專利名稱：非侵入性體內光學成像方法
非侵入性體內光學成像方法本發明涉及在受試者的血液中測定包含熒光實體和第二實體的熒光分析物的存在、定量該熒光分析物的血液水平、和/或監測或測定該熒光分析物的血液清除的非侵入性方法，其包括下列步驟或由下列步驟組成(a)將至少一種預定波長的激發光引導到包含所述受試者的瞳孔的至少一部分的劃定區上，以激發所述熒光實體，(b)通過所述受試者的眼，接收具有與(a)所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光，藉此測定所述受試者的血液中所述熒光分析物的存在，定量所述熒光分析物的血液水平，和/ 或監測或測定所述熒光分析物的血液清除。本發明進一步涉及用于任一種前述方法的如前述權利要求中任一項限定的熒光分析物或熒光標記物。此外，本發明涉及如前述權利要求中任一項限定的熒光分析物或熒光標記物用于制備要在任一種前述方法中采用的診斷組合物的用途。此外，本發明涉及用于本文中限定的任何方法的裝置。非侵入性成像可以追溯到威爾姆 倫琴(Wilhelm Roentgen)于1895年發現X-射線。在現代醫學中成像技術及其應用的數量劇增。計算機斷層攝影術(CT)、正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射計算機化斷層攝影術(SPECT)和磁共振成像(MRI)是一些經典的非侵入性成像技術。這些技術容許基于解剖學、形態學和生理學變化來診斷疾病，諸如癌癥。然而，大多數這些已建立的技術缺乏靈敏性，降低特異靶向性、而且不能展現出分子基礎上的功能性變化，故而不是基礎研究、臨床前和轉化應用中的合適工具。因此，僅可以在晚期、形態學可見的時間點時診斷出疾病。出于此原因，研究人員已經聚焦于具有高靈敏性和高對比度的用于對基因表達、 受體激活、信號傳導途徑、凋亡和多藥物抗性成像的分子-功能成像技術(Weissleder和 Mahmood, Radiology 2001 ；第 219 卷316-333)。與“經典的”診斷成像，例如磁共振(MR)、計算斷層攝影術(CT)、和超聲(US)成像相對的是，分子成像(諸如光學分子成像)是對作為疾病基礎的分子異常進行分析，而不是對這些分子變化的終末效應成像。光學分子成像諸如熒光和生物發光成像是醫學診斷學中最新的尖端技術之一，并且已成為一種對分子水平變化成像的有力工具。此技術的目的是顯現并定量疾病形成過程中的分子變化。特別感興趣的是這樣的熒光染料，其在近紅外(NIR，一種光譜窗口)發射，而血紅蛋白和水程度吸收最小，從而容許光子在組織中穿透數厘米。作為標記物使用的熒光染料應當吸收并發射近紅外范圍中的光。它們應當揭示高熒光量子產率、良好的水溶性和光靈敏性(Heiduschka等，hvestigative Ophthalmology & Visual Science 2007 ；第48卷28144823)。在過去數年中，花青染料(Cy-染料)被證明為在生物醫學研究中有效且可靠的熒光染料。由于其在近紅外區中的熒光，容許光子較深地穿過組織，并且它們以低的組織自身熒光為特征。它們是非常光穩定的，并且針對PH 變化不敏感。除了花青染料外，alexa染料也是光學成像技術中使用的常見熒光染料。在早期階段診斷出疾病，對于患者的預后會是極大的優勢，并且可以適時地啟動適當的治療。功能性成像技術性能包括研究功能性途徑的能力，在細胞和分子水平評估血管生成和低氧。為了非侵入性顯現生物學過程并為了能夠進行定量，可注射成像劑是必需的。此探針包含可以高度靈敏地檢出的標記物和展現出針對期望靶物的高親和力的配體。為了提高靈敏度，加強標記物特異性信號的策略是必需的；最后但也很重要的一點是，需要高分辨率的成像方式來檢測標記物特異性的信號(Hengerer和Mertelmeier， Electromedica 2001 ；第1卷44-49)。其他可選的標記技術，諸如遺傳報告物和外源細胞追蹤劑，是以不同的標記策略為基礎的，但是它們主要局限于小鼠模型和基礎生物科學。光學分子技術越來越多地用于了解癌癥的復雜性、多樣性和體內行為。可以使用對胞外受體特異性的經標記抗體來檢測腫瘤。可以使用分子標志基因來監測基因療法。此技術使得人們能夠對合適目標結構進行體外和/或體內評估，并可以測定針對這些結構的治療劑的效率，為更快速的藥物開發提供了可能(Hengerer和Merte Ime i er， Electromedica 2001 ；第 1 卷44-49 ；H0gemann和 Weissleder，Radiologie 2001 ；第 41 卷116-120 ;Reiser 等，Lehrbuch derRadiologie, Thieme Verlag, 2004 ；Cutler, Surg Gunecol Obstet 1929 :721-728) 目前，主要地，CT、MRT、PET 和 SPECT 是臨床試驗中用于測試治療效率的常用成像技術。穿過組織并與組織組分相互作用的光子是光學成像技術的基礎。卡特勒(Cutler) 在1擬9年首次報告了光學成像，即光診斷(diagnostic with light)，但是正是伴隨著高靈敏性CCD檢測系統的開發和偶聯熒光染料與生物化學標志物的機會，才促使光學成像成為研究人員關注的對象(Ntziachristos 和 Bremer, Radiology 2003 ；第 1 卷:195-208)。熒光照明和觀察已經是醫學和生物科學兩門學科中最快得到適用的成像技術之一。許多天然存在的材料在暴露于具有特定波長的光時發射另一波長的光。這種現象稱作發光。若發射光快速出現(在百萬分之一秒左右)，則它定義為熒光，而若發射花費長于百萬分之一秒， 則發光稱作磷光。這種現象早已為人所知，并且那些熒光分子已經證明在許多生物學系統中作為標記物極端有用。發熒光的材料幾乎總是發射比激發光波長(λ吸收)長的波長的光(λ發射)。上述波長間的差異稱作斯托克斯(Moke)位移(λ斯托克斯)，它說明了激發與發射波長間的能量水平(ΔΕ)。一定范圍的激發波長會激發熒光。此范圍稱為吸收光譜。發射光譜也涵蓋一定范圍的波長，提示了一種熒光材料不限于僅一種激發波長。許多生物學材料是天然熒光的，具體說有多種維生素、一些激素、和多種酶和結構蛋白。這些分子經常發射強到足以干擾特定的體內熒光標記研究的熒光。這樣所謂的自身熒光造成不期望的背景，因此激發光和發射光兩者都需要高度過濾。限制激發光波長可以降低自身熒光量。限制發射光的波長范圍可以使那些干擾期望的特定熒光的觀察和測量的自身熒光量最小化。隨著發射在電磁波譜的近紅外范圍中的光的熒光染料的開發，有可能進行更深組織水平的體內診斷。靈敏度依賴于檢查的標志物的量和定位(Bremer和Ntziachristos， AmericanJournal of Surgery 2001 ；第189卷389-392)。可見光能夠穿透深度不超過數毫米的組織，而近紅外光子(650-900nm)在若干厘米的范圍內更高效地穿過組織。此現象的原因是在所述波長范圍中來自水、黑色素和血紅蛋白的吸收系數低。由于此正面的組織特性，近紅外波長范圍又稱作“診斷窗口 ”(Mahmood和Weissleder，Molecular cancer therapeutics 2003 ；第5卷489-496)。在近紅外光譜中，光子被吸收的水平最低，并且組織自身熒光得到降低，產生最佳的靶物-背景比率(Licha和Riefke，Photochemistry andPhotobiology 2000 ；第 3 卷392-398)。監測人或動物身體的功能在許多情況下是必需的。傳統上，自受試者采集血液樣品，并用分光光度法(即一種光學成像技術)來測量組分。也可以直接應用分光光度計，通過使其與受試者接觸，例如通過使用改良的接觸鏡等裝置(即一種體內光學成像系統)，來測量受試者血液中的組分。WO 90/12534,WO 02/071932 和 WO 2006/079824 描述了一種裝置，具體地，一種改
良的接觸鏡系統，用來通過眼來實時監測人體或身體功能，如血液中的氧水平。這些文獻中所描述的發明聚焦于在麻醉期間通過眼來測量特別是氧濃度，因為眼提供了一種更為直接的評估腦中的狀況的方法。這是因為藉由眼動脈對眼的主要血供是頸內動脈的分支。因而， 可以貼切地把眼稱為腦的“窗口”。其中所描述的裝置是一種非侵入性分光分度系統，據稱其-與現有技術(US 5，553，617和US 5，919，132)相反-通過在虹膜平面中心聚焦沿著眼軸引導光，由此克服現有技術的缺點。這些分光光度技術的原理在于將光引導入眼中。此光通過眼，并被視網膜反射。用發光二極管或其它光感應器來測量反射光(來自視網膜)和反射光強度，然后計算此波長的透射率(transmittance)。因為眼是身體中唯一旨在傳播光的部分，因此可以說它們起著分光光度計的比色皿的作用。體內分子成像是一個發展很快的領域，對例如臨床診斷成像產生著影響。光學分子成像是這樣一種方法，其中將光學造影物質導入受試者或者在受試者體內激活光學造影物質，然后緣于光學造影物質的信號可使用光學檢測器如照相機加以測量，以提供一張或多張圖像。有光學分子探針可供使用，這些探針可以包含熒光或發光染料，或吸收物質，可以用于靶向并標記特定的細胞類型或激活生物化學過程，如生物發光。與磁共振成像(MRI)、 X-射線或正電子發射成像(PET)相比，光學分子成像得益于此類熒光、發光或吸收物質可以是小的生物相容性分子。通常對小動物實施體內光學分子成像以研究各種藥物或疾病的生理、病理或藥理效應。也可以對人體實施分子成像，人們希望分子成像最終會為診斷成像帶來實質性進展。 小動物的體內成像的優點是顯著的，因為它容許過程和應答在它們天然環境中得到實時顯現，而且容許使用相同的小動物實施隨時間的縱向研究，為評估疾病進展或對治療的響應提供條件。此外，小動物的體內成像可減少研究所需的動物數目，并且在疾病表現在不同動物間有變化的場合，諸如原位癌，可以降低研究的不一致性。光學分子成像(例如在小動物中)利用高度特異性的且生物相容的造影劑的能力來服務于藥物開發和疾病研究。然而，體內光學成像由于不能清楚地解析并識別被靶定的內部器官，阻礙了其廣泛應用。為了解決此問題而開發的光學斷層攝影術及組合X-射線和微計算斷層攝影術(微-CT)方法通常昂貴、復雜，或者不能實現真正的解剖影像融合 (co-registration)。相應地，Hillman和 Moore，Nature Photonics Q007)，第 1 卷5洸_530 提供了使用動力學造影劑對例如小動物分子成像的全光學解剖影像融合，即一種動力學熒光分子成像技術。他們的技術使用注射例如惰性染料后獲得的圖像的時間系列。染料的體內分布動力學的差異容許對器官進行精確的描繪和識別。此類影像融合的解剖圖容許在不用考慮重定位(!^positioning)或體重增加 (weight gain)的條件下實施縱向鑒定，由此有望極大地改善用于原位疾病研究、診斷和治療等方面的精確性和多用性。總之，有高度先進光學分子成像技術可供使用，它們容許精確地描繪并識別器官。 此外，有許多不同類型的熒光(包括近紅外熒光和發光)染料可供使用，它們可以在光學分子成像中應用。還有，已經公認，眼至少對于腦而言可以作為“窗口”然而，盡管有先前的努力及高度先進的技術和染料，尚未開發出臨床診斷應用諸如定性或定量測定受試者血液中的外來的和天然的生理物質的商業上可行的、非侵入性體內(實時)方法和用途。因此，本發明背后的技術問題是提供用于在體內非侵入性地監測和/或定量血液中的熒光分析物的手段和方法。本發明致力于解決此需要，由此，作為該技術問題的解決方案，提供了關于在體內且非侵入性地定性和/或定量測定受試者血液中的熒光分析物的手段和方法及用途的實施方案，藉此借助光學分子成像通過受試者的眼測定、定量或監測經熒光標記的分析物。這些實施方案在本文中表征并描述，并在權利要求書中得到反映。必須注意，如本文中所使用的，單數形式“一種”、“一個”、和“所述/該”包括復數指代，除非背景另有明確指示。如此，例如，提及“試劑”包括一種或多種此類不同試劑，而提及“方法”包括提及可以修飾或替換本文中所描述的方法的本領域普通技術人員已知的等同步驟和方法。通過提述完整并入本公開內容中引用的所有出版物和專利。若通過提述并入的材料與本說明書矛盾或者不一致，本說明書應當優于任何此類材料。除非另有指示，在一系列成分之前的術語“至少”應當理解為指系列中的每種成分。本領域技術人員只需通過常規試驗就會認識或能夠確認與本文中所描述的本發明具體實施方案的許多等同方案。本發明意圖涵蓋此類等同方案。在此說明書和所附的權利要求書全文中，除非上下文另有需要，詞語“包含”及變型應當理解為暗示包括規定的整數或步驟或整數組或步驟組，而不排除任何其它整數或步驟或整數組或步驟組。此說明書文本全文中引用了數個文件。在此通過提及而完整收錄本文中引用的每篇文件(包括所有專利、專利申請、科學出版物、制造商的說明書、指示等)(無論上文或下文)。本文中的任何文字都不應解釋為承認本發明沒有資格憑借在先發明而早于所述公開。藥動學描述了身體如何影響施用后的特定藥物。由此可見，“藥動學”包括所施用藥物的吸收和分布機制、藥物作用開始的速率和效果的持續時間、物質在身體中的化學變化(例如通過酶實現)和藥物代謝物的影響和排泄途徑的研究。因而，藥動學提供了探究生物系統中的化合物代謝的合理手段。關于藥動學公式和模型的綜述，參見例如Poulin和 Theil, J Pharm Sci. (2000)，第 89 卷16-35 ;Slob 等，Crit Rev Toxicol. (1997)，第 27 卷:261-272 ；Haddad 等，Toxicol Lett. (1996)，第 85 卷:113-126 ；Hoang, Toxicol Lett. (1995)，第 79 卷:99-106 ；Knaak 等，Toxicol Lett. (1995)，第 79 卷):87-98 ；及 Ball 禾口Schwartz, Comput Biol Med. (1994)，第M卷J69-276。在實踐中，藥動學主要應用于藥物物質，但理論上，它關注的對象包括各種各樣的以攝入或其它方式從外部投遞至生物體的化合物，諸如營養物、代謝物、激素、毒素等。在本發明的公開內容之前，藥動學(PK)的“常規”測量常規上通過靜脈內或腹膜內注射藥物來實施。在施用后的不同時間點，抽出血液，并通過不同分析方法(例如使用未標記的或經放射性標記的化合物的ELISA、SEC、HPLC、液相層析-串聯質譜術)定量藥物血清水平。為了接受統計學有意義的數據，通常對每個時間點使用約3至5只小鼠以得到血清峰水平(tmax)和藥物血清半衰期(tl/2)。對于一次研究，需要約9至15只小鼠(例如， 7個時間點，每個時間點3至5只小鼠，連續血液取樣)。通過插值測定tmax和tl/2兩者， 所述插值可能影響這些數值的精確性(

圖1，2)。在Hi研究終止后處死小鼠。與其形成鮮明對比的是，我們提出了一種方法和相應的裝置，其容許在期望的期間內，在一個受試者(例如，小鼠)中非侵入性地、連續實時地監測血液中的熒光分析物水平，和(如果這種情況出現的話)同時監測血液和器官中的熒光分析物水平(例如藥物水平)。通過采集血液樣品來定量熒光分析物(例如經熒光標記物的藥物)對于獲取Hi數據而言幾乎是不必要的，并且不需要處死動物。我們通過評估3種不同化合物來證明了此方法的效用1.吲哚花青綠andocyanine green)熒光染料2.帕米膦酸鹽(Pamidronate)經熒光標記的二膦酸鹽3.用Cy5標記的針對受體酪氨酸激酶的單克隆抗體我們首先通過使用吲哚花青綠(ICG，一種熒光染料)來評估此新方法的技術可行性。在i.v.注射入小鼠中時，ICG在約2至4分鐘后自循環清除(1，2)，并在肝中積累(3)。 雌性BALB/c裸鼠接受吸入麻醉，放置在成像室(圖3)中，并i. v.注射一劑20 μ g/200 μ 1。 在i. v.注射ICG前10秒開始眼中的熒光信號強度測量，并在一段8分鐘的時間里每秒以 500ms的采集時間記錄圖像。用范圍為671至705nm的波長的光激發ICG，并以820nm檢測發射。將眼區中熒光信號強度的最高值標準化為100，并且圖5，6中所描繪的數據表明在2分鐘時達到tmax，而熒光強度的半衰期為6. 6分鐘。在第二個實驗中，給具有s. c.生長腫瘤(Calu3)的BALB/c裸鼠i. v.注射ICG，并監測眼、肝、腎、腦和腫瘤區中的信號強度。在此實驗中，tmax是1.2分鐘。此后信號強度下降(tl/2 = 5. 4分鐘)，并觀察到肝中的積累在3. 8分鐘時達到平臺(圖7)。這些結果與發表的數據一致。在成功完成實施例1中所顯示的可行性研究后，我們評估了一種經熒光標記的二膦酸鹽(帕米膦酸鹽)。 二膦酸鹽(例如帕米膦酸鹽；麗279)臨床上可用于治療骨病。帕米膦酸鹽(在i.v.注射后)具有范圍為20至30分鐘的血清半衰期，并且在所檢查的所有組織中骨(脛骨)含
1 白勺 農PongchaidechaM · Clearance and tissue uptake following 4-hour and 24-hour infusions ofpamidronate in rats. Drug Metab Dispos 1993 ；21 (1) 100_104Daley-Yates 等 Acomparison of the pharmacokinetics of 14C_labelled ADP and 99mTc-labelIedADP in the mouse. Calcif Tissue Int 1988;43:125-127。我們使用經熒光標記的帕米膦酸鹽通過測量小鼠眼中的熒光強度和全身成像以監測所描述的動力學來計算tmax和tl/2血漿水平。在i. v.注射后，帕米膦酸鹽具有范圍為20至30 分鐘的血清半衰期，并且在所檢查的所有組織中骨(脛骨)含有最高的濃度。i.v.注射OsteoSense (200 μ 1 PBS中的2nMol)，并且每5秒記錄熒光信號強度(采集時間:3000ms ； 激發波長615至665nm ；發射波長780nm)。血清tl/2是34分鐘(圖7，8)，并且此后4. 4 小時和48小時時明顯表現出脊柱和后肢中的積累(圖9)。這兩個觀察結果均與發表的數據對應。最后，比較了未標記的和經Cy5標記的靶向受體酪氨酸激酶的單克隆抗體的tl/2。 常規測量揭示在5mg/k i. v.的劑量tl/2為7. 7小時(圖10)。使用光學成像，在2. 5mg/ kg i. v.的劑量tl/2是3. 05小時(圖11)。這些結果表明tmax和tl/2可以通過僅測量經麻醉動物的眼中的熒光信號強度來容易地實施。相對于常規技術，此新方法改善Hi研究的性能，因為對藥物的定量和數據插值不是必要的。此外，小鼠數目顯著減少，并且不需要處死小鼠。可以時間分辨地在線獲得關于來自不同器官的藥物積累和tl/2值的信息。總的來說，此規程容許在一只動物中進行多次測量(改善tmax和tl/2的精確性)。與常規方法相比，顯著縮短了工作時間，防止了血液樣品的混淆，而且非放射性材料的使用使得在沒有放射化學要求的預防措施的情況下通過常規實驗室方法進一步分析成為可能。除了 tmax和tl/2外，還可以追蹤器官分布。這樣的同時測量方便了關于與血清中的tl/2相比在所討論的器官中的積累的信息(例如血腦屏障滲透的指標)。可以用不同有機熒光染料容易地標記藥物(低分子量物質、肽、蛋白質、抗體和siRNA)。然而，在用經標記的藥物實施此類體內研究前，功能測定必須證明與未標記的藥物相比不存在差異。關于鐵調素調節蛋白(Hemojuvelin)，體外研究確認了未標記的和經Cy5標記的鐵調素調節蛋白在其阻斷BMP-2誘導的鐵調素Ofepcidin)mRNA在H印G2 細胞中的上調的能力上沒有差異。還有，Biacore數據揭示與未標記的赫賽汀相比，經Cy5 標記的赫賽汀具有相同的結合特征，并且結合表達Her2的腫瘤細胞。經標記的靶向受體酪氨酸激酶的抗體仍導致受體的內在化。因為不處死動物，可以多次給予相同的和/或其他的藥物(用與第一種熒光染料具有不同發射光譜的熒光染料標記)以得到關于藥物-藥物相互作用的信息。此外，可以在正常小鼠和基因工程小鼠(例如Fcfoi敲除或hu Fcfoi轉基因鼠)中評估i. v.、i. p.、口服、吸入、鼻和皮膚應用后的新設計的藥物制劑和藥物劑量的優化。成像方法的非凡進展使得對藥物和藥物投遞系統在體內的表現的可視化成為可能。 關于藥物定位和濃度的詳細且定量的信息可以作為時間函數獲得，由此對生物學效應實現更深刻的了解。此信息對于優化藥物的設計是至關重要的。因此，由本發明提供的新的非侵入性成像方法的影響是顯著的。第二，這些新方法可以用來實時地在體內評估熒光分析物諸如經熒光標記的藥物的藥動學。這一點預期會對藥物開發、藥物測試、以及為給定的受試者(例如人患者)選擇合適的療法和療法變化及藥物劑量的優化產生影響。例如，可以想見，可以建立患者依賴性療法(patient dependent therapy)，即基于給定的一組藥物或藥物制劑的藥動學，有可能為每名個體患者找到最好的可能的用藥，即個人化用藥(personalized medication)。實際上，可以實時地評估每一受試者的藥動學概況(profile)，可以非侵入性地快速獲得反饋，并且因此可以為每一受試者提供最優化的用藥(根據例如受試者的特征諸如重量、性別、年齡、健康狀態、疾病過程
寸乂 O第二，本發明的新的分子成像/定量方法和裝置為研究任何種類的藥物在活體系統的完整微環境中的藥動學提供了可能。所述新的成像裝置、用途和方法在為了促進許多不同疾病的控制和根治而設計的極其多種新生物制品、免疫學制品、和分子療法中將具有廣泛的應用，所述疾病包括癌癥、心血管疾病、神經變性疾病、炎性疾病、傳染性疾病和其它疾病。此外，所描述的檢測系統和方法對于組合環境(combined settings)中的無縫 (seamless)疾病檢測和治療會具有廣泛的應用。E，新方法和裝置可以不僅在體內而且實時檢測許多疾病的基礎病原體的存在。ma，新方法可以在藥效學(有時縮寫為“PD”，并且在與藥動學一起提及時可以稱為“PKPD”)中使用。藥效學是研究藥物對身體或對身體之內或之上的微生物或寄生物的生理學影響和藥物作用機制及藥物濃度與效果間的關系。光學成像是一種非侵入性、非離子化模式，它正在作為不同應用的診斷工具嶄露頭角。此技術為分子成像研究提供了簡單化的而高度靈敏的模式。可以通過使用經熒光標記的分析物來實現對于藥物峰水平、血中半衰期以及器官積累的非侵入性可視化。可以連續實施測量，由此使得以秒級時間分辨率進行1 分析成為可能。通過在數小時的時段里多次測量(采集時間通常在1秒之下)，可以創建“動力學影片(kinetic movies)”，使得計算血液峰水平、血液中的半衰期時間、剛施用后的理論濃度和對不同器官的分布/積累成為可能。因此，在第一方面，本發明提供了一種測定在受試者的血液中包含熒光實體和第二實體的熒光分析物的存在的非侵入性方法，包括下列步驟或由下列步驟組成(a)將至少一種預定波長的激發光引導到包含至少所述受試者的瞳孔的一部分的劃定區上，以激發所述熒光實體，(b)通過所述受試者的眼，接收具有與(a)所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光，藉此測定所述受試者的血液中所述熒光分析物的存在。“測定存在”意指定性檢測受試者血液(或血液循環系統)中的熒光分析物，由此容許確定熒光分析物是否在那里(在血液和/或血液循環系統中)。在又一方面，本發明提供了一種定量包含熒光實體和第二實體的熒光分析物的血液水平的非侵入性方法，包括下列步驟(a)將至少一種預定波長的激發光引導到包含至少所述受試者的瞳孔的一部分的劃定區上，以激發所述熒光實體，(b)藉由所述受試者的眼，接受具有與(a)所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光，由此定量熒光分析物的血液水平。為此目的，預想對受試者施用限定量的所討論的分析物，并自所述受試者采集血液樣品以定量血液中的所述分析物的量，隨后將這些數據與通過本發明的方法獲得(同時或連續獲得)的熒光信號聯系起來或將這些數據與所述熒光強度比較。應當理解，一旦發生所述關聯，便不再必需自同一受試者采集血液樣品，即一旦將數據聯系起來，便有可能通過本發明的方法定量熒光分析物的血液水平。或者和/或另外，還設想將通過本發明的方法獲得的熒光信號與已經知道(例如現有技術發表)或之前或之后已經通過常規方法(包括血液樣品)評估的血清水平數據比較。如此，在一個優選的實施方案中，比較步驟(b)中接受的所述光與參考值，由此(i)定量所述熒光分析物的血液水平。
本發明還提供了監測或測定受試者中包含熒光實體和第二實體的熒光分析物的血液清除的非侵入性方法，包括下列步驟(a)將至少一種預定波長的激發光引導到包含所述受試者的瞳孔的至少一部分的劃定區上，以激發所述熒光實體，(b)通過所述受試者的眼，接收具有與(a)所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光，由此監測或測定所述熒光分析物的血液清除。在一個優選的實施方案中，將步驟(b)中接受的所述光與參考值比較，由此(ii)測定所述熒光分析物的血液清除。術語“血液清除”包括生物學半衰期、tmax和/或tl/2的測定和/或監測。術語“生物學半衰期”意指分析物喪失其一半的活性(例如生物學、藥理學或生理學活性)所花費的時間。術語“t max”在本文中使用時指達到最大血液濃度的時間(time to reachmaximum blood concentration)。最大血液濃度是受試者血液中存在的化合物量。"T 1/2”是某種分析物在身體中的總量、或該物質在血液中的濃度降低一半所需要的時間。也可以使用t 1/2來測定分析物在該物質(例如藥物)停用(discontinue)后自身體或血液有效消除會花費多長時間。知曉半衰期對于，例如，確定為獲得期望的血液濃度的藥物施用頻率(每天攝取的次數)是有用的。例如，本發明的方法容許通過在一段時間里監測熒光信號來測定t max和tlA。 這樣，通過測定最大信號強度和最低信號強度，就可以測定t max和t 1/2。如此便不需要如通常為了測定t max和t 1/2那樣在預定的時段里抽取血液樣品。然而，任選地，可以如通常那樣通過抽取血液樣品測定t max和/或t 1/2。然后， 可以將t max和t 1/2值與如通過本發明的方法測定的t max和t 1/2值比較。因而，本發明的方法容許，例如，改進藥物的劑量，即目的是達到每種藥物的可確保對受試者功效最好且副作用最小的劑量的處方。“監測或測定熒光分析物的血液清除”進一步包括監測或測定按時間的自受試者的血液或血液循環清除的熒光分析物量。對于展現出實質性血漿蛋白質結合的熒光分析物，清除一般定義為總濃度(游離的+蛋白質結合的)而非游離的濃度。例如，分析物可能通過腎、肝、腸、肺、或免疫系統的細胞諸如專門的抗原呈遞細胞的處理而被濾出或清除。除了通過本發明的方法獲得的結果(其在下文進一步解釋)夕卜， 還可以獲得這些數據。然而，在腎之外的部位，清除是通過膜轉運蛋白而不是過濾來進行的，在這些部位中普遍的血漿蛋白結合可以通過保持整個毛細管床中游離物質的濃度相當恒定，抑制由通過毛細管的游離物質的濃度降低所致的清除降低，從而提高清除。分析物也可以例如通過靶物介導的清除，諸如抗體對腫瘤或實體瘤的結合，而被濾出或清除。如本文中所使用的，術語“腫瘤”指或描述哺乳動物中通常以不受調節的細胞生長為特征的生理學狀況。腫瘤的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤(包括髓母細胞瘤和視網膜母細胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜細胞肉瘤)、神經內分泌腫瘤(包括類癌瘤、 胃泌素瘤、和胰島細胞癌)、間皮瘤、神經鞘瘤(sctwarmoma)(包括聽神經瘤)、腦膜瘤、腺癌、和黑素瘤。術語“實體瘤”在本文中使用時指選自下組的腫瘤胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤(glioblastoma)、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(h印atoma)、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝細胞癌(h印aticcarcinoma)、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食管癌、膽道腫瘤、及頭頸癌，優選地乳腺癌。存在著至少三種不同光源檢測技術，它們在本發明的方法中可以根據本發明的方法的目的單獨地或以任意組合采用。最簡單的是連續波(CW)成像。此技術使用恒定強度的激發光，并采用多個光源-檢測器對(source-detector pair)來測量(1)由于激發熒光團分布所致的信號或O) 光衰減(由于組織吸收和散射所致)。該技術在技術上相對簡單，并且通常提供最好的信噪比(SNR)特征。一種更精巧的方法是使用單一或多頻率的強度調制(IM)激發光。憑借此方法，可以測量多個光源-檢測器對的相對于入射光的經調制的光衰減和相移。與產生強度衰減的 CW測量相比，IM技術提供兩種信息，即每個光源-檢測器對的強度衰減和相移。振幅和相位通常是不相關的測量值，并且可以更有效地解析固有襯比(intrinsic contrast)的吸收和散射系數。在熒光模式中，該技術可以對兩組信息即熒光團濃度和熒光半衰期成像。第三種方法，即時間分辨(TR)技術，使用射入眼和/或組織中的激發光的短脈沖。 該技術解析檢測光子傳播到多個光源-檢測器對的介質中的時間的分布。時間分辨方法每個光源-檢測器對含有最高的信息含量，其僅與以多頻率同時實施的IM方法相當。考慮到時間分辨數據的傅里葉變換產生多至IGHz的多個頻率(包括通過先前兩種方法使用的連續波成分(f = OMHz))的信息，這一點是容易解釋的。因此，時間分辨的方法提供用以與CW 系統直接比較的CW成分，而且還提供多個頻率(經由傅里葉變換)的強度衰減和相移測量值，其可以對固有吸收和散射，以及熒光團濃度和熒光半衰期成像。在熒光成像中，使用具有限定帶寬(包括至少一個，即1、2、3、4、5、或甚至更多個預定波長)的經過濾光(filtered light)或激光作為激發光的來源。“預定的波長”意指激發光包含能夠自相應的熒光團(由熒光實體和/或熒光分析物構成)激發熒光的、限定的光譜成分(包括單一波長、單一波長帶、超過一種波長、或超過一個波長帶)。若采用超過一種預定的波長，則優選的是這至少兩種波長互相區分或可區分。如本文中所使用的，術語“激發光”用于描述由激發光源產生的光。激發光包括但不限于能夠自熒光團激發熒光的光譜光成分(即波長)。能夠激發熒光的激發光中的光譜成分可以包括單一波長、單一波長帶、超過一種波長、或超過一個波長光譜帶。激發光中能夠激發熒光的的光譜成分可以包括約400至700納米(nm)的可見光譜區中的一種或多種波長。然而，激發光中能夠激發熒光的的光譜成分還可以包括其它光譜區中，例如約700至1000納米的近紅外(NIR)光譜區中，或約1至400納米的紫外(UV)光譜區中的一種或多種波長。激發光可以進一步包括不激發熒光的光譜成分。激發光中能夠激發熒光的光譜成分可以具有比它們所激發的熒光短的波長。然而，在其它設置中，激發光的一些其它光譜組分可以具有比它們激發的熒光長的波長。在一個優選的實施方案中，激發光包括范圍為約671至705nm(ICG)的光譜帶。激發光可以是在強度上連續的(continuous in intensity)，連續波的(continued in wave)，脈沖的(pulsed)，或者可以是受調制的(例如按照頻率或幅度)或其任何合適的組合。在一些實施方案中，激發光是相干光，例如激光。在其它實施方案中， 激發光是非相干光，例如自LED產生的光子或自黑體輻射(例如白熾、鹵素、或氙燈泡)產生的過濾光。在其它實施方案中，激發光是相干和非相干光的組合。優選地，可用于實施本發明的成像系統包括三種主要組件(1)激發光，(2)用于分離或區分激發光和發射光的手段(優選地可適合于激發光和/或檢測系統的軟件和/或硬件濾光器)，和C3)用于接收從至少一種熒光標記物和/或從熒光實體和/或從本發明的熒光分析物發射的光的檢測系統(光學檢測器)。設想光源(激發手段)可以任選地(i)包含預定的或可調的濾光器。光源可以是適當過濾的白光，即來自寬帶光源的帶通光。例如， 來自150瓦鹵素燈的光可以通過合適的帶通濾光器。在一些實施方案中，光源是激光。參見例如 Boas 等，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :4887-4891 ；Ntziachristos 等，2000， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :2767-2772 ；Alexander, 1991, J. Clin. LaserMed. Surg. 9 416-418。關于用于成像的近紅外激光的信息可參見//www. imds. com和各種其它公知的來源。可以使用高通或帶通濾光器(例如700nm)來自分離光學發射(發射光)與激發光。可以在本發明中使用任何合適的光檢測/圖像記錄組件(光學檢測器)，例如電荷耦合裝置(CCD)系統、光電二極管、光敏電阻器、互補金屬氧化物半導體(CM0Q或光電倍增管。在下文更為詳細地解釋所述組件。光檢測/圖像記錄的選擇將取決于各種因素，包括所使用的光聚集/圖像形成組件的類型。選擇合適的組件、將它們裝配成本發明的成像系統、及操作所述系統屬于本領域的普通技術。激發光從眼的角膜傳播至視網膜，由此通過瞳孔。在激發光遇到熒光標記物時， 光被吸收。在熒光標記物在被激發后弛豫至其基態時發生熒光。然后，熒光標記物發射與激發光具有可檢出的差別(可區別)特性、即光譜特性(例如略長的波長等)的光。被吸收的能量的一部分被轉化成熱。這種能量損失引起從較短激發波長至較長發射波長的波長移動。此過程稱為斯托克斯位移。然而，也可以使用其他的光學現象，如那些記載于Xu等 (1996)，Proc. Natl. Acad. Sci. 93 :10763-10768 的現象來產生熒光。被引導到包含至少受試者瞳孔的一部分的劃定區上的激發光可以沿著相應眼的光軸傳播，或者不然；或者激發光的一部分沿著相應眼的光軸傳播，而其它部分不然。還設想，例如，在產生多個激發光(它們優選的是可區分的)的多個光源的情況中，激發光的一部分沿著相應眼的光軸傳播，而其它部分不然。眼的“光軸”是一種公知的術語，定義為穿過眼的中心且與其前表面和后表面垂直的想象的直線，或者定義為角膜的前面或頂點與眼球的最遠后面部分之間的最長矢狀距離(sagittal distance)(這兩個定義都是本領域中公認的)。在本發明的語境中，設想將包含至少一種，即1種、2種、3種、4種、5種或更多種預定的且優選地區分的或可區分的波長的激發光引導到受試者的劃定區上，所述劃定區包含受試者瞳孔的至少一部分。這樣，“包含受試者瞳孔的至少一部分的劃定區”涵蓋至多(最多)受試者的整個身體或較之為小的身體的任何部分，只要所述較小的部分仍涵蓋受試者瞳孔的至少一部分(例如頭、或頭和肩、或頭和身體的上部)。所述劃定區可以比受試者的眼小或者比受試者的眼大。優選的是，所述劃定區包含受試者的整個瞳孔或者甚至全眼 (即眼球)，全眼是更優選的。“全眼”具體包括眼的可見部分(自外部可見)。
“眼”、“眼球”或“全眼”可互換使用。“眼”包括受試者的一只眼或受試者的雙眼。成像系統的例子是MAESTRO系統，其在圖3中例示。它是一種近紅外熒光成像系統。MAESTRO系統是一種優選的成像系統，其可以與本發明的實施方案結合應用。MAESTRO系統是一種平面熒光反射成像系統，其容許非侵入性體內熒光測量。在此多光譜分析中，在特定波長捕獲一系列圖像。捕獲的波長范圍應當覆蓋存在于標本中的標記物的預期光譜發射范圍。結果將是一系列稱作“圖像立方(image cube) ”的圖像，正是使用此一系列圖像內的數據來限定自身熒光和特定標記物兩者各自的光譜。許多具有生物學意義的標記物具有如此相似的發射光譜，使得使用昂貴的窄帶濾光器來分離是困難或不可能的。用單一長通發射濾光器代替大量發射濾光器。除了皮膚、毛皮、皮脂腺的天然自身熒光外，還存在著來自共棲生物體(真菌、螨等)和攝取食物(葉綠素)的獨特自身熒光。多光譜分析能夠藉由發射熒光的線性信號混合物的數學解開(分解)分開所有來自應用于標本的特定標記物的這些信號，只要期望信號和自身熒光的發射光譜是已知的。使用MAESTRO系統的測量如下運作給照明模塊裝備激發白光的氙氣燈 (Cermax)。經由下游連接的激發濾光器(由實驗者選擇)，將光限定于(對于該實驗)期望的波長范圍，并經由光纖引導入成像模塊中。在這里，將受限制的光劃分入照亮經過麻醉的測試動物的四根光纖中。MAESTRO系統自動選擇最佳的曝光時間(exposure time)，從而沒有過度曝光(overexposure)的風險。激活的熒光探針的發射熒光光經過發射濾光器選擇 (參見表1)，并經由液晶(LC)引導到高靈敏度的冷卻型CCD照相機。液晶使照相機能夠進行特定波長的選擇性照片記錄。波長測量范圍取決于選定的濾光器組(藍色、綠色、黃色、 紅色、深紅色、NIR)，以IOnm的步長記錄照片。將每個單一照片的光譜信息組合在一個稱作 “圖像立方體”的“照片包”中。表1 :Maestro 濾光器組。
權利要求
1.一種在受試者中監測或測定包含熒光實體和第二實體的熒光分析物的血液清除的非侵入性方法，包括下列步驟(a)將至少一種預定波長的激發光引導到包含所述受試者的瞳孔的至少一部分的劃定區上，以激發所述熒光實體，(b)通過所述受試者的眼接收具有與(a)所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光，由此監測或測定所述熒光分析物的血液清除。
2.一種在受試者中定量包含熒光實體和第二實體的熒光分析物的血液水平的非侵入性方法，包括下列步驟(a)將至少一種預定波長的激發光引導到包含所述受試者的瞳孔的至少一部分的劃定區上，以激發所述熒光實體，(b)通過所述受試者的眼接收具有與(a)所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光，由此定量熒光分析物的血液水平。
3.一種在受試者的血液中測定包含熒光實體和第二實體的熒光分析物的存在的非侵入性方法，包括下列步驟或由下列步驟組成(a)將至少一種預定波長的激發光引導到包含所述受試者的瞳孔的至少一部分的劃定區上，以激發所述熒光實體，(b)通過所述受試者的眼接收具有與(a)所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光，由此測定所述受試者的血液中所述熒光分析物的存在。
4.權利要求1或2中任一項的方法，其中將步驟(b)中接收的所述光與參照值比較，由此(i)定量所述熒光分析物的血液水平；或( )測定所述熒光分析物的血液清除。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述第二實體包含診斷和/或治療劑。
6.前述權利要求中任一項的方法，其中所述第二實體包含至少一個對靶物特異性的表位結合域。
7.前述權利要求中任一項的方法，其中步驟(b)以如下的步驟為特征接收具有與(a) 所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光，專門測定通過所述受試者的眼發射的光的量，由此(i)測定所述熒光分析物的存在；( )定量所述熒光分析物的血液水平；或(iii)監測或測定所述熒光分析物的血液清除。
8.前述權利要求中任一項的方法，其中通過所述受試者的眼專門接收所述具有與(a) 所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光。
9.前述權利要求中任一項的方法，其中在(a)中，將所述至少一種預定波長的激發光專門引導到包含所述受試者的瞳孔的至少一部分的劃定區上。
10.前述權利要求中任一項的方法，其進一步包括步驟(c)，該步驟(c)測定來自所述受試者的其它區域的具有與(a)所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光。
11.前述權利要求中任一項的方法，其中，所述被引導到包含所述受試者的瞳孔的至少一部分的劃定區上以激發所述熒光分析物的至少一種預定波長的激發光的光軸，與所述具有與所述預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光的光軸相互成一定的角度排布。
12.前述權利要求中任一項的方法，其中，用于將至少一種預定波長的激發光引導到包含所述受試者的瞳孔的至少一部分的劃定區上以激發所述熒光分析物的激發手段，與用于接收具有與所述預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光的光學檢測器是在空間上分開的。
13.前述權利要求中任一項的方法，其用于在受試者的血液中測定藥物、抗體或其功能性片段、蛋白質、肽、酶、核酸例如siRNA、多糖、脂質、受體、受體配體、病原體、病毒、細菌、細胞、細胞靶物、和/或腫瘤抗原的存在；定量藥物、抗體或其功能性片段、蛋白質、肽、酶、核酸例如siRNA、多糖、脂質、受體、受體配體、病原體、病毒、細菌、細胞、細胞靶物、和/或腫瘤抗原的血液水平；監測或測定藥物、抗體或其功能性片段、蛋白質、肽、酶、核酸例如siRNA、 多糖、脂質、受體、受體配體、病原體、病毒、細菌、細胞、細胞靶物、和/或腫瘤抗原的血液清除，用于測定藥物或診斷組合物的溶解動力學，和/或用于評估物質的消除途徑。
14.前述權利要求中任一項的方法，其中在(b)中，用光學檢測器接收所述具有與(a) 的所述預定波長可區別的波長的光。
15.權利要求14的方法，其中所述光學檢測器(i)包含所述檢測器上游的預定的或可調的濾光器，和/或( )分開(a)中使用的所述激發光的預定波長。
16.權利要求15的方法，其中所述濾光器排除(a)中使用的所述激發光的預定波長。
全文摘要
本發明涉及在受試者的血液中測定包含熒光實體和第二實體的熒光分析物的存在，定量該熒光分析物的血液水平，和/或監測或測定該熒光分析物的血液清除的非侵入性方法，其包括下列步驟或由下列步驟組成(a)將至少一種預定波長的激發光引導到包含所述受試者的瞳孔的至少一部分的劃定區上，以激發所述熒光實體，(b)通過所述受試者的眼，接收具有與(a)所述的預定波長可區別的波長的自所述熒光分析物發射的光，藉此在測定所述受試者的血液中所述熒光分析物的存在、定量所述熒光分析物的血液水平、和/或監測或測定所述熒光分析物的血液清除。本發明進一步涉及用于任一種前述方法的如前述權利要求中任一項限定的熒光分析物或熒光標記物。此外，本發明涉及如前述權利要求中任一項限定的熒光分析物或熒光標記物用于制備要在任一種前述方法中采用的診斷組合物的用途。此外，本發明涉及用于本文中限定的任何方法的裝置。
文檔編號A61B3/12GK102548466SQ201080043141
公開日2012年7月4日 申請日期2010年7月28日 優先權日2009年7月28日
發明者M.多博茲, S.斯特羅貝爾, W.朔伊爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司