物釋放的rhBMP-2是否保持其活性。為了證實釋放的rhBMP是生物活性的，應答細胞可以利用釋放物來培養，并測量其對生長因子的應答。這種分析在本領域中是已知的(參見Peel等，J.Craniofac.Surg.2003,14: 284-291)。
[0139]材料&方法
[0140]制備如實施例1至5中所述的具有或沒有rhBMP-2的材料。釋放物如實施例3中所述進行制備，除了緩沖劑是a最小必需培養基與15%的胎牛血清和抗體(a MEM+15%FBS+AB)0
[0141]C2C12細胞以0.5X IO5細胞/ml、lml a MEM+15%FBS每孔接種到24孔組織培養板中。在24和72小時之間的各種時期后，除去培養基并應用各種釋放物。陰性對照包括利用新鮮的a MEM+15%FBS+AB培養的C2C12細胞。陽性對照包括利用含有25、50和IOOng/ ml的rhBMP-2的a MEM+15%FBS+AB培養的C2C12細胞。48小時后，細胞在Iml細胞溶解緩沖劑(Cellytic Sigma Aldrich)中溶解,使用對硝基苯酹磷酸酯分析物(Sigma Aldrich) 測量細胞溶解物的堿性磷酸酶(ALP)活性。溶解物的細胞蛋白含量使用Coomassie Plus Reagent (Fisher)進行測量,并用于使ALP活性對每孔的細胞數歸一化。
[0142]一般地，為了確定是否在與載體或遞送載劑相結合時已經有BMP活性的任何損失，確定未與載體或遞送載劑相結合的rhBMP-2標準物的ALP/PTN結果的標準活性曲線。釋放物中活性rhBMP-2的濃度可以從該標準曲線進行確定，其表達為如通過ELISA測定的釋放物中存在的rhBMP-2總量的百分比。
[0143]實施例8:多相BMP植入物的骨誘導活性的評價
[0144]本實施例描述了如何體內測定含有BMP的生物植入物的骨誘導活性。為了評價生物植入物誘導骨形成的活性，使用小鼠肌肉囊分析。在該模型中，生物植入物置于在小鼠后肢中制造的肌肉囊中，形成的誘導骨的尺寸與試驗的BMP的量成比例。這種分析在本領域是已知的(參見如 Barr 等，Oral Surg.0ral Med.0ral Pathol.0ral Radiol.Endod., 2010 ；109:531-40)。
[0145]材料和方法
[0146]生物植入物如實施例1和5中所述進行制備。在麻醉下，在37至42天的雄性⑶_1 小鼠的后肢的大腿肌肉中通過鈍器解剖制造雙側的囊。然后，生物植入物置入已經置入肌肉囊的無菌膠囊中。將肌肉拉到一起，用Mitchel夾使皮膚閉合。
[0147]動物在術后第28天進行安樂死。收獲后肢，并用10%緩沖的福爾馬林進行固定。 固定之后,試樣使用微 CT 掃描儀(General Electric Healthcare eXplore?Locus SP)進行成像。掃描樣品，并使用制造商軟件在59 的分辨率下重構。圖像重構之后，確定感興趣的區域(R0I)。該區域包括含有生物植入物誘導的骨的所有區域。根據位置和密度這些可以簡單地與骨骼骨進行區分。
[0148]為了分析ROI內的骨的數量和質量，mCT圖像的體素區分為骨和非骨的相。區分通過確定體素灰度的閾值來實現，在所述閾值體素視為骨。對每個樣品測定ROI的總體積 (TV)、骨體積(BV)、總體積的礦物密度(TV-MD )、骨體積的礦物密度(BV-MD )、總體積的礦物含量(TV-MC)、骨體積的礦物含量(BV-MC)和骨體積分數(BVF)。對于由于載體引起的鈣的存在，通過使用僅選擇載體的上閾值并將其從使用包括載體加新骨的下閾值獲得的數值中扣除來調整數值(參見 Humber 等，Oral Surgery、Oral Medicine、Oral Pathology、Oral Radiology 和 Endodontology.2010.109:372_384)。
[0149]在微CT分析完成之后，試樣或者嵌入spurs樹脂，或者在甲酸中脫鈣并嵌入蠟中。 嵌入樹脂的樣品通過背散射SEM進行評價，而嵌入蠟的樣品進行切割并利用蘇木精和曙紅 (H&E)進行染色，并通過光學顯微鏡進行檢查，以評價移植部位存在的組織類型。
[0150]益果
[0151]載體和遞送載劑如實施例5所述進行組合。[0152]微CT分析顯示，所有BMP都在3PS載體內的生物植入物產生最小的骨的小骨，所述生物植入物具有持續BMP釋放模式(圖4:100-0)，所有BMP都在F127遞送載劑內的生物植入物產生中等尺寸的小骨，所述生物植入物具有突然的BMP釋放模式(圖4:0-100)，而 50%BMP裝載入載體并且50%裝載入遞送載劑的生物植入物產生最大的骨的小骨，所述生物植入物具有多相BMP釋放模式(圖4:50-50)。
[0153]背散射SEM顯示，到28天時骨遍及生物植入物形成以及形成到已經并入PLGA的磷酸鈣顆粒上(圖5)。組織學確認所形成的組織是骨(圖6)。
[0154]實施例9:來自生物植入物的BMP釋放的活體分析
[0155]本實施例描述了如何測量移植后從實施例1、2、3、4或5中所述的各種生物植入物到動物中的rhBMP-2的釋放。做到此的方法在本領域是眾所周知的。例如參見Uludag等， J Biomed Mater Res，46，193 - 202，1999。
[0156]材料&方法
[0157]重組的hBMP-2通過珀金埃爾默(Perkin Elmer)用碘125 (1-125)進行放射性標記。放射性標記的rhBMP-2 (強放射性的)與未標記的rhBMP-2 (無放射性的)混合，以產生 I: 100的強放射性的無放射性的混合物。
[0158]含有已知量的rhBMP-2的生物植入物如實施例1至5中進行制備。然后，這些生物植入物如實施例8中所述移植到動物中。在各個時間段，犧牲動物并切出植入物部位。然后對切出的組織稱重，放射性的量使用Y計數器進行測定。
[0159]為了確定計數是否與蛋白質相關，組織在0.5ml PBS+0.5%BSA中均勻化。兩ml冰冷的10%三氯乙酸加入勻漿中，然后在4°C保持至少I小時。然后，離心勻漿，并移除上層清液。然后，沉淀物的放射性使用Y計數器進行測量。
[0160]與植入物相關的放射性對衰減進行校正，估計保持在植入物中的BMP的總量。
[0161]實施例10:具有短持續釋放模式的載體的生產
`[0162]本實施例描述了生產以短持續釋放模式來釋放生長因子的載體的手段。
[0163]材料&方法
[0164]大孔雙相磷酸鈣(BCP)顆粒(Eclipse)購自Citagenix (Laval, Qc,加拿大)。重組的人類 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制緩沖劑(1.5mg/ml, pH4.5 ;5mm 谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%蔗糖和0.01%Tween?80與ddH20)中進行制備。
[0165]無菌的rhBMP-2溶液在搖動下以9.1 ii g每5mg或4.55 ii g每5mg (BMP每BCP) 的比例利用無菌BCP顆粒培養15分鐘。然后，樣品進行冷凍并無菌凍干。
[0166]凍干之后,載體稱為5mg的等分部分,并置于無菌的epindorf管中。一些管具有 33%的F127 (添加了 45.5 yl)。然后，BMP釋放模式如實施例6中所述進行測定。
[0167]MS
[0168]未用F127包覆的載體(BCP)顯示突然釋放模式，其中在第一天釋放大量BMP，然后在每一之后的時間點釋放減少量的BMP。在F127內混合BCP (BCP-Pol)產生短期的持續釋放模式，其中在前四天每天收集到相似量的BMP (圖7)。
[0169]實施例11:改變載體的持續釋放模式
[0170]本實施例描述改變載體的釋放模式的手段。
[0171]材料&方法[0172]具有不同本征粘度和分子量的PLGA購自Birmingham Polymers Inc.(Birmingham, AL)。然后,載體如實施例1所述使用這些PLGA來制造。這些載體的BMP釋放模式根據實施例6的方法進行測定。
[0173]結果
[0174]所有載體產生持續釋放模式。然而，釋放的BMP的量根據所用PLGA的粘度/分子量而不同。以低粘度PLGA(Pol-1)制造的載體在研究期間的12周內比使用高粘度(Pol-2) PLGA的那些釋放更多的rhBMP-2 (圖8)。
【權利要求】
1.一種用于生長因子在治療部位的多相釋放的系統，所述系統包括: -遞送載劑，其包含至少一種第一生長因子；和 -載體，其包含至少一種第二生長因子； -其中: -所述遞送載劑適合于在第一時間段以最初釋放模式釋放所述至少一種第一生長因子; -所述載體適合于在第二時間段以持續釋放模式釋放所述至少一種第二生長因子。
2.根據權利要求1所述的系統，其中所述遞送載劑包括聚合物。
3.根據權利要求2所述的系統，其中所述聚合物是反相聚合物或嵌段共聚物。
4.根據權利要求3所述的系統，其中所述聚合物是泊洛沙姆。
5.根據權利要求4所述的系統，其中所述聚合物是泊洛沙姆407。
6.根據權利要求1所述的系統，其中所述載體包括分散在聚合物基體內的多個顆粒，并且其中所述顆粒在其表面上含有所述至少一種第二生長因子。
7.根據權利要求6所述的系統，其中所述顆粒包括磷酸鈣顆粒。
8.根據權利要求6或7所述的系統，其中所述聚合物基體包括聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的系統，其中所述第一時間段包括數小時或數天。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的系統，其中所述第二時間段包括數天或數周。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的系統，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是相同的。
12.根據權利要求1至10中任一項所述的系統，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是不同的。
13.根據權利要求1至12中任一項所述的系統，其中所述第一和第二生長因子是轉化生長因子β總科的生長因子。
14.根據權利要求13所述的系統，其中所述第一和第二生長因子是:骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子β、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或血管內皮細胞生長因子(VEGF)。
15.根據權利要求14所述的系統，其中所述至少一種第一和第二生長因子是BMP。
16.根據權利要求15所述的系統，其中所述至少一種第一和第二生長因子是BMP-2或BMP-7。
17.根據權利要求1至16中任一項所述的系統，其中所述遞送載劑遞送總量的至少10%的所述生長因子，所述載體遞送總量的至少50%的所述生長因子。
18.一種包括根據權利要求1至17中任一項所述的生長因子釋放系統的生物植入物。
19.一種生長因子的多相釋放的方法，所述方法包括: -以最初釋放模式遞送至少一種第一生長因子； -以持續釋放模式遞送至少一種第二生長因子。
20.根據權 利要求19所述的方法，其中所述至少一種第一生長因子由遞送載劑遞送，所述至少一種第二生長因子由載體遞送。
21.根據權利要求19或20所述的方法，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是相同的。
22.根據權利要求19至21中任一項所述的方法，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是不同的。
23.根據權利要求19至22中任一項所述的方法，其中所述至少一種第一和第二生長因子是轉化生長因子β總科的生長因子。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述至少一種第一和第二生長因子是:骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子β、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或血管內皮細胞生長因子(VEGF)。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述至少一種第一和第二生長因子是BMP。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述至少一種第一和第二生長因子是BMP-2或BMP-7。
27.根據權利要求18至26中任一項所述的方法，其中所述遞送載劑遞送總量的至少10%的所述生長因子，所述載體遞送總量的至少50%的所述生長因子。
28.一種用于生長因子的多相遞送的試劑盒，所述試劑盒包括: -遞送載劑組分； -與所述遞送載劑相關聯的至少一種第一生長因子； -載體組分；和 -與所述載體相關聯的至少一種第二生長因子。
29.根據權利要求28所述的試劑盒，其中所述遞送載劑和所述載體組分在分開的容器中。
30.根據權利要求29所述的試劑盒，其中所述遞送載劑和所述至少一種第一生長因子提供在分開的容器中。
31.根據權利要求28至30所述的試劑盒，其中所述載體和所述至少一種第二生長因子在單個容器中組合，并且其中所述至少一種第二生長因子裝載或包覆在所述載體組分上。
32.根據權利要求28至31中任一項所述的試劑盒，其中所述遞送載劑包括聚合物。
33.根據權利要求32所述的試劑盒，其中所述聚合物是反相聚合物或嵌段共聚物。
34.根據權利要求33所述的試劑盒，其中所述聚合物是泊洛沙姆。
35.根據權利要求34所述的試劑盒，其中所述聚合物是泊洛沙姆407。
36.根據權利要求28所述的試劑盒，其中所述載體包括分散在聚合物基體內的多個顆粒，并且其中所述顆粒含有在其表面上的所述至少一種第二生長因子。
37.根據權利要求36所述的試劑盒，其中所述顆粒包括磷酸鈣顆粒。
38.根據權利要求36或37所述的試劑盒，其中所述聚合物基體包括聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)。
39.根據權利要求28至38中任一項所述的試劑盒，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是相同的。
40.根據權利要求28至38中任一項所述的試劑盒，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是不同的。
41.根據權利要求28至40中任一項所述的試劑盒，其中所述第一和第二生長因子是轉化生長因子β總科的生長因子。
42.根據權利要求41所述的試劑盒，其中所述第一和第二生長因子是:骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子β、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或血管內皮細胞生長因子(VEGF)。
43.根據權利要求42所述的試劑盒，其中所述第一和第二生長因子是BMP。
44.根據權利要求43所述的試劑盒，其中所述第一和第二生長因子是BMP-2或BMP-7。
45.根據權利要求28至44中任一項所述的試劑盒，其中所述至少一種第一生長因子包括總量的至少10%的提供于所述試劑盒中的生長因子，所述至少一種第二生長因子包括總量的至少50%的提供于所述試 劑盒中的生長因子。
【文檔編號】A61K38/18GK103596553SQ201280017716
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年4月11日 優先權日:2011年4月11日
【發明者】卡梅隆·M·L·克洛基, 肖恩·A·F·皮 申請人:感應生物制品股份有限公司
【專利摘要】一種用于至少一種生長因子在治療部位的多相遞送的系統，包括用于以最初釋放模式來釋放至少一種生長因子的遞送載劑，和用于以持續釋放模式來釋放至少一種生長因子的載體。最初釋放模式在數小時至數天的時間內釋放至少一種生長因子，其中所述生長因子最初大量釋放，剩余物以逐漸降低的量釋放。持續釋放模式在數天至數周的時間內釋放至少一種生長因子，其中所述生長因子在這樣的時間段內以通常恒定的量進行釋放。本發明的系統特別適合于對生物植入物的應用。本發明還包括用于至少一種生長因子的多相遞送的方法和試劑盒。
【專利說明】用于生長因子的多相釋放的系統和方法
[0001]在先申請的交叉引用
[0002]該申請根據巴黎公約要求2011年4月11日提交的美國申請61/474，049號的優先權,其全部內容通過引用并入本文。
【技術領域】
[0003]本發明涉及用于釋放生物物質的系統和方法。具體地，本發明涉及與生物植入物相關的生長因子的釋放。更具體地，本發明提供一種用于產生至少一種生長因子的多相釋放模式以改善生物植入物的性能的系統和方法。
【背景技術】
[0004]生長因子(GF)是通過GF與特定細胞表面受體的相互作用來刺激細胞的生長和/或分化的肽和蛋白質。生長因子在組織的修復和再生中起著必不可少的作用，GF的外源性應用可以用于刺激各種組織和器官的修復，所述組織和器官包括骨、軟骨、皮膚和粘膜，以及用于通過在修復部位的血管再生的刺激增強組織的修復。[0005]哺乳動物中分泌的生長和分化因子的轉化生長因子β (TGF β )總科有超過30個成員。這些二聚蛋白質的特征在于保守的七胱氨酸結基結構。它們調節許多細胞種類的增殖、分化和遷移，并在形態發生、器官發生、組織維護和創傷愈合方面具有重要作用。生長因子的TGFii總科可以細分為幾個亞科，包括轉化生長因子β亞科、骨形態發生蛋白(BMP)和生長分化因子(⑶F)科(也叫做BMP亞科)，以及抑制素和激活素亞科。
[0006]TGF β總科的BMP亞科包含至少二十種蛋白質，包括ΒΜΡ_2、ΒΜΡ-3 (也稱作成骨素)、BMP-3b (也稱作生長分化因子10，ffl)F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也稱作成骨蛋白-1，0Ρ-1)、ΒΜΡ-8 (也稱作成骨蛋白-2，OP-2)、BMP-9、BMP-10、BMP-1I (也稱作生長分化因子_8，⑶F-8，或者肌肉生長抑制素)、BMP-12 (也稱作生長分化因子_7，OTF-7)、BMP_13(也稱作生長分化因子6，⑶F-6)、BMP-14 (也稱作生長分化因子5，⑶F-5)和BMP-15 (關于綜述，參見例如 Azari 等，Expert Opin Invest Drugs2001 ; 10:1677-1686)。
[0007]BMP已經顯示出在成軟骨細胞中刺激基質合成；在成骨細胞中刺激堿性磷酸酶活性和膠原蛋白合成，誘導早期間質祖細胞分化為成骨細胞(骨誘導)，調節單核細胞和間質細胞的趨化性，以及調節神經細胞的分化(關于綜述，參見例如Azari等，Expert OpinInvest Drugs2001 ；10: 1677-1686 和 Hoffman 等，Appl.Microbiol.Biotech2001 ；57:294-308)。
[0008]BMP蛋白質的許多功能之一是在脊椎動物中誘導軟骨、骨和結締組織的形成。BMP總科的最具有骨誘導能力的成員是BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8和BMP-9 (參見例如Hoffman等，Appl.Microbiol.Biotech2001 ;57_294_308 ;Yeh等,J Cellular Biochem.，2005:95-173-188 ;和 Boden，0rthopaedicNursing2005, 24:49_52)。已經長期認為 BMP 的該骨誘導的能力對于各種治療和臨床應用非常有希望，所述治療和臨床應用包括骨折修復；脊柱融合；骨骼疾病的治療，頭骨、下頜骨和骨缺損的再生；以及在口腔和牙科應用中，例如在牙周創傷再生期間的牙齒發生和牙骨質發生中，拔牙窩移植、牙槽嵴增高和上頜竇增高。目前，由美敦力(Medtronic)以INFUSE?銷售的重組人類BMP-2被FDA批準用于脊柱融合手術，用于骨折不愈合的修復以及用于口腔手術，而由史賽克(Stryker)以OP-1?銷售的重組人類BMP-7被批準作為頑固的長骨不愈合中自體移植的替代，以及用于翻修后外側腰椎融合，其中自體移植和骨髓收獲是不可行的，或者預期不會促進融合。
[0009]已經外源地用于增強骨修復的其他重組生長因子包括各種TGFP (參見Clokie&Bell, J.Craniofacial Surg.2003，14:268_77)、成纖維細胞生長因子總科(FGF)的成員(參見 Kawaguchi 等，(2007) J.0rthopaedic Res.25 (4):480_487)、血小板衍生的生長因子總科(PDGF)的成員(參見Hollinger等，2008JBJS90 (si):48-54)和血管內皮細胞生長因子(VEGF)(參見 Street 等，2002PNAS99:9656-61 )。
[0010]為了使這些生長因子有效，當在修復部位存在適當的應答細胞的臨界密度時，它們必須是活性的并且同時以足夠的濃度可得。GF的短的半衰期、熱不穩定性、對蛋白酶的靈敏度和/或溶解度要求它們與載體組合施用，以滿足該要求。
[0011]已經對用于GF遞送的大量載體進行了評價。這些載體包括纖維膠原海綿，明膠水凝膠，纖維蛋白凝膠，肝素，反相聚合物(例如泊洛沙姆)，由聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)或其共聚物(PLGA)構成的支架，肝素接合的PLGA支架和無機材料(例如磷酸鈣)。例如，用于牙周再生的生物植入物(GEM-21S? )使用β -磷酸三鈣(β -TCP)作為rhroGF-BB的載體(參見 http: //www.0steohealth.com/GEM21S.aspx)。
[0012]然而，這些載體具有有限的有效性，這是由于當與載體結合時生長因子活性的損失，GF在植入部位無效率的釋放，和/或對蛋白質水解和降解差的防護。例如，生物植入物Infuse?使用I型膠原海綿作為rhBMP-2的載體。rhBMP-2從載體突然釋放，BMP在創傷部位內的半衰期為 I 至 3 天(Winn 等，1998, Adv.Drug Del.Rev.31:303 ；Friess 等，1999，Intl.J.Pharm.，187:91 )。到使骨再生的間充質干細胞已經遷移進入創傷部位的時候，僅裝載的初始量百分比的BMP的一 部分存在以刺激這些細胞制造骨。目前用于確保在這之后的時間內保持有效水平的BMP的解決方案是明顯地增加最初裝載的BMP的量。這些增加的劑量增加并發癥的風險，包括超越移植部位的骨形成、自身免疫應答和可能的癌癥。另外，這急劇地增加了移植的成本。
[0013]因此，本領域中存在對以一定模式釋放生長因子的材料和方法的需求，所述模式最小化需要裝載以實現要求的治療效果的生長因子的量。
[0014]一種策略是在生物可降解的聚合物基體中包封GF，所述生物可降解的聚合物基體以持續的釋放模式釋放GF許多天。例如，BMP已經與聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)組合以產生持續的釋放模式。然而，在PLA或PLGA中引入BMP能使BMP變性，降低其活性，并且難以控制釋放模式以優化生物植入物的有效性。另外，這些載體的降解速率一般使得大量的GF在愈合完成很久后保持封藏。
[0015]另一種策略是將GF直接化學固定到載體上，保持其在移植部位。然而，這也可能導致部分或全部的GF活性的損失，并且限制GF活性使得僅直接與載體接觸的那些細胞能夠與 GF 相互作用并應答(參見 Steinmuller-Nethl, D.等，Biomaterials, 2006, 27:4547-56)，因為效果限于與載體的直接界面處而不遍及創傷部位，這是不期望的。
[0016]實際上，在創傷愈合期間，多重GF在不同的時間以變化的濃度存在于創傷部位和周圍組織中。例如，骨折之后即刻，在受傷部位的血小板最初會在接下來的日子里在骨折部位內隨著蛋白質水平的急劇下降釋放大量的F1DGF (參見Tyndall等，ClinicalOrthopaedics and Related Research, 2003,408:319 - 330)。相反地，BMP-2 在骨折愈合過程的所有階段表達(參見 Rasubala 等，British Journal of Oral and MaxillofacialSurgery, 2003, 41:173 - 178)。估計這些生長因子的濃度在低于外源性GF的治療應用期間所使用的那些的數量級，這是由于濃度與細胞要求的匹配以及多重生長因子的協同效應。產生允許具有多相釋放模式的生長因子的遞送和具有不同的釋放模式的多重生長因子的釋放的系統將允許使用具有GF釋放模式的生物植入物，所述GF釋放模式比目前以突然釋放或持續釋放來釋放單一生長因子的生物植入物更接近地模擬在自然愈合過程中的GF釋放。
[0017]該背景信息是為了使本 申請人:認為的已知信息能夠與本發明相關聯而提供的。既不必意欲承認也不應解釋為任何前述信息構成針對本發明的現有技術。
【發明內容】
[0018]在一個方面，本發明提供一種用于至少一種生長因子在例如治療部位的多相釋放的系統、方法和 試劑盒。為此目的，本發明的系統可以提供為生物植入物等。在一個方面，本發明的方法以最初釋放來遞送至少一種生長因子，隨后以“持續釋放模式”遞送至少一種生長因子。本發明利用一種用于最初釋放的遞送系統和一種用于持續釋放的載體。
[0019]在一個方面，相同的生長因子以最初釋放模式和持續釋放模式進行釋放。在一個方面，釋放不同的生長因子，其中第一生長因子以最初模式釋放，第二生長因子以持續釋放模式釋放。如會被本領域技術人員所知的，認為兩種不同的生長因子以這種不同的方式的釋放更接近地模擬在治療部位自然的生長因子釋放系統。
[0020]根據本發明的一個方面，提供一種提供至少一種生長因子的持續釋放的載體，其與提供至少一種生長因子的最初釋放的遞送載劑組合。載體和遞送載劑的組合產生生長因子的多相釋放模式。
[0021]在優選實施方案中，生長因子(“GF”)是轉化生長因子β (TGFii)總科的成員。在特別優選的實施方案中，生長因子是骨形態發生蛋白(BMP)。
[0022]在本發明的一個方面，載體(“CAR”)由分散在聚合物支架或基體內的磷酸鈣顆粒形成。在一個方面，支架或基體進一步用羥磷灰石包覆。
[0023]在一個實施方案中，至少一種的生長因子以液態施用到鈣顆粒，然后在與聚合物基體組合前被凍干到顆粒上。
[0024]在本發明的另一個方面，載體通過混合一種或更多種磷酸鈣粉末與含有至少一種生長因子的液態溶液以產生磷酸鈣粘合劑來形成。在一個方面，然后粘合劑被研磨成顆粒。
[0025]在優選實施方案中，遞送載劑是反相聚合物。在特別優選的實施方案中，反相聚合物是泊洛沙姆，更具體地是泊洛沙姆407 (也叫做PluronicTMF127)。
[0026]如上文所指出的，在一個方面，載體和遞送載劑適合于釋放相同的生長因子，而在另一個方面，載體和遞送載劑適合于釋放不同的生長因子。在本發明的再一方面，載體和遞送載劑各自適合于釋放兩種或更多種生長因子的組合，其中各自所釋放的組合是相同或不同的。[0027]因此，在一個方面，本發明提供一種用于生長因子在治療部位的多相釋放的系統，所述系統包括:
[0028]-遞送載劑，其包含至少一種第一生長因子；和
[0029]-載體，其包含至少一種第二生長因子；
[0030]-其中:
[0031]-所述遞送載劑適合于在第一時間段以最初釋放模式來釋放至少一種第一生長因子;
[0032]-所述載體適合于在第二時間段以持續釋放模式來釋放至少一種第二生長因子。
[0033]在另一方面，本發明提供一種用于生長因子的多相釋放的方法，所述方法包括:
[0034]-以最初釋放模式來遞送至少一種第一生長因子；
[0035]-以持續釋放模式來遞送至少一種第二生長因子。
[0036]在另外的方面，本發明提供一種用于生長因子的多相遞送的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0037]-遞送載劑組分；
[0038]-與所述遞送載劑相關聯的至少一種第一生長因子；
[0039]-載體組分；和
[0040]-與所述載體相關聯的至少一種第二生長因子。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]現在，將參考【專利附圖】
【附圖說明】本發明，所述附圖在下文進行簡單說明。
[0042]圖1示出了本發明的載體所展現的持續釋放模式。
[0043]圖2示出了本發明的遞送載劑所展現的最初釋放模式。
[0044]圖3示出了基于在遞送載劑和載體中生長因子的量的不同的釋放模式。當生長因子并入遞送載劑和載體兩者中時(50-50 )，觀察多相釋放模式。
[0045]圖4示出了生物植入物的體內活性，其中生長因子根據本發明的方法如圖3中所示進行釋放。
[0046]圖5示出了當根據本發明的方法所制備的生物植入物移植到小鼠中時，新骨(骨)在磷酸鈣顆粒(CaP)上的形成。
[0047]圖6示出了當根據本發明的方法所制備的生物植入物移植到小鼠中時，在載體(載體)上所形成的新骨(骨)的組織學外觀。
[0048]圖7示出了根據本發明的方法所制備的載體所產生的短持續的生長因子釋放模式。
[0049]圖8示出了持續釋放模式如何能夠通過改變根據本發明的方法所制備的載體的性能來進行變化。
【具體實施方式】
[0050]生長因子(GF)在組織的修復和再生中起著必不可少的作用，外源性GF可以用于刺激各種組織和器官的修復。為了使外源性生長因子在刺激修復中有效，它們必須保持在需要修復的部位，并防止失活、隔絕或降解。為此使用載體。然而，生長因子從這些載體的釋放不理想，并且不能容易地改變。本發明基于生長因子從生物植入物的多相釋放增加植入物的功效的發現。
[0051]本發明人已經發展了用于通過改善生長因子在移植部位的釋放動力學或釋放模式同時保持生長因子的活性來增強例如生物植入物的功效的方法和材料。在一個方面，本發明提供一種生長因子遞送系統和方法，包括含有至少一種生長因子的載體，其與也含有至少一種生長因子的遞送載劑組合。由載體和遞送載劑所釋放的至少一種生長因子可以是相同或不同的。
[0052]本發明的系統和方法能用于各種治療和臨床應用，包括骨折修復；骨移植；脊柱融合；以及頭骨、下頜骨和骨缺損的再生。對于這些應用，本發明的系統優選提供在生物植入物上或以生物植入物的形式提供。
[0053]定義
[0054]除非下文另外定義，本文所使用的所有技術與科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的意思。
[0055]如本所所用，術語“生物植入物”是指適合于移植的材料，并且含有外源性生長因子或生物活性因子。如本文進一步討論的，本發明的系統優選通過對生物植入物施加所述物質來使用。然后在對象體內提供生物植入物，其中所述系統以多相釋放模式釋放至少一種生長因子。
[0056]如本文所用，術語“生長因子”是指通過GF與特定細胞表面受體的相互作用來刺激細胞的生長和/或分化的肽和蛋白質。生長因子的實例包括骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子β (TGFi3 )、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)和血管內皮細胞生長因子。在優選實施方案中，生長因子是BMP。
[0057]“重組的”表示由瞬時轉染的、穩定轉染的或轉基因的宿主細胞或者由含有關于所述蛋白質的cDNA的表達結構所指示的動物所產生的蛋白質。術語“重組的”還包括這種多肽的藥物可接受鹽。
[0058]如本文所用，術語“多肽”或“蛋白質”是指氨基酸單體的聚合物，其為通過酰胺鍵連接在一起的α氨基酸。因此，多肽的長度為至少兩個氨基酸殘基，并且通常更長。一般地，術語“肽”是指長度上僅有很少氨基酸殘基的多肽。與肽相反，多肽可以包含任意數量的氨基酸殘基。因此，術語多肽包括肽以及更長的氨基酸序列。
[0059]如本文所用，術語“骨形態發生蛋白”或“骨形態生成蛋白”或“BMP”可相互交換地使用，并且是指生長分化因子的轉化生長因子β (TGFii)總科的骨形態發生蛋白(BMP)亞科的任何成員，包括BMP-2、ΒΜΡ-3 (也稱作成骨素)、BMP_3b (也稱作生長分化因子10，⑶F-10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7 (也稱作成骨蛋白-1，0P-1)、BMP-8 (也稱作成骨蛋白-2，OP-2)、BMP-9、BMP-10, BMP-1l (也稱作生長分化因子_8，⑶F-8，或者肌肉生長抑制素)、BMP-12 (也稱作生長分化因子_7，GDF-7)、BMP-13 (也稱作生長分化因子6，⑶F-6)、BMP-14 (也稱作生長分化因子5，⑶F-5)和BMP-15。
[0060]術語“骨形態發生蛋白”和“BMP”還包括BMP的等位基因變異體、BMP的功能保守變異體和保持BMP活性的突變BMP。這種變異體和突變體的BMP活性可以通過本領域眾所周知的任何方法(參見下文中測量BMP活性的分析的章節)或如實施例1所說明的進行確定。[0061]在優選實施方案中，BMP是 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8 或 BMP-9。在特別優選的實施方案中，BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7。
[0062]在優選實施方案中，BMP是哺乳動物的BMP (例如哺乳動物的BMP-2或哺乳動物的BMP-7)。在特別優選的實施方案中，BMP是人類的BMP (hBMP)(例如hBMP_2或hBMP_7)。
[0063]如本文所用，術語“支架”是指其目的為提供支持細胞附著、遷移以及向內生長到組織修復部位內的結構的材料。
[0064]如本文所用，術語“載體”是指包含單一或多種組分的材料，并且適合于在一段時間內以“持續釋放”模式在治療部位釋放至少一種生長因子。在一個方面，載體釋放至少一種生長因子的時間段在幾天和幾周之間。優選地，載體適合于在幾周的時間內釋放至少一種生長因子。
[0065]在優選實施方案中，載體也可以用作支架或基體。如上所述，在本發明的一個方面，載體由分散在大孔的聚合物支架或基體內的磷酸鈣顆粒形成。在一個方面，支架或基體進一步包覆有羥磷灰石層。在一個實施方案中，至少一種生長因子以液態施用到鈣顆粒，然后在與聚合物基體組合前被凍干到顆粒上。
[0066]如本文所用，術語“遞送載劑”是指包含或含有至少一種生長因子的材料，并且適合于在一段時間內以最初釋放模式在治療部位釋放至少一種生產因子。在一個方面，形成遞送載劑的材料為凝膠的形式。在一個方面，遞送載劑釋放至少一種生長因子的時間段在幾小時和幾天之間。在本發明的一個優選實施方案中，遞送載劑以持續幾小時時間的“最初釋放”或“最初釋放模式”釋放大部分的至少一種生長因子。優選地，遞送載劑適合于在72小時的時間內釋放至少80%的其中所包含的(與其相關聯的)生長因子。
[0067]在優選實施方案中，遞送載劑是反相聚合物。如本文所用，術語“反相”是指憑借其聚合物進行從液體到凝膠的可逆溫度依賴轉變的性能。在一個方面，轉變溫度在15°C和37°C之間。優選地，轉變溫度在15°C和25°C之間。如本領域技術人員會知道的，“正相”材料隨著溫度降低其粘度增加。相反地，反相材料隨著溫度降低到其轉變溫度以下顯示出粘度降低。
[0068]在特別優選的實施方案中，反相聚合物是泊洛沙姆，更具體地是Pluronic?F127(也叫做泊洛沙姆407)。
[0069]如本文所用，術語“持續釋放”或“持續釋放模式”是指在幾天或幾周的時間內通過載體的至少一種生長因子的釋放，其中在最初時間段內釋放的量相似于或低于移植的幾天或幾周后相同時間段內釋放的量。優選地，持續釋放模式持續至少一周。如本領域技術人員會理解的，一般地，在前三天內以持續釋放模式釋放的生長因子的量會低于在隨后七天內釋放的量。
[0070]如本文所用，術語“最初釋放”或“最初釋放模式”是指通過遞送載劑的大量的至少一種生長因子的最初釋放，然后在幾小時或幾天的時間段內釋放逐漸降低的量。在一個方面，最初釋放模式導致在大致72小時的時間內至少80%的裝載的生長因子的遞送。最初釋放模式圖示于圖2中。
[0071]如本文所用，術語“多相釋放”是指在最初釋放時間段內至少一種生長因子的最初釋放，然后在第二時間段內至少一種生長因子的“持續”釋放。優選地，最初時間段是大致幾個小時，第二時間段是大致幾天到幾周。這種釋放模式還可以稱為“雙相釋放”，這是由于其在兩個階段進行。在優選實施方案中，最初釋放由本發明的遞送系統提供，“持續”釋放由本發明的載體提供。
[0072]在本發明的一個方面，遞送載劑組分包含總量的至少10%并不超過50%的由本發明的系統遞送的生長因子，載體組分包含總量的至少50%的由所述系統遞送的生長因子。
[0073]測暈BMP活性的分析
[0074]對重組的BMP的體外和體內功能進行表征的分析在本領域是眾所周知的(參見例如美國專利4，761,471號；美國專利4，789，732號；美國專利4，795, 804號；美國專利4，877，864號；美國專利5，013，649號；美國專利5，166,058號；美國專利5，618，924號；美國專利5,631, 142號；美國專利6，150，328號；美國專利6，593，109號；Clokie和Urist,Plast.Reconstr.Surg.2000 ；105:628-637 ;Kirsch等，EMBO J2000 ；19:3314-3324 ；Vallejo 等，J.Biotech.2002 ；94: 185-194 ；Peel 等，J.Craniofacial.Surg.2003 ； 14:284-291 ；以及 Hu 等，Growth Factors, 2004 ；22:29-33)。
[0075]這種分析包括:對移植(例如植入后腿及臀部肌肉或胸的區域)入嚙齒動物(例如大鼠或小鼠)后BMP的骨誘導活性進行定量的體內分析(參見例如美國專利4，761,471號；美國專利4，789，732號；美國專利4，795，804號；美國專利4，877，864號；美國專利5，013，649號；美國專利5，166,058號；美國專利5，618，924號；美國專利5,631, 142號；美國專利 6，150，328 號；美國專利 6，503，109 ；Kawai 和 Urist.,Clin.0rthop.Relat.Res.，1988 ；222:262-267 ;Clokie 和 Urist, Plast.Reconstr.Surg.2000 ；105:628-637 ;以及 Hu等，Growth Factors, 2004 ；22:29-33);對再生哺乳動物中頭骨環鋸缺損的BMP活性進行定量的體內分析(例如大鼠、狗或猴)(參見例如美國專利4，761，471號和美國專利4，789，732號)；對誘導體外培養的軟骨細胞增殖的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如美國專利4，795，804號)；對誘導體外培養的肌肉細胞(例如C2C12細胞，ATCC編號CRL-1772)或骨髓基質細胞(例如鼠的W-20細胞，ATCC編號CRL-2623)中堿性磷酸酶活性的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如美國專利6, 593, 109號；Ruppert等，Eur J Biocheml996 ；237:295-302 ；Kirsch 等，EM`BO J，2000 ；19:3314-3324 ;Vallejo 等，J Biotech,2002；94:185-194 ;Peel 等,J Craniofacial Surg., 2003 ； 14:284-291 ;以及Hu等,Growth Factors,2004 ；22:29-33);對誘導培養的間質祖細胞系(例如鼠的C3H10T1-2細胞)中FGF-受體2(FGFR3)表達的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如Vallejo等，J Biotech2002 ；94:185-194);對誘導雞枝芽細胞中蛋白多糖合成的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如Ruppert等，Eur J Biocheml996 ；237:295-302);以及對誘導骨髓基質細胞(例如鼠的W-20細胞；ATCC編號CRL-2623)中骨鈣素治療的BMP活性進行定量的體外分析(參見例如美國專利 6，593，109 號)。
[0076]測暈BMP結合與釋放的分析
[0077]各種分析可以用于測量來自載體的重組BMP的結合與釋放。例如，重組BMP蛋白質的量可以通過本領域中眾所周知的任何技術進行定量，包括斑點印跡、免疫分析(例如酶聯免疫吸附分析，ELISA)、當生物植入物包含放射標記的BMP時釋放緩沖劑中出現的放射性增加的測量以及色譜法(例如高壓液相色譜、HPLC和離子交換色譜)。
[0078]這類方法在本領域中是眾所周知的(參見例如Harlow和Lane，UsingAntibodies:A Laboratory Manual,冷泉港實驗室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press).1999 ;Gosling 編著，Immunoassays:A Practical Approach,牛津大學出版社(Oxford University Press).2000 ;01iver 編著，HPLC of Macromolecules:A Practical Approach.,牛津大學出版社，1998 ；Millner 編著，High ResolutionChromatography:A Practical Approach.牛津大學出版社，I999 ;Hockf ield 等，SelectedMethods for Antibody and Nucleic Acid Probes.冷泉港實驗室出版社.1993 ；Gore 編著，Spectrophotometry and Spectrofluorimetry:A Practical Approach.牛津大學出版社，2000)。
[0079]例如已經描述了 BMP蛋白質的放射免疫實驗分析的方案(參見例如美國專利4，857，456號)。例如已經描述了 BMP蛋白質的免疫印跡分析的方案(參見例如Wang等，ProcNatl Acad Sci USA1990 ;87:2220_2224)。例如用于人類、大鼠或小鼠BMP-2的蛋白質水平的定量的ELISA試劑盒是可以商業購買的，例如從R&D Systems(目錄#DBP200、roBP200或SBP200)。例如用于人類BMP-7的蛋白質水平的定量的ELISA試劑盒是可以商業購買的，例如從 R&D Systems (目錄#DY354 或 DY354E)。
_0] 試劑盒
[0081]在一個方面，本發明提供一種用于包含本文所描述系統的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含用于制造遞送載劑和載體以及所需的生長因子的必需組分。即本發明的試劑盒會包含用于制造遞送載劑和載體以及與遞送載劑相關聯的至少一種生長因子和與載體相關聯的至少一種生長因子的必需組分。
[0082]優選地，遞送載劑和相關聯的生長因子保持在分開的容器中，待在使用時組合。這在遞送載劑可以包括液體或凝膠的情況下會是特別優選的。在這種情況下，相關聯的生長因子可以以凍干粉末保持在分開的容器中。在使用時，粉末形式的生長因子可以與液體或凝膠遞送載劑組合。
[0083]試劑盒優選地包含·另外的包含載體的容器，相關聯的生長因子可以裝載或包覆到所述載體上。在一個實施方案中，載體材料還可以保持與相關聯的生長因子分開。
[0084]在一個優選的實施方案中，本發明的試劑盒會包含至少三個容器用于以下的每一個:1)遞送載劑組分；2)至少一種第一生長因子(即與遞送載劑相關聯的生長因子)；和3)載體和至少一種第二生長因子(即與載體相關聯的生長因子)。使用時，粉末形式的至少一種第二生長因子與液體或凝膠形式的遞送載劑組合，然后混合物施用到載體，至少一種第二生長因子預裝載到所述載體上。
[0085]在一個方面，本發明的試劑盒根據可能的需要可以包含任何必需的試劑和/或說明書和/或器皿。
[0086]實施例
[0087]現在，將通過以下實施例說明本發明。這些實施例說明了本發明人的新發現，即生長因子例如rhBMP-2的多相釋放模式比僅產生突然釋放或持續釋放的載體更有效，所述多相釋放模式通過在以持續釋放來釋放BMP的載體內裝載部分的BMP和在以最初釋放來釋放BMP的遞送載劑內裝載部分的BMP而產生。
[0088]如會對本領域技術人員明顯的，能夠在載體內放置一種生長因子，在遞送載劑內放置不同的生長因子，產生各生長因子不同的釋放模式。
[0089]將會理解，本文所提供的實施例僅意欲說明本發明，并不以任何方式限制本發明的范圍。同樣地，本發明不限于本文所描述的任何特別優選的實施方案。事實上，在閱讀本說明書后，本發明的許多修改和變化對本領域技術人員可以是明顯的。因此，本發明僅受所附的權利要求以及權利要求享有權利的等同物的完整范圍限制。
[0090]實施例1:通過在PLGA中包封制造含有BMP的持續釋放復合載體
[0091]該實施例示范如何形成含有rhBMP-2的載體，其以持續釋放模式釋放生長因子。
[0092]材料和方法
[0093]本征粘度為1.33dL/g 的 PLGA75/25 (MW=)購自 Birmingham Polymers Inc.(伯明翰，AL)。憐酸四鈣(TTCP)從 Taihei Chemical Industrial C0.(大阪，日本)獲得，無水憐酸二鈣(DCPA)和二甲亞諷(DMSO)從Taihei Chemical Industrial C0.(MO, USA)獲得。糖顆粒購自 Tate&Lyle North America Inc.(多倫多，加拿大)。
[0094]可再吸收的磷酸鈣顆粒通過在100%的相對濕度混合等摩爾的TTCP和DCPA與去離子蒸懼水(ddH20) 24小時進行制備。反應物進行研磨并通過45 y m的篩進行篩分。
[0095]重組的人類BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制緩沖劑(1.5mg/ml， pH4.5 ;5mm谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%鹿糖和0.01%Tween?80與ddH20)中進行制備。蛋白質溶液被添加到含有CaP粉末的小瓶中，并攪拌至少15分鐘。然后，粉末進行冷凍并凍干。
[0096]然后，具有(CaP-BMP)或沒有(CaP)BMP的顆粒用于通過如下的相轉化/顆粒浙濾來制造CaP顆粒-PLGA支架塊:將PLGA以11.5% (w/v)的濃度溶于DMSO。CaP和CaP-BMP 顆粒按照2:1的CaP/PLGA比例(w/w)徹底混合入該溶液。尺寸范圍為0.85至1.18mm的糖晶體分散于CaP/PLGA中，混合物在_18°C下在模具中進行固化。PLGA沉淀，糖晶體通過三次更換ddH20浸洗來濾出。
[0097]—層羥磷灰石如下沉積到大孔復合支架上并遍及大孔復合支架:干燥的PLGA/ CaP圓柱，測量直徑2mm和長2mm，在70%的乙醇中預濕潤，并在37°C下浸入60ml的3XSBF 中9天時間。SBF如下制備:在劇烈攪拌下，向1.8L的ddH20中依次加入以下鹽:29.711g NaCl, 2.206g CaCl2_2H20，IOmllM HCl, 0.852Na2HP04。最終體積達到 2L。每天更換 SBF 溶液。包覆之后，3PCC樣品在ddH20中進行漂洗，并空氣干燥。
[0098]這導致形成能夠在至少七天內以持續釋放模式釋放rhBMP-2的大孔復合載體 (3PS)。這些結果圖示于圖1中。
[0099]實施例2:通過在磷酸鈣粘合劑中包封制造含有BMP的持續釋放載體
[0100]本實施例示范如何形成具有持續釋放模式的包含rhBMP-2的磷酸鈣粘合劑(CPC) 載體。
[0101]材料和方法
[0102]磷酸四鈣(TTCP)從Taihei Chemical Industrial C0.(大阪，日本)獲得,無水磷酸二IiiKDCPA)從Sigma Chemical Co獲得。大孔雙相磷酸|丐顆粒(Eclipse)購自Citagenix (Laval Qc,加拿大)。重組的人類 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制緩沖劑 (1.5mg/ml,pH4.5 ；5mm 谷氛酸，2.5% 甘氛酸,0.5% 鹿糖和 0.01%Tween?80 與 ddH20)中進行制備。
[0103]可再吸收的磷酸鈣粘合劑顆粒通過混合等摩爾的TTCP和DCPA與rhBMP-2溶液來制備。反應物進行研磨，并通過300和100 u m的篩進行篩分，保留在100和300 u m之間的顆粒。[0104]這導致形成rhBMP-2并入其中的磷酸鈣粘合劑載體顆粒。在移植入動物中后，BMP 在至少幾周的時間內以持續的方式進行釋放。[0105]為了生成也用作大孔支架的基于CPC的持續釋放載體，CPC顆粒(0.1至0.3mm)與大孔磷酸鈣顆粒(1至2mm)以1:1的比例(w/w)進行混合。_6] 實施例3:通過使用結合BMP的涂層制造含有BMP的持續釋放載體[0107]本實施例示范如何通過應用結合BMP的涂層來形成具有持續釋放模式的載體。一個這樣的方法是如在我們的共同待決的申請號美國申請13/002，444號(其全部內容通過引用并入本文)中所述的用抗體或結合BMP的蛋白包覆支架。[0108]材料和方法[0109]純凈的多克隆兔抗人類BMP-2抗體購自Cell Sciences (Canton MA.,目錄 #PA0025)o 大孔雙相磷酸|丐(BCP)顆粒(Eclipse)購自 Citagenix (Laval, Qc,加拿大)。[0110]在生物安全柜中稱出無菌BCP顆粒，并置于無菌TPP管(Mandel Scientific, Guelph 0N，加拿大)中。抗體溶液在磷酸鹽緩沖的鹽水中稀釋至最終濃度為Iml PBS中150、 300和600ng抗體,過濾滅菌,并以l:lv/v的比例應用到支架。在進行冷凍和凍干前，樣品在室溫下攪拌至少15分鐘。然后，BMP溶液應用到顆粒，允許在室溫下浸15分鐘，然后進行冷凍和再凍干。[0111]這導致形成覆蓋有結合并以持續方式緩慢釋放rhBMP-2的抗體的BCP顆粒。[0112]能夠結合的rhBMP-2的量能通過增加所用抗體的量來增加。釋放的速率能夠通過使用具有更低的親和性和親和力的抗體來增加。[0113]實施例4:俥用F127牛產含BMP的遞送載劑[0114]本實施例示范如何使用F127制備含有rhBMP-2的遞送載劑。[0115]材料和方法[0116]泊洛沙姆如下進行制備:100ml的蒸餾水冷卻到4°C，隨著攪拌在幾個小時的時間內緩慢添加各種量的泊洛沙姆407，直到所有固體顆粒都溶解，使最終溶液在12和33%之間。然后，泊洛沙姆溶液在高壓釜中進行滅菌(121°C，20分鐘，30psi )。在滅菌后，泊洛沙姆溶液在4°C下保存直到使用。[0117]凍干的重組人類BMP-2粉末(rhBMP-2, Induce Biologies Inc)添加到泊洛沙姆溶液，并緩慢地混合。[0118]或者，rhBMP-2以 1/10 或 1/20 的比例(v/v)從溶液(lmg/ml, pH4.5 ;5mm 谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%蔗糖和0.01%吐溫80)添加。[0119]這導致形成在前兩天釋放超過80%的rhBMP-2的遞送載劑(如圖2中所示)。[0120]實施例5:具有多相釋放模式的生物植入物的生產[0121]本實施例示范如何形成以多相釋放模式來釋放rhBMP-2的含有rhBMP-2的 3PS-F127生物植入物。[0122]材料和方法[0123]制備每5mg載體含有0、4.55或9.1 y g的rhBMP-2的3PS載體(如實施例1所述)， 并儲存于Eppendorf管中。在45.5 的F127中含有0、4.55或9.1 y g的rhBMP-2的遞送載劑(如實施例4所述制備的)在4°C儲存于Eppendorf管中。緊接著使用之前，F127移液到3PS載體上，并且載體混合到遞送載劑中。[0124]然后，該3PS-F127生物植入物如下文所述用于測量體外BMP釋放以及體內骨形成活性。
[0125]載體與遞送載劑的比例能夠變化以產生凝膠(1:1比例v:v)或油灰(2:1比例 v:v)0另外，BMP與載體的比例或載體的顆粒尺寸能夠變化以改變持續釋放模式。最終，載體和遞送載劑中rhBMP-2的量能夠變化以改變與之后幾周釋放的量相比在前幾個小時最初釋放的rhBMP-2的量。
[0126]實施例6:來自牛物棺入物的BMP釋放的體外分析。
[0127]本實施例描述了如何測量來自實施例1至5中所述的各種生物植入物的rhBMP-2 的釋放。
[0128]材料&方法
[0129]如實施例1至5中所制備的含有已知量的rhBMP-2的生物植入物轉移到 Eppendorf管。所用的rhBMP-2的總量為相對于每5mg載體以及45.5 的F127的9.1 y g 的rhBMP-2，或者相對于每IOmg載體以及100 U I的F127的20 y g的rhBMP-2。
[0130]然后，樣品在37°C在攪拌下利用Iml包含磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)+1%BSA的釋放緩沖溶液進行培養。在不同時期(例如1、2、5、7和10天)后，緩沖劑被移除，并替換為新鮮的釋放緩沖劑，并且收集的溶液在_20°C下儲存于1.5ml的小瓶中用于進一步的分析。
[0131]使用商業的ELISA (Quantikine?hBMP-2ELISA, RnD Systems)測量釋放到緩沖劑中的BMP-2的量。ELISA根 據制造商的說明來實施。
[0132]益果
[0133]在從任何未裝載BMP的生物植入物中所收集的釋放緩沖劑中沒有可以檢測到的 BMP。已經裝載rhBMP-2的載體樣品證實在研究期間持續釋放rhBMP-2，而單獨的遞送載劑中的樣品以“最初釋放模式”進行釋放。
[0134]當載體和遞送載劑組合時，根據BMP裝載入的組分獲得各種釋放模式。當100%的 rhBMP-2 (9.1iig)裝載在之后與33%的F127 (45.5 yl)混合的3PS (5mg)載體內時，BMP 釋放模式與持續形式匹配，其中在前兩天釋放的BMP的量為5ng，在3天和5天之間其為 8ng，在5天和7天之間其為IOng (圖3 ; 100-0)。
[0135]當100%的rhBMP-2 (9.1 u g)裝載在33%的F127 (45.5 yl)內，然后與其中沒有 BMP的3PS載體(5mg)混合時，BMP被釋放，其中釋放的BMP的量在第一天為2363ng，在第二天為381ng，然后在第三天為12ng (圖3 ;0_100)。
[0136]當BMP分布在載體和遞送載劑之間時，生物植入物證實雙相釋放模式，其中在中等最初釋放之后是BMP的持續釋放(圖3 ;50-50)。
[0137]實施例7:測試釋放的BMP的活性的體外分析。
[0138]本實施例描述了如何確定從生物植入物釋放的rhBMP-2是否保持其活性。為了證實釋放的rhBMP是生物活性的，應答細胞可以利用釋放物來培養，并測量其對生長因子的應答。這種分析在本領域中是已知的(參見Peel等，J.Craniofac.Surg.2003,14: 284-291)。
[0139]材料&方法
[0140]制備如實施例1至5中所述的具有或沒有rhBMP-2的材料。釋放物如實施例3中所述進行制備，除了緩沖劑是a最小必需培養基與15%的胎牛血清和抗體(a MEM+15%FBS+AB)0
[0141]C2C12細胞以0.5X IO5細胞/ml、lml a MEM+15%FBS每孔接種到24孔組織培養板中。在24和72小時之間的各種時期后，除去培養基并應用各種釋放物。陰性對照包括利用新鮮的a MEM+15%FBS+AB培養的C2C12細胞。陽性對照包括利用含有25、50和IOOng/ ml的rhBMP-2的a MEM+15%FBS+AB培養的C2C12細胞。48小時后，細胞在Iml細胞溶解緩沖劑(Cellytic Sigma Aldrich)中溶解,使用對硝基苯酹磷酸酯分析物(Sigma Aldrich) 測量細胞溶解物的堿性磷酸酶(ALP)活性。溶解物的細胞蛋白含量使用Coomassie Plus Reagent (Fisher)進行測量,并用于使ALP活性對每孔的細胞數歸一化。
[0142]一般地，為了確定是否在與載體或遞送載劑相結合時已經有BMP活性的任何損失，確定未與載體或遞送載劑相結合的rhBMP-2標準物的ALP/PTN結果的標準活性曲線。釋放物中活性rhBMP-2的濃度可以從該標準曲線進行確定，其表達為如通過ELISA測定的釋放物中存在的rhBMP-2總量的百分比。
[0143]實施例8:多相BMP植入物的骨誘導活性的評價
[0144]本實施例描述了如何體內測定含有BMP的生物植入物的骨誘導活性。為了評價生物植入物誘導骨形成的活性，使用小鼠肌肉囊分析。在該模型中，生物植入物置于在小鼠后肢中制造的肌肉囊中，形成的誘導骨的尺寸與試驗的BMP的量成比例。這種分析在本領域是已知的(參見如 Barr 等，Oral Surg.0ral Med.0ral Pathol.0ral Radiol.Endod., 2010 ；109:531-40)。
[0145]材料和方法
[0146]生物植入物如實施例1和5中所述進行制備。在麻醉下，在37至42天的雄性⑶_1 小鼠的后肢的大腿肌肉中通過鈍器解剖制造雙側的囊。然后，生物植入物置入已經置入肌肉囊的無菌膠囊中。將肌肉拉到一起，用Mitchel夾使皮膚閉合。
[0147]動物在術后第28天進行安樂死。收獲后肢，并用10%緩沖的福爾馬林進行固定。 固定之后,試樣使用微 CT 掃描儀(General Electric Healthcare eXplore?Locus SP)進行成像。掃描樣品，并使用制造商軟件在59 的分辨率下重構。圖像重構之后，確定感興趣的區域(R0I)。該區域包括含有生物植入物誘導的骨的所有區域。根據位置和密度這些可以簡單地與骨骼骨進行區分。
[0148]為了分析ROI內的骨的數量和質量，mCT圖像的體素區分為骨和非骨的相。區分通過確定體素灰度的閾值來實現，在所述閾值體素視為骨。對每個樣品測定ROI的總體積 (TV)、骨體積(BV)、總體積的礦物密度(TV-MD )、骨體積的礦物密度(BV-MD )、總體積的礦物含量(TV-MC)、骨體積的礦物含量(BV-MC)和骨體積分數(BVF)。對于由于載體引起的鈣的存在，通過使用僅選擇載體的上閾值并將其從使用包括載體加新骨的下閾值獲得的數值中扣除來調整數值(參見 Humber 等，Oral Surgery、Oral Medicine、Oral Pathology、Oral Radiology 和 Endodontology.2010.109:372_384)。
[0149]在微CT分析完成之后，試樣或者嵌入spurs樹脂，或者在甲酸中脫鈣并嵌入蠟中。 嵌入樹脂的樣品通過背散射SEM進行評價，而嵌入蠟的樣品進行切割并利用蘇木精和曙紅 (H&E)進行染色，并通過光學顯微鏡進行檢查，以評價移植部位存在的組織類型。
[0150]益果
[0151]載體和遞送載劑如實施例5所述進行組合。[0152]微CT分析顯示，所有BMP都在3PS載體內的生物植入物產生最小的骨的小骨，所述生物植入物具有持續BMP釋放模式(圖4:100-0)，所有BMP都在F127遞送載劑內的生物植入物產生中等尺寸的小骨，所述生物植入物具有突然的BMP釋放模式(圖4:0-100)，而 50%BMP裝載入載體并且50%裝載入遞送載劑的生物植入物產生最大的骨的小骨，所述生物植入物具有多相BMP釋放模式(圖4:50-50)。
[0153]背散射SEM顯示，到28天時骨遍及生物植入物形成以及形成到已經并入PLGA的磷酸鈣顆粒上(圖5)。組織學確認所形成的組織是骨(圖6)。
[0154]實施例9:來自生物植入物的BMP釋放的活體分析
[0155]本實施例描述了如何測量移植后從實施例1、2、3、4或5中所述的各種生物植入物到動物中的rhBMP-2的釋放。做到此的方法在本領域是眾所周知的。例如參見Uludag等， J Biomed Mater Res，46，193 - 202，1999。
[0156]材料&方法
[0157]重組的hBMP-2通過珀金埃爾默(Perkin Elmer)用碘125 (1-125)進行放射性標記。放射性標記的rhBMP-2 (強放射性的)與未標記的rhBMP-2 (無放射性的)混合，以產生 I: 100的強放射性的無放射性的混合物。
[0158]含有已知量的rhBMP-2的生物植入物如實施例1至5中進行制備。然后，這些生物植入物如實施例8中所述移植到動物中。在各個時間段，犧牲動物并切出植入物部位。然后對切出的組織稱重，放射性的量使用Y計數器進行測定。
[0159]為了確定計數是否與蛋白質相關，組織在0.5ml PBS+0.5%BSA中均勻化。兩ml冰冷的10%三氯乙酸加入勻漿中，然后在4°C保持至少I小時。然后，離心勻漿，并移除上層清液。然后，沉淀物的放射性使用Y計數器進行測量。
[0160]與植入物相關的放射性對衰減進行校正，估計保持在植入物中的BMP的總量。
[0161]實施例10:具有短持續釋放模式的載體的生產
`[0162]本實施例描述了生產以短持續釋放模式來釋放生長因子的載體的手段。
[0163]材料&方法
[0164]大孔雙相磷酸鈣(BCP)顆粒(Eclipse)購自Citagenix (Laval, Qc,加拿大)。重組的人類 BMP-2 (rhBMP-2, Induce Biologies Inc)在配制緩沖劑(1.5mg/ml, pH4.5 ;5mm 谷氨酸，2.5%甘氨酸，0.5%蔗糖和0.01%Tween?80與ddH20)中進行制備。
[0165]無菌的rhBMP-2溶液在搖動下以9.1 ii g每5mg或4.55 ii g每5mg (BMP每BCP) 的比例利用無菌BCP顆粒培養15分鐘。然后，樣品進行冷凍并無菌凍干。
[0166]凍干之后,載體稱為5mg的等分部分,并置于無菌的epindorf管中。一些管具有 33%的F127 (添加了 45.5 yl)。然后，BMP釋放模式如實施例6中所述進行測定。
[0167]MS
[0168]未用F127包覆的載體(BCP)顯示突然釋放模式，其中在第一天釋放大量BMP，然后在每一之后的時間點釋放減少量的BMP。在F127內混合BCP (BCP-Pol)產生短期的持續釋放模式，其中在前四天每天收集到相似量的BMP (圖7)。
[0169]實施例11:改變載體的持續釋放模式
[0170]本實施例描述改變載體的釋放模式的手段。
[0171]材料&方法[0172]具有不同本征粘度和分子量的PLGA購自Birmingham Polymers Inc.(Birmingham, AL)。然后,載體如實施例1所述使用這些PLGA來制造。這些載體的BMP釋放模式根據實施例6的方法進行測定。
[0173]結果
[0174]所有載體產生持續釋放模式。然而，釋放的BMP的量根據所用PLGA的粘度/分子量而不同。以低粘度PLGA(Pol-1)制造的載體在研究期間的12周內比使用高粘度(Pol-2) PLGA的那些釋放更多的rhBMP-2 (圖8)。
【權利要求】
1.一種用于生長因子在治療部位的多相釋放的系統，所述系統包括: -遞送載劑，其包含至少一種第一生長因子；和 -載體，其包含至少一種第二生長因子； -其中: -所述遞送載劑適合于在第一時間段以最初釋放模式釋放所述至少一種第一生長因子; -所述載體適合于在第二時間段以持續釋放模式釋放所述至少一種第二生長因子。
2.根據權利要求1所述的系統，其中所述遞送載劑包括聚合物。
3.根據權利要求2所述的系統，其中所述聚合物是反相聚合物或嵌段共聚物。
4.根據權利要求3所述的系統，其中所述聚合物是泊洛沙姆。
5.根據權利要求4所述的系統，其中所述聚合物是泊洛沙姆407。
6.根據權利要求1所述的系統，其中所述載體包括分散在聚合物基體內的多個顆粒，并且其中所述顆粒在其表面上含有所述至少一種第二生長因子。
7.根據權利要求6所述的系統，其中所述顆粒包括磷酸鈣顆粒。
8.根據權利要求6或7所述的系統，其中所述聚合物基體包括聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的系統，其中所述第一時間段包括數小時或數天。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的系統，其中所述第二時間段包括數天或數周。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的系統，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是相同的。
12.根據權利要求1至10中任一項所述的系統，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是不同的。
13.根據權利要求1至12中任一項所述的系統，其中所述第一和第二生長因子是轉化生長因子β總科的生長因子。
14.根據權利要求13所述的系統，其中所述第一和第二生長因子是:骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子β、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或血管內皮細胞生長因子(VEGF)。
15.根據權利要求14所述的系統，其中所述至少一種第一和第二生長因子是BMP。
16.根據權利要求15所述的系統，其中所述至少一種第一和第二生長因子是BMP-2或BMP-7。
17.根據權利要求1至16中任一項所述的系統，其中所述遞送載劑遞送總量的至少10%的所述生長因子，所述載體遞送總量的至少50%的所述生長因子。
18.一種包括根據權利要求1至17中任一項所述的生長因子釋放系統的生物植入物。
19.一種生長因子的多相釋放的方法，所述方法包括: -以最初釋放模式遞送至少一種第一生長因子； -以持續釋放模式遞送至少一種第二生長因子。
20.根據權 利要求19所述的方法，其中所述至少一種第一生長因子由遞送載劑遞送，所述至少一種第二生長因子由載體遞送。
21.根據權利要求19或20所述的方法，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是相同的。
22.根據權利要求19至21中任一項所述的方法，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是不同的。
23.根據權利要求19至22中任一項所述的方法，其中所述至少一種第一和第二生長因子是轉化生長因子β總科的生長因子。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述至少一種第一和第二生長因子是:骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子β、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或血管內皮細胞生長因子(VEGF)。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述至少一種第一和第二生長因子是BMP。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述至少一種第一和第二生長因子是BMP-2或BMP-7。
27.根據權利要求18至26中任一項所述的方法，其中所述遞送載劑遞送總量的至少10%的所述生長因子，所述載體遞送總量的至少50%的所述生長因子。
28.一種用于生長因子的多相遞送的試劑盒，所述試劑盒包括: -遞送載劑組分； -與所述遞送載劑相關聯的至少一種第一生長因子； -載體組分；和 -與所述載體相關聯的至少一種第二生長因子。
29.根據權利要求28所述的試劑盒，其中所述遞送載劑和所述載體組分在分開的容器中。
30.根據權利要求29所述的試劑盒，其中所述遞送載劑和所述至少一種第一生長因子提供在分開的容器中。
31.根據權利要求28至30所述的試劑盒，其中所述載體和所述至少一種第二生長因子在單個容器中組合，并且其中所述至少一種第二生長因子裝載或包覆在所述載體組分上。
32.根據權利要求28至31中任一項所述的試劑盒，其中所述遞送載劑包括聚合物。
33.根據權利要求32所述的試劑盒，其中所述聚合物是反相聚合物或嵌段共聚物。
34.根據權利要求33所述的試劑盒，其中所述聚合物是泊洛沙姆。
35.根據權利要求34所述的試劑盒，其中所述聚合物是泊洛沙姆407。
36.根據權利要求28所述的試劑盒，其中所述載體包括分散在聚合物基體內的多個顆粒，并且其中所述顆粒含有在其表面上的所述至少一種第二生長因子。
37.根據權利要求36所述的試劑盒，其中所述顆粒包括磷酸鈣顆粒。
38.根據權利要求36或37所述的試劑盒，其中所述聚合物基體包括聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)。
39.根據權利要求28至38中任一項所述的試劑盒，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是相同的。
40.根據權利要求28至38中任一項所述的試劑盒，其中所述至少一種第一生長因子和所述至少一種第二生長因子是不同的。
41.根據權利要求28至40中任一項所述的試劑盒，其中所述第一和第二生長因子是轉化生長因子β總科的生長因子。
42.根據權利要求41所述的試劑盒，其中所述第一和第二生長因子是:骨形態發生蛋白(BMP)、轉化生長因子β、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)或血管內皮細胞生長因子(VEGF)。
43.根據權利要求42所述的試劑盒，其中所述第一和第二生長因子是BMP。
44.根據權利要求43所述的試劑盒，其中所述第一和第二生長因子是BMP-2或BMP-7。
45.根據權利要求28至44中任一項所述的試劑盒，其中所述至少一種第一生長因子包括總量的至少10%的提供于所述試劑盒中的生長因子，所述至少一種第二生長因子包括總量的至少50%的提供于所述試 劑盒中的生長因子。
【文檔編號】A61K38/18GK103596553SQ201280017716
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年4月11日 優先權日:2011年4月11日
【發明者】卡梅隆·M·L·克洛基, 肖恩·A·F·皮 申請人:感應生物制品股份有限公司
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