專利名稱：聚合物微粒及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組蛋白及相關構建體和方法，還有聚合物微粒及其用途。具體地，本發明涉及功能化的聚合物微粒、其生產方法、及其引發免疫應答以及治療或預防疾病或病況中的用途，包括那些因細胞內或細胞外病原體所致的疾病或病況。
背景技術：
下文包括可用于理解本發明的信息。這并非承認本文提供的任何信息都是本文所述或所要求保護的發明的現有技術或與之相關，或具體或隱含引用的任何出版物或文獻都是現有技術。病原體包括細胞內和細胞外病原體，已知引起多種有害的人類疾病，包括例如結核、肝炎、流感、麻瘋病、李斯特氏菌病、傷寒癥、痢疾、瘟疫、肺炎、斑疹傷寒癥、衣原體病、炭疽病以及腦膜炎等等。本文涵蓋生成由傳統疫苗接種策略所引發的強大細胞介導的免疫應答和體液應答兩種能力。例如，結核病(Tb)估計每年殺死超過200萬人。目前用來治療或預防結核的方法因為多藥耐藥性結核分枝桿菌的出現而受到挑戰(Anderson，2007 ；Mustafa, 2001) 0 Tb的治療和預防因為該細胞內細菌不能進入宿主免疫系統而變得復雜化。期望開發出安全有效的方法來遞送靶向疫苗，以克服常規疫苗遞送系統的許多缺點。缺點包括費用增加，需要反復給藥，主要是因為藥效隨著時間而減弱。生成免疫應答特別是細胞介導的免疫應答，也已經提出作為治療多種其他疾病和病況[包括例如癌癥]的方法。因此需要能夠引發強大免疫應答的疫苗組合物，特別是能夠引發細胞介導的免疫應答或體液應答或兩種應答的組合物。聚羥基烷基羧酸酯、特別是聚羥基烷酸酯(PHA)的性能已經就其生物塑料應用、 以及在醫學、藥學和食品工業應用中作為基質運送藥物和其他活性劑的用途進行了研究。 通過PHA分子生物工程化，能夠操縱PHA分子的組成和表達以適應特定功能。本發明的目的是提供聚合物微粒用于治療或預防不同的疾病和病況，包括例如通過免疫或疫苗接種來為有需要的受試者提供引發有效免疫應答的方法和組合物，或者至少為公眾提供可用的選擇。發明概述本文描述和要求保護的發明有許多特征和實施方案，包括但不限于此發明概述部分闡述、說明或述及的那些。其并非意在包羅萬象，故本文描述和要求保護的發明并不局限或受限于此發明概述部分所確定的特征或非限制性實施方案，僅僅是出于舉例說明而非限制目的而納入這些特征或實施方案的。本發明公開了生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述至少一個表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列；或者至少一個編碼與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列；
在適合于所述表達構建體表達的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒。在一個實施方案中，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述至少一個表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼能夠例如引發細胞介導的免疫應答的抗原的核酸序列；或者至少一個編碼與能夠例如引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列；在適合于所述表達構建體表達的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒。在一個實施方案中，所述微粒形成蛋白是聚合物合酶。在一個實施方案中，所述表達構建體是高拷貝數載體。在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列與強啟動子有效連接。在一個實施方案中，所述強啟動子是病毒啟動子或噬菌體啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子是噬菌體啟動子，例如T7噬菌體啟動子。在一個實施方案中，在微粒形成蛋白底物、優選聚合物合酶底物或底物混合物的存在下維持宿主細胞，包括單體底物、能夠被宿主細胞代謝形成所述微粒形成蛋白底物的前體底物。在一個實施方案中，宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體。在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的一些實施方案中，至少一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白和至少一個能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和與至少一個能夠引發免疫應答(包括例如細胞介導的免疫應答)的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體。在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的其他實施方案中，一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒大小決定蛋白的核酸序列的表達構建體，或包含編碼聚合物調節蛋白的核酸序列的表達構建體。
在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的其他實施方案中，一個表達構建體包含編碼微粒形成蛋白(優選聚合物合酶)和與至少一個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列，且至少一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白和至少一個能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和與至少一個能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體。在一個實施方案中，宿主細胞含有混合的表達構建體群，其中每個表達構建體包含編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含至少一個微粒形成蛋白，和至少一個能夠引發免疫應答的抗原，或至少一個與至少一個能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域。在多種實施方案中，抗原是能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原。本發明另一方面涉及表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列。在一個實施方案中，所述核酸編碼能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原。本發明另一方面涉及表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列。在多種實施方案中，抗原是能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原，或者結合結構域與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合。在一個實施方案中，表達構建體編碼的融合多肽包含微粒形成蛋白和能夠引發免疫應答的抗原。在一個實施方案中，表達構建體編碼的融合多肽包含微粒形成蛋白和與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域。在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列與強啟動子有效連接。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼附加多肽的核酸序列。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一個與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域；和至少一個編碼附加多肽的核酸序列，所述附加多肽結合融合多肽中與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域。在一個實施方案中，所述附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一個能夠引發免疫應答的抗原，例如能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原。在一個實施方案中，構建體還包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，或ii.至少一個還原酶，或iii.⑴和(ii)兼而有之。在一個實施方案中，構建體包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，ii.至少一個還原酶，iii.至少一個聚合物合酶，iv.至少一個能夠引發免疫應答的抗原，v.至少一個與至少一個能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，vi.包含上述i)至V)中一項或多項的融合蛋白，vii.上述i)至vi)中的任一組合。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原；和至少一個編碼附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含與至少一個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原能夠結合的結合結構域。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原；和至少一個編碼附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域。在一個實施方案中，所述附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和與至少一個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原能夠結合的結合結構域。本發明另一方面涉及包含本發明表達構建體的載體。在一個實施方案中，載體是高拷貝數載體。在一個實施方案中，載體是低拷貝數載體。本發明另一方面涉及宿主細胞，其含有如上文所定義的表達構建體或載體。
在一個實施方案中，宿主細胞含有選自下組的表達構建體包含編碼微粒形成蛋白和至少一個能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和與至少一個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的核酸序列的表達構建體。本發明另一方面涉及包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與結合結構域融合的微粒形成蛋白，所述結合結構域與能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原能夠結合。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的融合多肽。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含位于聚合物微粒表面的兩個或更多不同的融合多肽。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含三個或更多不同的融合多肽，例如位于聚合物微粒表面的三個或更多不同的融合多肽。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的能夠引發免疫應答 (例如細胞介導的免疫應答)的抗原。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含至少兩個或更多不同的能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原的結合結構域。在一個實施方案中，所述聚合物微粒還包含至少一個與聚合物微粒結合或摻入聚合物微粒之中的物質，或其組合。在一個實施方案中，所述物質為抗原、佐劑或免疫刺激分子。在一個實施方案中，所述物質通過交聯結合。在一個實施方案中，至少一種聚合物微粒包含至少一個選自下組的抗原結核分枝桿菌(M. tuberculosis)抗原、丙肝病毒抗原、流感病毒抗原、土拉熱弗朗西斯氏菌 (Francisella tularensis)抗原、流產布魯氏菌(Brucella abortus)抗原、腦膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis)抗原、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)抗原、登革病毒抗原、埃博拉病毒抗原、西尼羅病毒抗原，包括本文所述的抗原之一。本發明另一方面涉及根據上文定義的方法生產的聚合物微粒。本發明另一方面涉及聚合物微粒組合物，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，所述融合多肽包含與至少一個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及聚合物微粒組合物，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，所述融合多肽包含與結合結構域融合的微粒形成蛋白，所述結合結構域與至少一個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原能夠結合。本發明另一方面涉及聚合物微粒組合物，其中所述聚合物微粒根據上文定義的方法生產。在多種實施方案中，組合物是疫苗組合物。在多種實施方案中，疫苗組合物還包含一種或多種佐劑或免疫刺激分子。本發明另一方面涉及診斷試劑，其包含如上文所定義的聚合物微粒組合物。本發明另一方面涉及診斷試劑盒，其包含如上文所定義的聚合物微粒組合物。在一個實施方案中，所述組合物含有同質聚合物微粒群。在一個實施方案中，所述組合物含有混合的聚合物微粒群。在一個實施方案中，所述組合物還包含如下一個或多個物質一個或多個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原，一個或多個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原的一個或多個結合結構域，一個或多個佐劑，或一個或多個免疫刺激因子或分子。本發明另一方面涉及引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個能夠引發受試者免疫應答的抗原融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，免疫應答是細胞介導的免疫應答。在一個實施方案中，抗原是能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原。在一個實施方案中，免疫應答是體液免疫應答。在一個實施方案中，抗原是能夠引發體液免疫應答的抗原。本發明另一方面涉及引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與結合結構域融合的微粒形成蛋白，所述結合結構域與至少一個能夠引發受試者免疫應答的抗原能夠結合，其中所述結合結構域結合了、受試者含有、或對受試者給藥至少一個能夠引發免疫應答的抗原。在一個實施方案中，免疫應答是細胞介導的免疫應答。在一個實施方案中，結合結構域與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合。在一個實施方案中，所述方法涉及對受試者進行抗結核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個能夠引發細胞介導的或其他免疫應答抗原融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，所述方法涉及對受試者進行抗結核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結合結構域融合的微粒形成蛋白，所述結合結構域與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答抗原能夠結合，其中所述與至少一個能夠引發細胞介導的或其他免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域結合了、受試者含有、或對受試者給藥至少一個能夠引發免疫應答的抗原。在一個實施方案中，所述至少一種聚合物微粒存在于包含至少一個能夠引發受試者免疫應答的抗原的組合物之中，例如包含至少一個能夠引發受試者細胞介導的或其他免疫應答的抗原的組合物。在一個實施方案中，本發明涉及對感染了結核的受試者引發免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥聚合物微粒，所述聚合物微粒包含與例如結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白，優選聚合物合酶。在一個實施方案中，結核分枝桿菌抗原結合結構域與例如內源結核分枝桿菌抗原
纟口口。本發明另一方面涉及用來引發受試者免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個能夠引發受試者免疫應答的抗原融合的微粒形成蛋白，優選聚合物合酶。在一個實施方案中，免疫應答是細胞介導的免疫應答。在一個實施方案中，抗原是能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原。在一個實施方案中，免疫應答是體液免疫應答。在一個實施方案中，抗原是能夠引發體液免疫應答的抗原。本發明另一方面涉及用來對有需要的受試者引發免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與結合結構域融合的微粒形成蛋白，所述結合結構域與至少一個能夠引發受試者免疫應答的抗原能夠結合，其中所述結合結構域結合了、受試者含有、或對受試者給藥至少一個能夠引發免疫應答的抗原。在一個實施方案中，免疫應答是細胞介導的免疫應答。在一個實施方案中，結合結構域與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合。在一個實施方案中，免疫應答是體液免疫應答。在一個實施方案中，抗原是能夠引發體液免疫應答的抗原。在一個實施方案中，所述至少一種聚合物微粒存在于包含至少一個能夠引發免疫應答(例如細胞介導的免疫應答)的抗原的組合物之中。在一個實施方案中，所述至少一種聚合物微粒存在于包含例如至少一個結核分枝桿菌抗原的組合物之中。在一個實施方案中，舉例來說，所述至少一種聚合物微粒存在于包含至少一個選自下組的抗原的組合物之中結核分枝桿菌抗原、丙肝病毒抗原、流感病毒抗原、土拉熱弗朗西斯氏菌抗原、流產布魯氏菌抗原、腦膜炎奈瑟菌抗原、炭疽芽孢桿菌抗原、登革病毒抗原、埃博拉病毒抗原、西尼羅病毒抗原，例如包括本文所述的抗原之一。在一個實施方案中，例如，受試者感染有細胞內病原體，或具有感染細胞內病原體的風險。在另一實施方案中，例如，受試者感染有、或具有感染生命周期主要是細胞內形式的病原體的風險。在不同的實施方案中，受試者感染有肝炎、流感或結核。
在另一實施方案中，受試者已進行過例如抗細胞內病原體免疫。例如，受試者已經接種過卡介苗(BCG)疫苗。在一個實施方案中，例如，受試者感染有細胞外病原體，或具有感染細胞外病原體的風險。在另一實施方案中，例如，受試者感染有、或具有感染生命周期主要是細胞外形式的病原體的風險。本發明另一方面涉及用來對感染有細胞內病原體或進行過抗細胞內病原體免疫的受試者引發免疫應答的聚合物微粒，其中至少一種聚合物微粒包含與結合結構域融合的微粒形成蛋白，優選聚合物合酶，所述結合結構域與至少一個能夠引發免疫應答的抗原能夠結合。也考慮如上所述的聚合物微粒在制備藥物中的用途，所述藥物用于對受試者進行抗細胞內病原體免疫、或對受試者(包括感染有細胞內病原體或進行過抗細胞內病原體免疫的受試者)引發免疫應答。本發明另一方面涉及用來對例如感染有細胞外病原體或進行過抗細胞外病原體免疫的受試者引發免疫應答的聚合物微粒，其中至少一種聚合物微粒包含與結合結構域融合的微粒形成蛋白，優選聚合物合酶，所述結合結構域與至少一個能夠引發免疫應答的抗原能夠結合。也考慮如上所述的聚合物微粒在制備藥物中的用途，所述藥物用于例如對受試者進行抗細胞外病原體免疫、或例如對受試者(包括感染有細胞外病原體或進行過抗細胞外病原體免疫的受試者)引發免疫應答。本發明還提供了用于對有需要的受試者進行疫苗接種的如本文所述的聚合物微粒。因此考慮如本文所述的聚合物微粒在制備用于對有需要的受試者進行疫苗接種的藥物中的用途。本發明另一方面涉及診斷病原體感染的方法，其中所述方法包括向受試者給藥至少一種本發明的聚合物微粒，和檢測指示病原體存在的反應。在一個實施方案中，病原體是細胞內病原體。在另一實施方案中，病原體是細胞外病原體。在一個實施方案中，指示病原體(例如細胞內病原體)存在的反應是遲發型超敏反應。本發明另一方面涉及診斷病原體感染的方法，其中所述方法包括使從受試者獲得樣品與至少一種本發明的聚合物微粒接觸，和檢測指示病原體存在的反應。同樣，在某些實施方案中，病原體是細胞內病原體、細胞外病原體、例如生命周期主要是細胞內形式的病原體、或例如生命周期主要是細胞外形式的病原體。在一個實施方案中，指示病原體存在的反應是檢測所述樣品中病原體抗體的存在。在一個實施方案中，指示病原體存在的反應是檢測所述樣品中病原體反應性免疫細胞的存在。在一個實施方案中，檢測病原體抗體的存在是通過免疫測定法進行的。在一個實施方案中，檢測病原體抗體的存在是通過ELISA、放射免疫測定分析或蛋白質印跡(Western Blot)進行的。
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在一個實施方案中，指示病原體存在的反應是檢測所述樣品中病原體反應性免疫細胞的存在。本發明另一方面提供了生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述至少一個表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列，和至少一個編碼結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列；在適合于表達構建體表達和聚合物微粒形成的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒。在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的一些實施方案中，至少一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原的核酸序列的表達構建體， 或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個結核分枝桿菌抗原的核酸序列的表達構建體。在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的其他實施方案中，一個表達構建體包含編碼微粒形成蛋白和與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列，且至少一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原的核酸序列的表達構建體， 或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個結核分枝桿菌抗原的核酸序列的表達構建體。在一個實施方案中，宿主細胞含有混合的表達構建體群，其中每個表達構建體包含編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含至少一個微粒形成蛋白，和至少一個結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域
本發明另一方面涉及表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼結核分枝桿菌抗原的核酸序列。本發明另一方面涉及表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列。在一個實施方案中，表達構建體編碼的融合多肽包含微粒形成蛋白和結核分枝桿菌抗原。在一個實施方案中，表達構建體編碼的融合多肽包含微粒形成蛋白和結核分枝桿菌抗原結合結構域。
在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼結核分枝桿菌抗原的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域；和至少一個編碼附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一個與融合多肽中結核分枝桿菌抗原結合結構域結合的多肽。在一個實施方案中，附加多肽是結核分枝桿菌抗原或包含至少一個結核分枝桿菌抗原。在一個實施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原；和至少一個編碼附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域。在一個實施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域。在一個實施方案中，宿主細胞含有選自下組的表達構建體包含編碼微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原的核酸序列的表達構建體， 或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個結核分枝桿菌抗原的核酸序列的表達構建體。本發明另一方面涉及包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。 在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的結核分枝桿菌抗原。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的結核分枝桿菌抗原結合結構域。本發明另一方面涉及聚合物微粒組合物，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，所述融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及聚合物微粒組合物，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，所述融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。
在一個實施方案中，所述組合物還包含如下一個或多個物質一個或多個結核分枝桿菌抗原，一個或多個結核分枝桿菌抗原結合結構域，一個或多個佐劑，或一個或多個免疫刺激因子或分子。本發明另一方面涉及對受試者進行抗結核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及對受試者進行抗結核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白，其中所述結核分枝桿菌抗原結合結構域結合了、受試者含有、或對受試者給藥至少一個結核分枝桿菌抗原。在一個實施方案中，聚合物微粒存在于包含至少一個結核分枝桿菌抗原的組合物之中。本發明另一方面涉及引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白，其中所述結核分枝桿菌抗原結合結構域結合了、受試者含有、或對受試者給藥至少一個結核分枝桿菌抗原。在一個實施方案中，至少一種聚合物微粒存在于包含至少一個結核分枝桿菌抗原的組合物之中。在一個實施方案中，受試者感染有結核。在另一實施方案中，受試者已經進行過抗結核免疫。例如，受試者已經接種過卡介苗(BCG)(世界衛生組織-//WWW. who. int)疫苗。本發明另一方面涉及對感染了結核的受試者引發免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種聚合物微粒，其所述聚合物微粒包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，結核分枝桿菌抗原結合結構域與內源結核分枝桿菌抗原結
I=I O本發明另一方面涉及用來對受試者進行抗結核免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及用來對受試者進行抗結核免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及用來引發受試者免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原融
21合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及用來引發受試者免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，所述聚合物微粒存在于包含至少一個結核分枝桿菌抗原的組合物之中。在一個實施方案中，受試者感染有結核。在另一實施方案中，受試者已經進行過抗結核免疫。例如，受試者已經接種過卡介苗(BCG)疫苗。本發明另一方面涉及用來對感染有結核或進行過抗結核免疫的受試者引發免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。也考慮如上所述的聚合物微粒在制備藥物中的用途，所述藥物用于對受試者進行抗結核免疫、或對受試者(包括感染有結核或進行過抗結核免疫的受試者)引發免疫應答。本發明另一方面涉及診斷受試者結核菌感染的方法，其中所述方法包括向受試者給藥至少一種本發明的聚合物微粒，和檢測指示結核分枝桿菌存在的反應。在一個實施方案中，指示結核分枝桿菌存在的反應是遲發型超敏反應。本發明另一方面涉及診斷受試者結核菌感染的方法，其中所述方法包括使從受試者獲得樣品與本發明的聚合物微粒接觸，和檢測指示結核分枝桿菌存在的反應。在一個實施方案中，指示結核分枝桿菌存在的反應是檢測所述樣品中結核分枝桿菌抗原抗體的存在。在一個實施方案中，結核分枝桿菌抗原抗體的存在通過免疫測定法檢測。在一個實施方案中，檢測結核分枝桿菌抗原抗體的存在是通過ELISA、放射免疫測定分析或蛋白質印跡(Western Blot)進行的。在一個實施方案中，指示細胞內病原體存在的反應是檢測所述樣品中結核分枝桿菌抗原反應性免疫細胞的存在。在一個實施方案中，結核分枝桿菌抗原反應性免疫細胞的存在通過細胞增殖測定法、包括FACS在內細胞分選測定法或原位雜交測定法來檢測。本發明另一方面提供了生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述至少一個表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列，和至少一個編碼肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原結合結構域的核酸序列；在適合于表達構建體表達和聚合物微粒形成的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒。在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的一些實施方案中，至少一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的核酸序列的表達構建體，或
包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個肝炎病毒抗原的核酸序列的表達構建體。在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的其他實施方案中，一個表達構建體包含編碼微粒形成蛋白和與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的核酸序列，且至少一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個肝炎病毒抗原的核酸序列的表達構建體。在一個實施方案中，宿主細胞含有混合的表達構建體群，其中每個表達構建體包含編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含至少一個微粒形成蛋白，和至少一個肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域。本發明另一方面涉及表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼肝炎病毒抗原的核酸序列。本發明另一方面涉及表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼肝炎病毒抗原結合結構域的核酸序列。在一個實施方案中，表達構建體編碼的融合多肽包含微粒形成蛋白和肝炎病毒抗原。在一個實施方案中，表達構建體編碼的融合多肽包含微粒形成蛋白和肝炎病毒抗原結合結構域。在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼肝炎病毒抗原的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼肝炎病毒抗原結合結構域的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原結合結構域；和至少一個編碼附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一個與融合多肽中肝炎病毒抗原結合結構域結合的多肽。在一個實施方案中，附加多肽是肝炎病毒抗原或包含至少一個肝炎病毒抗原。在一個實施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原；和
至少一個編碼附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一個肝炎病毒抗原結合結構域。在一個實施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原結合結構域。在一個實施方案中，宿主細胞含有選自下組的表達構建體包含編碼微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個肝炎病毒抗原的核酸序列的表達構建體。本發明另一方面涉及包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的肝炎病毒抗原。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的肝炎病毒抗原結合結構域。本發明另一方面涉及聚合物微粒組合物，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，所述融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及聚合物微粒組合物，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，所述融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，所述組合物還包含如下一個或多個物質一個或多個肝炎病毒抗原，一個或多個肝炎病毒抗原結合結構域，一個或多個佐劑，或一個或多個免疫刺激因子或分子。本發明另一方面涉及對受試者進行抗肝炎免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及對受試者進行抗肝炎免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白，其中所述肝炎病毒抗原結合結構域結合了、受試者含有、或對受試者給藥至少一個肝炎病毒抗原。在一個實施方案中，聚合物微粒存在于包含至少一個肝炎病毒抗原的組合物之中。本發明另一方面涉及引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白，其中所述肝炎病毒抗原結合結構域結合了、受試者含有、或對受試者給藥至少一個肝炎病毒抗原。在一個實施方案中，至少一種聚合物微粒存在于包含至少一個肝炎病毒抗原的組合物之中。在一個實施方案中，受試者感染有肝炎。在另一實施方案中，受試者已經進行過抗肝炎免疫。本發明另一方面涉及對感染了肝炎的受試者引發免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種聚合物微粒，其所述聚合物微粒包含與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，肝炎病毒抗原結合結構域與內源肝炎病毒抗原結合。本發明另一方面涉及用來對受試者進行抗肝炎免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及用來對受試者進行抗肝炎免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及用來引發受試者免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及用來引發受試者免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，所述聚合物微粒存在于包含至少一個肝炎病毒抗原的組合物之中。在一個實施方案中，受試者感染有肝炎。在另一實施方案中，受試者已經進行過抗肝炎免疫。本發明另一方面涉及用來對感染有肝炎或進行過抗肝炎免疫的受試者引發免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。也考慮如上所述的聚合物微粒在制備藥物中的用途，所述藥物用于對受試者進行抗肝炎免疫、或對受試者(包括感染有肝炎或進行過抗肝炎免疫的受試者)引發免疫應答。本發明另一方面涉及診斷受試者肝炎病毒感染的方法，其中所述方法包括向受試者給藥至少一種本發明的聚合物微粒，和檢測指示肝炎病毒存在的反應。在一個實施方案中，指示肝炎病毒存在的反應是遲發型超敏反應。本發明另一方面涉及診斷受試者肝炎病毒感染的方法，其中所述方法包括使從受試者獲得樣品與本發明的聚合物微粒接觸，和檢測指示肝炎病毒存在的反應。在一個實施方案中，指示肝炎病毒存在的反應是檢測所述樣品中肝炎病毒抗原抗體的存在。
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在一個實施方案中，肝炎病毒抗原抗體的存在通過免疫測定法檢測。在一個實施方案中，檢測肝炎病毒抗原抗體的存在是通過ELISA、放射免疫測定分析或蛋白質印跡(Western Blot)進行的。在一個實施方案中，指示細胞內病原體存在的反應是檢測所述樣品中肝炎病毒抗原反應性免疫細胞的存在。在一個實施方案中，肝炎病毒抗原反應性免疫細胞的存在通過細胞增殖測定法、 包括FACS在內細胞分選測定法或原位雜交測定法來檢測。本發明另一方面提供了生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述至少一個表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列，和至少一個編碼流感病毒抗原或流感病毒抗原結合結構域的核酸序列；在適合于表達構建體表達和聚合物微粒形成的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒。在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的一些實施方案中，至少一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個流感病毒抗原的核酸序列的表達構建體。在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的其他實施方案中，一個表達構建體包含編碼微粒形成蛋白和與至少一個流感病毒抗原結合結構域的核酸序列，且至少一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個流感病毒抗原的核酸序列的表達構建體。在一個實施方案中，宿主細胞含有混合的表達構建體群，其中每個表達構建體包含編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含至少一個微粒形成蛋白，和至少一個流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域。本發明另一方面涉及表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼流感病毒抗原的核酸序列。本發明另一方面涉及表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼流感病毒抗原結合結構域的核酸序列。在一個實施方案中，表達構建體編碼的融合多肽包含微粒形成蛋白和流感病毒抗原。在一個實施方案中，表達構建體編碼的融合多肽包含微粒形成蛋白和流感病毒抗原結合結構域。在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼流感病毒抗原的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。在一個實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼流感病毒抗原結合結構域的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原結合結構域；和至少一個編碼附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一個與融合多肽中流感病毒抗原結合結構域結合的多肽。在一個實施方案中，附加多肽是流感病毒抗原或包含至少一個流感病毒抗原。在一個實施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原。在一個實施方案中，所述表達構建體包含至少一個編碼融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原；和至少一個編碼附加多肽的核酸序列，所述附加多肽包含至少一個流感病毒抗原結合結構域。在一個實施方案中，附加多肽是融合多肽，包含微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原結合結構域。在一個實施方案中，宿主細胞含有選自下組的表達構建體包含編碼微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原結合結構域的核酸序列的表達構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個流感病毒抗原的核酸序列的表達構建體。本發明另一方面涉及包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的流感病毒抗原。在一個實施方案中，所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的流感病毒抗原結合結構域。本發明另一方面涉及聚合物微粒組合物，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，所述融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及聚合物微粒組合物，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，所述融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。
在一個實施方案中，所述組合物還包含如下一個或多個物質一個或多個流感病毒抗原，—個或多個流感病毒抗原結合結構域，一個或多個佐劑，或一個或多個免疫刺激因子或分子。本發明另一方面涉及對受試者進行抗流感免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及對受試者進行抗流感免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白，其中所述流感病毒抗原結合結構域結合了、受試者含有、或對受試者給藥至少一個流感病毒抗原。在一個實施方案中，聚合物微粒存在于包含至少一個流感病毒抗原的組合物之中。本發明另一方面涉及引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白，其中所述流感病毒抗原結合結構域結合了、受試者含有、或對受試者給藥至少一個流感病毒抗原。在一個實施方案中，至少一種聚合物微粒存在于包含至少一個流感病毒抗原的組合物之中。在一個實施方案中，受試者感染有流感。在另一實施方案中，受試者已經進行過抗流感免疫。本發明另一方面涉及對感染了流感的受試者引發免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種聚合物微粒，其所述聚合物微粒包含與流感病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，流感病毒抗原結合結構域與內源流感病毒抗原結合。本發明另一方面涉及用來對受試者進行抗流感免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及用來對受試者進行抗流感免疫的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及用來引發受試者免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。本發明另一方面涉及用來引發受試者免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含一個或多個融合多肽，其中至少一個融合多肽包含與至少一個流感病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。在一個實施方案中，所述聚合物微粒存在于包含至少一個流感病毒抗原的組合物之中。在一個實施方案中，受試者感染有流感。在另一實施方案中，受試者已經進行過抗流感免疫。本發明另一方面涉及用來對感染有流感或進行過抗流感免疫的受試者引發免疫應答的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含與至少一個流感病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。也考慮如上所述的聚合物微粒在制備藥物中的用途，所述藥物用于對受試者進行抗流感免疫、或對受試者(包括感染有流感或進行過抗流感免疫的受試者)引發免疫應答。本發明另一方面涉及診斷受試者流感感染的方法，其中所述方法包括向受試者給藥至少一種本發明的聚合物微粒，和檢測指示流感病毒存在的反應。在一個實施方案中，指示流感病毒存在的反應是遲發型超敏反應。本發明另一方面涉及診斷受試者流感感染的方法，其中所述方法包括使從受試者獲得樣品與本發明的聚合物微粒接觸，和檢測指示流感病毒存在的反應。在一個實施方案中，指示流感病毒存在的反應是檢測所述樣品中流感病毒抗原抗體的存在。在一個實施方案中，流感病毒抗原抗體的存在通過免疫測定法檢測。在一個實施方案中，檢測流感病毒抗原抗體的存在是通過ELISA、放射免疫測定分析或蛋白質印跡(Western Blot)進行的。在一個實施方案中，指示細胞內病原體存在的反應是檢測所述樣品中流感病毒抗原反應性免疫細胞的存在。在一個實施方案中，流感病毒抗原反應性免疫細胞的存在通過細胞增殖測定法、 包括FACS在內細胞分選測定法或原位雜交測定法來檢測。如下實施方案可涉及任何上述方面。在不同的實施方案中，微粒形成蛋白是聚合物合酶。在不同的實施方案中，聚合物微粒包含選自聚β-氨基酸、聚乳酸、聚硫酯和聚酯的聚合物。最優選聚合物包含聚羥基烷酸酯(PHA)，優選聚(3-羥基丁酸酯)(PHB)。在不同的實施方案中，聚合物微粒包含由磷脂單層包裹的聚合物微粒。在不同的實施方案中，聚合物微粒包含兩個或更多不同的融合多肽。在不同的實施方案中，聚合物微粒包含位于聚合物微粒表面的兩個或更多不同的融合多肽。在不同的實施方案中，聚合物微粒包含三個或更多不同的融合多肽，例如位于聚合物微粒表面的三個或更多不同的融合多肽。在不同的實施方案中，聚合物微粒還包含至少一個與聚合物微粒結合或摻入聚合物微粒之中的物質，或其組合。在不同的實施方案中，所述物質為抗原、佐劑或免疫刺激分子。在不同的實施方案中，所述物質通過交聯與聚合物微粒結合。
在不同的實施方案中，聚合物合酶與聚合物微粒結合、或與磷脂單層結合、或與兩者均結合。在不同的實施方案中，聚合物合酶與其所形成的聚合物微粒共價或非共價結合。在不同的實施方案中，聚合物合酶是來自不動桿菌屬(AcinetcAacter)、 弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、色桿菌屬(ChromcAacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、動膠菌屬(Zoogloea)、產堿菌屬(Alcaligenes)、代爾夫特菌屬(Delftia)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、紅球菌屬(Rhodococcus)、戈登氏菌屬(Gordonia)、紅細菌屬(Rhodobacter)、畐Ij球菌屬(Paracoccus) > 5 3 ^ # M (Rickettsia)、禾丙木干胃 M (Caulobacter)、甲■木干胃 M (Methylobacterium)、固氮根瘤菌屬(Azorhizobium)、農桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、立克次體屬(Rickettsia)、7良古菌 Π (Crenarchaeota)、集胞藻屬(Synechocystis)、夕卜硫紅 累菌屬(Ectothiorhodospira) > 莢硫菌屬(Thiocapsa)、囊硫菌屬(Thyocystis)和異著色菌屬(Allochromatium)的 1型PHA合酶；來自伯克霍爾德菌屬和假單胞菌屬的2型PHA合酶；或來自芽孢桿菌屬(Bacillus)的4型PHA合酶；更優選來自不動桿菌(Acinetobacter sp. )RA3849、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、斑點氣單胞菌(Aeromonas punctata)FA440、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、紫色色桿菌 (Chromobacterium violaceum)、假單胞菌(Pseudomonas sp. ) 61-3、生枝動膠菌(Zoogloea ramigera)、月巴大產喊菌(Alcaligenes latus)、產喊菌(Alcaligenes sp. ) SH—69、食酸代爾夫特菌(Delftia acidovorans)、伯克霍爾德菌(Burkholderia sp.)DSMZ9242、真養雷爾氏菌(Ralstonia eutrophia)H16、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)、赤紅球菌(Rhodococcus rubber) PP2、戈登氏菌(Gordonia rubripertinctus)、普氏立克次體(Rickettsia prowazekii)、集胞藻(Synechocystis sp. )PCC6803、沙氏外硫紅螺菌 (Ectothiorhodospira shaposhnikovii)Nl、普氏莢硫菌(Thiocapsa pfennigii)9111、酒色異著色菌(Allochromatium vinosum) D、紫囊硫菌(Thyocystis violacea) 2311、類球紅 MM (Rhodobacter sphaeroides)、月兌MiIlJi求lif (Paracoccus denitrificans)、英月莫紅細菌(Rhodobacter capsulatus)、新月柄桿菌(Caulobacter crescentus)、扭脫甲基桿菌 (Methylobacterium extorquens) ^ ^! MIH^lii (Azorhizobium caulinodans)、f艮癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、苜猜中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)41、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)HA和深紅紅螺菌ATCC25903的1型PHA合酶；來自石竹伯克霍爾德菌(Burkholderia caryophylli)、綠針假單胞菌(Pseudomonas chloraphis)、 假單胞菌Pseudomonas sp.) 61-3、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) U、食油假單胞菌 Pseudomonas oleovorans)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、食樹月旨假單胞菌 (Pseudomonas resinovorans)、斯氏{段單胞菌(Pseudomonas stutzeri)、Π 多薩{段單胞菌 (Pseudomonas mendocina) >^/feMIixIfilif (Pseudomonas pseudolcaligenes)、惡HiM單胞菌BMOl、硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducins)、綠針假單胞菌(Pseudomonas chloraphis)的2型PHA合酶；以及來自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和芽孢桿菌(Bacillus sp.) INT005 的 4 型 PHA 合酶。在其他實施方案中，聚合物合酶是來自革蘭氏陰性及革蘭氏陽性真細菌或來自古 30細菌的PHA聚合物合酶。在多個實例中，聚合物合酶可以包含來自保藏號分別為AY836680、AE004091、 AB205104、AF109909、YP137339、AB049413and AF150670 的鉤蟲貪銅菌(C. necator)、銅綠假單胞菌、酒色異著色菌、巨大芽孢桿菌、死海鹽盒菌(H. marismortui)、致黃假單胞菌 (P. aureofaciens)或惡臭假單胞菌的PHA聚合物合酶。其他適用于本發明的聚合物合酶包括來自如下分別以保藏號標識的生物的聚合物合酶真養雷爾氏菌(A34341)、普氏莢硫菌(X93599)、斑點氣單胞菌(03M72)、假單胞菌 61-3 (AB014757 和 AB014758)、類球紅細菌(AAA72004)、紫色色桿菌(AAC69615)、 泊庫島食烷菌(A. borkumensis) SK2 (CAL17662)、泊庫島食烷菌 SK2 (CAL16866)、類球紅細菌 KDl3I (ACM01571 和 YPOO2M6O72)、不透明紅球菌(R. opacus)B4 (BAH51880 和 YP002780825)、多噬伯克霍爾德菌(B. multivorans) ATCC 17616 (YP001946215 和 BAG43679)、泊庫島食烷菌 SK2(YP6939;34 和 YP693138)、深紅紅螺菌(AAD53179)、γ 變形菌(gamma proteobacterium) HTCC5015 (ZP05061661 禾口 EDY86606)、固氮弧菌(Azoarcus sp.) BH72 (YP932525)、紫色色桿菌 ATCC 12472 (NP902459)、湖沉積桿菌(Limnobacter sp.)MED 105(ZP01915838 和 EDM82867)、Μ. algicola DG893(ZP01895922 和 EDM46004)、 類球紅細菌(CAA65833)、紫色色桿菌ATCC 1M72 (AAQ60457)、肥大產堿菌(AAD10274、 AADO1209 和 AAC83658)、嗜麥芽窄食單孢菌(S. maltophilia) K279a (CAQ46418 和 YP001972712)、茄科雷爾氏菌(R. solanacearum) IP01609 (CAQ59975 和 YP002258080)、多噬伯克霍爾德菌 ATCC17616 (YP001941448 和 BAG47458)、假單胞菌 gl 13 (ACJ02400)、假單胞菌 gl06 (ACJ02399)、假單胞菌 glOl (ACJ02398)、根瘤菌(R. sp.) gl32 (ACJ02397)、 豌豆根瘤菌(R. Ieguminosarum bv. viciae)3841 (CAK10329 和 YP770390)、固氮弧菌 BH72 (CAL93638)、假單胞菌 LDC-5 (AAV36510)、L. nitroferrum 2002 (ZP03698179)、索氏菌(Thauera sp. )MZ1T (YP002890098 和 ACR01721)、耐輻射甲基桿菌(M. radiotolerans) JCM 2831(YP001755078 和 ACB24395)、甲基桿菌 4-46(YP001767769 和 ACA15335)、 L. nitroferrum 2002 (EEG08921)、脫氮副球菌(BAA77257)、格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌 (M. gryphiswaldense) (ABG23018)、假單胞菌 USM4-55 (ABX64435 和 ABX64434)、嗜水氣單胞菌(AAT77261 和 AAT77258)、芽孢桿菌 INT005 (BAC45232 和 BAC45230)、惡臭假單胞菌(AAM6;3409 和 AAM63407)、戈登氏菌(G. rubripertinctus) (AAB94058)、巨大芽孢桿菌 (AAD05260)、食酸代爾夫特菌(BAA33155)、嗜絲氨酸副球菌(P. seriniphilus) (ACM68662)、 假單胞菌 14-3 (CAK18904)、假單胞菌 LDC-5 (AAX18690)、假單胞菌 PC17 (ABV25706)、假單胞菌 3Y2(AAV;35431、AAV35429 和 AAV!35426)、門多薩假單胞菌(AAM10546 和 AAM10M4)、 硝基還原假單胞菌(P. nitroreducens) (AAK19608)、類產堿假單胞菌(AAK19605)、食樹脂假單胞菌(AAD26367和AA擬636 、假單胞菌USM7-7 (ACM90523和ACM9052》、熒光假單胞菌(P. f luorescens) (AAP58480)及其他未培養細菌(BAE02881、BAE02880、BAE02879、 BAE02878、BAE02877、BAE02876、BAE02875、BAE02874、BAE02873、BAE02872、BAE02871、 BAE02870、BAE02869、BAE02868、BAE02867、BAE0286、BAE02865、BAE02864、BAE02863、 BAE02862、BAE02861、BAE02860、BAE02859、BAE02858、BAE02857、BAE07146、BAE07145、 BAE07144、BAE07143、BAE07142、BAE07141、BAE07140、BAE07139、BAE07138、BAE07137、 BAE07136、BAE07135、BAE07134、BAE07133、BAE07132、BAE07131、BAE07130、BAE07129、BAE07128、 BAE07120、 BAE07112、 BAE07104、 BAE07096, BAE07088、 BAE07046、 BAE07038、 BAE07030、 BAE07022、 BAE07014、 BAE07006、 BAE06998、 BAE06990、 BAE06982、 BAE06974、 BAE06966、 BAE06958、 BAE06950、 BAE06942、 BAE06934、 BAE06926、 BAE06918、 BAE06910、 BAE06902、 BAE06894、 BAE06886、 BAE06878、 BAE06870、 BAE06862、
BAE07127、 BAE07119、 BAE07111、 BAE07103、 BAE07095, BAE07053、 BAE07045、 BAE07037、 BAE07029, BAE07021、 BAE07013、 BAE07005、 BAE06997、 BAE06989、 BAE06981、 BAE06973、 BAE06965、 BAE06957、 BAE06949、 BAE06941、 BAE06933、 BAE06925、 BAE06917、 BAE06909、 BAE06901、 BAE06893、 BAE06885、 BAE06877、 BAE06869、 BAE06861、
BAE07126、 BAE07118、 BAE07110、 BAE07102、 BAE07094、 BAE07052, BAE07044、 BAE07036、 BAE07028, BAE07020、 BAE07012、 BAE07004、 BAE06996、 BAE06988、 BAE06980、 BAE06972、 BAE06964、 BAE06956、 BAE06948、 BAE06940、 BAE06932、 BAE06924, BAE06916、 BAE06908、 BAE06900、 BAE06892、 BAE06884、 BAE06876、 BAE06868、 BAE06860、
BAE07125、 BAE07117、 BAE07109、 BAE07101、 BAE07093、 BAE0705U BAE07043、 BAE07035, BAE07027、 BAE07019、 BAE07011、 BAE07003、 BAE06995、 BAE06987、 BAE06979、 BAE06971、 BAE06963、 BAE06955、 BAE06947、 BAE06939、 BAE06931、 BAE06923、 BAE06915、 BAE06907、 BAE06899、 BAE06891、 BAE06883、 BAE06875、 BAE06867、 BAE06859、
BAE07124, BAE07116、 BAE07108、 BAE07100、 BAE07092、 BAE07050、 BAE07042、 BAE07034、 BAE07026、 BAE07018、 BAE07010、 BAE07002、 BAE06994、 BAE06986、 BAE06978、 BAE06970、 BAE06962、 BAE06954, BAE06946、 BAE06938、 BAE06930、 BAE06922、 BAE06914、 BAE06906、 BAE06898、 BAE06890、 BAE06882、 BAE06874、 BAE06866、 BAE06858、
BAE07123、 BAE07115、 BAE07107、 BAE07099、 BAE07091、 BAE07049、 BAE07041、 BAE07033, BAE07025, BAE07017、 BAE07009、 BAE07001、 BAE06993、 BAE06985、 BAE06977、 BAE06969、 BAE06961、 BAE06953、 BAE06945、 BAE06937、 BAE06929、 BAE06921、 BAE06913、 BAE06905、 BAE06897、 BAE06889、 BAE06881、 BAE06873、 BAE06865、 BAE06857、
BAE07122、 BAE07114、 BAE07106、 BAE07098, BAE07090、 BAE07048、 BAE07040、 BAE07032、 BAE07024、 BAE07016、 BAE07008、 BAE07000、 BAE06992、 BAE06984、 BAE06976、 BAE06968、 BAE06960、 BAE06952、 BAE06944、 BAE06936、 BAE06928、 BAE06920、 BAE06912、 BAE06904、 BAE06896、 BAE06888、 BAE06880、 BAE06872、 BAE06864、 BAE06856、
BAE07121、 BAE07113、 BAE07105、 BAE07097, BAE07089、 BAE07047、 BAE07039、 BAE07031、 BAE07023、 BAE07015、 BAE07007、 BAE06999、 BAE06991、 BAE06983、 BAE06975、 BAE06967、 BAE06959、 BAE06951、 BAE06943、 BAE06935, BAE06927、 BAE06919、 BAE06911、 BAE06903、 BAE06895、 BAE06887、 BAE06879、 BAE06871、 BAE06863、 BAE06855、
BAE06854、BAE06853 和 BAE06852)。在不同的實施方案中，聚合物合酶可通過使底物(R)-羥基酰基-CoA或其他CoA 硫酯或其衍生物聚合或促進其聚合作用而用于在體外生產聚合物微粒。在不同的實施方案中，底物或底物混合物包含至少一種任選地取代的氨基酸、乳酸鹽、酯或者飽和或不飽和的脂肪酸，優選酰基_CoA。在不同的實施方案中，表達構建體處于高拷貝數載體之中。在不同的實施方案中，表達構建體包含至少一個編碼附加多肽的核酸序列。在不同的實施方案中，構建體還包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，或
ii.至少一個還原酶，或iii.⑴和(ii)兼而有之。在不同的實施方案中，構建體包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，ii.至少一個還原酶，iii.至少一個聚合物合酶，iv.至少一個能夠引發免疫應答的抗原，v.至少一個與至少一個能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，vi.包含上述i)至V)中一項或多項的融合蛋白，vii.上述i)至vi)中的任一組合。在不同的實施方案中，構建體包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，ii.至少一個還原酶，iii.至少一個聚合物合酶，iv.至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原，或v.至少一個與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，vi.包含上述i)至V)中一項或多項的融合蛋白，vii.上述i)至vi)中的任一組合。在不同的實施方案中，所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列與強啟動子有效連接。在不同的實施方案中，強啟動子是病毒啟動子或噬菌體啟動子。在不同的實施方案中，啟動子是噬菌體啟動子，例如T7噬菌體啟動子。在不同的實施方案中，在微粒形成蛋白底物、優選聚合物合酶底物或底物混合物的存在下維持宿主細胞，包括單體底物、能夠被宿主細胞代謝形成所述微粒形成蛋白底物的前體底物。在不同的實施方案中，宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體。在宿主細胞含有至少兩個不同的表達構建體的多個實施方案中，一個表達構建體選自下組包含編碼微粒形成蛋白的核酸序列的表達構建體，或包含編碼微粒大小決定蛋白的核酸序列的表達構建體，或包含編碼聚合物調節蛋白的核酸序列的表達構建體。在不同的實施方案中，編碼融合多肽的核酸序列包含與編碼微粒形成蛋白(優選聚合物合酶)的核酸序列的5’或3’端鄰接的、編碼能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原、或與能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列；或通過期望長度的多核苷酸接頭或間隔臂序列而與編碼微粒形成蛋白(優選聚合物合酶)的核酸序列的5’或3’端間接融合的、編碼能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原、或與能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列；或任選地通過期望長度的多核苷酸接頭或間隔臂序列而插入在編碼微粒形成蛋白 (優選聚合物合酶)的核酸序列之中的、編碼能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原、 或與能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列；或位于編碼能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原、或與能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列與編碼微粒形成蛋白(優選聚合物合酶)的核酸序列之間的、編碼蛋白酶切割位點的核酸序列；或位于編碼能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原、或與能夠引發受試者細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列與編碼微粒形成蛋白(優選聚合物合酶)的核酸序列之間的、編碼自我剪接元件的核酸序列；或其中兩項或更多項的任意組合。在不同的實施方案中，至少一個融合多肽包含與包含微粒形成蛋白(優選聚合物合酶)的氨基酸序列的N-或C-末端鄰接的、 包含能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原、或包含與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的氨基酸序列；或通過期望長度的肽接頭或間隔臂序列而與包含微粒形成蛋白(優選聚合物合酶) 的氨基酸序列的N-或C-末端間接融合的、包含能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原、或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的氨基酸序列；或通過期望長度的肽接頭或間隔臂序列而插入在包含微粒形成蛋白(優選聚合物合酶)的氨基酸序列之中的、包含能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原、或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的氨基酸序列；或位于包含能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原、或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的氨基酸序列與編碼微粒形成蛋白(優選聚合物合酶)的氨基酸序列之間的、包含蛋白酶切割位點的氨基酸序列；或位于包含能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原、或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的氨基酸序列與編碼微粒形成蛋白(優選聚合物合酶)的氨基酸序列之間的、包含自我剪接元件的氨基酸序列；或其中兩項或更多項的任意組合。在不同的實施方案中，編碼融合多肽的核酸包含與編碼微粒形成蛋白的核酸序列的5’或3’端鄰接的、編碼結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列；或通過期望長度的多核苷酸接頭或間隔臂序列而與編碼微粒形成蛋白的核酸序列的5’或3’端間接融合的、編碼結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列；或任選地通過期望長度的多核苷酸接頭或間隔臂序列而插入在編碼微粒形成蛋白的核酸序列之中的、編碼結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列； 或位于編碼結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列與編碼微粒形成蛋白的核酸序列之間的、編碼蛋白酶切割位點的核酸序列；或
位于編碼結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列與編碼微粒形成蛋白的核酸序列之間的、編碼自我剪接元件的核酸序列；或其中兩項或更多項的任意組合。在不同的實施方案中，至少一個融合多肽包含與包含微粒形成蛋白的氨基酸序列的N-或C-末端鄰接的、包含結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的氨基酸序列；或通過期望長度的肽接頭或間隔臂序列而與包含微粒形成蛋白的氨基酸序列的 N-或C-末端間接融合的、包含結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的氨基酸序列；或通過期望長度的肽接頭或間隔臂序列而插入在包含微粒形成蛋白的氨基酸序列之中的、包含結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的氨基酸序列；或位于包含結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的氨基酸序列與編碼微粒形成蛋白的氨基酸序列之間的、包含蛋白酶切割位點的氨基酸序列；或位于包含結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的氨基酸序列與編碼微粒形成蛋白的氨基酸序列之間的、包含自我剪接元件的氨基酸序列；或其中兩項或更多項的任意組合。在不同的實施方案中，表達構建體包含組成型或調控型啟動子系統。在不同的實施方案中，調控型啟動子系統是誘導型或阻遏型啟動子系統。在不同的實施方案中，調控型啟動子系統選自LacI、 ρ、噬菌體γ和噬菌體RNA 聚合酶啟動子系統。在一個實施方案中，啟動子是本領域技術人員已知的任何強啟動子。合適的強啟動子包括腺病毒啟動子，例如腺病毒主要晚期啟動子；或異源啟動子，例如巨細胞病毒 (CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；猴病毒40(SV40)啟動子；誘導型啟動子，例如MMT啟動子；金屬硫蛋白啟動子；熱激啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子，例如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；逆轉錄病毒LTR ； β -肌動蛋白啟動子；人生長激素啟動子；噬菌體啟動子例如T7、SP6和T3RNA聚合酶啟動子以及花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)啟動子。在不同的實施方案中，啟動子是T7RNA聚合酶啟動子，例如如公開號為 W02007/037706 的 PCT/NZ2006/000251 中所述的 T7RNA 聚合酶啟動子。在不同的實施方案中，細胞含有兩個或更多不同的表達構建體，每個表達構建體編碼不同的融合多肽。在不同的實施方案中，能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原是來自于細胞內病原體的抗原。在不同的實施方案中，能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原選自來自下組病原體的抗原分枝桿菌屬(MyccAacterium)(例如牛分枝桿菌(M. bovis)、結核分枝桿菌(M. tuberculosis)、麻風分枝桿菌(M. leprae)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、 鳥分枝桿菌(M. avium)、鳥分枝桿菌副結核亞種(M. aviumparatuberculosis)、分枝桿菌(Mycobacterium sp.))、李斯特菌屬(Listeria)(例如產單核細胞李斯特菌 (L. monocytogenes)、李斯特菌(Listeria sp·))、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如傷寒沙
35門氏菌(S. typhi))、耶爾森氏菌屬(Yersinia)(例如鼠疫耶爾森氏菌(Y. pestis)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y. enterocolitica)、假結核耶爾森氏菌(Y. pseudotuberculosis))、 炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、軍團菌屬(Legionella)(例如嗜肺軍團菌 (L. pneumophila)、長灘軍團菌(L. Iongbeacha)、博茲曼軍團菌(L. bozemanii)、軍團菌 (Legionella sp.))、立克次體屬(Rickettsia)(例如立氏立克次體(R. rickettsii)、螨立克次體(R. akari)、康氏立克次體(R. conorii)、西伯利亞立克次體(R. siberica)、澳大利亞立克次體(R. australis)、日本立克次體(R. japonica)、非洲立克次體(R. africae)、 普氏立克次體(R. prowazekii)、斑疹傷寒立克次體(R. typhi,)、立克次體(Rickettsia sp.))、衣原體屬(Chlamydia)(例如肺炎衣原體(C. pneumoniae)、沙眼衣原體 (C. trachomatis)、衣原體(Chlamydia sp.))、嗜性衣原體屬(Clamydophila)(例如鸚鵡熱嗜性衣原體(C. psittaci)、流產嗜性衣原體(C. abortus))、鏈球菌屬(Mi^ptococcus)(例如肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)、釀膿鏈球菌(S. pyogenes)、無乳鏈球菌(S. agalactiae))、 葡萄球菌屬Staphylococcus)(金黃色葡萄球菌(S. aureus)，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA))、埃立克體屬Ehrlichia)(例如查菲埃立克體(E. chaffeensis)、嗜吞噬細胞埃立克體群、埃立克體(Ehrlichia sp.))、貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii)、利什曼原蟲(Leishmania sp.)、剛地弓形蟲(Toxpolasma gondii)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、 組織胞漿菌(Histoplasma sp. )、土拉熱弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、以及病毒，包括丙肝病毒、腺病毒、小核糖核酸病毒，包括柯薩奇病毒；甲肝病毒、脊髓灰質炎病毒、 皰疹病毒科，包括EB病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、人皰疹病毒8型、水痘帶狀皰疹病毒；嗜肝DNA病毒，包括乙肝病毒；黃病毒科，包括丙肝病毒、黃熱病毒、登革病毒、西尼羅病毒；逆轉錄病毒，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)；正粘病毒，包括流感病毒；副粘病毒，包括麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒；乳頭瘤病毒屬，包括乳頭瘤病毒；彈狀病毒屬，包括狂犬病毒；披膜病毒，包括風疹病毒；以及其他病毒，包括痘苗病毒、禽痘病毒、腺相關病毒、改良型痘苗病毒安卡拉株、塞姆利基森林病毒、 痘病毒和冠狀病毒；或所述抗原為任一上述抗原的至少一個抗原性部分或T細胞表位。
在不同的實施方案中，結核分枝桿菌抗原選自下組早期分泌抗原靶蛋白 (ESAT) -6、Ag85A、Ag85B (MPT59)、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT51、MPT59、MPT63、MPT64、MPT83、 MPB5、MPB59、MPB64、MTC28、Mtb2、Mtb8. 4、Mtb9. 9、Mtb32A、Mtb39、Mtb41、TB10. 4、TB10C、 TB11B、TB12. 5、TB13A、TB14、TB15、TB15A、TB16、TB16A、TB17、TB18、TB21、TB20. 6、TB24、 TB27B、TB32、TB32A、TB33、TB38、TB40. 8、TB51、TB54、TB64、CFP6、CFP7、CFP7A、CFP7B、CFP8A、 CFP8B、CFP9、CFP10、CFPl 1、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、 CFP22A、CFP23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP27、CFP28、CFP28B、CFP29、CFP30A、 CFP30B、CFP50、CWP32、hspX(a -晶型)、ΑΡΑ、結核菌素純蛋白衍生物(PPD)、ST-CF、ΡΡΕ68、 LppX, PstS-U PstS-2、PstS-3、HBHA, GroEL, GroEL2、GrpES, LHP、19kDa 月旨蛋白、71kDa、 RD1-0RF2、RD1-0RF3、RD1-0RF4、RD1-0RF5、RD1-0RF8、RD1-0RF9A、RD1-0RF9B、Rvl984c、 Rv0577、Rvl827、BfrB、Tpx. Rvl352、Rvl810、PpiA、Cut2、FbpB、FbpA、FbpC、DnaK、FecB、Ssb、 RplL、FixA、FixB、AhpC2、Rv2626c、Rvl211、Mdh、Rvl626、Adk、ClpP、SucD(Belisle et al, 2005 ；US 7, 037, 510 ；US 2004/0057963 ；US 2008/0199493 ;US2008/0267990)，或任一上述抗原的至少一個抗原性部分或T細胞表位。
在一個例子中，結核分枝桿菌抗原是早期分泌抗原靶蛋白(ESAT)-6、Ag85A、 ESAT-6的至少一個抗原性部分、Ag85A的至少一個抗原性部分、或其中兩項或更多項的任意組合，例如ESAT-6和Ag85A兩項。在不同的實施方案中，與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，例如與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域選自蛋白、蛋白片段、結合結構域、靶標結合結構域、結合蛋白、結合蛋白片段、抗體、抗體片段、抗體重鏈、抗體輕鏈、 單鏈抗體、單域抗體(例如VHH)、Fab抗體片段、Fc抗體片段、Fv抗體片段、F(ab’)2抗體片段、Fab’抗體片段、單鏈Fv(ScFv)抗體片段、T細胞受體、MHC I類分子、MHC II類分子或其組合。例如，在不同的實施方案中，結核分枝桿菌抗原結合結構域選自蛋白、蛋白片段、 結合結構域、靶標結合結構域、結合蛋白、結合蛋白片段、抗體、抗體片段、抗體重鏈、抗體輕鏈、單鏈抗體、單域抗體(例如VHH)、Fab抗體片段、Fc抗體片段、Fv抗體片段、F(ab’)2抗體片段、Fab’抗體片段、單鏈Fv(ScFv)抗體片段、T細胞受體、MHCI類分子、MHCII類分子或其組合。在不同的實施方案中，組合物含有同質聚合物微粒群。在不同的實施方案中，組合物含有混合的聚合物微粒群。免疫應答是細胞介導的免疫應答，或體液免疫應答，或細胞介導的免疫應答與體液免疫應答兩者的組合。例如，免疫應答是細胞介導的免疫應答而沒有顯著的體液應答。例如，免疫應答是細胞介導的免疫應答，例如IFN-Y反應所指示的應答，而沒有顯著的IgA反應，或沒有顯著的IgE反應，或沒有顯著的IgG反應，包括沒有顯著的IgGl反應，或沒有顯著的IgG2反應， 或沒有顯著的IgM反應。在另一個例子中，免疫應答是體液應答而沒有顯著的細胞介導的應答。會理解本發明的焦點在于引發免疫應答從而有效治療或預防本文所述的疾病或病況。同樣會理解，考慮到免疫應答的性質，引發細胞介導的免疫應答也可以引發體液應答，從而受試者對本發明方法的反應實際上可以是細胞介導的免疫應答與體液免疫應答兩者的組合。所述及的本文公開的數字范圍(例如1-10)旨在也并入對落在該范圍內的所有有理數(例如1、1· 1、2、3、3.9、4、5、6、6. 5、7、8、9和10)以及落在該范圍內的任何有理數范圍 (例如2-8、1.5-5.5和3. 1-4. 7)的述及，所以，本文明確公開的所有范圍的所有亞范圍都在此明確公開了。這些僅僅具體意圖的例子而已，而且與此類似，所列舉的最低值和最高值之間所有可能的數值組合應視為在已本申請中明確陳述。本發明更多的方面和優點會因為下面僅作為舉例給出的說明而變得顯而易見。在本說明書引用專利說明書、其他外部文獻或其他信息來源的情況下，通常是出于提供討論本發明技術特征的背景的目的。除非另有明確說明，對此類外部文獻的引用在任何管轄區域內都不應闡釋為承認此類文獻或此類信息來源為現有技術或構成部分本領域的公知常識。附圖的簡短說明根據僅作為舉例說明的如下說明，參照附圖，本發明的其他方面將變得顯而易見。


圖1顯示了抗H印C抗體與H印C聚合物微粒的結合。參見本文實施例4。圖2顯示了免疫接種了抗丙肝病毒的不同聚合物微粒疫苗的小鼠中的IgGl抗體反應。EC50指給出半數最大光密度的血清滴度的倒數。檢測水平為25。*表示與其他組別差異顯著(P < 0. 05)。細線表示SEM。參見本文實施例4。圖3顯示了免疫接種了抗丙肝病毒的不同聚合物微粒疫苗的小鼠中的IgG2c抗體反應。EC50指給出半數最大光密度的血清滴度的倒數。檢測水平為25。*表示與其他組別差異顯著(P < 0. 05)。細線表示SEM。參見本文實施例4。圖4顯示了免疫接種了抗肝炎病毒的不同聚合物微粒疫苗的小鼠中的IFN-Y反應。*表示與其他組別差異顯著(P < 0. 05)。細線表示SEM。參見本文實施例4。圖5顯示了以0-90 μ g展示Ag85A-ESAT_6的聚合物微粒或30 μ g重組 Ag85A-ESAT-6免疫接種3次的小鼠中的抗體反應。*表示與PBS免疫接種的對照組相比反應顯著更大(ρ <0.01)。**表示與其他所有疫苗接種組相比反應顯著更大(ρ <0.01)。 參見本文實施例5。圖6顯示了以30 μ g野生型聚合物微粒、Ag85A-ESAT-6聚合物微粒、含Emulsigen 的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒免疫接種3次的小鼠或未進行免疫接種的小鼠中的抗體反應。 *表示與PBS免疫接種的對照組相比反應顯著更大(p<0.01)。**表示與其他所有疫苗接種組相比反應顯著更大(P < 0. 01)。參見本文實施例5。圖7顯示了以0-90 μ g展示Ag85A-ESAT-6的聚合物微粒或30 μ g重組 Ag85A-ESAT-6免疫接種3次的小鼠中的IFN- Y反應。*表示與PBS免疫接種的對照組相比反應顯著更大(P < 0. 01)。**表示與其他所有疫苗接種組相比反應顯著更大(ρ < 0. 01)。 參見本文實施例5。圖8顯示了以30 μ g野生型聚合物微粒、Ag85A-ESAT-6聚合物微粒、含Emulsigen 的Ag85A-ESAT-6聚合物微粒免疫接種3次的小鼠或未進行免疫接種的小鼠中的IFN- γ反應。*表示與PBS免疫接種的對照組相比反應顯著更大(ρ<0.01)。**表示與其他所有疫苗接種組相比反應顯著更大(P < 0. 01)。參見本文實施例6。圖9顯示了抗ESAT-6抗體與Ag8fe_ESAT_6聚合物微粒的結合。參見本文實施例 5。圖10顯示了小鼠在用不同聚合物微粒疫苗進行疫苗接種、隨后用牛分枝桿菌激發之后的肺培養結果。*表示與非疫苗接種組的統計學差異(P <0.05)。細線表示SEM。 參見本文實施例6。圖11顯示了小鼠在用不同聚合物微粒疫苗進行疫苗接種之后的脾培養結果。*表示與非疫苗接種組的統計學差異(P <0.05)。細線表示SEM。參見本文實施例6。圖12顯示了小鼠在用不同聚合物微粒疫苗進行疫苗接種、隨后用牛分枝桿菌激發之后的IgGl抗體反應。EC50指給出半數最大光密度的血清滴度的倒數。檢測水平為25。 *表示與其他組別差異顯著(P < 0. 05)。細線表示SEM。參見本文實施例6。圖13顯示了小鼠在用不同聚合物微粒疫苗進行疫苗接種、隨后用牛分枝桿菌激發之后的IgG2c抗體反應。EC50指給出半數最大光密度的血清滴度的倒數。檢測水平為 25。*表示與其他組別差異顯著(ρ < 0. 05)。細線表示SEM。參見本文實施例6。發明詳述
本發明涉及聚合物微粒及其用途。具體地，本發明涉及功能化的聚合物微粒，例如生產功能化聚合物微粒的方法，及其治療或預防不同疾病和病況的用途，包括那些因病原體所致或與之相關的疾病或病況，包括本文所鑒定的或所述的那些病原體。本發明功能化的聚合物微粒可以包含一個或多個表面結合的融合多肽，而且也可以包含一個或多個摻入或吸附于聚合物微粒核的物質，一個或多個結合于表面結合的融合多肽的物質，或其組合。1.定義術語“編碼區”或“開放閱讀框”(ORF)是指基因組DNA序列或cDNA序列的有義鏈， 其在適宜調控序列的控制之下產生轉錄產物和/或多肽。編碼序列通過5’翻譯起始密碼子和3’翻譯終止密碼子的存在而鑒別。在插入到遺傳構建體中的情況下，“編碼序列”有效連接于啟動子和終止子序列時能夠表達。如本說明書所用的術語“包含”表示“至少部分地包括”。在闡釋本說明書中每一個包括術語“包含”的陳述時，除以該術語開場之外的其他特征也可以存在。相關術語例如 “含有”和“包括”應以相同方式進行闡釋。如本文所用的術語“偶聯劑是指適于與至少一個物質或另一偶聯劑結合的無機或有機化合物，所述另一偶聯劑適于在一側結合偶聯劑而另一側結合至少一個物質。適宜偶聯劑的例子，及其應用的示例性方法(包括適于化學修飾本發明的微粒或融合蛋白的方法)在公開號為W02004/020623(Bemd Rehm)的PCT/DE2003/002799中提出，在此全文并入作為參考。術語“表達構建體”是指遺傳構建體，包括允許插入的多核苷酸分子轉錄和任選的將轉錄物翻譯成多肽的元件。表達構建體典型地按5’至3’方向包含(1)在待引入構建體的宿主細胞中有功能的啟動子，(2)待表達的多核苷酸，和(3)在待引入構建體的宿主細胞中有功能的終止子。本發明的表達構建體插入到可復制的載體中用于克隆或表達，或者整合到宿主基因組中。適合調整而適應本發明應用的表達構建體的例子在公開號為 W02004/020623 (Bernd Rehm)的 PCT/DE2003/002799 以及公開號為 W02007/037706 (Bernd Rehm)的PCT/NZ2006/000251中提供，在此全文并入作為參考。如本文所用的術語“形成聚合物微粒”和“聚合物微粒形成”是指如本文所討論的微粒形成蛋白的活性。多肽“片段”是多肽中行使酶活或結合活性所需功能和/或提供多肽三維結構的亞序列。如本文所用的術語“融合多肽”是指包含兩個或更多氨基酸序列的多肽，例如兩個或更多的多肽結構域通過相應的氨基和羧基殘基以肽鍵融合從而形成單個連續的多肽。應當理解，兩個或更多氨基酸序列可以直接融合，或者借助接頭或間隔臂或附加多肽而通過其相應的氨基和羧基末端間接地融合。在一個實施方案中，包含融合多肽的氨基酸序列之一包含微粒形成蛋白。在一個實施方案中，包含融合多肽的氨基酸序列之一包含結核分枝桿菌抗原、結核分枝桿菌抗原結合結構域、或融合配偶體。如本文所用的術語“融合配偶體”是指多肽，例如蛋白、蛋白片段、結合結構域、靶標結合結構域、結合蛋白、結合蛋白片段、抗體、抗體片段、抗體重鏈、抗體輕鏈、單鏈抗體、 單域抗體(例如VHH)、Fab抗體片段、Fc抗體片段、Fv抗體片段、F(ab，)2抗體片段、Fab， 抗體片段、單鏈Fv(SCFV)抗體片段、抗體結合結構域(例如^結構域)、抗原、抗原決定簇、 表位、半抗原、免疫原、免疫原片段、生物素、生物素衍生物、親和素、鏈霉親和素、底物、酶、 抗體酶、輔因子、受體、受體片段、受體亞單位、受體亞單位片段、配體、抑制因子、激素、凝集素、多聚組氨酸、偶聯結構域、DNA結合結構域、FLAG表位、半胱氨酸殘基、文庫肽、報告肽、 親和純化肽，或其中任何兩項或多項的任意組合。應當理解，上文所列的兩個或更多個多肽能夠形成融合配偶體。在一個實施方案中，融合多肽的氨基酸序列通過接頭或間隔臂間接融合，例如，所述融合多肽的氨基酸序列的排列順序為聚合物合酶-接頭-能夠引發免疫應答的抗原、或能夠引發免疫應答的抗原-接頭-聚合物合酶、或聚合物合酶-接頭-能夠引發免疫應答的抗原的結合結構域、或能夠引發免疫應答的抗原的結合結構域-接頭-聚合物合酶。在其他實施方案中，融合多肽的氨基酸序列通過附加多肽間接融合或者或包含附加多肽，排列順序為聚合物合酶-附加多肽-能夠引發免疫應答的抗原、或聚合物合酶-附加多肽-能夠引發免疫應答的抗原的結合結構域、或聚合物合酶-接頭-能夠引發免疫應答的抗原-附加多肽、或聚合物合酶-接頭-能夠引發免疫應答的抗原的結合結構域-附加多肽。同樣， 此處明確考慮聚合物合酶的N-末端延伸。免疫應答包括細胞介導的和體液免疫應答。在一個實施方案中，融合多肽的氨基酸序列通過接頭或間隔臂間接融合，例如，所述融合多肽的氨基酸序列的排列順序為聚合物合酶-接頭-結核分枝桿菌抗原、或結核分枝桿菌抗原-接頭-聚合物合酶、或聚合物合酶-接頭-結核分枝桿菌抗原結合結構域、 或結核分枝桿菌抗原結合結構域-接頭-聚合物合酶。在其他實施方案中，融合多肽的氨基酸序列通過附加多肽間接融合或者或包含附加多肽，排列順序為聚合物合酶-附加多肽-結核分枝桿菌抗原、或聚合物合酶-附加多肽-結核分枝桿菌抗原結合結構域、或聚合物合酶-接頭-結核分枝桿菌抗原-附加多肽、或聚合物合酶-接頭-結核分枝桿菌抗原結合結構域-附加多肽。同樣，此處明確考慮聚合物合酶的N-末端延伸。根據本發明的融合多肽還可以包含插入在另一多肽序列之中的一個或多個多肽序列。例如，諸如蛋白酶識別序列的多肽序列插入到包含微粒結合結構域的蛋白質的可變區中。便利地，本發明的融合多肽由單個核酸序列編碼，其中該核酸序列包含至少兩個分別編碼多肽或多肽結構域的亞序列。在某些實施方案中，所述至少兩個亞序列以“同一閱讀框”存在以構成單個開放閱讀框從而編碼如本文所討論的融合多肽。在其他實施方案中， 所述至少兩個亞序列以“不同閱讀框”存在，并被核糖體閱讀框移碼位點或促進閱讀框移碼的其他序列隔開，從而在翻譯后形成融合多肽。在某些實施方案中，所述至少兩個亞序列是鄰接的。在其他實施方案中，例如在上文所討論的那些至少兩個多肽或多肽結構域通過附加多肽間接融合的情況下，所述至少兩個亞序列是不鄰接的。“結合結構域”或“能夠結合......的結構域”旨在表示互補結合對中的一半，可以包括上文所列的結合對。例如，抗體-抗原、抗體-抗體結合結構域、生物素-鏈霉親和素、受體-配體、酶-抑制因子對。靶標結合結構域將結合樣品中的靶分子，為例如抗體或抗體片段。多肽結合結構域將結合多肽，為例如抗體或抗體片段、或來自受體或信號傳導蛋白的結合結構域。為結合結構域所結合的物質的例子包括蛋白、蛋白片段、肽、多肽、多肽片段、抗體、抗體片段、抗體結合結構域、抗原、抗原片段、抗原決定簇、表位、半抗原、免疫原、免疫原片段、藥物活性劑、生物活性劑、佐劑或其中任何兩項或多項的任意組合。這樣的物質為根據本發明方法所分析的樣品中的“靶組分”。從而，“與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結構域”及其語法意義上的等同體應理解為是指互補結合對中的一個組分，其中另一組分是能夠引發免疫應答的抗原。同樣，“與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結構域”及其語法意義上的等同體應理解為是指互補結合對中的一個組分，其中另一組分是能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原。例如，“能夠結合結核分枝桿菌抗原的結構域”也可以稱為“結核分枝桿菌抗原結合結構域”，是能夠結合一個或多個結核分枝桿菌抗原的結構域。從而，“結核分枝桿菌抗原結合結構域”是能夠結合一個或多個結核分枝桿菌抗原的結構域。如本文所用的“結核分枝桿菌抗原”是來源于結核分枝桿菌的抗原。同樣，其他抗原也以其來源生物進行標識。短語“能夠引發免疫應答的抗原”是指當與免疫系統的一個或多個因子(例如一個或多個抗體或一個或多個細胞)接觸時能夠引發或上調免疫系統反應性的抗原，例如上調一個或多個T細胞群，例如增加CD8+T細胞活CD4+T細胞活性或數量，或上調一個或多個 B細胞群，例如能夠產生特異于該抗原或能夠結合該抗原的抗體的一個或多個B細胞群，或增加一個或多個抗體群的數量或活性。短語“能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原”是指當與免疫系統的一個或多個細胞接觸時能夠引發或上調免疫系統反應性的抗原，例如上調一個或多個T細胞群，例如增加⑶8+T細胞活⑶4+T細胞活性或數量。術語“遺傳構建體”是指多核苷酸分子，通常為雙鏈DNA，可以有其他多核苷酸分子 (插入的多核苷酸分子)例如但不限于cDNA分子插入其中。遺傳構建體可以含有允許插入的多核苷酸分子轉錄和任選的將轉錄物翻譯成多肽的必要元件。插入的多核苷酸分子來源于宿主細胞、或來源于不同的細胞或生物體和/或為重組多核苷酸。一旦進入宿主細胞，遺傳構建體整合到宿主染色體DNA中。在一個實例中，遺傳構建體與載體相連。術語“宿主細胞”是指細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或動物細胞，例如哺乳動物宿主細胞，其為1)天然PHA微粒生產宿主細胞，或幻攜帶表達構建體的宿主細胞，所述表達構建體包含編碼至少一個硫解酶和還原酶和任選的包涵體蛋白 Phasin的核酸序列。需要哪些基因來補充宿主細胞聚合物微粒形成所缺少的那些將取決于宿主細胞的基因組成以及培養基中所提供的底物。如本文所用的術語“接頭或間隔臂是指將兩個或更多個多肽或編碼兩個或更多個多肽的兩個或更多個核酸序列間接融合起來的氨基酸或核苷酸序列。在一些實事方案中， 接頭或間隔臂長約 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或約100個氨基酸或核苷酸。在其他實施方案中，接頭或間隔臂長約100、125、150、175、200、 225、250、275、300、325、350、375、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或約1000個氨基酸或核苷酸。而在其他實施方案中，接頭或間隔臂長約1至約1000個氨基酸或核苷酸、長約10至約1000、長約50至約1000、長約100至約1000、長約200至約1000、 長約300至約1000、長約400至約1000、長約500至約1000、長約600至約1000、長約700 至約1000、長約800至約1000或長約900至約1000個氨基酸或核苷酸。在一個實施方案中，接頭或間隔臂可以包含限制性酶識別位點。在另一實施方案中，接頭或間隔臂可以包含蛋白酶切割識別序列，例如腸激酶、凝血酶或)(a因子識別序列， 或自身剪接元件例如蛋白內含子。在另一實施方案中，接頭或間隔臂促進融合多肽的獨立折疊。如本文所用的術語“混合群”是指兩個或更多個實體群，落在混合群范圍內的每個實體群與落在該混合群范圍內的另一實體群在一些方面存在差異。例如，當用來表述混合的表達構建體群時，是指兩個或更多個表達構建體群，其中每個表達構建體群就該群成員所編碼的融合多肽而言、或就構建體的一些其他方面(例如構建體中存在的啟動子的身份)而言存在差異。或者，當用來表述混合的融合多肽群時，是指兩個或更多個融合多肽群，其中每個融合多肽群就多肽，例如聚合物合酶、能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原、 或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域、該群所含的成員而言存在差異。例如，在治療結核病的用途的情況下，混合的融合多肽群是指兩個或更多個融合多肽群，其中每個融合多肽群就多肽，例如聚合物合酶、結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域、該群所含的成員而言存在差異。與此相似，在肝炎或流感的情況下，混合的融合多肽群是指兩個或更多個融合多肽群，其中每個融合多肽群就多肽、例如聚合物合酶、 肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原結合結構域、流感病毒抗原或流感病毒抗原結合結構域、該群所含的成員而言存在差異。還有，當述及混合的微粒群時，是指兩個或更多個微粒群，其中每個微粒群就融合多肽或該群所攜帶成員而言存在差異。如本文所用的術語“核酸”是指脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸堿基或天然核苷酸已知類似物或其混合物的單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非另有說明，該術語包括對具體序列及其互補序列的引述。術語“核酸”和“多核苷酸”在本文可互換使用。“有效連接”表示待表達的序列置于調控元件的控制之下，調控元件包括啟動子、 組織特異性調控元件、瞬時調控元件、增強子、阻遏子和終止子。術語“過表達”通常是指宿主細胞中基因產物的產量超過了正常或未轉化宿主細胞中的產量水平。當術語“過表達”用來表述信使RNA水平時，優選表示表達水平比對照宿主細胞或未轉化細胞中通常觀察到的高至少大約3倍。更優選表達水平比對照宿主細胞或未轉化細胞中通常觀察到的高至少大約5倍、大約10倍、大約15倍、大約20倍、大約25 倍、大約30倍、大約35倍、大約40倍、大約45倍、大約50倍、大約55倍、大約60倍、大約 65倍、大約70倍、大約75倍、大約80倍、大約85倍、大約90倍、大約95倍、或大約100倍或以上。mRNA的水平利用本領域技術人員已知的多種技術中的任何一種測量，包括但不限于RNA 印跡(Northern blot)分析和 RT-PCR，包括定量 RT-PCR。如本文所用的術語“微粒形成蛋白”是指參與微粒形成的蛋白。例如，其可以選自
42下組的蛋白聚合物解聚酶、聚合物調控蛋白、聚合物合酶和微粒大小決定蛋白。優選微粒形成蛋白選自下組硫解酶、還原酶、聚合物合酶和包涵體蛋白phasin。微粒形成蛋白例如合酶可以通過使底物或底物衍生物聚合形成聚合物微粒而催化形成聚合物微粒。或者，微粒形成蛋白例如硫解酶、還原酶、或包涵體蛋白Phasin可以通過促進聚合化作用而促進聚合物微粒形成。例如，硫解酶或還原酶可以催化產生聚合酶的適宜底物。包涵體蛋白phasin 可以控制所形成的聚合物微粒的大小。優選聚合物微粒形成蛋白包含微粒結合結構域和微粒形成結構域。如本文所用，術語“微粒形成反應混合物”在宿主細胞或表達構建體包含合酶催化結構域的情況下至少是指聚合物合酶底物，或者在宿主細胞或表達構建體包含其他微粒形成蛋白或并非聚合物合酶催化結構域的微粒結合結構域的情況下至少是指聚合物合酶及其底物。“微粒大小決定蛋白”是指控制微粒大小的蛋白。其可以例如來源于包涵體蛋白 phasin樣蛋白家族，優選選自來自雷爾氏菌屬、產堿菌屬和假單胞菌屬的蛋白，更優選來自真養雷爾氏菌包涵體蛋白phasin基因phaP和來自食油假單胞菌的包涵體蛋白phasin基因phaF。包涵體蛋白phasin為分子量1448kDa的兩性蛋白，與聚合物微粒的疏水表面緊密結合。這也可以包含結合微粒并決定微粒大小的其他宿主細胞蛋白。術語“病原體”或“細胞內病原體”或“微生物”是指至少部分其繁殖或生命周期存在于宿主細胞內的任何生物，無論是在細胞質中還是在液泡內。細胞內病原體包括病毒 (例如CMV、HIV)、細菌(分枝桿菌屬、李斯特菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬(Siigella)、 耶爾森氏菌屬、布魯氏菌屬、芽孢桿菌屬、軍團菌屬、立克次體屬、衣原體屬、嗜性衣原體屬、 鏈球菌屬、葡萄球菌屬、埃立克體屬、弗朗西斯氏菌屬、腸致病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌)、原生動物(例如，弓形蟲屬)、真菌和細胞內寄生蟲(例如瘧原蟲屬(Plasmodium))。將會理解病原體典型地是宿主特異性的。從而，本發明的方法和組合物適合于改良(用于)對特定宿主物種進行抗特定病原體免疫，包括進行抗物種特異性病原體免疫。例如，對人類進行抗病原體免疫，包括人特異性病原體，例如分枝桿菌屬(例如牛分枝桿菌、 結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結核亞種、分枝桿菌)、李斯特菌屬(例如產單核細胞李斯特菌、李斯特菌)、沙門氏菌屬(例如傷寒沙門氏菌)、耶爾森氏菌屬(例如鼠疫耶爾森氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、假結核耶爾森氏菌)、 炭疽芽孢桿菌、軍團菌屬(例如嗜肺軍團菌、長灘軍團菌、博茲曼軍團菌、軍團菌)、立克次體屬(例如立氏立克次體、螨立克次體、康氏立克次體、西伯利亞立克次體、澳大利亞立克次體、日本立克次體、非洲立克次體、普氏立克次體、斑疹傷寒立克次體、立克次體)、衣原體屬(例如肺炎衣原體、沙眼衣原體、衣原體)、嗜性衣原體屬(例如鸚鵡熱嗜性衣原體、流產嗜性衣原體)、鏈球菌屬(例如肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、無乳鏈球菌)、葡萄球菌屬(例如金黃色葡萄球菌)、埃立克體屬(例如查菲埃立克體、嗜吞噬細胞埃立克體群、埃立克體)、 貝氏柯克斯體、利什曼原蟲、剛地弓形蟲、克氏錐蟲、組織胞漿菌、土拉熱弗朗西斯氏菌、以及腺病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、腺相關病毒、改良型痘苗病毒安卡拉株、塞姆利基森林病毒、痘病毒和皰疹病毒。其他屬的細胞內病原體具有寬泛的宿主特異性，包括例如布魯氏菌屬物種。布魯氏菌屬為革蘭氏陰性不運動型沒有莢膜的球桿菌。布魯氏菌屬是布魯氏菌病的病因。不同布魯氏菌屬物種的例子包括羊布魯氏菌(B.melitensis)、流產布魯氏菌、豬布魯氏菌 (B. suis)、綿羊布魯氏菌(B. ovis)、鰭型布魯氏菌(B. pinnipediae)和沙林鼠布魯氏菌 (B. neotomae)。在其他實施例中，對非人類受試者進行抗病原體免疫，包括物種特異性病原體。例如對牛、烏鴉和綿羊受試者進行抗分枝桿菌免疫，包括例如牛分枝桿菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結核亞種及其他分枝桿菌。從而，“受試者”為動物，例如哺乳動物，包括哺乳動物伴侶動物或人類。代表性的伴侶動物包括貓、馬和犬。代表性的農業動物包括牛、綿羊、鹿和豬。在一個實施方案中，人類為成人、兒童或嬰幼兒，包括免疫受損的成人、兒童或嬰幼兒，或進行了抗病原體免疫接種的、感染了病原體的、接觸了病原體的、或具有病原體感染或接觸風險的成人、兒童或嬰幼兒。術語“治療”及其派生詞(包括作為名詞的“治療”)應解釋為其最寬廣可能的含義。該術語不應理解為暗示治療受試者直至完全康復。從而“治療”廣義地包括特定病況癥狀發作或嚴重性的緩解和/或預防。如本文所用的“聚合物調控蛋白”是指調控參與聚合物微粒形成的phaA、phaB和 PhaC基因轉錄的蛋白。其通過與微粒表面結合而免受轉錄調控。此類調控蛋白的一個例子是來自真養雷爾氏菌YP_725943的包涵體蛋白phasin阻遏子(phaR)，其與包涵體蛋白 phasin樣基因的啟動子結合，其表達產物調控所形成的聚合物微粒的大小，并防止phasin 基因通讀。因為phasin阻遏子結合在所形成的聚合物微粒的表面，釋放了啟動子上的位點，所以下面的基因轉錄能夠開始。如本文所用的“聚合物合酶”是指能夠通過使底物或底物衍生物聚合形成聚合物微粒而催化形成聚合物微粒的蛋白。已經從> 45種不同的細菌中獲得了 88種PHA合酶基因的核苷酸序列，它們在一級結構、底物特異性和亞單位組成方面均有所不同(Rehm，2007)。聚合物合酶至少包含位于合酶蛋白C-末端的合酶催化結構域，其介導聚合物的聚合反應以及合酶蛋白與微粒核心的連接。用于本發明的聚合物合酶在Rehm，2003中詳細說明，在此全文并入作為參考。例如，聚合物合酶是來自不動桿菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬、色桿菌屬、假單胞菌屬、動膠菌屬、產堿菌屬、代爾夫特菌屬、伯克霍爾德菌屬、雷爾氏菌屬、紅球菌屬、戈登氏菌屬、紅細菌屬、副球菌屬、立克次體屬、柄桿菌屬、甲基桿菌屬、固氮根瘤菌屬、農桿菌屬、根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、立克次體屬、泉古菌門、集胞藻屬、外硫紅螺菌屬、莢硫菌屬、囊硫菌屬和異著色菌屬的1型PHA合酶；來自伯克霍爾德菌屬和假單胞菌屬的2型PHA合酶；或來自芽孢桿菌屬(Bacillus)的4型PHA合酶；更優選來自不動桿菌RA3849、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、斑點氣單胞菌FA440、嗜水氣單胞菌、紫色色桿菌、假單胞菌61-3、生枝動膠菌、肥大產堿菌、產堿菌SH-69、食酸代爾夫特菌、伯克霍爾德菌DSMZ9M2、真養雷爾氏菌H16、洋蔥伯克霍爾德菌、赤紅球菌PP2、戈登氏菌(Gordonia rubripertinctus)、普氏立克次體、集胞藻PCC6803、沙氏外硫紅螺菌附、普氏莢硫菌9111、 酒色異著色菌D、紫囊硫菌2311、類球紅細菌、脫氮副球菌、莢膜紅細菌、新月柄桿菌、扭脫甲基桿菌、莖瘤固氮根瘤菌、根癌農桿菌、苜蓿中華根瘤菌41、深紅紅螺菌HA和深紅紅螺菌 ATCC25903的1型PHA合酶；來自石竹伯克霍爾德菌、綠針假單胞菌、假單胞菌61_3、惡臭假單胞菌U、食油假單胞菌、銅綠假單胞菌、食樹脂假單胞菌、斯氏假單胞菌、門多薩假單胞菌、類產堿假單胞菌、惡臭假單胞菌BM01、硝基還原假單胞菌、綠針假單胞菌的2型PHA合酶; 以及來自巨大芽孢桿菌和芽孢桿菌INT005的4型PHA合酶。 其他可適用于本發明的聚合物合酶包括來自如下分別以保藏號標識的生物的聚合物合酶鉤蟲貪銅菌(AY836680)、銅綠假單胞菌(AE004091)、酒色異著色菌(AB205104)、 巨大芽孢桿菌(AF109909)、死海鹽盒菌(YP137339)、致黃假單胞菌(AB049413)、惡臭假單胞菌(AF150670)、真養雷爾氏菌(A34341)、普氏莢硫菌(X93599)、斑點氣單胞菌(032472)、 假單胞菌61-3 (AB014757和AB014758)、類球紅細菌(AAA72004)、紫色色桿菌(AAC69615)、 泊庫島食燒菌SK2 (CAL17662)、泊庫島食燒菌SK2 (CAL16866)、類球紅細菌KD131 (ACM01571 和YP002526072)、不透明紅球菌B4 (BAH51880和YP002780825)、多噬伯克霍爾德菌ATCC 17616 (YP001946215 和 BAG43679)、泊庫島食燒菌 SK2 (YP693934 和 YP693138)、深紅紅螺菌 (AAD53179)、γ 變形菌 HTCC5015 (ΖΡ05061661 和 EDY86606)、固氮弧菌 ΒΗ72 (ΥΡ932525)、 紫色色桿菌 ATCC 12472 (ΝΡ902459)、湖沉積桿菌 MED105 (ΖΡ01915838 和 EDM82867)、 Μ. algicola DG893 (ZP01895922 和 EDM46004)、類球紅細菌(CAA65833)、紫色色桿菌 ATCC 12472 (AAQ60457)、肥大產堿菌(AAD10274、AADO1209 和 AAC83658)、嗜麥芽窄食單孢菌 K279a(CAQ46418 和 YP001972712)、茄科雷爾氏菌 IP01609 (CAQ59975 和 YP002258080)、多噬伯克霍爾德菌 ATCC 17616 (YP001941448 和 BAG47458)、假單胞菌 gll3 (ACJ02400)、假單胞菌 gl06 (ACJ02399)、假單胞菌 glO 1 (ACJ02398)、根瘤菌 gl32 (ACJ02397)、豌豆根瘤菌 3841 (CAK10329 和 YP770390)、固氮弧菌 BH72 (CAL93638)、假單胞菌 LDC-5 (AAV36510)、 L. nitroferrum 2002 (ZP03698179)、索氏菌 MZlT (YP002890098 和 ACR01721)、耐輻射甲基桿菌 JCM 2831 (YP001755078 和 ACB243%)、甲基桿菌 4_46 (YP001767769 和 ACA15335)、 L. nitroferrum 2002 (EEG08921)、脫氮副球菌(BAA77257)、格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌 (M. gryphiswaldense) (ABG23018)、假單胞菌 USM4-55 (ABX64435 和 ABX64434)、嗜水氣單胞菌(AAT77261 和 AAT77258)、芽孢桿菌 INT005 (BAC45232 和 BAC45230)、惡臭假單胞菌(AAM63409 和 AAM63407)、戈登氏菌(Gordonia rubripertinctus) (AAB94058)、巨大芽孢桿菌(AAD05260)、食酸代爾夫特菌(BAA33155)、嗜絲氨酸副球菌(ACM68662)、假單胞菌 14-3(CAK18904)、假單胞菌 LDC-5 (AAX18690)、假單胞菌 PC17 (ABV25706)、假單胞菌 3Y2 (AAV3543U AAV35429 和 AAV!35426)、門多薩假單胞菌(AAM10546 和 AAM10544)、硝基還原假單胞菌(AAK19608)、類產堿假單胞菌(AAK19605)、食樹脂假單胞菌(AAD26367和 AAD26365)、假單胞菌 USM7-7 (ACM90523 和 ACM90522)、熒光假單胞菌(AAP58480)及其他未培養細菌(BAE02881、BAE02880、BAE02879、BAE02878、BAE02877、BAE02876、BAE02875、 BAE02874、BAE02873、BAE02872、BAE02871、BAE02870、BAE02869、BAE02868、BAE02867、 BAE0286、BAE02865、BAE02864、BAE02863, BAE02862、BAE0286U BAE02860, BAE02859、 BAE02858、BAE02857、BAEO7146, BAE07145、BAE07144、BAE07143、BAE07142、BAE07141、 BAE07140、BAE07139、BAE07138、BAE07137、BAE07136、BAE07135、BAE07134、BAE07133、 BAE07132、BAE07131、BAE07130、BAE07129、BAE07128、BAE07127、BAE07126、BAE07125、 BAE07124、BAE07123、BAE07122、BAE07121、BAE07120、BAE07119、BAE07118、BAE07117、 BAE07116、BAE07115、BAE07114、BAE07113、BAE07112、BAE07111、BAE07110、BAE07109、 BAE07108、BAE07107、BAE07106、BAE07105、BAE07104、BAE07103、BAE07102、BAE07101、 BAE07100、BAE07099、BAE07098、BAE07097、BAE07096、BAE07095、BAE07094、BAE07093、BAE07092、 BAE07050、 BAE07042、 BAE07034, BAE07026, BAE07018、 BAE07010、 BAE07002、 BAE06994、 BAE06986、 BAE06978、 BAE06970、 BAE06962、 BAE06954, BAE06946、 BAE06938、 BAE06930、 BAE06922、 BAE06914、 BAE06906、 BAE06898、 BAE06890、 BAE06882、 BAE06874、 BAE06866、
BAE07091、 BAE07049、 BAE07041、 BAE07033、 BAE07025, BAE07017、 BAE07009、 BAE07001、 BAE06993、 BAE06985、 BAE06977、 BAE06969、 BAE06961、 BAE06953、 BAE06945、 BAE06937、 BAE06929、 BAE06921、 BAE06913、 BAE06905、 BAE06897、 BAE06889、 BAE06881、 BAE06873、 BAE06865、
BAE07090, BAE07048、 BAE07040、 BAE07032、 BAE07024, BAE07016、 BAE07008、 BAE07000、 BAE06992、 BAE06984、 BAE06976、 BAE06968、 BAE06960、 BAE06952、 BAE06944、 BAE06936、 BAE06928、 BAE06920、 BAE06912、 BAE06904、 BAE06896、 BAE06888、 BAE06880、 BAE06872、 BAE06864、
BAE07089、 BAE07047、 BAE07039、 BAE07031、 BAE07023、 BAE07015、 BAE07007, BAE06999、 BAE06991、 BAE06983、 BAE06975、 BAE06967、 BAE06959、 BAE06951、 BAE06943、 BAE06935、 BAE06927、 BAE06919、 BAE06911、 BAE06903、 BAE06895、 BAE06887、 BAE06879、 BAE06871、 BAE06863、
BAE07088、 BAE07046、 BAE07038, BAE07030、 BAE07022、 BAE07014、 BAE07006、 BAE06998、 BAE06990、 BAE06982、 BAE06974、 BAE06966、 BAE06958、 BAE06950、 BAE06942、 BAE06934、 BAE06926、 BAE06918、 BAE06910、 BAE06902、 BAE06894、 BAE06886、 BAE06878、 BAE06870、 BAE06862、
BAE07053、 BAE07045、 BAE07037、 BAE07029, BAE07021、 BAE07013、 BAE07005、 BAE06997、 BAE06989、 BAE06981、 BAE06973、 BAE06965、 BAE06957、 BAE06949、 BAE06941、 BAE06933、 BAE06925、 BAE06917、 BAE06909、 BAE06901、 BAE06893、 BAE06885、 BAE06877、 BAE06869、 BAE06861、
BAE07052、 BAE07044、 BAE07036、 BAE07028, BAE07020、 BAE07012、 BAE07004、 BAE06996、 BAE06988、 BAE06980、 BAE06972、 BAE06964、 BAE06956、 BAE06948、 BAE06940、 BAE06932、 BAE06924, BAE06916、 BAE06908、 BAE06900、 BAE06892、 BAE06884、 BAE06876、 BAE06868、 BAE06860、
BAE07051、 BAE07043、 BAE07035、 BAE07027、 BAE07019、 BAE07011、 BAE07003、 BAE06995、 BAE06987、 BAE06979、 BAE06971、 BAE06963、 BAE06955、 BAE06947、 BAE06939、 BAE06931、 BAE06923、 BAE06915、 BAE06907、 BAE06899、 BAE06891、 BAE06883、 BAE06875、 BAE06867、 BAE06859、
BAE06858、BAE06857、BAE06856、BAE06855、BAE06854、BAE06853 和 BAE06852)。PHA合酶蛋白的N-末端片段(約氨基酸1_200或1_150或1_100)高度可變，并且在一些實例中缺失或替換為抗原、抗原結合結構域、或另一融合配偶體，而不會使酶失活或防止合酶借助于聚合物微粒結合結構域(即C-末端片段)與聚合物核心共價相連。合酶的聚合物微粒結合結構域至少包含介導聚合物核心聚合以及聚合物微粒形成的合酶蛋白的催化結構域。在一些實施方案中，PHA合酶蛋白的C-末端片段進行了修飾、部分缺失或部分替換為能夠引發免疫應答的抗原、與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域、或另一融合配偶體，而不會使酶失活或防止合酶與聚合物微粒共價相連。在某些情況下，能夠引發免疫應答的抗原、與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域、或另一融合配偶體與PHA合酶蛋白的N-末端或C-末端融合，而不會使酶失活或防止合酶與聚合物微粒共價相連。與此相似，在其他情況下，能夠引發免疫應答的抗原、與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域、或另一融合配偶體插入在PHA合酶蛋白之中，或者實際上位于微粒形成蛋白之中。PhaC融合蛋白的例子在本領域已知，且已在本文提出。在一個實例中，PHA合酶蛋白的N-末端片段(約氨基酸1-200或1-150或1-100) 高度可變，并且缺失或替換為結核分枝桿菌抗原、結核分枝桿菌抗原結合結構域、肝炎病毒抗原、肝炎病毒抗原結合結構域、流感病毒抗原、或流感病毒抗原結合結構域、或另一融合配偶體，而不會使酶失活或防止合酶借助于聚合物微粒結合結構域(即C-末端片段(此結構域借助疏水相互作用結合))與聚合物核心共價相連(共價相連通過新生聚酯突出的活性位點發生)。合酶的聚合物微粒結合結構域至少包含介導聚合物微粒聚合以及聚合物微粒形成的合酶蛋白的催化結構域。PHA合酶蛋白的C-末端片段也可以進行修飾、部分缺失或部分替換為例如結核分枝桿菌抗原、結核分枝桿菌抗原結合結構域、肝炎病毒抗原、肝炎病毒抗原結合結構域、流感病毒抗原、或流感病毒抗原結合結構域、或另一融合配偶體，而不會使酶失活或防止合酶與聚合物微粒共價相連。在某些情況下，結核分枝桿菌抗原、結核分枝桿菌抗原結合結構域、肝炎病毒抗原、肝炎病毒抗原結合結構域、流感病毒抗原、或流感病毒抗原結合結構域、或另一融合配偶體與PHA合酶蛋白的N-末端或C-末端融合，而不會使酶失活或防止合酶與聚合物微粒共價相連。與此相似，在其他情況下，結核分枝桿菌抗原、結核分枝桿菌抗原結合結構域、肝炎病毒抗原、肝炎病毒抗原結合結構域、流感病毒抗原、或流感病毒抗原結合結構域、或另一融合配偶體插入在PHA合酶蛋白之中，或者實際上位于微粒形成蛋白之中。I^haC融合蛋白的例子在本領域已知，且已在本文提出。如本文所用的“聚合物解聚酶”是指能夠將既有的聚合物(例如見于聚合物微粒中的聚合物)水解成水溶性單體和寡聚體的蛋白。聚合物解聚酶的例子發生在廣泛多種的PHA降解細菌和真菌之中，包括來自Paucimonas Iemoignei的PhaZl_PhaZ7細胞外解聚酶、來自食酸菌(Acidovorax sp.)、糞產堿菌(A. faecalis) (AE122和Tl菌株)、食酸代爾夫特菌(叢毛單胞菌)(Delftia) (Comamonas)acidovorans)菌株YM1069、睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)、叢毛單胞菌(Comamonas sp·)、纖發菌(Leptothrix sp.)菌株HS、假單胞菌菌株GMlOl (保藏號AM93347)、熒光假單胞菌菌株GK13、斯氏假單胞菌、皮氏雷爾氏菌(R. pickettii) (Al和Kl菌株，保藏號J04223、D25315)、脫葉鏈霉菌 (S. exfoliatus)K10 和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的 PhaZ 解聚酶(參見 Jendrossek D. , and Handrick, R. , Microbial Degredation of Polyhydroxyalkanoates, Annual Review of Microbiology，2002，56 :403-32)。如本文所用的術語“多肽”囊括任何長度的氨基酸鏈，但優選至少5個氨基酸，包括全長蛋白，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵相連。本發明的多肽為純化的天然產物，或者部分或完全利用重組或合成技術生產。該術語可以指多肽、多肽聚集體例如二聚體或其他多聚體、融合多肽、多肽變體、或其衍生物。術語“啟動子”是指位于編碼區上游調控基因轉錄的非轉錄順式調控元件。啟動子包含指定轉錄起始位點的順式起始子元件、保守盒例如TATA盒、以及為轉錄因子所結合的基序。術語“終止子”是指終止轉錄的序列，見于翻譯序列下游基因的3’非翻譯末端。終止子是mRNA穩定性的重要決定因素，并且在一些情況下發現具有空間調控功能。
在表述結合于、吸附至或摻入聚合物微粒時，術語“物質”旨在表示為融合配偶體所結合的物質或能夠吸附至或摻入聚合物微粒的物質。如本文所用的術語“變體”是指與具體標識的序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中進行了一個或多個核苷酸或氨基酸殘基缺失、取代或添加。變體為天然存在的等位基因變體、或非天然存在的變體。變體來自相同或其他物種，并且可以涵蓋同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些實施方案中，多核苷酸和多肽變體擁有與野生型多核苷酸或多肽相同或相似的生物活性。述及多核苷酸和多肽的術語“變體”涵蓋如本文所定義的所有形式的多核苷酸和多肽。多核苷酸和多肽變體如本文所用的術語“多核苷酸”表示任何長度的單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，但優選至少15個核苷酸，并且作為非限制性的例子包括基因的編碼和非編碼序列、有義和反義互補序列、外顯子、內含子、基因組DNA、cDNA、前mRNA、mRNA、rRNA、 siRNA、miRNA, tRNA、核酶、重組多肽、分離的和純化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的 RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。許多核酸類似物在本領域已知并且也考慮在內。本文提供的多核苷酸序列的“片段”是連續核苷酸的亞序列，優選長至少15個核苷酸。本發明的片段優選包含本發明多核苷酸的至少20個核苷酸、更優選至少30個核苷酸、更優選至少40個核苷酸、更優選至少50個核苷酸、最優選至少60個連續核苷酸。多核苷酸序列片段可用在反義、基因沉默、三螺旋或核酶技術之中，或作為引物、探針、納入在微陣列之中、或在基于多核苷酸的選擇方法中使用。術語“片段”述及啟動子多核苷酸序列時旨在包括這樣的序列，其包含順式作用元件和啟動子多核苷酸序列中能夠調控該片段與之有效連接的多核苷酸序列表達的區域。優選本發明啟動子多核苷酸序列片段包含本發明啟動子多核苷酸序列的至少20 個、更優選至少30個、更優選至少40個、更優選至少50個、更優選至少100個、更優選至少 200個、更優選至少300個、更優選至少400個、更優選至少500個、更優選至少600個、更優選至少700個、更優選至少800個、更優選至少900個、最優選至少1000個連續核苷酸。術語“引物”是指短的多核苷酸，通常具有游離3’ OH基團，其與模板雜交而用于引發與該模板互補的多核苷酸聚合反應。這樣的引物優選長至少5個、更優選至少6個、更優選至少7個、更優選至少9個、更優選至少10個、更優選至少11個、更優選至少12個、更優選至少13個、更優選至少14個、更優選至少15個、更優選至少16個、更優選至少17個、更優選至少18個、更優選至少19個、更優選至少20個核苷酸。術語“探針”是指短的多核苷酸，其用來在基于雜交的測定法中檢測與該探針互補的多核苷酸序列。探針可以由如本文所定義的多核苷酸“片段”組成。優選這樣的探針長至少5個、更優選至少10個、更優選至少20個、更優選至少30個、更優選至少40個、更優選至少50個、更優選至少100個、更優選至少200個、更優選至少300個、更優選至少400個、 最優選至少500個核苷酸。如本文所用的術語“變體”是指與具體標識的序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中進行了一個或多個核苷酸或氨基酸殘基缺失、取代或添加。變體為天然存在的等位基因變體、或非天然存在的變體。變體來自相同或其他物種，并且可以涵蓋同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些實施方案中，多核苷酸和多肽變體擁有與野生型多核苷酸或多肽相同或相似的生物活性。述及多核苷酸和多肽的術語“變體”涵蓋如本文所定義的所有形式的多核苷酸和多肽。多核苷酸變體變體多核苷酸序列優選與指定的多核苷酸序列呈現出至少50%、更優選至少 51%, 至少52%、至少53%、至少、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少％、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少 82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少 90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%或至少99%的同一性。就指定多核苷酸序列的至少20個核苷酸位置、優選至少50個核苷酸位置、至少100個核苷酸位置的比較窗口或全長來尋找同一性。多核苷酸序列的同一性可按如下方式來確定。利用可由NCBI (ftp://ftp.ncbi. nih. gov/blast/)公開獲得的 BLASTN(來自 BLAST 程序套，2. 2. 10 版[2004 年 10 月])通過bl2seq(Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), " Blast2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences" , FEMSMicrobiol Lett. 174 247-250)將目標多核苷酸序列與候選多核苷酸序列進行比較。使用blkeq的默認參數，不過應當關閉對低復雜度部分的過濾。可利用如下imix命令行參數來檢查多核苷酸序列的同一性bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p blastn參數-F F關閉對低復雜度區段的過濾。參數-ρ為序列對選擇適當的算法。bl2seq 程序在“Identities =”行就相同核苷酸的數目和百分比給出序列同一性報告。多核苷酸序列的同一性也可以利用全局序列比對程序(例如Needleman，S. B. and Wunsch,C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48，443-453)就候選和目標多核苷酸序列重疊部分的全長來計算。Needleman-Wunsch全局序列比對算法的完整執行見可由//www. hgmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/ 獲得的 EMBOSS 包(Rice，P. Longden, I. and Bleasby, A. EMBOSS The European Molecular Biology OpenSoftware Suite, Trends in Genetics June 2000，vol 16，No 6. pp. 276-277)中的 needle 程序。歐洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)月艮務器也于 http:/www. ebi. ac. uk/emboss/align/ 在線提供執行兩序列間的EMBOSS-needle全局比對工具。或者可利用GAP程序，其計算兩序列的最佳全局比對而不會對末端缺口進行罰分。GAP 在如下文獻中說明Huang，X. (1994)On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10,227-235。本發明的多核苷酸變體也涵蓋與一個或多個具體標識的序列呈現出相似性的序列，其很可能保留了那些序列的等同功能，這不可能合理預期會隨機發生。就多肽而言，此類序列相似性利用可公開獲得的來自NCBI (ftp://ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)的BLAST程序套(2.2. 10版[2004年10月])中的blkeq程序來確定。可利用如下imix命令行參數來檢查多核苷酸序列的相似性bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p tblastx
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參數-F F關閉對低復雜度區段的過濾。參數-P為序列對選擇適當的算法。該程序尋找序列間的相似性區域，并就每一個這樣的區域給出“E值”報告，其為在固定參照大小的含隨機序列的數據庫中預期偶然見到此類匹配的預期次數。數據庫的大小由blkeq程序默認設置。對于遠遠小于1的小E值而言，該E值約等于此類隨機匹配的概率。變體多核苷酸序列優選與任一具體標識的序列相比呈現出小于1χ10_1(ι、更優選小于 lxlO—2。、小于 1x10—3°、小于 1x10—4°、小于 lxlO—5。、小于 lxlO—6。、小于 lxlO—7。、小于 1χ10_8°、 小于 1x10—9°、小于 lxlO—·、小于 1x10—"°、小于 IxlO-120 或小于 lxlO-123 的 E 值。或者，本發明的變體多核苷酸與指定的多核苷酸序列或其互補物在嚴謹條件下雜 、-父。術語“在嚴謹條件下雜交”及其語法意義上的等同體是指多核苷酸分子在限定的溫度和鹽濃度條件下與靶多核苷酸分子(例如DNA或RNA印跡如Southern印跡或Northern 印跡上固定的靶多核苷酸分子)雜交的能力。在嚴謹雜交條件下雜交的能力可通過最初在低嚴謹條件下雜交、而后提高嚴謹性至期望的嚴謹性來確定。就長度超過約100個堿基的多核苷酸分子而言，典型的嚴謹雜交條件比天然雙鏈體的解鏈溫度(Tm)低不超過25-30°C (例如10°C )( 一般性地參見Sambrook et al.，Eds， 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ； Ausubel et al. ,1987,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing)。 大于約100個堿基的多核苷酸分子的Tm可按照公式Tm = 81. 5+0. 41% (G+C-log(Na+)來計 ^ (Sambrook et al. ,Eds,1987,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Bolton and McCarthy, 1962,PNAS 84 :1390)。長度大于 100 個堿基的多核苷酸的典型嚴謹條件為這樣的雜交條件，例如以6X SSC, 0. 2% SDS溶液預洗；65°C， 6X SSC，0. 2% SDS過夜雜交；接著于65°C以IX SSC，0. 1 % SDS洗兩次，每次30分鐘，并于 65°C以0. 2X SSC, 0. 1% SDS洗兩次，每次30分鐘。就長度小于100個堿基的多核苷酸分子而言，例示性的嚴謹雜交條件是比Tm低 5-10°C。一般而言，長度小于IOObp的多核苷酸分子的Tm降低約(500/寡核苷酸長度)V。就公知為肽核酸(PNA)的DNA 模擬物(Nielsen et al.，Science. 1991Dec6 ； 254(5037) :1497-500)而言，Tm 值比 DNA-DNA 或 DNA-RNA 雜合體要高，可利用 Giesen et al.，Nucleic Acids Res. 1998Nov 1 ；26 (21) :5004-6 中所述的公式來計算。長度小于 IOObp的DNA-PNA雜合體的例示性嚴謹雜交條件比Tm低5_10°C。本發明的變體多核苷酸也涵蓋于本發明的序列不同，但是由于遺傳密碼子的簡并性，其編碼的多肽與本發明多核苷酸所編碼的多肽具有相似的活性。不改變多肽氨基酸序列的序列變異為“沉默變異”。除ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)以外，在一些實例中，通過本領域認可的技術來改變成同一氨基酸的其他密碼子，例如在特定宿主生物體中優化密碼子表達。本發明也包括導致所編碼的多肽中一個或幾個氨基酸保守取代而不顯著改變其生物活性的多核苷酸變異。技術人員會明了進行表型沉默的氨基酸取代的方法(參見例如 Bowie et al. ，1990， Science 247,1306)。由于沉默變異和所編碼多肽序列中保守取代而致的變態多核苷酸可如之前所述利用可公開獲得的來自 NCBI (ftp://ttp. ncbi. nih. Rov/blast/)的 BLAST 程序套(2. 2. 10版[2004年10月])中的blkeq程序借助tblastx算法來確定。多肽變體就多肽而言的術語“變體”涵蓋天然存在的、重組以及合成產生的多肽。變體多肽序列優選與本發明的序列呈現出至少50%、更優選至少51%、至少52%、至少53%、至少、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少％、至少 77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少 85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少 93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的同一性。就本發明多肽的至少20個氨基酸位置、優選至少50個氨基酸位置、至少100個氨基酸位置的比較窗口或就全長來尋找同一性。多肽序列同一性可按如下方式來確定。利用可由NCBI (ftp://ftp. ncbi.nih.gov/ blast/)公開獲得的BLASTP (來自BLAST程序套，2. 2. 10版[2004年10月])通過blkeq 將目標多肽序列與候選多肽序列進行比較。使用bl^eq的默認參數，不過應當關閉對低復雜度區域的過濾。多肽序列的同一性也可以利用全局序列比對程序就候選和目標多核苷酸序列重疊部分的全長來計算。如上文所討論的EMBOSS-needle (可獲自http:/www. ebi. ac. uk/ emboss/align/)禾口 GAP(Huang, Χ. (1994)On Global SequenceAlignment. Computer Applications in the Biosciences 10，227-235)也是計算多肽序列同一性的適宜的全局序列比對程序。本發明的多肽變體也涵蓋與一個或多個具體標識的序列呈現出相似性的序列，其很可能保留了那些序列的等同功能，這不可能合理預期會隨機發生。就多肽而言，此類序列相似性利用可公開獲得的來自NCBI (ftp://ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)的BLAST程序套 (2.2. 10版[2004年10月])中的blkeq程序來確定。可利用如下imix命令行參數來檢查多肽序列的相似性bl2seq-i peptideseql-j peptideseq2_F F_p blastp變體多肽序列優選與任一具體標識的序列相比呈現出小于1χ10_1(ι、更優選小于 1χ10_2°、小于 1Χ1(Γ3°、小于 1Χ1(Γ4°、小于 1Χ10_5°、小于 lxlO,、小于 lxlO—70、小于 1x10.、小于 1Χ1(Γ9°、小于 lxlO—·、小于 1x10-"°、小于 IxlO-120 或小于 lxlO-123 的 E 值。參數-F F關閉對低復雜度區段的過濾。參數-ρ為序列對選擇適當的算法。該程序尋找序列間的相似性區域，并就每一個這樣的區域給出“E值”報告，其為在固定參照大小的含隨機序列的數據庫中預期偶然見到此類匹配的預期次數。數據庫的大小由blkeq程序默認設置。對于遠遠小于1的小E值而言，該E值約等于此類隨機匹配的概率。本發明也包括所述多肽中不顯著改變其生物活性的一個或幾個氨基酸保守取代。技術人員會明了進行表型沉默的氨基酸取代的方法(參見例如Bowie et al.，1990， Science 247，1306)。本發明的多肽變體也涵蓋由編碼多肽的核酸產生、但是與野生型多肽不同的多肽，這是由于加工不同從而具有改變了的氨基酸序列。例如，因為初級RNA轉錄物的替代剪接模式與產生野生型多肽的不同而產生的變體。術語“載體”是指多核苷酸分子，通常為雙鏈DNA，用來將遺傳構建體輸送到宿主細胞中。在某些實例中，載體能夠在至少一個另外的宿主系統例如大腸桿菌中復制。2.病原體應理解本發明的聚合物微粒、方法和組合物部分地涉及預防或治療病原體、包括細胞內病原體所致的疾病。從而，來源于細胞內病原體的抗原適合用于本發明，可由本領域技術人員來選擇。代表性的細胞內病原體在下文更詳細地說明，但本領域技術人員將會理解，按照本文所述的方法，通過選擇一個或多個來自靶細胞內病原體的抗原或者能夠結合來自該靶細胞內病原體的抗原的結合結構域，本發明可應用于任何與細胞內病原體相關的疾病或病情。分枝桿菌屬來自放線菌綱(Actinobacteria)。該屬包括已知會引起哺乳動物嚴重疾病的病原體，包括結核病和麻風病。病原體物種的例子包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、 非洲分枝桿菌(M. africanum)、田鼠分枝桿菌(M. microti)、麻風分枝桿菌(麻瘋病)、鳥分枝桿菌副結核亞種(與人類克羅恩病和綿羊約內氏病相關)。李斯特菌屬物種為革蘭氏陽性桿菌。該屬最著名的病原體是產單核細胞李斯特菌，為李斯特菌病的致病因子。伊萬諾夫李斯特菌(Listeria ivanovii)是反芻動物病原體，僅罕見地為人類疾病的致病因子。志賀氏菌屬為與大腸桿菌和沙門氏菌屬密切相關的革蘭氏陰性無芽孢的桿狀細菌。志賀氏菌屬為人類志賀菌病(痢疾)的致病因子，僅感染靈長類動物而非其他哺乳動物。耶爾森氏菌屬為革蘭氏陰性桿狀細菌。具體的人類病原體包括引起耶爾森氏菌病的小腸結腸炎耶爾森氏菌，為瘟疫致病因子的鼠疫耶爾森氏菌，以及最不常見的病原體假結核耶爾森氏菌。耶爾森氏菌屬涉及反應性關節炎的致病因子之一。布魯氏菌屬為革蘭氏陰性不運動型沒有莢膜的球桿菌。布魯氏菌屬是布魯氏菌病的病因。不同布魯氏菌屬物種的例子包括羊布魯氏菌和感染綿羊的綿羊布魯氏菌，感染牛的流產布魯氏菌，感染豬的豬布魯氏菌，由海洋哺乳動物分離的鰭型布魯氏菌和沙林鼠布魯氏菌。人類通常通過接觸感染動物(綿羊、牛或豬)的體液或由其獲得的食物產品例如未經巴斯德消毒的奶液和奶酪而被感染。軍團菌屬為革蘭氏陰性細菌。最著名的物種嗜肺軍團菌引起軍團菌病或軍團菌病或退伍軍人癥。立克次體屬為運動型革蘭氏陰性無芽孢細菌。立克次體屬物種由許多蜱類、蚤類和虱類作為寄生蟲攜帶，引起諸如落磯山斑點熱(立氏立克次體)、立克次體痘(螨立克次體)、紐扣熱(康氏立克次體)、西伯利亞蜱傳斑疹傷寒(西伯利亞立克次體)、澳大利亞蜱傳斑疹傷寒(澳大利亞立克次體)、東方斑點熱(日本立克次體)、非洲蜱咬熱(非洲立克次體)、流行性斑疹傷寒(普氏立克次體)和地方性斑疹傷寒(斑疹傷寒立克次體)等疾病。沙門氏菌屬為桿狀革蘭氏陰性無芽孢運動型腸桿菌，引起人類和許多動物疾病， 包括傷寒熱、副傷寒熱和沙門氏菌病。衣原體屬是細菌的一個屬，包括人類病原體沙眼衣原體。嗜性衣原體屬為相關的細菌，包括人類病原體引起肺炎的肺炎嗜性衣原體，引起呼吸道鸚鵡熱的鸚鵡熱嗜性衣原體，和與人類流產相關的流產嗜性衣原體。鏈球菌屬為球形革蘭氏陽性菌，已知引起多種人類疾病，包括腦膜炎、細菌性肺炎 (肺炎鏈球菌)、心內膜炎、丹毒和壞死性筋膜炎(釀膿鏈球菌)。葡萄球菌屬為革蘭氏陽性菌，是常見的食物中毒的病因。瘧原蟲屬為寄生性原生動物。感染這些寄生蟲已知引起瘧疾(惡性瘧原蟲) (P.falciparum)。2. 1結核病結核病是嚴重的全球衛生問題，每年造成全球200萬以上的人死亡。該病由結核分枝桿菌所致。該菌一般地通過吸入而入侵肺部，引起肺部感染，可最終擴散至身體其他部分，包括中樞神經系統、淋巴系統、循環系統、泌尿生殖系統、腸胃系統、骨骼、關節和皮膚 (Dietrich, 2006 ；Mustafa, 2001)。多種形式的農業動物結核病，例如牛結核病和約內氏病也對產量具有重大的負面影響。結核分枝桿菌感染的擴散受免疫系統的限制。許多個體僅僅表現出咳嗽發熱癥狀。然而，約30%的個體不能充分控制感染，罹患原發性疾病。除此之外，該病能夠在個體體內休眠，數年或數十年后再次感染這些個體。因此，結核分枝桿菌在傳染性細菌中很獨特，因為它能夠逃逸免疫應答，并經過長期的頑固性非復制期或慢復制期存活下來。結核菌感染分三個階段。第一急性期階段以細菌在機體器官中增殖為特征。免疫應答很快出現，控制感染，最終導致細菌載量下降。急性期之后，確立第二潛伏期。在此第二階段，細菌載量維持在穩定的低水平上。結核分枝桿菌從急性期的活躍繁殖狀態轉變成潛伏期的休眠狀態。可能發生第三再活動期，從而該菌再次開始復制。影響第三階段的因素在很大程度上依然未知(Barnes andCave，2003)。據認為在整個感染的不同階段免疫應答的抗原特異性發生了變化，因為該菌在從活躍復制向休眠狀態轉變期間能夠調節基因表達。2. 2 肝炎肝炎是通常由不同肝炎病毒所致的疾病的總稱。肝炎的其他成因包括包括酒精、 毒素、藥物和自身免疫病。肝炎是一種肝臟炎癥，癥狀包括身體不適、肌肉和關節疼痛、食欲喪失、以及一些病例中的黃疸和最終的肝衰竭。肝炎可以是急性和慢性的，在該病慢性患者中觀察到了硬化。2. 3 流感流行性感冒(更常稱為“流感”)由正粘病毒科的RNA病毒所致。流感每年造成 250，000-500，000的人死亡。常見癥狀包括寒戰、發熱、喉痛、肌肉疼和疼痛、頭痛、咳嗽、虛弱和疲乏。在一些病例中，流感可引起肺炎，對于年幼和年老的人是一種潛在的致命性病況。流感可通過空氣傳播，或通過直接接觸感染的鳥類糞便或鼻液而傳播。存在著三型流感病毒(甲、乙和丙)，都具有相似的結構。病毒粒子表面展示有兩個大的糖蛋白、血凝素和神經氨酸酶，它們參與病毒與靶細胞的結合，病毒基因組向靶細胞的轉移，以及病毒子代從感染細胞中的釋放。血凝素有16個已知的亞型(Hl至H16)，而神經氨酸酶有9個亞型(附至N9)。2. 4當前的治療策略
用來抵御細胞內病原體的當前的治療策略包括抗已知抗原的疫苗，或對感染有細胞內細菌病原體的患者進行抗生素治療。無論是感染前的預防，還是感染發生后的治療，都沒有抵御細胞內病原體再活動的合適疫苗，促使我們急需抗細胞內病原體的新的改進的治療策略。例如，目前僅有的結核菌疫苗是卡介苗(BCG)，其含有牛分枝桿菌活的減毒株。BCG 在控制結核菌感染方面功效有限。雖然該免疫似乎對兒童提供抗原發性疾病保護作用，但其針對成年型結核菌病(潛伏之后再活動)的保護功效減小(世界衛生組織-//WWW. who. int)。在結核病流行的許多第三世界國家BCG的功效有限也已有報道。另外，BCG疫苗是活疫苗，不適合對免疫受損的患者給藥。雖然據報道BCG疫苗降低結核分枝桿菌向脾臟(及其他器官)的傳播，但其并不阻止肺部細菌的生長。無論是感染前的預防，還是感染發生后的治療，都沒有抵御再活動的合適疫苗，還有與活疫苗相關的其他問題，促使我們急需抗細胞內病原體包括結核菌、肝炎病毒或流感病毒的新的改進的治療策略。3.免疫應答3. 1.細胞介導的應答細胞介導的免疫主要是由T淋巴細胞介導的。致病性抗原在抗原提呈細胞(例如巨噬細胞、B淋巴細胞和樹突細胞)表面表達，與主要組織相容性MHC I類或MHC II類分子結合。提呈的與MHC II類分子偶聯的致病性抗原激活輔助(CD4+)T細胞應答。在該T細胞與抗原-MHC II類分子復合物結合之后，CD4+T細胞增殖，釋放細胞因子，包括γ干擾素 (IFN- y )和白介素 2 (IL-2)、IL-4、IL-7 和 IL-12。提呈的與MHC I類分子偶聯的致病性抗原激活激活細胞毒性(CD8+) T細胞應答。 在該T細胞與抗原-MHC I類分子復合物結合之后，CD8+細胞分泌穿孔素，導致病原體細胞裂解，膨脹和死亡。或者，⑶8+細胞誘導程序性細胞死亡和凋亡。對⑶8+T細胞的激活通過⑶4+T細胞釋放特定細胞因子而放大。細胞介導的免疫應答據認為對于抗多種病原體的免疫力至關重要，包括細胞內病原體例如結核分枝桿菌。用來評估和監測受試者細胞介導的應答的發生和進程的方法在本領域公知。便利的示例性方法包括評估與細胞介導的應答相關的一個或多個細胞因子的存在或水平，例如本文所鑒定的那些。與此相似，用來評估和監測細胞介導的應答的發生和進程的基于細胞的方法適合用于本發明，并且可以包括細胞增殖或活化測定法，包括目的在于鑒定一群或多群免疫細胞例如T淋巴細胞的活化或擴增的測定法。在某些實施方案中，優選本發明中既引發細胞介導的免疫應答又引發體液應答的方法。在其他實施方案中，優選本發明中主要引發細胞介導的應答的方法。此類方法可以包括引發細胞介導的免疫應答而沒有顯著的體液應答或沒有任何可檢測的體液應答的方法。在一個實例中，免疫應答是細胞介導的免疫應答，例如IFN-Y反應所指示的應答， 而沒有顯著的IgA反應，或沒有顯著的IgE反應，或沒有顯著的IgG反應，包括沒有顯著的 IgGl反應，或沒有顯著的IgG2反應，或沒有顯著的IgM反應。3. 2.體液應答
體液免疫應答是由B細胞所產生的分泌抗體介導的。所述分泌抗體與入侵病原休表面上呈現的抗原結合，將它們標記出來進行破壞。已有人提出組合的細胞介導的和體液應答(例如作為已經起始的細胞介導的應答的后果發生)將會有益于實現更為高度敏感的針對細胞內病原體的免疫應答或者增強抗細胞內病原體的保護作用水平。同樣，用來評估和監測體液應答的發生和進程的方法在本領域公知。這包括抗體結合測定法、ELISA、皮膚點刺試驗等等。4.抗原將會理解有許多來自不同病原生物的抗原已經進行過表征，并適合用于本發明。 考慮能夠引發免疫應答的所有抗原，不論目前表征過與否。4.1結核菌抗原將會理解有許多結核分枝桿菌抗原已經進行過表征，并適合用于本發明。考慮能夠引發免疫應答的所有結核分枝桿菌抗原，不論目前表征過與否。適合用于本發明的示例性結核分枝桿菌抗原包括早期分泌抗原靶蛋白 (ESAT) -6、Ag85A、Ag85B (MPT59)、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT51、MPT59、MPT63、MPT64、MPT83、 MPB5、MPB59、MPB64、MTC28、Mtb2、Mtb8. 4、Mtb9. 9、Mtb32A、Mtb39、Mtb41、TB10. 4、TB10C、 TB11B、TB12. 5、TB13A、TB14、TB15、TB15A、TB16、TB16A、TB17、TB18、TB21、TB20. 6、TB24、 TB27B、TB32、TB32A、TB33、TB38、TB40. 8、TB51、TB54、TB64、CFP6、CFP7、CFP7A、CFP7B、CFP8A、 CFP8B、CFP9、CFP10、CFPl 1、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、 CFP22A、CFP23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP27、CFP28、CFP28B、CFP29、CFP30A、 CFP30B、CFP50、CWP32、hspX(a -晶型)、ΑΡΑ、結核菌素純蛋白衍生物(PPD)、ST-CF、ΡΡΕ68、 LppX, PstS-U PstS-2、PstS-3、HBHA, GroEL, GroEL2、GrpES, LHP、19kDa 月旨蛋白、71kDa、 RD1-0RF2、RD1-0RF3、RD1-0RF4、RD1-0RF5、RD1-0RF8、RD1-0RF9A、RD1-0RF9B、Rvl984c、 Rv0577、Rvl827、BfrB、Tpx. Rvl352、Rvl810、PpiA、Cut2、FbpB、FbpA、FbpC、DnaK、FecB、Ssb、 RplL、FixA、FixB、AhpC2、Rv2626c、Rvl211、Mdh、Rvl626、Adk、ClpP、SucD(Belisle et al, 2005 ；US7, 037，510 ；US2004/0057963 ；US2008/0199493 ；US2008/0267990)，或任一上述抗原的至少一個抗原性部分或T細胞表位。本發明考慮單個結核分枝桿菌抗原的應用。不過，也具體考慮依賴于應用兩個或更多個結核分枝桿菌抗原的實施方案。在各種實例中，所述兩個或更多個抗原作為包含兩個或更多個結核分枝桿菌抗原 (包括選自上述抗原的兩個或更多個結核分枝桿菌抗原)的融合蛋白而生產。4. 2肝炎病抗原許多肝炎病毒抗原已經進行過表征，并適合用于本發明。示例性的丙肝病毒抗原包括 C-p22、El-gp35、E2-gp70、NSl-p7、NS2-p23、NS3-p70、NS4A-p8、NS4B-p27、NS5A-p56/58 和NS5B-p68，各個(無論是單獨還是組合)都適合用于本發明。考慮能夠引發免疫應答的所有肝炎病毒抗原，不論目前表征過與否。4. 3流感抗原許多流感病毒抗原已經進行過表征，并適合用于本發明。適合用于本發明的示例性流感病毒抗原包括PB、PB2、PA、血凝素(HA)或神經氨酸酶(NA)蛋白中任一、NP、M和NS，各個(無論是單獨還是組合)都適合用于本發明。考慮能夠引發免疫應答的所有流感病毒抗原，不論目前表征過與否。4. 4炭疽菌抗原許多炭疽芽孢桿菌抗原已經鑒定為潛在的疫苗開發候選抗原，并可用于本發明。 例如，PA83為一個這樣的用于疫苗開發的抗原。目前，僅有一個FDA批準的炭疽病疫苗，稱為“吸附炭疽疫苗” (AVA)或BioThrax 。該疫苗來源于吸附在鋁佐劑上的炭疽芽孢桿菌無莢膜株的無細胞上清液。PA是AVA中的主要免疫原。適合用于本發明的其他示例性炭疽菌抗原包括保護性抗原(PA或PA63)、LF和EF(蛋白)、聚γ -(D-谷氨酸)膠囊、孢子抗原 (內孢子特異性組分)、BclA(外孢子特異性蛋白、ΒχρΒ(孢子結合蛋白)和分泌蛋白。考慮能夠引發免疫應答的所有炭疽菌抗原，不論目前表征過與否。4. 5 土拉菌抗原許多土拉熱弗朗西斯氏菌抗原已經鑒定為潛在的疫苗開發候選抗原，并可用于本發明。例如，AcpA和IglC為適合于疫苗開發的抗原。適合用于本發明的其他示例性土拉菌抗原包括0-抗原、CPS、外膜蛋白(例如R)PA)、脂蛋白(例如Tul4)、分泌蛋白和脂多糖。 考慮能夠引發免疫應答的所有土拉菌抗原，不論目前表征過與否。4. 6布魯氏菌抗原許多流產布魯氏菌抗原已經鑒定為潛在的疫苗開發候選抗原，并可用于本發明。 例如，0mpl6為一個這樣的用于疫苗開發的抗原。適合用于本發明的其他示例性布魯氏菌抗原包括0-抗原、脂多糖、外膜蛋白(例如0mpl6)、分泌蛋白、核糖體蛋白(例如L7和L12)、 細菌鐵蛋白、P39 (推定的周質結合蛋白)、groEL(熱激蛋白)、二氧四氫喋啶合酶(lumazine synthase)、BCSP31表面蛋白、PAL16. 50M脂蛋白、過氧化氫酶、26kDa周質蛋白、31 kDa 0mp3U28kDa 0mp、25kDa Omp和IOkDA Om脂蛋白。考慮能夠引發免疫應答的所有布魯氏菌抗原，不論目前表征過與否。4. 7腦膜炎抗原許多腦膜炎奈瑟菌抗原已經鑒定為潛在的疫苗開發候選抗原，并可用于本發明。 例如，Cys6、P0rA、P0rB、!^tA和SiuD為適合用于疫苗開發的抗原。適合用于本發明的其他示例性腦膜炎抗原包括0-抗原、H因子結合蛋白(fHbp)、TbpB, NspA, NadA、外膜蛋白、B群 CPS、分泌蛋白和脂多糖。考慮能夠引發免疫應答的所有腦膜炎抗原，不論目前表征過與否。4. 8登革病毒抗原許多黃病毒抗原已經鑒定為潛在的疫苗開發候選抗原以治療登革熱，并可用于本發明。例如，登革病毒被膜蛋白E1-E4和膜蛋白M1-M4為適合用于疫苗開發的抗原。適合用于本發明的其他示例性登革病毒抗原包括C、preM、l、2A、2B、3、4A、4B和5。考慮能夠引發免疫應答的所有登革病毒抗原，不論目前表征過與否。4. 9埃博拉病毒抗原許多埃博拉病毒抗原已經鑒定為潛在的疫苗開發候選抗原以治療埃博拉病毒感染，并可用于本發明。例如，絲狀病毒科扎伊爾型埃博拉病毒和蘇丹型埃博拉病毒相應的病毒體刺突糖蛋白前體抗原ZEBOV-GP和SEBOV-GP適合用于疫苗開發。適合用于本發明的其他示例性埃博拉病毒抗原包括NP、vp35、vp40、GP、vp30、vp24和L。考慮能夠引發免疫應答的所有埃博拉病毒抗原，不論目前表征過與否。
4. 10西尼羅病毒抗原許多西尼羅病毒抗原已經鑒定為潛在的疫苗開發候選抗原以治療感染，并可用于本發明。例如，來自西尼羅病毒(WNV)的黃病毒被膜抗原(E)是在WNV病毒體表面表達的一種無毒蛋白(WNVE)，適合用于疫苗開發。適合用于本發明的其他示例性WNV抗原包括Cp、 Prm、NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。考慮能夠引發免疫應答的所有西尼羅病毒抗原，不論目前表征過與否。上文所列或所引述的抗原僅為本發明的示例而非限制。5.表達構建體產生和利用表達構建體在微生物、植物細胞或動物細胞(細胞表達系統)中或在無細胞表達系統中表達融合多肽的方法，以及含有可用于形成本發明所用聚合物微粒的表達構建體的宿主細胞在本領域公知(例如，Sambrook et al. , 1987 ；Ausubel et al.， 1987)。在一個實施方案中，用于本發明方法的表達構建體插入到可復制的載體中用于克隆或表達，或在另一實施方案中，整合到宿主基因組中。多種載體可公開獲得。載體為例如質粒、粘粒、病毒粒子或噬菌體的形式。適當的核酸序列可通過多種方法插入到載體中。一般而言，利用本領域已知的技術將DNA插入到適當的限制性內切核酸酶位點。載體組分一般包括但不限于一個或多個信號序列、復制原點、一個或多個可選擇標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。含有一個或多個這些組分的適宜載體的構建采用本領域已知的標準連接技術。表達和克隆載體均含有使載體能夠在一種或多種選擇的宿主細胞中復制的核酸序列。對于多種細菌、酵母和病毒而言，此類序列是公知的。在一個實施方案中，表達構建體存在于高拷貝數載體之中。在一個實施方案中，高拷貝數載體選自那些在每個宿主細胞中以20-3000個拷貝存在的載體。在一個實施方案中，高拷貝數載體含有高拷貝數復制原點(ori)，例如ColEl或 ColEl衍生的復制原點。例如，ColE-I衍生的復制原點可以構成pUC19復制原點。眾多適合用于本發明載體的高拷貝數復制原點在本領域公知。這包括來自pBR322 及其衍生質粒的ColEl衍生的復制原點以及其他高拷貝數復制原點，例如M13FR ori或 P15A ori。2 μ質粒原點適用于酵母，而多種病毒原點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV) 可用作為哺乳動物細胞的克隆載體。優選高拷貝數復制原點包含ColEl衍生的pUC19復制原點。限制性位點位于復制原點之中，從而將插入片段克隆到該限制性位點會使該原點失活，使之不能指導載體復制。或者，至少一個限制性位點位于該原點之內，從而將插入片段克隆到該限制性位點會使之僅能夠支持載體以低拷貝數或單拷貝數復制。表達和克隆載體一般會含有選擇基因，也成為可選擇標記，以檢測所轉化的宿主細胞中該載體的存在。典型的選擇基因編碼(a)賦予抗生素或其他毒素例如青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環素抗性的蛋白；(b)補充營養缺陷型的蛋白；或(C)供應不能夠從復合培養基中獲得的關鍵養分的蛋白，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。常用于植物轉化的可選擇標記包括賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶II基因(NPT II)；賦予壯觀霉素和鏈霉素抗性的aadA基因；用于Ignite(AgrEvo)和 Basta(Hoechst)抗性的膦絲菌素乙酰轉移酶(bar基因)；以及用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)。用于哺乳動物細胞的適宜可選擇標記的例子是能夠鑒定有能力攝入表達構建體的細胞的那些標記，例如DHFR或胸苷激酶。采用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是如 Urlaub et al.，1980所述制備和傳代的DHFR活性缺陷型CHO細胞系。用于酵母的適宜選擇基因是存在于酵母質粒YRp7中的trpl基因Gtinchcomb et al. , 1979 ；Kingsman et al. ,1979 ；Tschemper et al.，1980)。trpl基因為缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株例如 ATCC No. 44076 或 PEP4-1 提供選擇標記[Jones, Genetics, 85 :12(1977)]。可用于形成聚合物微粒的表達構建體優選包括啟動子，其控制至少一個編碼聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽的核酸表達。多種潛在宿主細胞所識別的啟動子是公知的。適合用于原核宿主的啟動子包括 β-內酰胺酶和乳糖啟動子系統[Chang et al. , 1978 ；Goeddel et al.，1979)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統[Goeddel, Nucleic Acids Res.，8 :4057(1980) ；EP36, 776]、 以及雜合啟動子例如tac啟動子[deBoer et al.，1983)。用于細菌系統的啟動子還會含有a!ine-Dalgarno(S. D.)序列，其與編碼聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽的核酸有效連接。用于酵母宿主的適宜啟動子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzemanet al. ,1980)或其他糖酵解酶[Hess et al. , 1968 ；Holland, 1978)的啟動子，例如烯醇化酶、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、 3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。其他為誘導型啟動子的酵母啟動子具有以生長條件控制轉錄的額外優勢，有醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、以及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區域。用于植物宿主細胞、包括單子葉或雙子葉植物的組織或器官的適宜啟動子的例子包括細胞、組織和器官特異性啟動子，細胞周期特異性啟動子，瞬時啟動子，誘導型啟動子， 在大多數植物組織中有活性的組成型啟動子，以及重組啟動子。啟動子的選擇將取決于所期望的克隆多核苷酸的時間和空間表達。啟動子來自宿主細胞、或來源于其他植物、病毒及植物致病性細菌和真菌的基因。本領域技術人員無需過度的勞動，就能夠選擇適合用于修飾和調節應用包含本發明多核苷酸序列的基因構建體的表達構建體的啟動子。組成型植物啟動子的例子包括CaMV 35S啟動子、胭脂堿合酶啟動子和章魚堿合酶啟動子、以及來自玉米的W^i 1啟動子。在特定組織中或者響應內部發育信號或外部非生物或生物脅迫而有活性的植物啟動子在科研文獻中有說明。示例性的啟動子描述在例如W002/00894中，在此并入作為參考。用于哺乳動物宿主細胞的適宜啟動子的例子由病毒基因組獲得的啟動子，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如2型腺病毒)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙肝病毒和猴病毒40 (SV40)；異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；以及熱激啟動子，只要此類啟動子與宿主細胞系統相容即可。在一些實例中，通過在載體中插入增強子序列而增加高等真核細胞中表達構建體的轉錄。增強子為DNA的順式作用元件，通常約10_300bp，其作用于啟動子而增加其轉錄。 目前已知許多增強子序列來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)。不過一般人們會使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括位于復制原點下游 (bp 100-270)的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復制原點下游的多瘤病毒增強子、以及腺病毒增強子。通常增強子剪接到載體中聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽編碼核酸5'或3'的位置，但優選位于啟動子的5'側。在真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞生物的有核細胞)中使用的表達載體還會含有終止轉錄以及穩定mRNA所必需的序列。此類序列常來自于真核或病毒DNA或cDNA的5’和偶爾的3’非翻譯區。這些區域中含有轉錄為mRNA 非翻譯區多聚腺苷酸化區段的核苷酸區段，所述mRNA編碼聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽。在一個實施方案中，表達構建體含有上游誘導型啟動子，例如受阿拉伯糖誘導的 BAD啟動子。在一個實施方案中，表達構建體含有組成型或調控型啟動子系統。在一個實施方案中，調控型啟動子系統是誘導型或阻遏型啟動子系統。盡管在生產重組蛋白方面期望使用強啟動子，但這些啟動子的調控至關重要，因為組成型過表達異源蛋白導致生長速度、質粒穩定性和培養物生存能力下降。許多啟動子受到阻遏子與操縱子(啟動子下游區域)相互作用的調控。最著名的操縱子來自Iac操縱元和噬菌體A。有關大腸桿菌調控型啟動子的綜述見Friehs & Reardon, 1991 中的表 1。標準細菌培養與涉及重組大腸桿菌的培養之間的一個主要差異在于生長階段與生產階段或誘導階段的分隔。重組蛋白生產往往利用調控型啟動子，在生長階段(此時啟動子“關閉”，宿主細胞的代謝負荷輕)實現高細胞密度生長，而后在誘導階段(在誘導之后 “開啟”啟動子)實現高速的異源蛋白生產。在一個實施方案中，調控型啟動子系統選自LacIJrp、噬菌體γ和噬菌體RNA聚合酶啟動子系統。在一個實施方案中，啟動子系統選自Iac或Ptac啟動子和IacI阻遏子，或trp啟動子和rpR阻遏子。在一個實施方案中，LacI阻遏子因為添加異丙基-β _D_硫代半乳糖苷(IPTG)而失活，IPTG與活性LacI阻遏子結合導致操縱子解離從而允許表達。在一個實施方案中，trp啟動子系統應用具有明確色氨酸濃度的合成培養基，從而當濃度降至低于閾值水平時該系統變成自身誘導型。在一個實施方案中，添加3-β-吲哚-丙烯酸而使TrpR阻遏子失活。在一個實施方案中，啟動子系統可以利用噬菌體Y阻遏子Cl。此阻遏子利用Y 原噬菌體，通過與兩個稱為OL和OR的操縱子相互作用而阻止全體裂解基因的表達。這些操縱子分別與兩個強啟動子PL和ra重疊。Cl阻遏子的存在阻止了 RNA聚合酶的結合。Cl 阻遏子可通過紫外輻射或用絲裂霉素C處理細胞而失活。允許重組多肽表達的一個更為便利的方法是應用溫度敏感型的cl阻遏子CI857。攜帶基于Y的表達系統的宿主細胞可在低溫培養至對數中期，然后移至高溫以誘導重組多肽的表達。
—種廣泛使用的表達系統利用噬菌體T7RNA聚合酶，其僅識別見于T7DNA的啟動子而非宿主細胞啟動子中存在的啟動子。因此，表達構建體可以含有重組基因與之融合的一個T7啟動子(通常啟動子位于基因10之前)。編碼T7RNA聚合酶的基因位于該表達構建體中、另一相容的表達構建體中或者整合在宿主細胞染色體之中。在所有三種情況下，基因都與允許其在表達階段進行轉錄和翻譯的誘導型啟動子融合。大腸桿菌菌株BL21 (DE3)和 BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen, CA)為攜帶 T7RNA 聚合酶基因的宿主細胞的例子(有一些非常適合的可商購的大腸桿菌菌株含有T7RNA聚合酶基因，例如KRX and XJ(自溶性))。其他攜帶T7RNA聚合酶基因的細胞株在本領域已知，例如T7RNA聚合酶基因整合在其基因組中的銅綠假單胞菌ADD1976 (Brunsctiwig & Darzins， 1992)，以及T7RNA聚合酶基因整合在其基因組中在phaP啟動子控制之下的鉤蟲貪銅菌 ((Cupriavidus necator)(從前稱作真養雷爾氏菌)(Barnard et al.，2004)。T7RNA聚合酶與宿主細胞酶相比具有3個優點第一其僅由一個亞單位組成，第二其發揮更高的處理性能，第三其對利福平不敏感。后一個特征可特別地通過在誘導編碼 T7RNA聚合酶的基因之后大約10分鐘添加此抗生素來增強融合蛋白的含量。在那時候，已經合成了足夠的聚合酶，從而允許融合蛋白高水平表達，并抑制宿主細胞酶，防止質粒以及染色體上的所有其他基因進一步表達。抑制細菌RNA聚合酶而非T7RNA聚合酶的其他抗生素在本領域已知，例如鏈霉溶菌素和曲張鏈菌素。由于所有的啟動子系統都有滲漏表達，編碼T7RNA聚合酶的基因低水平表達在重組多肽編碼毒性蛋白的情況下對細胞可能是有害的。在生長階段存在的這些聚合酶分子可通過表達T7編碼的溶菌酶基因來進行抑制。該溶菌酶為雙功能蛋白，切割宿主細胞細胞壁中的鏈鍵，并通過與T7RNA聚合酶結合而選擇性抑制T7RNA聚合酶，這是一種確保T7感染期間可控的轉錄爆發的反饋機制。大腸桿菌菌株BL21 (DE3) pLysS是攜帶組成型表達T7溶菌酶的質粒的宿主細胞的一個例子。在一個實施方案中，啟動子系統利用諸如API或AI5R等啟動子，它們通過溫度變化而被誘導或“開啟”以起始誘導周期，例如通過將溫度由30-37°C升高到42°C來起始誘導周期。強啟動子可以在體內生產期間增強微粒表面的融合多肽密度。優選的融合多肽包含聚合物合酶，和包含如下的融合配偶體(i)至少一個能夠引發免疫應答的抗原，或(ii)與至少一個能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，或(iii)⑴和(ii)兼而有之。用于本文的編碼(i)和(ii)兩者的核酸序列包含編碼聚合物合酶的核酸和編碼能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的核酸，或者包含編碼聚合物合酶的核酸序列和編碼與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸。一經表達，融合多肽即能夠形成或促進形成聚合物微粒。在一個實施方案中，編碼至少一個聚合物合酶的核酸序列通過期望長度的多核苷酸結構或間隔臂序列，與編碼微粒形成蛋白的核酸序列和編碼能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的核酸，或與編碼微粒形成蛋白優選聚合物合酶的核酸和編碼與能夠引發細胞介
60導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與包含聚合物合酶的氨基酸序列的C-末端鄰接。在一個實施方案中，包含至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，通過期望長度的促進融合多肽獨立折疊的肽接頭或間隔臂，與包含聚合物合酶片段的氨基酸序列的N-末端間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與包含微粒形成蛋白、優選聚合物合酶或C-末端合酶片段的氨基酸序列的N-末端鄰接。在一個實施方案中，編碼至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，通過期望長度的促進融合多肽獨立折疊的肽接頭或間隔臂，與包含微粒形成蛋白、優選聚合物合酶或N-末端聚合物合酶片段的氨基酸序列的C-末端間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與編碼解聚酶或C-末端解聚酶片段的氨基酸序列的N-末端鄰接。在涉及結核病治療或預防的不同實施方案中，示例性的融合多肽包含聚合物合酶，和包含如下的融合配偶體(i)至少一個結核分枝桿菌抗原，或(ii)與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域，或(iii)⑴和(ii)兼而有之。用于本文的編碼(i)和(ii)兩者的核酸序列包含編碼聚合物合酶的核酸和編碼結核分枝桿菌抗原的核酸，或者包含編碼聚合物合酶的核酸序列和編碼結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸。一經表達，融合多肽即能夠形成或促進形成聚合物微粒。在一個實施方案中，編碼至少一個聚合物合酶的核酸序列通過期望長度的多核苷酸結構或間隔臂序列，與編碼微粒形成蛋白的核酸序列和編碼結核分枝桿菌抗原的核酸， 或與編碼微粒形成蛋白的核酸和編碼結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與包含聚合物合酶的氨基酸序列的C-末端鄰接。在一個實施方案中，包含至少一個結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，通過期望長度的促進融合多肽獨立折疊的肽接頭或間隔臂，與包含聚合物合酶片段的氨基酸序列的N-末端間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與包含微粒形成蛋白或C-末端合酶片段的氨基酸序列的N-末端鄰接。在一個實施方案中，編碼至少一個結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，通過期望長度的促進融合多肽獨立折疊的肽接頭或間隔臂，與包含微粒形成蛋白或N-末端聚合物合酶片段的氨基酸序列的C-末端間接融
I=I O在一個實施方案中，編碼至少一個結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與編碼解聚酶或C-末端解聚酶片段的氨基酸序列的N-末端鄰接。在涉及肝炎治療或預防的不同實施方案中，示例性的融合多肽包含聚合物合酶，和包含如下的融合配偶體(i)至少一個肝炎病毒抗原，或(ii)與至少一個肝炎病毒抗原結合結構域，或(iii)⑴和(ii)兼而有之。用于本文的編碼(i)和(ii)兩者的核酸序列包含編碼聚合物合酶的核酸和編碼肝炎病毒抗原的核酸，或者包含編碼聚合物合酶的核酸序列和編碼肝炎病毒抗原結合結構域的核酸。一經表達，融合多肽即能夠形成或促進形成聚合物微粒。在一個實施方案中，編碼至少一個聚合物合酶的核酸序列通過期望長度的多核苷酸結構或間隔臂序列，與編碼微粒形成蛋白的核酸序列和編碼肝炎病毒抗原的核酸，或與編碼微粒形成蛋白的核酸和編碼肝炎病毒抗原結合結構域的核酸間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與包含聚合物合酶的氨基酸序列的C-末端鄰接。在一個實施方案中，包含至少一個肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，通過期望長度的促進融合多肽獨立折疊的肽接頭或間隔臂，與包含聚合物合酶片段的氨基酸序列的N-末端間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與包含微粒形成蛋白或C-末端合酶片段的氨基酸序列的 N-末端鄰接。在一個實施方案中，編碼至少一個肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，通過期望長度的促進融合多肽獨立折疊的肽接頭或間隔臂，與包含微粒形成蛋白或N-末端聚合物合酶片段的氨基酸序列的C-末端間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與編碼解聚酶或C-末端解聚酶片段的氨基酸序列的N-末端鄰接。在涉及流感治療或預防的不同實施方案中，示例性的融合多肽包含聚合物合酶，和包含如下的融合配偶體(i)至少一個流感病毒抗原，或(ii)與至少一個流感病毒抗原結合結構域，或(iii)⑴和(ii)兼而有之。用于本文的編碼(i)和(ii)兩者的核酸序列包含編碼聚合物合酶的核酸和編碼流感病毒抗原的核酸，或者包含編碼聚合物合酶的核酸序列和編碼流感病毒抗原結合結構域的核酸。一經表達，融合多肽即能夠形成或促進形成聚合物微粒。在一個實施方案中，編碼至少一個聚合物合酶的核酸序列通過期望長度的多核苷酸結構或間隔臂序列，與編碼微粒形成蛋白的核酸序列和編碼流感病毒抗原的核酸，或與編碼微粒形成蛋白的核酸和編碼流感病毒抗原結合結構域的核酸間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與包含聚合物合酶的氨基酸序列的C-末端鄰接。在一個實施方案中，包含至少一個流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，通過期望長度的促進融合多肽獨立折疊的肽接頭或間隔臂，與包含聚合物合酶片段的氨基酸序列的N-末端間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與包含微粒形成蛋白或C-末端合酶片段的氨基酸序列的 N-末端鄰接。在一個實施方案中，編碼至少一個流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，通過期望長度的促進融合多肽獨立折疊的肽接頭或間隔臂，與包含微粒形成蛋白或N-末端聚合物合酶片段的氨基酸序列的C-末端間接融合。在一個實施方案中，編碼至少一個流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域的融合多肽的氨基酸序列，與編碼解聚酶或C-末端解聚酶片段的氨基酸序列的N-末端鄰接。根據本發明融合多肽的一個優點在于，修飾與聚合物微粒表面結合的蛋白并不影響參與聚合物微粒形成的蛋白的功能。例如，聚合物合酶的功能在重組多肽與其N-末端融合時得以保留，從而導致在微粒表面產生重組多肽。如果蛋白的功能性還是因為融合而削弱，那么這個缺點可通過行使相同功能并以活性狀態存在的其他微粒形成蛋白來彌補。這樣就可以確保聚合物微粒上結合的重組多肽借助于微粒形成蛋白進行穩定鍵合。應理解，融合多肽中蛋白的排布順序取決于質粒中所含核酸的基因序列的次序。例如，可能期望產生這樣的融合多肽，其中能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域與聚合物合酶間接融合。術語“間接融合”是指這樣的融合多肽，其所包含的微粒形成蛋白優選聚合物合酶，和至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，通過可以是期望在融合多肽中表達的任何蛋白的附加蛋白分隔開。在述及結核病治療情形下的微粒時，可能期望產生這樣的融合多肽，其中結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域與聚合物合酶間接融合。與此類似， 在述及肝炎或流感治療的情形時，可能期望產生這樣的融合多肽，其中肝炎病毒抗原或流感病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域或至少一個流感病毒抗原結合結構域與聚合物合酶間接融合。術語“間接融合”是指這樣的融合多肽，其所包含的微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域，通過可以是期望在融合多肽中表達的任何蛋白的附加蛋白分隔開。與此類似，該術語可以指這樣的融合多肽， 其所包含的微粒形成蛋白和至少一個肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域， 通過可以是期望在融合多肽中表達的任何蛋白的附加蛋白分隔開。或者，該術語可以指這樣的融合多肽，其所包含的微粒形成蛋白和至少一個流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域，通過可以是期望在融合多肽中表達的任何蛋白的附加蛋白分隔開。在一個實施方案中，附加蛋白選自微粒形成蛋白、或融合多肽、或促進融合多肽獨立折疊的接頭或間隔臂，如上文所討論的那樣。在該實施方案中，將有必要對質粒中的基因序列進行排序，以反映期望排列的融合多肽。在一個實施方案中，能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域可與聚合物合酶直接融合。術語“直接融合”在本文用來表示兩個或更多個肽借助于肽鍵相連。例如，在涉及結核病治療或預防的不同實施方案中，結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域可與聚合物合酶直接融合。術語“直接融合”在本文用來表示兩個或更多個肽借助于肽鍵相連。在涉及肝炎治療或預防的不同實施方案中，肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域可與聚合物合酶直接融合。在涉及肝炎治療或預防的不同實施方案中，流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域可與聚合物合酶直接融合。術語“直接融合”在本文用來表示兩個或更多個肽借助于肽鍵相連。也可以形成這樣的微粒，其中微粒包含至少兩個與聚合物微粒結合的截然不同的融合多肽。例如，可以結合聚合物微粒的第一融合多肽包含與聚合物合酶融合的、能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域。在述及結核病治療的情形時，微粒包含可以結合聚合物微粒的第一融合多肽，所述融合多肽包含例如與聚合物合酶融合的結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域。在述及肝炎治療的情形時，微粒包含可以結合聚合物微粒的第一融合多肽，所述融合多肽包含例如與聚合物合酶融合的肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域。在述及流感治療的情形時，微粒包含可以結合聚合物微粒的第一融合多肽，所述融合多肽包含例如與聚合物合酶融合的流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域。在一個實施方案中，表達構建體在體內表達。優選表達構建體是在微生物優選大腸桿菌中表達的質粒。在一個實施方案中，表達構建體在體外表達。優選表達構建體利用無細胞表達系統在體外表達。在一個實施方案中，一個或多個基因可以插入在單個表達構建體中，或一個或多個基因可以整合到宿主細胞基因組中。在所有情況下，都可以通過如上文所述的啟動子來控制表達。在一個實施方案中，表達構建體還編碼至少一個附加融合多肽，所述附加融合多肽包含能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域和微粒形成蛋白，優選聚合物合酶，如上文所討論的那樣。在一個實施方案中，表達構建體還編碼至少一個附加融合多肽，所述附加融合多肽包含結核分枝桿菌抗原或至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域和微粒形成蛋白，如上文所討論的那樣。在一個實施方案中，表達構建體還編碼至少一個附加融合多肽，所述附加融合多肽包含肝炎病毒抗原或至少一個肝炎病毒抗原結合結構域和微粒形成蛋白，如上文所討論的那樣。在一個實施方案中，表達構建體還編碼至少一個附加融合多肽，所述附加融合多肽包含流感病毒抗原或至少一個流感病毒抗原結合結構域和微粒形成蛋白，如上文所討論的那樣。可用于本文的質粒在實施例中顯示，并在公開號為W02004/020623(Bernd Rehm) 的 PCT/DE2003/002799 和公開號為 W02007/037706(Bernd Rehm)的 PCT/NZ2006/000251 中詳細說明，分別整體并入作為參考。將會理解，能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的結合結構域，能夠結合至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原，例如受試者體內存在的能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原，其中對該受試者給藥了與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域、或者欲對該受試者引發免疫應答。在結核病治療的情形下，將會理解結核分枝桿菌抗原結合結構域能夠結合至少一個結核分枝桿菌抗原，例如受試者體內存在的結核分枝桿菌抗原，其中對該受試者給藥了結核分枝桿菌抗原結合結構域、或者欲對該受試者引發免疫應答。與此類似，在肝炎治療的情形下，將會理解肝炎病毒抗原結合結構域能夠結合至少一個肝炎病毒抗原，例如受試者體內存在的肝炎病毒抗原，其中對該受試者給藥了肝炎病毒抗原結合結構域、或者欲對該受試者引發免疫應答。在流感治療的情形下，將會理解流感病毒抗原結合結構域能夠結合至少一個流感病毒抗原，例如受試者體內存在的流感病毒抗原，其中對該受試者給藥了流感病毒抗原結合結構域、或者欲對該受試者引發免疫應答。6.用于微粒生產的宿主本發明的微粒便利地利用如本文所述的一個或多個表達構建體在宿主細胞中生產。本發明的聚合物微粒可通過使宿主細胞表達所述表達構建體而生產。這可通過首先將表達構建體引入宿主細胞或宿主細胞的先祖細胞中而實現，例如通過用表達構建體轉化或轉染宿主細胞或宿主細胞的先祖細胞，或以其他方式確保表達構建體存在于宿主細胞之中。轉化之后，在適合于表達構建體中的融合多肽表達和聚合物微粒形成的條件下維持轉化的宿主細胞。如本領域已知的那樣，此類條件包括適合于所選擇的表達構建體例如質粒在適宜生物體中表達的那些條件。例如，特別是期望高產量或過表達的情況下，在培養基中提供允許融合多肽的微粒形成蛋白組分形成聚合物微粒的適宜底物。從而，本發明提供了生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白、優選聚合物合酶的核酸序列；和至少一個編碼能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列；在適合于表達構建體表達和聚合物微粒形成的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒。在一個實施方案中，發明提供了生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述表達構建體包含
至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼例如結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列；在適合于表達表達構建體和聚合物合酶形成聚合物微粒的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒以制備包含聚合物微粒的組合物。在一個實施方案中，發明提供了生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原結合結構域或者流感病毒抗原或流感病毒抗原結合結構域的核酸序列；在適合于表達表達構建體和聚合物合酶形成聚合物微粒的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒以制備包含聚合物微粒的組合物。優選宿主細胞為例如細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或動物細胞，優選分離的或非人類宿主細胞。在謹記本文討論的考慮事項之后，生產重組聚合物微粒的本領域公知方法(例如Sambrook et al.，1987 ；Ausubel et al.，1987)中可用的宿主細胞往往適合用于本發明的方法。適宜的原核宿主細胞包括例如真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌株可公開獲得，例如大腸桿菌 Kl2 菌株 I\ftC94 (ATCC31，446)；大腸桿菌 Xl776 (ATCC31,537)；大腸桿菌菌株 W3110 (ATCC 27，325)和K5772 (ATCC53，635)。其他適宜的原核宿主細胞包括其他腸桿菌科成員，例如 ±矣希氏菌(Escherichia spp.)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬例如傷寒沙門氏菌、沙雷氏菌屬 (Serratia)例如粘質沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志賀氏菌屬，以及芽孢桿菌屬例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)、假單胞菌屬例如銅綠假單胞菌、及放線菌(Actinomycetes)例如鏈霉菌屬(Str印tomyces)、紅球菌屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)禾口分枝桿菌屬(Mycobaterium)。例如，在一些實施方案中，可以使用大腸桿菌菌株W3110，因為它是重組DNA產物發酵中常見的宿主菌株。優選宿主細胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以修飾菌株W3110以實現編碼宿主內源蛋白質的基因的遺傳突變，此類宿主的實例包括大腸桿菌 W3110菌株1A2，其具有完整的tonA基因型；大腸桿菌W3110菌株9E4，其具有完整的tonA ptr3基因型；大腸桿菌W3110菌株27C7(ATCC 55，244)，其具有完整的tonA ptr3phoA E15 (argF-lac) 169degPompT kanr基因型；大腸桿菌W3110菌株37D6，其具有完整的tonA ptr3phoAE15(argF-lac) 169 degP ompT rbs7ilvG kanr基因型；大腸桿菌W3110菌株40B4， 其為具有非卡那霉素抗性degP缺失突變的菌株37D6。例如，在一些優選的實施方案中，可以使用不產生脂多糖內毒素的乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)菌株。乳酸乳球菌菌株的例子包括MG1363和乳酸乳球菌乳脂亞種 (Lactococcus lactis subspecies cremoris)NZ9000。
例如，除了原核生物，真核細胞微生物例如絲狀真菌或酵母也是用于本發明方法的適宜的克隆和表達宿主。例子包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，一種常用的低等真核宿主微生物。其他例子包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse,1981 ；EP139,383)> 克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專禾U No. 4，943，529 ；Fleer et al.，1991)例如乳酸克魯維酵母(K. Iactis) (MW98-8C、CBS683、CBS4574 ；Louvencourt et al.，1983)、脆壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC12, 424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC16, 045)、維克漢姆克魯維酵母(K. wickeramii) (ATCC24, 178)、瓦爾特克魯維酵母(K. waltii) (ATCC56, 500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum) (ATCC 36, 906 ；Van den Berg et al，1990)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克斯克魯維酵母(K. marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia) (EP402, 2 )；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP183, 070 ；Sreekrishna et al.， 1988)；假絲酵母屬(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia) (EP244, 234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa) (Case et al. , 1979)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)例如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis) (EP394, 538，1990 年 10 月 31 日公開)；以及絲狀真菌例如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium) (W091/00357,1991年1月10日公開)，以黑曲霉屬(Aspergillus)宿主例如構巢曲霉 (A. nidulans)(Ballance et al. ,1983 ；Tilburn et al. , 1983 ；Yelton et al.,1984) 和黑曲霉(A.niger) (Kelly and Hynes，1985)。甲基營養酵母適用于本文，包括選自以下屬的能夠在甲醇上生長的酵母漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬、克勒克酵母屬 (Kloeckera)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、球擬酵母屬(Torulopsis)、 和紅酵母屬(Iihodotorula)。作為此類酵母例子的具體物種清單可見于Anthony，1982。無脊椎宿主細胞的實例包括昆蟲細胞，例如果蠅(DrOSOphila)S2和灰翅夜蛾 (Spodoptera)Sfg ；以及植物細胞，例如棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的細胞培養物。已經鑒定了眾多桿狀病毒和變體以及對應的來自例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) ( ^^ ) ,i^RP^C (Aedes aegypti) ( ^^ )、^^Cp^C (Aedes albopictus) (蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)等宿主的許可性昆蟲宿主細胞。多種用于轉染的病毒株可公開獲得，例如苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica NPV) L-I變體和家蠶核多角體病毒NPV的Bm_5株，并且此類病毒可用作為本文本發明的病毒，特別是用來轉染草地貪夜蛾細胞。 可用的哺乳動物細胞系的例子有SV40轉化的CVl猴腎細胞系(C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系093或經亞克隆進行懸浮培養的293細胞，Graham et al., J. Gen Virol. 36 :59(1977))；幼倉鼠腎細胞系(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞 /-DHFR(CHO，Urlaub et al.，1980)；小鼠睪丸支持細胞(TM4,Mather, 1980)；猴腎細胞(CV IATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76, ATCCCRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(Wl38, ATCC CCL75)；人肝細胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳腺癌細胞(MMT 060562， ATCC CCL51) ；TRI 細胞(Mather et al.，1982) ；MRC 5 細胞；FS4 細胞；以及肝癌細胞系(Hep G2)。 例如，在能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或者與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域、或者結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域、或者肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原結合結構域、或者流感病毒抗原或流感病毒抗原結合結構域需要一種或多種翻譯后修飾例如糖基化作用的情況下，將優選真核生物細胞系， 特別是哺乳動物細胞系。例如，一個或多個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原可能需要翻譯后修飾而具有免疫原性或更優化的免疫原性，因此可以在能進行此類翻譯后修飾的表達宿主中有效地表達。在一個實施方案中，宿主細胞是具有氧化性胞漿的細胞，例如大腸桿菌Origami 菌株(Novagen)。在另一實施方案中，宿主細胞是具有還原性胞漿的細胞，優選大腸桿菌。例如，宿主細胞可以選自以下的屬雷爾氏菌屬、產堿菌屬、假單胞菌屬和鹽二型菌屬(Halobiforma)。例如，優選所使用的微生物選自下組真養雷爾氏菌、肥大產堿菌、大腸桿菌、脆假單胞菌I^seudomonas fragi)、惡臭假單胞菌、食油假單胞菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌和鹽二型菌(Halobiforma haloterrestris)。該組既包括天然地能夠生產生物相容性生物可降解微粒的微生物，又包括比如像大腸桿菌等由于其基因組成不能如此的微生物。如上文所述而引入為使后者所述微生物能夠生產微粒所需的基因。極端嗜鹽古細菌生產的聚合物微粒具有更低水平的蛋白非特異性結合，使得從這些細胞中分離和純化微粒更為容易。原則上，任何可培養的宿主細胞均可通過上述方法用來生產聚合物微粒，即便是宿主細胞由于不同的代謝而不能夠產生形成聚合物微粒所需的底物。在這樣的情況下，向培養基中添加必要的底物，而后由已經引入細胞的基因所表達的蛋白將其轉化成聚合物微粒。用來使后者所述宿主細胞能夠生產聚合物微粒的基因包括例如硫解酶、還原酶或聚合物合酶，例如來自真養雷爾氏菌的PhaA硫解酶、phaB酮脂酰還原酶或phaC合酶。需要哪些基因來補充宿主細胞聚合物微粒形成所缺少的那些將取決于宿主細胞的基因組成以及培養基中所提供的底物。參與形成聚羥基烷酸酯(PHA)微粒的基因和蛋白，以及有關微粒形成的總體考慮事項在Madison，et al，1999 ；公開的 PCT 國際申請 W02004/020623 (Bernd Rehm)；和 Rehm，
2003 ；Brockelbank JA. et al.，2006 ；Peters and Rehm, 2006 ；Backstrom et al, (2006)
以及RehnK2006)中報道，全都并入本文作為參考。單獨的聚合物合酶可在任何以(R)-羥基酰基-CoA或其他CoA硫酯或其衍生物為底物的宿主細胞中使用。聚合物微粒也可以在體外形成。例如，優選使用無細胞表達系統。在這樣的系統中提供聚合物合酶。優選純化的聚合物合酶，例如可通過重組生產獲得的，或在能夠進行蛋白翻譯的無細胞系統中獲得的，可通過引入編碼編碼聚合物合酶的表達構建體而由無細胞系統自身獲得的聚合物合酶。為了產生允許微粒體外形成的環境，培養基中應當包括聚合物微粒形成所必需的底物。聚合物合酶可利用例如(R)-羥基酰基-CoA或其他CoA硫酯作為底物而用于在體內生產功能化聚合物微粒。在進行體外聚合物微粒生產之前，融合多肽可利用細胞分選儀、離心、過濾或親和
68層析而從裂解的細胞中純化。體外聚合物微粒形成能夠優化控制表面組成，包括融合多肽覆蓋水平、磷脂組成寸寸。應理解，聚合物微粒的特征可以通過控制生產聚合物微粒的條件加以影響或控制。例如，這可以包括宿主細胞的基因組成，例如生產大顆粒的細胞分裂突變體，如Peters and Rehm, 2005中所述。還有維持宿主細胞的條件，例如溫度，底物的存在，一個或多個微粒形成蛋白例如微粒大小決定蛋白的存在，聚合物調控蛋白的存在，等等。在一個實施方案中，聚合物微粒一個期望的特征是持久性。術語“持久性”是指聚合物微粒在選定的環境中抗降解的能力。聚合物微粒另一個期望的特征是其通過聚合物合酶或微粒形成蛋白形成，并在微粒組裝期間結合于聚合物合酶或微粒形成蛋白的C-或 N-末端。在本發明的一些實施方案中，期望在宿主細胞中實現表達構建體的過表達。特定表達構建體的過表達機制在本領域公知，并取決于構建體自身、待表達它的宿主、以及其他因素，包括期望或需要的過表達程度。例如，可通過如下方式實現過表達i)利用強啟動子，例如在原核宿主中利用T7RNA聚合酶啟動子系統；ii)利用高拷貝數質粒，例如含有 colEl復制原點的質粒；或iii)穩定信使RNA，例如通過應用融合序列進行；或iv)通過例如優化密碼子使用、核糖體結合位點或終止位點等來優化翻譯。過表達的益處允許在期望時生產較小的微粒以及生產更高數目的聚合物微粒。形成聚合物微粒的聚合物的組成可以影響聚合物微粒的機械或理化性能。例如聚合物組成有別的聚合物微粒可能半壽期不同，或者可能以不同的速率釋放生物活性物質， 特別是藥物活性成分。例如，由C6-C143-羥基脂肪酸組成的聚合物微粒由于該聚合物的低結晶度而呈現出較高的聚合物降解速度。增加聚合物骨架上側鏈相對大的聚合物組份的分子比，通常會降低結晶度，產生更為突出的彈性性能。通過控制按照本發明所述方法中的聚合物組成，可相應地影響聚合物微粒的生物可降解性，從而影響聚合物微粒(以及存在情況下微粒上的一個或多個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原或者能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的結合結構域、或者微粒上的一個或多個結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域、或者肝炎病毒抗原或肝炎病毒抗原結合結構域、或者流感病毒抗原或流感病毒抗原結合結構域)在例如給藥受試者體內的持續時間，或影響聚合物微粒上或聚合物微粒中存在的生物活性物質特別是藥物活性劑或護膚成分的釋放速率。優選在培養基中引入至少一種具有功能性側基的脂肪酸作為形成聚合物微粒的底物，其中特別優選引入至少一種羥基脂肪酸和/或至少一種巰基脂肪酸和/或至少一種
氨基脂肪酸。“具有功能性側基的脂肪酸”應理解為表示飽和或不飽和的脂肪酸。這也包括含有選自下組的功能性側基的脂肪酸甲基、烷基、羥基、苯基、巰基、伯胺基、仲胺基和叔胺基、醛基、酮基、醚基、羰基、0-酯基、硫酯基、羧酸酰胺基、半縮醛基、縮醛基、磷酸單酯基團和磷酸雙酯基團。底物的使用根據聚合物微粒期望的組成和期望的性能來決定。底物或底物混合物可以含有至少一種任選取代的氨基酸、乳酸鹽、酯或者飽和或不飽和的脂肪酸，優選酰基_CoA。在一個實施方案中，底物混合物中提供佐劑、免疫調節因子或分子，例如免疫刺激因子或分子、或可用于制備疫苗的其他化合物，從而在聚合物微粒形成期間摻入到聚合物微粒之中，或擴散到聚合物微粒之中。聚合物微粒可以包含選自例如聚β -氨基酸、聚乳酸、聚硫酯和聚酯的聚合物。最優選聚合物包含聚羥基烷酸酯(PHA)，優選聚(3-羥基丁酸酯)(PHB)。聚合物合酶或聚合物微粒包含由磷脂單層包裹的聚合物微粒。優選所述微粒形成蛋白橫跨所述脂單層。聚合物合酶或微粒形成蛋白優選與聚合物微粒結合、或與磷脂單層結合、或與兩者均結合。微粒形成蛋白優選與其所形成的聚合物微粒共價或非共價結合。優選聚合物微粒至少約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或 100%
的表面積覆蓋有融合多肽。在某些情況下，可能期望控制本發明方法所產生的微粒的大小，以例如產生特別適合給定應用的微粒。例如，可能期望產生相對大的包含一個或多個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的聚合物微粒，以例如引發強大的細胞介導的免疫應答。例如，在用于治療結核病的微粒情況下，可能期望產生相對大的包含一個或多個結核分枝桿菌抗原的聚合物微粒，以例如引發強大的細胞介導的免疫應答。類似的情形可適用于肝炎或流感的治療， 可能期望產生相對大的包含一個或多個肝炎病毒抗原或一個或多個流感病毒抗原的聚合物微粒，以例如引發強大的細胞介導的免疫應答。控制聚合物微粒大小的方法在公開號為 W02004/020623 的 PCT/DE2003/002799 和公開號為 W02007/037706 的 PCT/NZ2006/000251 中有說明。例如，在一些實施方案中，微粒大小通過控制微粒形成蛋白的表達、或如果存在的話通過控制微粒大小決定蛋白的表達進行控制。例如，在本發明的其他實施方案中，微粒大小控制可通過控制底物的可利用性、例如培養基中底物的可利用性來實現。在某些實例中，按足以控制聚合物微粒大小的量向培養基中添加底物。應理解可以組合應用此類方法，從而可以對微粒大小實現更為有效的控制。例如，在不同的實施方案中，可以控制微粒大小以產生粒徑約IOnm至3μπι、優選約 IOnm 至約 900nm、約 IOnm 至約 800nm、約 IOnm 至約 700nm、約 IOnm 至約 600nm、約 IOnm 至約500nm、約IOnm至約400nm、約IOnm至約300nm、約IOnm至約200nm、特別優選約IOnm 至約IOOnm的微粒。例如，在其他實施方案中，可以控制微粒大小以產生粒徑約IOnm至約90nm、約 IOnm 至約 80nm、約 IOnm 至約 70nm、約 IOnm 至約 60nm、約 IOnm 至約 50nm、約 IOnm 至約 40nm、 約IOnm至約30nm、或約IOnm至約20nm的微粒。具體考慮平均聚合物大小的其他范圍，例如包括落在上述范圍之內的范圍，例如粒徑約50至約500nm、約150至約250nm、或約100至約500nm等的聚合物微粒。例如，在不同的實施方案中，所產生的微粒中有90%粒徑約200nm或以下、80%粒徑約150nm或以下、60%粒徑約IOOnm或以下、45%粒徑約80nm或以下、40%粒徑約60nm 或以下、25%粒徑約50nm或以下、5%粒徑約35nm或以下。例如，在不同的實施方案中，所述方法產生平均粒徑小于約200nm、小于約150nm或小于約IlOnm的聚合物微粒。7.組合物和制劑本發明的聚合物微粒可配制成適合用于本發明方法多種不同應用的組合物，例如，經配制用于經由特定路徑給藥，或經配制用于貯存，可在其生產宿主細胞外面穩定地維持為微粒，并且可對這些微粒進行設計以適應許多應用。例如，在一個實施方案中，配制本文可用的組合物以允許通過任何選擇的路徑對受試者給藥，包括但不限于口服或腸胃外(包括局部、皮下、肌內和靜脈注射)給藥。因此，例如根據本發明可用的藥物組合物可以用根據目的給藥路徑和標準藥學實踐所選擇的適宜的可藥用載體(包括賦形劑、稀釋劑、輔劑及其組合)來配制。例如，如本領域公知的那樣，旨在進行疫苗接種的藥物組合物可以含有一個或多個佐劑或免疫刺激劑。 例如，根據本發明可用的組合物可作為粉劑、液劑、片劑或膠囊劑口服給藥，或作為膏劑、霜劑或洗劑局部給藥。適宜的制劑可以含有需要的附加藥劑，包括乳化劑、抗氧化劑、調味劑或著色劑，并且可以調整以適合速釋、延遲釋藥、調控釋藥、持續釋藥、脈沖釋藥或控釋。因此，本發明也涉及用于治療人類或其他哺乳動物疾病、紊亂和/或病況及如本文所公開的其他紊亂的、包含一種或多種本發明聚合物微粒的劑量、劑型、制劑、組合物和/ 或器械，包括本文所公開的那些。應用包含一種或多種本發明聚合物微粒的這些劑型、制劑組合物和/或器械能夠有效治療這些病況。例如，本發明提供了包含一種或多種本發明聚合物微粒、例如一種或多種包含Tb抗原的聚合物微粒的劑型、制劑、器械和/或組合物。可配制本發明的劑型、制劑、器械和/或組合物，以優化生物利用度、免疫原性，或使血漿、血液或組織濃度維持在免疫原性或治療范圍內，包括維持一段時間。例如，也可以利用控釋遞藥制品來優化作用部位的抗原濃度。.可配制本發明的劑型、制劑、器械和/或組合物進行周期性給藥，例如以提供對一種或多種本發明聚合物微粒的持續接觸。用來引發有益免疫應答的策略，例如采用一次或多次“加強”疫苗的策略在本領域公知，并且可以采用這樣的策略來實施本發明。藥物組合物和劑型可以通過腸胃外路徑給藥，并且在引發免疫應答的方法的某些實施方案中，例如本文所述的那些，將優選此路徑。腸胃外劑型的例子包括活性劑水溶液、 等滲鹽水或5%葡萄糖液，或其他可藥用的賦形劑。例如，環糊精或本領域技術人員公知的其他增溶劑可用作為藥物賦形劑來遞送治療劑。適合于口服給藥的劑型例子包括但不限于能夠提供治療有效量的本發明聚合物微粒的片劑、膠囊劑、錠劑或類似形式，或任何液劑形式例如糖漿劑、水劑、乳劑等。膠囊劑可以含有任何標準的可藥用材料例如明膠或纖維素。片劑可以按照常規方法通過壓制活性成分與固體載體及潤滑劑的混合物來配置。固體載體的例子包括淀粉和糖、膨潤土。活性成分可以以含有粘合劑例如乳糖或甘露醇、常規填充劑和壓片劑的硬殼片劑或膠囊劑的形式給藥。適合于透皮給藥的劑型例子包括但不限于透皮貼劑、透皮繃帶等。適合于局部給藥本發明組合物和制劑的劑型例子為任何洗劑、棒劑、噴劑、膏劑、糊劑、霜劑、凝膠劑等，直接施用于皮膚，或借助于媒介如敷劑、貼劑等。適合于栓劑給藥本發明組合物和制劑的劑型例子包括任何插入體孔、特別是直腸、陰道和尿道插入的固體劑型。
適合于注射本發明組合物和制劑的劑型例子包括借助于快速濃注遞藥，例如通過靜脈注射、皮下、真皮下和肌內給藥單次或多次給藥或口服給藥。適合于儲庫給藥本發明組合物和制劑的劑型例子包括本發明聚合物微粒的小丸或小圓柱，或本發明聚合物微粒的置于生物可降解聚合物、微乳劑、脂質體中的任何固體劑型或微膠囊劑型。本發明組合物和制劑的輸注器械的例子包括含有一種或多種本發明聚合物微粒的輸注泵，以期望的量給藥期望的劑量數或以穩定狀態給藥，并且包括植入式藥泵。本發明組合物和制劑的植入式輸注器械的例子包括本發明聚合物微粒的包封于或散布在生物可降解聚合物或合成聚合物如硅樹脂、硅橡膠、硅膠或類似聚合物中的任何固體劑型。適合于透粘膜遞送本發明組合物和制劑的劑型的例子包括灌腸劑貯液、陰道栓劑、棉塞、霜劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑、霧化溶液、粉劑以及除活性成分外還含有本領域已知適宜的載體的類似制劑。具體考慮適合于吸入或吹入本發明組合物和制劑的劑型，包括處于可藥用水性或有機溶劑或其混合物之中的含組合物的溶液和/或混懸液，和/或粉劑。透粘膜遞送本發明組合物和制劑可以利用任何粘膜，但常利用鼻腔、口腔、陰道和直腸組織。 適合于鼻腔給藥本發明組合物和制劑的劑型可以以液體形式給藥，例如鼻腔噴劑、鼻腔滴劑，或通過霧化器以氣霧劑給藥，包括聚合物微粒的水性或油性溶液。當載體為固體時，鼻腔給藥制劑包括粒徑例如小于約100 μ m的粗粉，優選更小，最優選小于約50 μ m，其通過吸氣的方式給藥，即通過鼻道從靠近鼻部的粉劑容器中迅速吸入。本發明的制劑可制備為水性溶液，例如處于生理鹽水中，采用苯甲醇或其他適宜防腐劑、增強生物利用度的吸收促進劑、碳氟化合物和/或本領域已知的增溶劑或分散劑的溶液。適合于口腔給藥本發明組合物和制劑的劑型的例子包括錠劑、片劑等，處于可藥用水性或有機溶劑或其混合物之中的含組合物的溶液和/或混懸液，和/或粉劑。適合于舌下給藥本發明組合物和制劑的劑型的例子包括錠劑、片劑等，處于可藥用水性或有機溶劑或其混合物之中的含組合物的溶液和/或混懸液，和/或粉劑。適合于眼部給藥本發明組合物和制劑的劑型的例子包括插入劑，和/或處于可藥用水性或有機溶劑之中的含組合物的溶液和/或混懸液。可用于遞送本發明組合物和制劑的組合物劑型的例子，包括疫苗和控釋藥物劑型，可見于例如 Sweetman，S. C. (Ed. ). Martindale. The Complete Drug Reference, 33rd Edition, Pharmaceutical Press, Chicago,2002,2483PP. ；Aulton, Μ. Ε. (Ed.) Pharmaceutics.The Science of Dosage Form Design. Churchill Livingstone, Edinburgh,2000,734pp.；禾口 Ansel, H. C. , Allen, L. V. and Popovich, N. G. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7thEd. , Lippincott 1999，676PP·。 備遞藥系統所采用的賦形劑在本領域技術人員已知的多種出版物中有說明，包括例如KilDbe， Ε. H. Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd Ed.，American Pharmaceutical Association，Washington，2000，665pp。USP還提供了調控釋藥口服劑型的例子，包括配制為片劑或膠囊劑的那些劑型。參見例如fThe United States Pharmacopeia 23/ National Formulary 18， The United States Pharmacopeial Convention, Inc.， Rockville MD，1995(以下記做“USP”)，其中也描述了用來確定緩釋和延遲釋藥片劑和膠囊劑釋藥能力的具體試驗。有關緩釋和延遲釋藥藥品釋藥的USP測試以劑量單位藥物溶解所用的測試時間為基礎。關于多種測試儀器和方法的說明可見于USP。F.D.A提供了有關緩釋劑型分析的更多指南(參見Guidance for Industry. Extended release oral dosage forms -development， evaluation, and application of in vitro/in vivo correlations. Rockville, MD Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration,1997)。本發明劑型的更多例子包括但不限于調控釋藥(MR)劑型，包括延遲釋藥(DR)劑型；延時釋藥(PA)劑型；控釋(CR)劑型；緩釋(ER)劑型；定時釋藥(TR)劑型；和長效釋藥 (LA)劑型。這些術語大部分用來描述口服給藥的劑型，但是這些術語可適用于本文所述的任何劑型、制劑、組合物和/或器械。這些制劑在給藥后實現總藥物的延緩釋放，和/或在給藥后以小量均分間歇性釋藥、和/或通過遞藥系統控制以可控的速率慢速釋藥、和/或以不變的恒定速率釋藥、和/或以比普通制劑顯著更長的時間釋藥。在某些實施方案中，一種或多種本發明的聚合物微粒、或包含一個或多個抗原的一種或多種本發明的聚合物微粒的治療有效量是約lug/kg至約lg/kg。示例性的治療有效的劑量范圍包括例如約1 μ g/kg至約500mg/kg、約1 μ g/kg至約400mg/kg、約1 μ g/kg至約 300mg/kg、約 1 μ g/kg 至約 200mg/kg、約 1 μ g/kg 至約 100mg/kg、約 1 μ g/kg 至約 90mg/ kg、約 1 μ g/kg 至約 80mg/kg、約 1 μ g/kg 至約 70mg/kg、約 1 μ g/kg 至約 60mg/kg、約 1 μ g/ kg 至約 50mg/kg、約 5 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 10 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 50 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 100 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 200 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 300 μ g/kg 至約 50mg/ kg、約 400 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 500 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 600 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 700 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 800 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 900 μ g/kg 至約 50mg/kg、約 lmg/ kg 至約 50mg/kg、約 5mg/kg 至約 50mg/kg、約 lOmg/kg 至約 50mg/kg、約 15mg/kg 至約 50mg/ kg、約 20mg/kg 至約 50mg/kg、約 25mg/kg 至約 50mg/kg、約 30mg/kg 至約 50mg/kg、約 35mg/ kg 至約 50mg/kg、約 40mg/kg 至約 50mg/kg、或約 45mg/kg 至約 50mg/kg。其他治療有效的劑量范圍包括例如約lmg/kg至約lg/kg、約1. 5mg/kg至約 950mg/kg、約 2mg/kg 至約 900mg/kg、約 3mg/kg 至約 850mg/kg、約 4mg/kg 至約 800mg/kg、 約 5mg/kg 至約 750mg/kg、約 5mg/kg 至約 700mg/kg，5mg/kg 至約 600mg/kg、約 5mg/kg 至約 500mg/kg、約 10mg/kg 至約 400mg/kg、約 10mg/kg 至約 300mg/kg、約 10mg/kg 至約 200mg/kg、 約 10mg/kg 至約 250mg/kg、約 10mg/kg 至約 200mg/kg、約 10mg/kg 至約 200mg/kg、約 IOmg/ kg 至約 150mg/kg、約 10mg/kg 至約 100mg/kg、約 10mg/kg 至約 75mg/kg、約 10mg/kg 至約 50mg/kg、或約 15mg/kg 至約 35mg/kg。在本發明靶向人類受試者的一些實施方案中，一種或多種本發明的聚合物微粒、 或包含一個或多個抗原的一種或多種本發明的聚合物微粒的治療有效量是例如約IOmg至約IOg每劑。其他治療有效的劑量范圍包括例如約20mg至約9g、約30mg至約8g、約40mg 至約7g、約50mg至約6g、約60mg至約5g、約70mg至約4g、約80mg至約3g、約IOOmg至約 2g、約 IOOmg 至約 1. 5g、約 200mg 至約 1400mg、約 200mg 至約 1300mg、約 200mg 至約 1200mg、 約 200mg 至約 IlOOmg, about 200mg 至約 lOOOrng、約 300mg 至約 900mg、約 300mg 至約 800、 約300mg至約700mg、或約300mg至約600mg每劑。本發明還部分地提供了包含一種或多種本發明的聚合物微粒的低劑量組合物、制劑和器械。例如，低劑量組合物、制劑等以足以提供例如下述劑量的量給藥約0. OOlmg/kg 至約 5mg/kg、約 0. 01mg/kg 至約 4. 5mg/kg、約 0. 02mg/kg 至約 4mg/kg、約 0. 02 至約 3. 5mg/ kg、約 0. 02mg/kg 至約 3mg/kg、約 0. 05mg/kg 至約 2. 5mg/kg、約 0. 05mg/kg 至約 2mg/kg、約 0. 05-0. lmg/kg 至約 5mg/kg、約 0. 05-0. lmg/kg 至約 4mg/kg、約 0. 05-0. lmg/kg 至約 3mg/ kg、約0. 05-0. lmg/kg至約ang/kg、約0. 05-0. lmg/kg至約lmg/kg，和/或落在本文所示種種范圍內的任何其他劑量或劑量范圍的一種或多種本發明的聚合物微粒、或包含一個或多個抗原的一種或多種本發明的聚合物微粒。本文所述的劑量可以按單次劑量、多次劑量或均分劑量給藥。例如，如免疫學領域所公知的那樣，所述劑量可以在一個療程內一次、兩次、三次、四次或更多次給藥。根據本發明可用的組合物的功效可在體外和體內進行評價。參見例如下文的實施例。簡而言之，可以在體外或在體內測試組合物誘導細胞介導的免疫應答的能力。對于體內研究，可對動物(例如小鼠)飼喂或注射組合物，然后評估其引發免疫應答的效果。基于這些結果，可確定合適的劑量范圍和給藥路徑。在本發明的一些實施方案中，治療有效量是有效引發免疫應答的量，例如血液中的 IFN- γ 濃度約 0. 5ng/mL 至約 20ng/mL、約 0. 5ng/mL 至約 15ng/mL、約 0. 5ng/mL 至約 10ng/mL、約 0. 5ng/mL 至約 9ng/mL、約 Ing/mL 至約 8ng/mL、約 2ng/mL 至約 7ng/mL、或約 3ng/mL 至約 6ng/mL。在一些情況下，包括感染后或長期感染期間，觀察到IFN-Y血液濃度升高，因此在確定基線時這種濃度升高應當考慮在內，針對此基線來評估本發明聚合物微粒所引發的有效免疫應答。8.用聚合物微粒進行治療已近發現聚合物微粒例如聚羥基烷酸酯聚合物微粒，可以在其生產宿主細胞外面穩定地維持為微粒，并且可對這些微粒進行設計以適應許多應用。功能化的聚合物微粒可以包含一個或多個表面結合的能夠引發細胞介導的或其他免疫應答的抗原，一個或多個與能夠引發細胞介導的或其他免疫應答的抗原的結合結構域結合的物質，或其組合。例如，在一個實施方案中，物質在微粒形成期間固定在微粒的表面，結合于與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，或通過荷載、擴散或摻入而整合到微粒中。例如，在用于結核病治療的情形下，聚合物微粒可以包含一個或多個表面結合的結核分枝桿菌抗原，一個或多個與結核分枝桿菌抗原結合結構域結合的物質，或其組合。在一個實施方案中，物質在微粒形成期間固定在微粒表面上，與例如結核分枝桿菌抗原結合結構域結合，或通過荷載、擴散或摻入而整合到微粒中。也具體考慮例如通過交聯而使之共價連接于聚合物微粒表面。在一個實施方案中，所述物質選自例如下組清單蛋白或蛋白片段、肽、多肽、抗體或抗體片段、抗體結合結構域、抗原、抗原決定簇、表位、免疫原或其片段、或其中兩項或多項的任意組合。在一個實施方案中，來自細胞內病原體的DNA可進行片段化，并插入到編碼包含聚合物合酶的融合多肽的表達構建體中。這樣，利用公知的可升級的細菌生產系統，能夠產生展示細胞內病原體抗原決定簇的聚合物微粒，利用來自感染患者的血清進行篩選，并鑒定、分離和生產抗原提呈微粒。在一個實施方案中，多個能夠引發細胞介導的(或其他)免疫應答的抗原固定在聚合物微粒的表面。在一個實施方案中，來自例如結核分枝桿菌的DNA可進行片段化，并插入到編碼包含聚合物合酶的融合多肽的表達構建體中。這樣，利用公知的可升級的細菌生產系統，能夠產生展示例如結核分枝桿菌抗原決定簇的聚合物微粒，利用來自感染患者的血清進行篩選，并鑒定、分離和生產抗原提呈微粒。例如，在一個實施方案中，多個結核分枝桿菌或其他抗原固定在聚合物微粒的表與此類似，在不同的實施方案中，來自例如肝炎病毒或來自流感病毒的DNA可進行片段化，并插入到編碼包含聚合物合酶的融合多肽的表達構建體中。這樣，利用公知的可升級的細菌生產系統，能夠產生展示肝炎病毒抗原決定簇或流感病毒抗原決定簇的聚合物微粒，利用來自感染患者的血清進行篩選，并鑒定、分離和生產抗原提呈微粒。在一個實施方案中，多個肝炎病毒或流感病毒抗原抗原固定在聚合物微粒的表本發明一方面涉及攜帶一個或多個抗原的聚合物微粒引發免疫應答的能力。在一個實施方案中，聚合物微粒包含至少一個與聚合物微珠融合的、能夠引發細胞介導的或其他免疫應答的抗原。在聚合物微粒表面展示至少一個能夠引發細胞介導的或其他免疫應答的抗原，以刺激針對該抗原性部分的最佳免疫應答。在一個實施方案中，攜帶一個或多個抗原的聚合物微粒引發免疫應答。在一個實施方案中，聚合物微粒包含例如至少一個與聚合物微珠融合的結核分枝桿菌抗原。在聚合物微粒表面展示例如至少一個結核分枝桿菌抗原，以刺激針對該抗原性部分的最佳免疫應答。在一個實施方案中，攜帶一個或多個抗原的聚合物微粒引發針對肝炎病毒的免疫應答。在一個實施方案中，聚合物微粒包含例如至少一個與聚合物微珠融合的肝炎病毒抗原。在聚合物微粒表面展示例如至少一個肝炎病毒抗原，以刺激針對該抗原性部分的最佳免疫應答。在一個實施方案中，聚合物微粒包含例如至少一個與聚合物微珠融合的流感病毒抗原。在聚合物微粒表面展示例如至少一個流感病毒抗原，以刺激針對該抗原性部分的最佳免疫應答。考慮其他抗原，如本文所指出的那樣。例如，在一個實施方案中，組合物中存在、或者微粒中或微粒上存在不止一個抗原、或組合的抗原和佐劑或其他免疫調節因子或分子例如免疫刺激因子或分子。典型地，存在組合的抗原、佐劑或其他免疫調節因子或分子將會進一步增強免疫應答。例如，在一個實施方案中，本發明提供了多期疫苗組合物。所述雜合疫苗展示特異于結核菌感染多個階段的不同抗原。例如，早期抗原與潛伏期抗原共表達。特異于多個病原體包括細胞內病原體的抗原在本領域公知，并且示例病原體的代表性抗原在本文說明。本發明也涉及引發受試者細胞介導的(和/或其他)免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥包含例如融合于與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的微粒形成蛋白優選聚合物合酶的聚合物微粒。
在該實施方案中，在對受試者給藥之后，與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，可以與能夠引發細胞介導的免疫應答的內源抗原結合。應理解，包含與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的聚合物微粒，與能夠引發細胞介導的免疫應答的內源抗原結合，能夠引發或增強受試者的免疫應答。例如，在給藥包含例如至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的微粒之前，受試者體內存在的能夠引發細胞介導的免疫應答、但不能引發受試者有效的免疫應答的抗原， 在與微粒結合之后，能夠引發有效的免疫應答或有效增強受試者的免疫應答。在一個實施方案中，本發明提供了對例如感染有結核的、或例如之前進行過抗結核免疫的受試者引發免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥包含與例如結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白的聚合物微粒。例如，在該實施方案中，在對受試者給藥之后，結核分枝桿菌抗原結合結構域可以與內源結核分枝桿菌抗原結合。應理解，包含結核分枝桿菌抗原結合結構域的聚合物微粒， 與例如內源結核分枝桿菌抗原結合，能夠引發或增強受試者的免疫應答。例如，在給藥包含例如至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的微粒之前，受試者體內存在的、但不能引發受試者有效的免疫應答的結核分枝桿菌抗原，在與微粒結合之后，能夠引發有效的免疫應答或有效增強受試者的免疫應答。在一個實施方案中，本發明提供了對例如感染有肝炎的、或之前進行過抗肝炎免疫的受試者引發免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥包含與肝炎病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白的聚合物微粒。例如，在該實施方案中，在對受試者給藥之后，肝炎病毒抗原結合結構域可以與內源肝炎病毒抗原結合。應理解，包含肝炎病毒抗原結合結構域的聚合物微粒，與例如內源肝炎病毒抗原結合，能夠引發或增強受試者的免疫應答。例如，在給藥包含例如至少一個肝炎病毒抗原結合結構域的微粒之前，受試者體內存在的、但不能引發受試者有效的免疫應答的肝炎病毒抗原，在與微粒結合之后，能夠引發有效的免疫應答或有效增強受試者的免疫應答。例如，在一個實施方案中，本發明提供了對例如感染有流感的、或之前進行過抗流感免疫的受試者引發免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥包含與流感病毒抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白的聚合物微粒。例如，在該實施方案中，在對受試者給藥之后，流感病毒抗原結合結構域可以與內源流感病毒抗原結合。應理解，包含流感病毒抗原結合結構域的聚合物微粒，與例如內源流感病毒抗原結合，能夠引發或增強受試者的免疫應答。例如，在給藥包含例如至少一個流感病毒抗原結合結構域的微粒之前，受試者體內存在的、但不能引發受試者有效的免疫應答的流感病毒抗原，在與微粒結合之后，能夠引發有效的免疫應答或有效增強受試者的免疫應答。應理解本發明提供了對給藥受試者引發免疫應答的微粒、組合物和方法。優選地， 針對利用本發明的微粒、組合物和方法提呈給受試者的一個或多個抗原所引發的免疫應答的幅度大于針對單獨的抗原(即，沒有本發明的微粒或組合物，或者通過并非本文提供的方法提呈)所引發的幅度。對免疫應答特別是細胞介導的免疫應答幅度進行量化的方法在本領域公知。
9.免疫應答調理劑在某些實施方案中，會期望生產展示包含至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原的融合蛋白的聚合物微粒。或者，期望包含至少一個或多個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原連同佐劑或其他免疫應答調理劑的融合蛋白來引發免疫應答。在某些情況下，會期望生產展示包含至少一個能夠引發體液免疫應答的抗原的融合蛋白的聚合物微粒。或者，期望包含至少一個或多個能夠引發體液免疫應答的抗原連同佐劑或其他免疫應答調理劑的融合蛋白引發免疫應答。例如，在結核病的治療中，會期望生產展示包含至少一個結核分枝桿菌抗原的融合蛋白的聚合物微粒，其中該聚合物微粒與一個或多個佐劑或其他免疫系統調理劑一起給藥。或者，期望包含融合蛋白(其包含一個或多個結核分枝桿菌抗原)和例如佐劑或其他免疫應答調理劑的聚合物微粒來引發免疫應答。在肝炎的治療中，會期望生產展示包含至少一個肝炎病毒抗原的融合蛋白的聚合物微粒，其中該聚合物微粒與一個或多個佐劑或其他免疫系統調理劑一起給藥。或者，期望包含融合蛋白(其包含一個或多個肝炎病毒抗原) 和佐劑或其他免疫應答調理劑的聚合物微粒來引發免疫應答。在流感的治療中，會期望生產展示包含至少一個流感病毒抗原的融合蛋白的聚合物微粒，其中該聚合物微粒與一個或多個佐劑或其他免疫系統調理劑一起給藥。或者，期望包含融合蛋白(其包含一個或多個流感病毒抗原)和佐劑或其他免疫應答調理劑的聚合物微粒來引發免疫應答。在一個實例中，本發明的聚合物微粒可以包含一個或多個抗原連同一個或多個 toll樣受體，包括一個或多個能夠與下組的一個或多個配體結合的toll樣受體LPS、脂蛋白、脂肽、鞭毛蛋白、雙鏈RNA、未甲基化的CpG島、或細菌或病毒DNA或RNA。與此相似，本發明的組合物可以包含含一個或多個Tb抗原的聚合物群、含一個或多個免疫調節分子例如一個或多個toll樣受體的聚合物群。存在一個或多個免疫調節分子可用于引發體液特異的免疫應答或細胞介導的特異性免疫應答，或引發包含體液和細胞介導的應答兩者組合的免疫應答。具體抗原可以選自任何已知的結核分枝桿菌抗原，包括上文所述和本文引用文獻中所述的那些。可以選擇抗原從而產生適合于治療或進行抗早期感染免疫的疫苗。 可選地，提供了包含來自早期和潛伏期感染的抗原的多期疫苗。例如，提供了包含展示 Ag85A-ESAT-6融合蛋白的聚合物微粒的疫苗遞送系統。另一個例子可以包括表達Ag85A抗原和適合于刺激抗結核病免疫應答的已知佐劑的聚合物微粒。具體抗原可以選自任何能夠引發細胞介導的免疫應答的已知抗原，包括上文所述和本文引用文獻中所述的那些。可以選擇抗原從而產生適合于治療或進行抗早期感染免疫的疫苗。可選地，提供了包含來自早期和潛伏期感染的抗原的多期疫苗。本發明由前述內容組成，也設想下文僅作為舉例給出的構架。
實施例實施例1-質粒構建和在大腸桿菌中生產PHA聚合物微粒本實施例描述了為在大腸桿菌中生產聚合物微粒所用質粒的構建以及所述聚合物微粒免疫原性的分析，所述聚合物微粒展示結核抗原Ag-85A和ESAT-6、丙肝病毒核心抗原、以及Hl型流感病毒血凝素(HA)抗原。
材料和方法1.大腸桿菌菌株的培養大腸桿菌DH5 α (Invitrogen)在補加有1 % (w/w)葡萄糖和75 μ g/mL氨芐青霉素的Difco Luria Broth (見表1)培養基中培養。大腸桿菌BL21 (Invitrogen)在補加有 1 % (w/w)葡萄糖、75 μ g/mL氨芐青霉素和30 μ g/mL氯霉素的Difco LuriaBroth培養基
中培養。表1 :Difco Luria Broth 培養基
權利要求
1.引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個能夠引發免疫應答的抗原融合的微粒形成蛋白。
2.引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與結合結構域融合的微粒形成蛋白，所述結合結構域與至少一個能夠引發受試者免疫應答的抗原能夠結合。
3.對受試者進行抗病原體免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個能夠引發免疫應答的抗原融合的微粒形成蛋白。
4.對受試者進行抗病原體免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與結合結構域融合的微粒形成蛋白，所述結合結構域與至少一個能夠引發受試者免疫應答的抗原能夠結I=I ο
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述免疫應答包括細胞介導的免疫應答。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述免疫應答包括體液應答。
7.權利要求1至6中任一項的方法，其中所述受試者已受病原體感染或者已進行過抗病原體免疫。
8.權利要求2或4至7中任一項的方法，其中所述與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域與內源抗原結合。
9.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個能夠引發免疫應答的抗原融合的微粒形成蛋白。
10.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個結合結構域融合的微粒形成蛋白，所述結合結構域與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合。
11.權利要求9或權利要求10的聚合物微粒，其中所述抗原能夠引發細胞介導的免疫應答。
12.權利要求9至11中任一項的聚合物微粒，其中所述抗原能夠引發體液免疫應答。
13.權利要求9至12中任一項的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的融合多肽。
14.權利要求9至13中任一項的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的抗原，或者兩個或更多不同的能夠結合抗原的結合結構域。
15.權利要求9至14中任一項的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含至少一個能夠引發免疫應答的抗原和至少一個與能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域。
16.權利要求9至15中任一項的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒還包含至少一個與聚合物微粒結合或摻入聚合物微粒之中的物質。
17.權利要求16的聚合物微粒，其中所述物質為抗原、佐劑、免疫刺激分子、或其任意兩項或更多項的組合。
18.權利要求9至17中任一項的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒是多價的。
19.權利要求16至18中任一項的聚合物微粒，其中所述物質通過交聯與聚合物微粒結合
20.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個能夠引發免疫應答的抗原融合的微粒形成蛋白，用于對有需要的受試者引發免疫應答、或對受試者進行抗病原體免疫、或對有需要的受試者進行病原體感染診斷。
21.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個結合結構域融合的微粒形成蛋白，所述結合結構域與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合，用于對有需要的受試者引發免疫應答、或對受試者進行抗病原體免疫、或對有需要的受試者進行病原體感染診斷。
22.前述權利要求中任一項的聚合物微粒，其中所述抗原為選自下組的生物的抗原 分枝桿菌屬(例如牛分枝桿菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、鳥分枝桿菌副結核亞種、分枝桿菌)、李斯特菌屬(例如產單核細胞李斯特菌、李斯特菌)、沙門氏菌屬(例如傷寒沙門氏菌)、耶爾森氏菌屬(例如鼠疫耶爾森氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、假結核耶爾森氏菌)、炭疽芽孢桿菌、軍團菌屬(例如嗜肺軍團菌、長灘軍團菌、博茲曼軍團菌、軍團菌)、立克次體屬(例如立氏立克次體、螨立克次體、康氏立克次體、 西伯利亞立克次體、澳大利亞立克次體、日本立克次體、非洲立克次體、普氏立克次體、斑疹傷寒立克次體、立克次體)、衣原體屬(例如肺炎衣原體、沙眼衣原體、衣原體)、嗜性衣原體屬(例如鸚鵡熱嗜性衣原體、流產嗜性衣原體)、鏈球菌屬(例如肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、 無乳鏈球菌)、葡萄球菌屬(金黃色葡萄球菌，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA))、 埃立克體屬(例如查菲埃立克體、嗜吞噬細胞埃立克體群、埃立克體)、貝氏柯克斯體、利什曼原蟲、剛地弓形蟲、克氏錐蟲、組織胞漿菌、土拉熱弗朗西斯氏菌、以及病毒，包括丙肝病毒、腺病毒、小核糖核酸病毒，包括柯薩奇病毒；甲肝病毒、脊髓灰質炎病毒、皰疹病毒科，包括EB病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、人皰疹病毒8型、水痘帶狀皰疹病毒；嗜肝DNA病毒，包括乙肝病毒；黃病毒科，包括丙肝病毒、黃熱病毒、登革病毒、 西尼羅病毒；逆轉錄病毒，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)；正粘病毒，包括流感病毒；副粘病毒，包括麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒；乳頭瘤病毒屬，包括乳頭瘤病毒；彈狀病毒屬，包括狂犬病毒；披膜病毒，包括風疹病毒；以及其他病毒，包括痘苗病毒、禽痘病毒、腺相關病毒、改良型痘苗病毒安卡拉株、塞姆利基森林病毒、痘病毒和冠狀病毒；或所述抗原為任一上述抗原的至少一個抗原性部分或T細胞表位。
23.根據權利要求1至8中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒是根據權利要求9 至22中任一項的聚合物微粒。
24.組合物，包含權利要求9至22中任一項的聚合物微粒。
25.權利要求25的組合物，用于對有需要的受試者引發免疫應答、或對有需要的受試者進行疫苗接種、或對有需要的受試者進行抗病原體免疫、或對有需要的受試者進行病原體感染診斷。
26.權利要求25或權利要求沈的組合物，其中所述組合物是疫苗。
27.權利要求9至22中任一項的聚合物微粒在制備藥物中的用途，所述藥物適于對有需要的受試者引發免疫應答、或對有需要的受試者進行疫苗接種、或對有需要的受試者進行抗病原體免疫、或對有需要的受試者進行病原體感染診斷。
28.根據權利要求27的用途，其中所述藥物是疫苗。
29.表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列，或至少一個編碼與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列。
30.權利要求四的表達構建體，其中所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列或所述至少一個編碼與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。
31.權利要求四或30的表達構建體，其中所述表達構建體編碼融合多肽，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和能夠引發免疫應答的抗原或與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域。
32.權利要求四至31中任一項的表達構建體，其中所述構建體還包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，或ii.至少一個還原酶，或iii.(i)和(ii)兼而有之。
33.權利要求四至32中任一項的表達構建體，其中所述構建體包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，或ii.至少一個還原酶，或iii.至少一個聚合物合酶，或iv.至少一個能夠引發免疫應答的抗原，或v.至少一個與至少一個能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，或vi.包含上述i)至ν)中一項或多項的融合蛋白，或vii.上述i)至vi)中的任一組合。
34.權利要求四至33中任一項的表達構建體，其中抗原是能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原。
35.生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述至少一個表達構建體包含至少一個編碼能夠引發免疫應答的抗原的核酸序列，或至少一個編碼與能夠引發免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域的核酸序列；在適合于所述表達構建體表達的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒。
36.診斷病原體感染的方法，其中所述方法包括向受試者給藥至少一種權利要求9至 22中任一項的聚合物微粒，和檢測指示病原體存在的反應。
37.權利要求36的方法，其中指示病原體存在的反應是遲發型超敏反應。
38.權利要求36的方法，其中指示病原體存在的反應是檢測由受試者獲得的樣品中病原體抗體的存在。
39.權利要求36的方法，其中指示病原體存在的反應是檢測所述樣品中病原體反應性免疫細胞的存在。
40.生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述至少一個表達構建體包含 至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列，和至少一個編碼結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列； 在適合于所述表達構建體表達的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒。
41.權利要求40的方法，其中表達構建體處于高拷貝數載體之中。
42.權利要求40的方法，其中至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列與強啟動子有效連接。
43.權利要求40的方法，其中在聚合物合酶底物或底物混合物的存在下維持宿主細胞，包括單體底物、能夠被宿主細胞代謝形成聚合物合酶底物的前體底物。
44.權利要求40的方法，其中宿主細胞含有至少兩個選自下組的不同表達構建體 包含編碼微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原的核酸序列的構建體，或包含編碼微粒形成蛋白和至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列的構建體，或包含編碼佐劑的核酸序列的表達構建體，或包含編碼至少一個結核分枝桿菌抗原的核酸序列表達構建體。
45.權利要求40的方法，其中至少一個編碼結核分枝桿菌抗原的核酸序列編碼 ESAT-6。
46.權利要求40的方法，其中至少一個編碼結核分枝桿菌抗原的核酸序列編碼Ag85A。
47.權利要求40的方法，其中至少一個編碼結核分枝桿菌抗原的核酸序列編碼ESAT-6 和 Ag85A。
48.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原融合的微粒形成蛋白。
49.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。
50.權利要求48或權利要求49的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的融合多肽。
51.權利要求50的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的結核分枝桿菌抗原，或者兩個或更多不同的結核分枝桿菌抗原結合結構域。
52.權利要求50或權利要求51的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含至少一個結核分枝桿菌抗原和至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域。
53.權利要求48至52中任一項的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒還包含至少一個與聚合物微粒結合或摻入聚合物微粒之中的物質，或其組合。
54.權利要求53的聚合物微粒，其中所述物質為抗原、佐劑或免疫刺激分子。
55.權利要求48至M中任一項的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒是多價的。
56.權利要求53至55中任一項的聚合物微粒，其中所述物質通過交聯與聚合物微粒結合。
57.權利要求48至56中任一項的聚合物微粒，包含結核分枝桿菌ESAT-6抗原。
58.權利要求48至57中任一項的聚合物微粒，包含結核分枝桿菌Ag85A抗原。
59.權利要求58的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含ESAT-6抗原和Ag85A抗原。
60.表達構建體，所述表達構建體包含 至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼結核分枝桿菌抗原的核酸序列，或至少一個編碼結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列。
61.權利要求60的表達構建體，其中所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼結核分枝桿菌抗原的核酸序列或所述至少一個編碼結核分枝桿菌抗原結合結構域的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。
62.權利要求60或61的表達構建體，其中所述表達構建體編碼融合多肽，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和結核分枝桿菌抗原或結核分枝桿菌抗原結合結構域。
63.權利要求60至62中任一項的表達構建體，其中所述構建體還包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，或ii.至少一個還原酶，或iii.(i)和(ii)兼而有之。
64.權利要求60至63中任一項的表達構建體，其中所述構建體包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，或ii.至少一個還原酶，或iii.至少一個聚合物合酶，或iv.至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原，或v.至少一個與至少一個能夠引發細胞介導的免疫應答的抗原能夠結合的結合結構域，或vi.包含上述i)至ν)中一項或多項的融合蛋白，或vii.上述i)至vi)中的任一組合。
65.對受試者進行抗結核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原融合的微粒形成蛋白。
66.對受試者進行抗結核免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。
67.引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原融合的微粒形成蛋白。
68.引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域融合的微粒形成蛋白。
69.權利要求65至68中任一項的方法，其中受試者感染有結核。
70.權利要求65至69中任一項的方法，其中受試者已經進行過抗結核免疫。
71.權利要求66或68至70中任一項的方法，其中結核分枝桿菌抗原結合結構域與內源結核分枝桿菌抗原結合。
72.權利要求65至71中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含兩個或更多不同的融合多肽。
73.權利要求65至72中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含兩個或更多不同的結核分枝桿菌抗原，或者兩個或更多不同的結核分枝桿菌抗原結合結構域。
74.權利要求65至73中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含至少一個結核分枝桿菌抗原和至少一個結核分枝桿菌抗原結合結構域。
75.權利要求65至74中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒還包含至少一個與聚合物微粒結合或摻入聚合物微粒之中的物質，或其組合。
76.權利要求75的方法，其中所述物質為抗原、佐劑或免疫刺激分子。
77.權利要求65至74中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒是多價的。
78.權利要求75至77中任一項的方法，其中所述物質通過交聯與聚合物微粒結合。
79.權利要求65至78中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含結核分枝桿菌 ESAT-6 抗原。
80.權利要求65至79中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含結核分枝桿菌 Ag85A抗原。
81.權利要求65至80中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含的至少一個融合多肽包含ESAT-6抗原和Ag85A抗原。
82.權利要求65至81中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含選自下組的結核分枝桿菌抗原Ag85B (MPT59)、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT51、MPT59、MPT63、MPT64、MPT83、 MPB5、MPB59、MPB64、MTC28、Mtb2、Mtb8. 4、Mtb9. 9、Mtb32A、Mtb39、Mtb41、TB10. 4、TB10C、 TB11B、TB12. 5、TB13A、TB14、TB15、TB15A、TB16、TB16A、TB17、TB18、TB21、TB20. 6、TB24、 TB27B、TB32、TB32A、TB33、TB38、TB40. 8、TB51、TB54、TB64、CFP6、CFP7、CFP7A、CFP7B、CFP8A、 CFP8B、CFP9、CFP10、CFPl 1、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、 CFP22A、CFP23、CFP23A、CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP27、CFP28、CFP28B、CFP29、CFP30A、 CFP30B、CFP50、CWP32、hspX(a -晶型)、ΑΡΑ、結核菌素純蛋白衍生物(PPD)、ST-CF、ΡΡΕ68、 LppX, PstS-U PstS-2、PstS-3、HBHA, GroEL, GroEL2、GrpES, LHP、19kDa 月旨蛋白、71kDa、 RD1-0RF2、RD1-0RF3、RD1-0RF4、RD1-0RF5、RD1-0RF8、RD1-0RF9A、RD1-0RF9B、Rvl984c、 Rv0577、Rvl827、BfrB、Tpx. Rvl352、Rvl810、PpiA、Cut2、FbpB、FbpA、FbpC、DnaK、FecB、Ssb、 RplL、FixA、FixB、AhpC2、Rv2626c、Rvl211、Mdh、Rvl626、Adk、ClpP、SucD(Belisle et al, 2005 ；US7, 037，510 ；US2004/0057963 ；US2008/0199493 ；US2008/0267990)；或任一上述抗原的至少一個抗原性部分或T細胞表位。
83.對受試者進行抗肝炎或抗流感免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白，優選聚合物合酶。
84.對受試者進行抗肝炎或抗流感免疫的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與能夠結合至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原的結合結構域融合的微粒形成蛋白， 優選聚合物合酶。
85.引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白，優選聚合物合酶。
86.引發受試者免疫應答的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者給藥至少一種包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中至少一個融合多肽包含與能夠結合至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原的結合結構域融合的微粒形成蛋白，優選聚合物合酶。
87.權利要求83至86中任一項的方法，其中免疫應答是細胞介導的免疫應答。
88.診斷肝炎病毒或流感病毒感染的方法，其中所述方法包括向受試者給藥至少一種權利要求9至22中任一項的聚合物微粒，和檢測指示肝炎病毒或流感病毒存在的反應。
89.權利要求88的方法，其中指示肝炎病毒或流感病毒存在的反應是遲發型超敏反應。
90.權利要求88的方法，其中指示肝炎病毒或流感病毒存在的反應是檢測所述樣品中針對肝炎病毒或流感病毒的抗體的存在。
91.權利要求88的方法，其中指示肝炎病毒或流感病毒存在的反應是檢測所述樣品中肝炎病毒或流感病毒反應性免疫細胞的存在。
92.權利要求88至91中任一項的方法，其中受試者感染有肝炎或流感。
93.權利要求88至92中任一項的方法，其中受試者已經進行過抗肝炎或抗流感免疫。
94.權利要求89或91至93中任一項的方法，其中能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域與內源肝炎病毒抗原或流感病毒抗原結合。
95.權利要求88至94中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含兩個或更多不同的融合多肽。
96.權利要求88至95中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含兩個或更多不同的肝炎病毒抗原或兩個或更多流感病毒抗原，或者兩個或更多不同的能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域。
97.權利要求88至96中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原，和至少一個能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域。
98.權利要求88至97中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒還包含至少一個與聚合物微粒結合或摻入聚合物微粒之中的物質，或其組合。
99.權利要求98的方法，其中所述物質為抗原、佐劑或免疫刺激分子。
100.權利要求88至99中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒是多價的。
101.權利要求98至100中任一項的方法，其中所述物質通過交聯與聚合物微粒結合。
102.權利要求88至101中任一項的方法，其中至少一種聚合物微粒包含至少一個抗原或至少一個能夠結合至少一個抗原的結合結構域，其中所述抗原來自選自下組的生物病毒，包括丙肝病毒、腺病毒、小核糖核酸病毒，包括柯薩奇病毒；甲肝病毒、脊髓灰質炎病毒、 皰疹病毒科，包括EB病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、人皰疹病毒8型、水痘帶狀皰疹病毒；嗜肝DNA病毒，包括乙肝病毒；黃病毒科，包括丙肝病毒；正粘病毒，包括流感病毒；或任一上述抗原的至少一個抗原性部分或T細胞表位。
103.生產聚合物微粒的方法，所述方法包括提供含有至少一個表達構建體的宿主細胞，所述至少一個表達構建體包含至少一個編碼肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的核酸序列，或至少一個編碼能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域的核酸序列；在適合于所述表達構建體表達的條件下維持所述宿主細胞；和從宿主細胞中分離聚合物微粒。
104.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白。
105.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域融合的微粒形成蛋白。
106.權利要求104或權利要求105的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的融合多肽。
107.權利要求106的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含兩個或更多不同的肝炎病毒抗原或兩個或更多流感病毒抗原，或者兩個或更多不同的能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域。
108.權利要求106或權利要求107的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒包含至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原，和至少一個能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域。
109.權利要求104至108中任一項的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒還包含至少一個與聚合物微粒結合或摻入聚合物微粒之中的物質，或其組合。
110.權利要求109的聚合物微粒，其中所述物質為抗原、佐劑或免疫刺激分子。
111.權利要求104至110中任一項的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒是多價的。
112.權利要求109至111中任一項的聚合物微粒，其中所述物質通過交聯與聚合物微粒結合。
113.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原融合的微粒形成蛋白，用于對有需要的受試者引發細胞介導的免疫應答、或對受試者進行抗肝炎或抗流感免疫、或對有需要的受試者進行肝炎病毒或流感病毒感染診斷。
114.包含一個或多個融合多肽的聚合物微粒，其中所述融合多肽包含與至少一個能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域融合的微粒形成蛋白，用于對有需要的受試者引發細胞介導的免疫應答、或對受試者進行抗肝炎或抗流感免疫、或對有需要的受試者進行肝炎病毒或流感病毒感染診斷。
115.權利要求104至114中任一項的聚合物微粒在制備藥物中的用途，所述藥物適于對有需要的受試者引發細胞介導的免疫應答、或對受試者進行抗肝炎或抗流感免疫、或對有需要的受試者進行肝炎病毒或流感病毒感染診斷。
116.表達構建體，所述表達構建體包含至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列；和至少一個編碼肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的核酸序列，或至少一個編碼能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域的核酸序列。
117.權利要求116的表達構建體，其中所述至少一個編碼微粒形成蛋白的核酸序列和所述至少一個編碼肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的核酸序列或所述至少一個編碼能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域的核酸序列作為單個開放閱讀框存在。
118.權利要求116或117的表達構建體，其中所述表達構建體編碼融合多肽，所述融合多肽包含微粒形成蛋白和肝炎病毒抗原或流感病毒抗原或能夠結合肝炎病毒抗原或流感病毒抗原的結合結構域。
119.權利要求116至118中任一項的表達構建體，其中所述構建體還包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，或ii.至少一個還原酶，或iii.(i)和(ii)兼而有之。
120.權利要求116至119中任一項的表達構建體，其中所述構建體包含編碼下述蛋白的核酸i.至少一個硫解酶，或ii.至少一個還原酶，或iii.至少一個聚合物合酶，或iv.至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原，或v.至少一個能夠結合至少一個肝炎病毒抗原或至少一個流感病毒抗原的結合結構域，或vi.包含上述i)至ν)中一項或多項的融合蛋白，或vii.上述i)至vi)中的任一組合。
全文摘要
本發明涉及聚合物微粒及其用途。具體地，本發明涉及功能化的聚合物微粒、其制備方法、其引發細胞介導的免疫應答的用途以及治療或預防疾病或病況的用途，包括因細胞內病原體所引起的那些疾病或病況。
文檔編號A61K39/145GK102573891SQ201080043214
公開日2012年7月11日 申請日期2010年7月29日 優先權日2009年7月29日
發明者大衛·奈爾·維德洛克, 娜塔莉·安妮·帕拉尼, 布賴斯·馬爾科姆·布德勒, 貝恩德·赫爾穆特·阿達姆·雷姆 申請人:大衛·奈爾·維德洛克, 娜塔莉·安妮·帕拉尼, 布賴斯·馬爾科姆·布德勒, 貝恩德·赫爾穆特·阿達姆·雷姆