牛膝糖聚合物及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥及保健食品技術領域，具體涉及植物中糖聚合物的制備方法，更 具體的說涉及懷牛膝粗糖聚合物、精糖聚合物的制備方法，還涉及該牛膝粗糖聚合物在預 防和/或治療骨質疏松癥中的應用。本發明中的糖聚合物包括多糖和寡糖。
【背景技術】
[0002] 骨質疏松癥（osteoporosis, 0P)是一種以骨礦物量減少、骨微結構破壞、骨強度 降低，從而導致骨的脆性增加和易于發生骨折為特征的疾病。骨質疏松癥是一種多發性的 老年性疾病，隨著人口的老齡化日趨嚴重，骨質疏松癥已嚴重危害老年人健康。絕經后女性 因受到衰老和體內激素水平下降的雙重影響，成為該病最大的受害人群，約占總患病人數 70%以上。目前防治骨質疏松癥的藥物主要是骨吸收抑制劑、骨形成促進劑和礦化藥物，這 些藥物均屬替代治療，在長期使用過程中，具有毒副作用大，靶向性低，依從性差，費用高等 缺點。因此，有必要找尋到一種高效、低毒的藥物來治療骨質疏松癥。中藥在治療骨質疏松 癥方面具有悠久歷史，具有全身調理、毒副作用小、價格低廉等優勢，越來越受到人們的關 注。而在眾多中藥中，補腎壯骨類中藥由于良好的療效一直受到人們的青睞。
[0003] 牛膝（B. 1)為莧科植物牛膝的干燥根，為"四大懷藥"之 一。具有補肝腎、強筋骨、逐瘀通經、引血下行之功，主要用于腰膝酸痛、筋骨無力、經閉癥 瘕、肝陽眩暈之癥。歷代本草明確記載治療"骨痹"、"骨痿"的方劑共21個，涉及藥物77種， 其中牛膝出現11次。牛膝糖聚合物作為牛膝的主要活性成分之一，已被報道具有免疫調 節、抗腫瘤、降血糖、保護肝腎等多種藥理活性。
[0004] 目前，國內外對牛膝糖聚合物的研究主要集中在其抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、降 糖、抗衰老等方面的活性研究，對其在防治骨質疏松癥方面的研究尚未見報道。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種牛膝糖聚合物ABW3-1。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種牛膝中糖聚合物的提取方法。
[0007] 本發明的再一目的在于提供上述牛膝糖聚合物在制備防治骨質疏松藥物或保健 食品或功能食品中的應用。
[0008] 本發明所采取的技術方案是： 一種牛膝糖聚合物ABW3 -1，該糖聚合物是由葡萄糖和果糖組成的寡糖，其結構為：
[0009] -種牛膝中糖聚合物的提取方法，該方法包括以下操作步驟： 1) 剪切：將牛膝干燥根切成小段，用水清洗干凈、晾干； 2) 水提：將剪切好的牛膝進行水提，分別收集提取液和殘渣； 3) 分級醇沉：將提取液濃縮后，加入乙醇使乙醇體積濃度為a%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB1 ;將上清液再次濃縮，加入乙醇使乙醇體積濃度為b%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB2 ;將上清液再次濃縮，加入乙醇使乙醇體積濃度為c%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB3 ;其中10彡a<b<c< 100 ; 4) 堿提：將水提后的殘渣浸泡于0. 1~1MNaOH溶液中，靜置1~4h，上清液用0. 1~ 1MHC1進行中和，使上清液的pH為6~8,離心取上清，濃縮上清，加入乙醇使乙醇體積濃 度為50~90%，靜置，收集沉淀，即得堿提粗糖聚合物ABB; 5) 純化：對上述粗糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB進行純化，即得牛膝糖聚合物。
[0010] 進一步的，步驟2)中所述水提的具體操作為用5~15倍體積的60~100°C熱水對 切好的牛膝進行提取，提取時間1~4h。
[0011] 進一步的，步驟3)中所有所述濃縮為40~70°C減壓濃縮，所有所述靜置的時間為 10 ~28h〇
[0012] 進一步的，步驟 3)中 10 彡a< 60,60 <b< 80,80 <c< 100。
[0013] 進一步的，將步驟5)中純化后的糖聚合物AB3再進行離子交換柱層析，用蒸餾水 進行洗脫，使用苯酚-硫酸法跟蹤洗脫曲線，根據洗脫曲線收集糖部分，濃縮，冷凍干燥；然 后用水溶解，離心，取上清液進行分子篩凝膠柱層析，用水進行洗脫，使用苯酚-硫酸法跟 蹤洗脫曲線，根據洗脫曲線收集糖部分，濃縮，冷凍干燥后獲得牛膝糖聚合物ABW3-1。
[0014] 牛膝糖聚合物，該糖聚合物的提取方法為上述所述的提取方法。
[0015] 牛膝糖聚合物ABW3-1在制備防治骨質疏松的藥物或保健食品或功能食品中的應 用。
[0016] 牛膝糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB在制備防治骨質疏松的藥物或保健食品或功能 食品中的應用。
[0017] 牛膝糖聚合物在制備防治骨質疏松的藥物或保健食品或功能食品中的應用。
[0018]本發明的有益效果是： 1.本發明利用離子交換層析和分子篩凝膠柱層析方法純化牛膝糖聚合物，首次制備 出一種牛膝精寡糖，并且對該精寡糖的理化性質、分子量、單糖組成等進行了系統的分析鑒 定，并成功得出了該寡糖的特征結構。本發明提供了牛膝中粗糖聚合物、精糖聚合物的制備 方法及牛膝糖聚合物在抗骨質疏松方面的活性研究，為牛膝糖聚合物在醫藥、保健品等領 域的應用提供依據。
[0019] 2.與傳統水煮法提取糖聚合物相比，本發明采用水提醇沉法和堿提法的結合，乙 醇濃度由低到高進行分級醇沉，對牛膝糖聚合物進行初步分離，同時高濃度乙醇能將極性 大、水溶性好的糖聚合物與極性小、水溶性差的糖聚合物分離，使所提取的糖聚合物組合物 含有更多種類的糖聚合物成分。且本制備工藝簡單，操作方便，且可以大規模生產。
[0020] 3.本發明中通過柱層析法對牛膝粗糖聚合物進行分離純化，效果顯著，首次制備 出一種牛膝寡糖純品。
[0021] 4.本發明對制備出的一種牛膝寡糖結構進行了鑒定，明確了該寡糖的理化性質 及結構，為探究其藥理活性機制提供結構依據。
[0022] 5.本發明提供了牛膝中具有抗骨質疏松活性的成分的制備方法，并且篩選出了 含量高、活性強的糖聚合物部位。
【附圖說明】
[0023]圖 1 為ABW3-1 的HPGPC色譜圖； 圖2為ABW3-1的紅外圖譜； 圖3為ABW3-1的13CNMR圖譜； 圖4為ABW3-1的1HNMR圖譜； 圖5為ABW3-1的HSQC圖譜； 圖6為ABW3-1的HMBC圖譜； 圖7為牛膝糖聚合物對去卵巢大鼠體重的影響； 圖8為牛膝糖聚合物對去卵巢大鼠子宮系數的影響； 圖9為牛膝糖聚合物對去卵巢大鼠股骨骨密度的影響； 圖10為牛膝糖聚合物對去卵巢大鼠腰椎骨骨密度的影響； 圖11為牛膝糖聚合物對去卵巢大鼠股骨骨礦物量的影響； 圖12為牛膝糖聚合物對去卵巢大鼠腰椎骨骨礦物量的影響。
【具體實施方式】
[0024] 1.牛膝中糖聚合物的提取方法，該方法包括以下操作步驟： 1) 剪切：將牛膝干燥根切成小段，用冷水快速清洗、晾干； 2) 水提：將剪切好的牛膝進行水提，分別收集提取液和殘渣； 3) 分級醇沉：將提取液濃縮后，加入乙醇使乙醇體積濃度為a%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB1 ;將上清液再次濃縮，加入乙醇使乙醇體積濃度為b%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB2 ;將上清液再次濃縮，加入乙醇使乙醇體積濃度為c%，靜置，收集沉淀，即得 粗糖聚合物AB3 ;其中10彡a<b<c< 100 ;更優選的10彡a<b<c< 100,且10彡a < 60,60 <b< 80,80 <c< 100 ； 4) 堿提：將水提后的殘渣浸泡于0. 1~1MNaOH溶液中，靜置1~4h，上清液用0. 1~ 1MHC1進行中和，使上清液的pH為6~8,離心取上清，濃縮上清，加入乙醇使乙醇體積濃 度為50~90%，靜置，收集沉淀，即得堿提粗糖聚合物ABB; 5)純化：對上述粗糖聚合物AB1、AB2、AB3、ABB進行純化，即得牛膝糖聚合物。
[0025] 優選的，步驟1)中所述小段為1~2cm的小段。
[0026] 優選的，步驟2)中所述水提的具體操作為用5~15倍體積的60~100°C熱水對牛 膝進行提取，提取時間1~4h。
[0027] 優選的，步驟3)中所有所述濃縮為40~70°C減壓濃縮，所有醇沉靜置的時間為 10 ~28h〇
[0028] 優選的，步驟4)中NaOH溶液用量體積為殘渣體積的10~20倍。
[0029] 優選的，步驟5)中所述純化具體操作為利用Sevag法分別對粗糖聚合物AB1、AB2、 AB3、ABB除蛋白，除蛋白后再經透析袋進行透析、凍干。
[0030] 優選的，上述透析袋的截留分子量為3000Da。
[0031] 優選的，對步驟5)中純化后的