專利名稱：含有胰高血糖素樣肽-1的融合蛋白及制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種融合蛋白，特別涉及一種含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白及制備方法與應用。
背景技術：
糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤后第三大非傳染性疾病，世界衛生組織(WHO) 預測2030年全世界糖尿病患者將超過3. 6億，其中II型糖尿病占90%以上。II型糖尿病是非胰島素依賴型糖尿病，是一種發病率逐年升高的常見病。胰高血糖素樣肽-I (Glucagon-like peptide-1, GLP-1)類似物及其衍生物在II 型糖尿病治療中表現出廣闊前景。在小腸黏膜的L細胞內，胰高血糖素原酶解產生無生物活性的GLP-I (1-37)，GLP-I (1-37)進一步水解切除N-端的6個氨基酸，成為GLP-I (7-37)， 其中一部分C-端的一個氨基酸被分解，且末端被酰胺化為GLP-I (7-36) NH2。GLP-I (7-36) NH2和GLP-I (7-37)在體內具有相同的生理功能。GLP-I誘導多種生物學效應，GLP-I作用于胰腺，促進胰島素分泌，促進胰島β細胞的增殖分化，抑制β細胞的凋亡，增強外周胰島素敏感組織對胰島素的敏感性，抑制高血糖素的分泌；GLP-1作用于中樞神經系統，抑制攝食中樞活性，減低食欲；GLP-1作用于胃腸道，抑制胃腸排空，控制胃酸分泌；GLP-1作用于心臟，抑制心肌細胞的凋亡，保護心臟；GLP-1作用于血管，可以舒張血管、降低血壓，保護內皮細胞。II型糖尿病患者中，其腸促胰島素效應受損，餐后GLP-I分泌減少，因此GLP-I及其類似物可作為治療II型糖尿病的一個重要的靶點。GLP-I的顯著特征是葡萄糖依賴性方式刺激胰島素分泌而不伴有低血糖風險，而低血糖危險常見于胰島素治療中。但是，GLP-I應用于臨床面臨著巨大問題，人體自身產生的GLP-I在體內很不穩定，很快被二肽基肽酶-IV (DPP-IV)所清除，半衰期非常短，約為I 2min，即必須持續靜脈滴注或者持續皮下注射才能產生療效，這嚴重限制了其在臨床治療上的應用。人血清白蛋白(HAS)是血漿中含量最多的蛋白質，濃度約為600μΜ，占血漿總蛋白的40% -60%。它也是人體血漿中主要的藥物運輸蛋白，在人體內的半衰期可達19 天。與人血清白蛋白結合能有效的改善某些肽分子和蛋白藥物代謝動力學特性，延長其半衰期。因此，如將GLP-I與血清白蛋白親和結合序列融合，該融合蛋白與血清白蛋白親和結合，可以達到緩釋的目的，并且不易被腎臟清除，從而延長GLP-I血漿半衰期。申請號為 200810028614. 5、名稱為“一種緩釋生物活性多肽的方法與應用”的發明專利申請提供了一種融合多肽，其中的血清白蛋白結合肽可為LPHSHRAHSLPP，連接體為FNPRGA、FNPRGS, FNPRGP、FNPRPP、FNPRPA。但是此發明所提供的GLP-I融合多肽在糖尿病動物模型db/db小鼠中的降糖試驗表明，其降糖效果仍有提聞的空間。

發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白。本發明的另一目的在于提供所述含有胰高血糖素樣肽-I或其衍生物的融合蛋白的制備方法。本發明的另一目的在于提供所述含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白， 其氨基酸序列如下所示LPHSHRAHSLPP FNPKTPX ;其中LPHSHRAHSLPP是與血漿白蛋白親和結合序列；FNPKTP為連接體，是體內特異性蛋白酶識別位點；X 為 GLP-I (7-37)，X 的序列為H7AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG37 ；編碼所述的含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白的核苷酸序列如下所示CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTAC CTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGT GGC ；所述的含有胰高血糖素樣肽-I或其衍生物的融合蛋白的制備方法，優選包含以下步驟將如下所示的核苷酸序列克隆至表達載體中，得到的重組載體置于宿主細胞中進行表達，純化得到；核苷酸序列為CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTAC CTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGT GGC。所述的表達載體優選為原核表達載體，特別優選為pMFH質粒載體；所述的重組載體優選為pMFH-GLP-1 Der重組載體，其通過包含以下步驟的制備方法得到通過設計引物進行PCR，使得上述的核苷酸序列的5’端帶有EcoRI酶切位點，3’端帶有BamHI酶切位點，得到帶有EcoRI酶切位點和BamHI酶切位點的序列A ;接著將EcoRI 和BamHI雙酶切后的序列A和EcoRI和BamHI雙酶切后的pMFH載體連接，得到pMFH_GLP_l Der重組載體。所述的含有胰高血糖素樣肽-I的GLP-I融合蛋白是由大腸桿菌表達系統重組表達產生的，所述的宿主細胞優選為大腸桿菌BL21(DE3)；所述的含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白用于制備治療非胰島素依賴型糖尿病及其并發癥的藥物；所述的非胰島素依賴型糖尿病和各種狀況優選為II型糖尿病、糖耐量受損、肥胖、代謝綜合征，更優選為II型糖尿病。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(I)本發明所提供的GLP-I融合蛋白，其中的血清白蛋白結合肽為 LPHSHRAHSLPP,其連接體為FNPKTP，完整氨基酸序列為LPHSHRAHSLPPFNPKTPHAEGTF TSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG。在糖尿病動物模型db/db小鼠中的試驗表明，申請號為200810028614. 5、名稱為“一種緩釋生物活性多肽的方法與應用”的發明專利申請提供的 GLP-I融合多肽(連接體分別為FNPRPP、FNPRPA、FNPRHA)在小鼠體內持續藥效為8小時左右，本發明所提供的含胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白化學性質穩定，不易被體內的DPP-IV 降解，持續藥效達到12小時以上，從而克服了必須持續靜脈滴注或者持續皮下注射GLP-I 才能產生療效的缺陷。(2)申請號為200810028614. 5、名稱為“一種緩釋生物活性多肽的方法與應用”的發明專利申請提供的GLP-I融合多肽(連接體分別為FNPRPP、FNPRPA、FNPRHA)在小鼠體內8小時內的降糖百分比才達到27. 31%。而本發明所提供的GLP-I融合蛋白12小時內的降糖百分比達到34. 3%，24小時內的降糖百分比仍達到24. 83%，體內持續降糖藥效達到12小時以上。因而，無論是口服糖耐量實驗(OGTT)，還是即時降糖實驗，本發明所提供的 GLP-I融合蛋白的降糖效果均具有顯著優勢。所以本發明所提供的GLP-I融合蛋白非常具有優勢和潛力應用于臨床治療。同時，本發明所提供的含胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白作為有效成分治療II型糖尿時，既有顯著的降糖效果，12小時內的降糖百分比達到34. 3%, 24小時內的降糖百分比達到24. 83%，又具有很長的血漿半衰期(12小時以上)。(3)藥效學結果表明，經過長期注射本發明所提供的含胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白，能顯著提高糖耐受性，刺激胰島素的分泌，保護胰島β細胞，延緩糖尿病病程的發展。因而本發明所提供的GLP-I融合蛋白非常具有優勢和潛力應用于臨床治療。


圖I是pMFH質粒載體圖譜圖。圖2是pMFH-GLP-lDer融合蛋白質粒圖譜圖。圖3是pMFH-GLP-lDer融合蛋白重組質粒的酶切鑒定圖；其中泳道M是DNA Marker ;泳道I是pMFH-GLP-lDer重組載體經EcoRI和BamHI雙酶
切結果；泳道2是pMFH質粒經EcoRI和BamHI雙酶切結果。圖4是GLP-I融合蛋白HPLC制備圖譜圖。圖5是GLP-I融合蛋白純度分析圖。圖6是GLP-I融合蛋白質譜鑒定圖。圖7是GLP-I融合蛋白在體內穩定性結果圖。圖8是db/db小鼠注射GLP-I融合蛋白后降糖百分比圖。圖9是db/db小鼠連續給藥一周后給藥口服糖耐量結果圖。圖10是db/db小鼠連續給藥六周后給藥口服糖耐量結果圖。圖11是db/db小鼠連續給藥七月后不給藥口服糖耐量結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例I構建含有編碼胰高血糖素樣肽-I或其衍生物的融合蛋白(簡稱為GLP-I融合蛋白)序列的重組質粒。
(1)編碼GLP-1融合蛋白的核苷酸序列的PCR及酶切根據GLP-1融合蛋白的結構特點，采用大腸桿菌的密碼子的偏好性設計引物，弓丨 物由上海生物工程有限公司商業化合成。引物序列如下上游引物1(UP1) :5，-GCGC |GAA TTC| GAT CCG CTG CCG CAT AGCCAT CGC GCC CAT AGC CTG CCG CCG-3’上游引物2(UP2) :5，-CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG AAG ACGCCG CAC GCT GAA GGT ACC-3’下游引物(DP):5’ -TCATCCGCCAAAACAGCCAAG-3’ ；采用重疊延伸PCR方法，以質粒pMFH-GLP-1 (7-37)(該質粒已在申請號為 “201010221511. 8”、名稱為“利用乳糖誘導pMFH載體生產重組蛋白的發酵方法”的發明專 利申請中公開)為模板，擴增GLP-1融合蛋白cDNA序列。以pMFH-GLP-1質粒為模板，UP2 和DP為引物，進行第一次PCR擴增，然后再以第一次PCR擴增產物為模板，使用UP1和DP 引物進行全長片段的擴增，得到如下序列的PCR產物GCGC |GAATTC| GATCCGCTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGA CGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCT TGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC |TAA| TAA |GGATCC| TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTT TTGGCGGATGA。|GAATTC|為EcoRI酶切位點，GATCCG為甲酸酶解位點，|GGATCC |為BamHI酶 切位點。PCR反應體系為
模板(pMFH-GLP-1 質粒) 3.6 ^il 2xGC buffer I25.0 ^il
UP1 (10 pmol)或 UP2 (10 pmol) 2.0 fil DP (10 pmol)4.0 fil
dNTP Mixture5.0 fil
TransTaq HiFi DNA polymerase 1.0 fil Milli Q 水9.4 0
總體積50 piPCR反應條件
95 °C預變性4min95 °C變性 61 °C退火 72 °C延伸循環數 72 °C延伸
30 s 30 s 30 s 30
10 minPCR擴增之后，回收PCR產物(操作見PCR清潔試劑盒說明書)。對PCR產物進行
酶切，酶切反應體系如下
GLP-I融合蛋白 10 X Buffer H EcoRI BamHI MillQ 水
1.5pg
5.0μ
2.0μ
2.0μ
補至50酶切反應條件先30°C水浴2h,再37°C水浴2h。接著采用商業化的Omega Agarose Gel DNA Purification Kit對酶切產物進行純化。(2) pMFH表達載體的雙酶切及重組質粒的連接pMFH 表達載體(Staphylococcal nuclease fusion proteins for the production of recombinant peptides. US 7390639B2 中已經詳細公開了該載體的構建過程)含有大腸桿菌編碼依賴RNA聚合酶轉錄單位的T7啟動子；且具有融合表達系統的運載蛋白片段MFH，在MFH的C末端含有6 XHis標簽，便于融合蛋白的純化(如圖I所示)，其
酶切體系如下
pMFH質粒 IOXBufferH EcoRI BamHI MillQ 水
2.0 pg
5.0μ
2.0μ
2.0μ 補至60 μ 酶切反應條件先30°C水浴2h,再37°C水浴2h。接著采用商業化的Omega Agarose Gel DNA Purification Kit對目的DNA片段進行純化。取經EcoRI和BamHI雙酶后的pMFH 質粒載體和步驟(I)制備的雙酶切后的編碼GLP-I融合蛋白基因序列進行連接，連接體系
為
pMFH20 ng
GLP-I衍生物PCR產物60 ng
10 X ligation Buffer2.0 μ
Τ4 DNA 連接酶1.0 μ
MillQ 水up to 20 μ 連接反應條件16°C連接16 20h。最終獲得含有編碼GLP-I融合蛋白序列的重組質粒pMFH-GLP-lDer (如圖2所示)。(3) pMFH-GLP-lDer 轉化大腸桿菌 DH5 α將構建好的重組質粒轉化至感受態大腸桿菌DH5 α (寶生物(大連)生物工程有限公司)中，冰浴30min，升溫至42°C水浴中，維持90s，立即轉移至冰浴中，靜置2min。加入Iml LB培養液，置37°C恒溫振蕩(IOOrpm)培養45min，取100 μ I轉化后的菌液均勻地涂布于含有100μ g/mL氨芐青霉素的固體LB培養基上，37°C恒溫放置至液體被平板完全吸收后，37°C倒置培養12 16h至長出明顯菌落。篩選出Amp抗性的單克隆菌落。通過對陽性克隆EcoRI和BamHI的雙酶切以及瓊脂糖凝膠電泳鑒定(如圖3所示)，結果表明GLP-I 融合蛋白的cDNA序列已定向插入表達載體pMFH中。對已鑒定的重組質粒進行DNA測序， 確證獲得了含pMFH-GLP-lDer的重組菌。GLP-I融合蛋白核酸序列如下CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTAC CTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGT GGC。實施例2 pMFH-GLP-Ι融合蛋白發酵表達抽提重組質粒pMFH-GLP-lDer，進一步轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)(寶生物(大連)生物工程有限公司)，得到基因工程表達菌。通過搖瓶培養逐級放大，在5L發酵罐中培養發酵GLP-I融合蛋白表達菌。所用的培養基為2YT培養基，配方為胰蛋白胨16g/L，乳糖10g/L，NaCl 5g/L;用NaOH調pH至7.0，發酵罐內滅菌，滅菌條件為121°C，20min。發酵培養條件如下接種量為體積百分比1% ;培養溫度為37°C ;裝液量為體積百分比80% ； 氨芐青霉素(Amp)濃度為100mg/L。培養至對數生長中后期，添加O. 6mM IPTG，誘導時間為 6h,放罐后12000rpm離心30min收集菌體。實施例3 :分離純化獲得GLP-I融合蛋白(I)將發酵菌體離心收集，用裂解液重懸，裂解液配方為配方為50mmol/ LNaH2PO4,300mmoI/L NaCLUOmmoI/L 咪唑(imidazole)，用 NaOH 調 pH 到 8. O。采用超聲破碎儀(DF-6P3C型超聲細胞破碎儀，寧波新芝科器研究)在冰浴中破碎菌體，開5s，停5s，工作20min。IOOOOrpm, 4°C, 30min,離心破碎菌體,收集上清。(2)將步驟(I)中收集的上清進行 Ni-NTA Agarose (nickel-charged resin, QIAGEN)親和柱純化，用含IOmM咪唑的裂解液洗除雜蛋白后，再用含250mM咪唑的裂解液 (除咪唑濃度不同，其他成分同前述裂解液)洗脫目的蛋白。(3)甲酸水解(2)中目的蛋白，以去除目的蛋白上的His標簽。反應條件如下按 30mg目的蛋白/ml甲酸溶液計算，甲酸溶液的濃度為體積百分比50%，水解溫度為45°C，恒溫振蕩48小時，得到水解產物。(4)將水解產物進行Ni-NTA Agarose親和柱純化，收集GLP-I融合蛋白組分(即上樣穿透峰部分)。(5)將步驟(4)得到GLP-I融合蛋白通過懸蒸濃縮儀進行濃縮后，利用高效液相色譜(HPLC)進一步的精制純化。HPLC儀為半制備的Agilent 1100系列，C18柱(Agilent) 規格為21. 2*250mm，7 μ m。濃縮后的樣品通過0. 45 μ m RC濾膜過濾后進樣，每次進樣體積為1ml，流動相為含體積百分比0. 1%三氟乙酸(TFA)的超純H2O以及含體積百分比0. 1% TFA的乙腈(ACN)，檢測波長為280nm。出峰時間為17. 5min,收集此峰組分。HPLC制備條
8件為
權利要求
1.一種含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白，其特征在于氨基酸序列如下所示LPHSHRAHSLPP FNPKTPX ；其中X 為 GLP-I(7-37)；FNPKTP為連接體；X 的氨基酸序列為H7AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG37。
2.根據權利要求I所述的含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白，其特征在于編碼所述的含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白的核苷酸序列如下所示CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC。
3.權利要求I或2所述的含有胰高血糖素樣肽-I或其衍生物的融合蛋白的制備方法， 其特征在于包含以下步驟將如下所示的核苷酸序列克隆至表達載體中，得到的重組載體置于宿主細胞中進行表達，純化得到含有胰高血糖素樣肽-I或其衍生物的融合蛋白；核苷酸序列為CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC。
4.根據權利要求3所述的含有胰高血糖素樣肽-I或其衍生物的融合蛋白的制備方法， 其特征在于所述的表達載體為原核表達載體。
5.根據權利要求4所述的含有胰高血糖素樣肽-I或其衍生物的融合蛋白的制備方法， 其特征在于所述的原核表達載體為PMHl載體。
6.根據權利要求3所述的含有胰高血糖素樣肽-I或其衍生物的融合蛋白的制備方法， 其特征在于所述的重組載體為pMFH-GLP-1 Der重組載體，其通過包含以下步驟的制備方法得到通過設計引物進行PCR，使得權利要求4所述的核苷酸序列的5’端帶有EcoRI酶切位點，3’端帶有BamHI酶切位點，得到帶有EcoRI酶切位點和BamHI酶切位點的序列A ； 接著將EcoRI和BamHI雙酶切后的序列A和EcoRI和BamHI雙酶切后的pMFH載體連接，得到pMFH-GLP-1 Der重組載體。
7.根據權利要求3所述的含有胰高血糖素樣肽-I或其衍生物的融合蛋白的制備方法， 其特征在于所述的宿主細胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。
8.權利要求I或2所述的含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白的應用，其特征在于所述的含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白用于制備治療和/或預防非胰島素依賴型糖尿病及其并發癥的藥物。
9.根據權利要求8所述的含有胰高血糖素樣肽-I的融合蛋白的應用，其特征在于所述的非胰島素依賴型糖尿病及其并發癥為II型糖尿病、糖耐量受損、肥胖、代謝綜合征。
全文摘要
本發明公開了一種含有胰高血糖素樣肽-1的融合蛋白及制備方法與應用。該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明通過基因工程的方法，突變已知序列的一個氨基酸，得到編碼本發明所述的融合蛋白的核苷酸序列；接著將該核苷酸序列克隆入表達載體中，通過表達、純化，得到本發明所述的融合蛋白。本發明所提供的含有GLP-1的融合蛋白使GLP-1的生理作用具有更好的穩定性和持續性，而且，藥效學結果表明，該融合蛋白具有顯著的降低血糖效果。另外，經過長期注射本發明所提供的融合蛋白，能顯著提高糖耐受性，刺激胰島素的分泌，保護胰島β細胞，延緩糖尿病病程的發展。因而本發明所提供的GLP-1融合蛋白非常具有優勢和潛力應用于臨床治療。
文檔編號A61K38/26GK102585015SQ201210007118
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者冉艷紅, 周天鴻, 李弘劍, 王從峰, 蘇正定 申請人:暨南大學