專利名稱：用于治療淀粉樣變的化合物的制作方法
用于治療淀粉樣變的化合物本發明涉及與β -淀粉樣蛋白形成和/或聚集(β -淀粉樣變)有關的疾病的預 防，治療和診斷。更具體地說，本發明提供引發針對β-淀粉樣蛋白和N端截短型和/或翻 譯后修飾型淀粉樣蛋白片段的免疫應答的新模擬表位和識別所述模擬表位和Αβ肽的 新抗體，供與淀粉樣蛋白形成和/或聚集有關的疾的預防，治療和診斷中使用。各種變性性疾病的特征在于特定蛋白質的異常聚合和累積，所謂的蛋白病 (proteopathy) 0本發明涉及與術語β _淀粉樣變下總結的β _淀粉樣蛋白蛋白質有關的 蛋白病的預防，治療和診斷。淀粉樣變的最突出形式是阿爾茨海默氏病(AD)。其它例 子包括但不限于具有Lewy小體的癡呆和唐氏綜合征中的癡呆。AD是人中最常見形式的癡呆。迄今沒有有效的治療方法來終止人患者中的漸進 性神經變性及相關認知衰退。AD的特征在于細胞外淀粉狀蛋白斑的異常累積-與廣泛的 星形細胞增多和微觀神經膠質增多(microgliosis)以及神經元營養不良(dystrophic neurons)和神經元損失密切相關。這些淀粉狀蛋白斑主要由淀粉樣蛋白-β (Αβ ；其衍生 自APP(gi :112927))肽Αβ40和Aβ 42組成，其衍生自在神經系統中的多種細胞類型上表 達的淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)。Αβ肽被認為是直接涉及AD的發病和進展。因此，在AD 患者中降低腦中的Aβ負荷預測減緩或停止疾病進展且還能終止認知衰退。APP在正常情況中通過兩個切割步驟來加工，形成當前已知形式的 Αβ χ-40/42/43。第一次切割由所謂的β _位點APP切割酶1和2(BACE1和BACE2)實施； 第二個蛋白水解步驟由Y-分泌酶復合物實施。BACE酶識別假定A β肽的N端部分中的兩個位點，而且BACE的蛋白水解活性導致 A β I-X和Il-X分別形成。如此，BACE介導的APP加工創建多種不同A β種類，主要成分為 全長Αβ 1-40/42。Y-分泌酶活性導致3種主要片段生成Aβ 1-40/42/43。一旦這些肽生 成，它們就被氨肽酶進一步加工，導致它們后續的逐步降解。這些進一步的步驟分別導致其 它形式像例如A β 3-40/42形成。APP加工中涉及的第三個蛋白水解酶家族是所謂的α-分泌酶家族(ADAM(‘ —種 解聯蛋白和金屬蛋白酶')家族)。α-分泌酶切割淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)(在其跨膜 區中進行，介于Αβ肽序列的aal6和aal7之間)且排除Αβ肽形成。如此，α -分泌酶切 割是非淀粉樣蛋白生成性APP加工的至關重要步驟。具體而言，α-分泌酶切割導致稱作 sAPPa的分泌形式釋放。sAPPa被認為是足以介導APP的大多數生理功能且可充當信號 傳導分子。有證據提示脫落的胞外域在培養的成纖維細胞的生長中發揮作用。發現sAPP 對于培養的原代神經元是神經保護性的，阻止由葡萄糖剝奪引起的細胞內Ca2+水平升高 且提高谷氨酸鹽的興奮性中毒閾值，以及介導軸突和樹突生長。在人中，平均60-85%的淀粉狀蛋白斑材料由N端截短的和常常修飾的Αβ 40/42 衍生物形成。N端截短的Αβ種類的相對量關于Αβ水平，突變和BACE活性是多變的。 最豐富的截短形式的Αβ是Αβ 3-40/42和Αβ 11-40/42，認為占到所有截短形式的多達 50%。這意味著這些同等型(isoform)占AD腦中所有淀粉樣蛋白肽的25-40%。這兩種 肽都含有N端谷氨酸殘基，它常常被酶促修飾成焦谷氨酸，分別導致A β 3 (ρΕ) -40/42和
4A β 11 (ρΕ) -40/42形成。因為A β 3 (ρΕ)和11 (ρΕ)肽的氨基末端被內部內酰胺所封閉，所以 它受到保護免于焦谷氨酸特異性氨肽酶以外的氨肽酶的蛋白水解作用且能如此在組織中 保持穩定。在AD患者中能檢測到別的自β-淀粉樣蛋白位置2，3，4，5，6，7，8，9，或10起始 的N端截短的淀粉樣蛋白變體。這些形式常常受到翻譯后修飾，例如甲基化。先前顯示了截短的和修飾的肽在神經組織中比全長Αβ要更穩定。另外，N端截短 形式的Αβ比未修飾的Αβ肽更能生成淀粉樣蛋白，如此提高斑形成的速率，而且還在應用 于培養的神經元時以及在體內實驗中顯示神經毒性活性。截短形式的Αβ早就能在AD早 期階段中Aβ的彌漫性聚集中檢測到，而且可能涉及早期斑形成，在體內起各種子的作用。 由于這些效果，有人提出Αβχ-40/42肽可啟動和/或促進斑形成，或許通過起成核中心的 作用，作為相對較少生成淀粉樣蛋白但明顯更豐富的全長Αβ肽的后續沉積的種子。另外， 有令人信服的證據表明N端截短的Αβ種類的存在與散發性和家族性阿爾茨海默氏病以及 唐氏綜合征患者中神經變性的早期發作和嚴重性升高有關。來自此類患者的數據暗示截短 的Αβ種類的早期形成與疾病發作以及進展之間的聯系。總之，這些發現預測在體外和在 AD腦中證明存在的A β肽N端異質性可能促進A β沉積成斑。如此，促成在A β的N端結 構域內切割APP的蛋白水解事件在AD及相關病癥的發病機制中可能是相當大的意義。根據這些發現，降低AD患者中這些肽種類的量以改變疾病進展及降低毒性和伴 隨的認知衰退似乎是重要的。一種最佳的AD疫苗應當如此在不干擾APP信號傳導的生理功 能(特別是sAPPa的功能)的情況中引發如下的免疫應答，其能夠靶向AD患者的腦中存 在的最突出形式的 Αβ 肽，Αβ 1-40/42，Aβ 3-40/42 以及 Aβ 3 (ρ)Ε-40/42 和 Aβ 11-40/42 以及 A β ll(p)E-40/42。在AD的動物模型中，使用針對全長A β的主動和被動免疫接種策略的免疫治療性 處理導致Αβ斑縮小/減少，而且對疾病進展具有有益影響。所有在小鼠模型中測試的主 動免疫接種辦法使用全長A β 40/42或含有A β天然序列的片段。然而，由于嚴重的神經炎癥副作用，包括自身反應性T細胞的腦浸潤(Nicoll， J.A. et al. 2003 Nat Med 9 :448-452 ；Bayer, A. J.，et al. 2005 Neurology64 :94-101)， 使用全長A β 42作為抗原在AD患者中進行的第一次IIa期臨床免疫接種試驗不得不停止。 不過，調查在用ΑΝ-1792處理的患者中的臨床效果的研究揭示，發生了針對Αβ 42的抗體應 答但沒有遭受腦膜腦炎的患者在認識測試中表現比不響應的患者要好，指示免疫療法會是 AD的有用治療辦法。最重要的是，最近自分析接受過ΑΝ1792免疫接種的患者尸檢案例獲得的結果顯 示了全長Αβ種類自腦清除，但是N端截短形式的Αβ得到維持(Nicoll，J.A. , et al. 2006 J Neuropathol Exp Neurol 65:1040-1048)。這強調靶向全長Αβ以及N端截短和修飾形 式的這種分子的新疫苗發明的必要性。在人中誘導針對A β 40/42肽的免疫應答會干預AD患者中的認知衰退，但是安全 的阿爾茨海默氏病疫苗必須避免自身反應性T細胞形成。使用天然A β 40/42肽或其片段 的免疫接種遭受在患者中誘導自身免疫性疾病的內在風險，因為免疫應答不能專一地靶向 Αβ。本發明的一個目的是提供可用于治療和/或預防阿爾茨海默氏病的化合物和藥 物。這些化合物應當在給個體施用時不顯示誘導自身免疫性疾病的風險或顯示顯著降低的誘導自身免疫性疾病的風險。依照本發明的另一個目的，所述化合物能夠在體內在個體中 誘導針對截短和/或穩定形式的Aβ (它們通常是淀粉樣蛋白沉積物的主要成分)的抗體 形成。因此，本發明涉及至少一種包含下述氨基酸序列的化合物在生產用于預防和/或 治療阿爾茨海默氏病的藥物中的用途，(X1) ^X2X3X4X5FX6 (X7) η (式 11)，其中X1為絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)或半胱氨酸(C)，X2為谷氨酰胺(Q)，蘇氨酸(T)或甲硫氨酸(M)，X3為賴氨酸⑷或精氨酸(R)，X4為亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，X5為色氨酸(W)，酪氨酸⑴，苯丙氨酸(F)或異亮氨酸⑴，X6為天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，丙氨酸㈧或半胱氨酸(C)，X7為半胱氨酸(C)，η和m獨立地為0或1，所述化合物具有結合對包含氨基酸序列HQKLVF和/或HQKLVFFAED的淀粉樣蛋白 β肽(Αβ)表位特異性的抗體的能力。本文中呈現的發明指如下的抗原，其不包含天然A β肽的序列但模擬通過諸如WO 2004/062556中記載的模擬表位檢測不到的A β新表位的結構。此類基于模擬表位的AD疫 苗因此誘導與上文所述病理Aβ分子廣泛起反應但不與親本結構起反應的抗體應答。重要 的是，通過這些模擬表位誘導的免疫應答不與全長APP和分泌型ΑΡΡα (sAPPa)相互作用， 而且如此免疫接種保留這兩種分子的正常生理功能。另外，模擬表位不含有潛在的T細胞 自身表位，而且避免誘導有害的自身反應性T細胞。令人驚訝地發現包含式I氨基酸序列的化合物能夠在體內誘導分別針對未截 短A β形式A β 1-40/42，和N端截短形式像A β 3-40/42，A β (ρΕ) 3-40/42，未修飾的 Αβ 11-40/42，經修飾的Αβ ρ (E) 11-40/42和Αβ 14-40/42，還有針對別的自Aβ位置2，4， 5，6，7，8，9，或10起始的N端截短的和翻譯后修飾的淀粉樣蛋白變體的抗體形成。重要的 是，這些模擬表位不誘導與自APP切除后sAPP α中存在的新表位的交叉反應性，而且如此 不干擾正常sAPPa信號傳導。通過免疫接種本發明的分子(模擬表位)而形成的抗體能夠結合上文所列A β片 段，導致A β斑崩解。式I和II和本文中公開的所有其它肽分子模擬天然存在Αβ肽和變體 A β 1-40/42，A βρΕ3-40/42, A β 3-40/42 和 A β 11-40/42，A βpEl1-40/42 和 A β 14-40/42， 使得包含本文中公開的氨基酸序列的化合物能夠誘導相應抗體形成。別的自Αβ位置2，4， 5，6，7，8，9，或10起始的N端截短的和翻譯后修飾的淀粉樣蛋白變體也可通過此類抗體來 檢測。如本文中使用的，“ β -淀粉樣變(amyloidoses) ”指以特定蛋白質的異常聚合和 累積(所謂的蛋白病)為特征的多種變性性疾病。本發明涉及在術語“β_淀粉樣變”之下 概括的β-淀粉樣蛋白蛋白質有關的蛋白病的預防，治療和診斷。淀粉樣變的最突出形式是阿爾茨海默氏病(AD)。其它例子包括但不限于具有Lewy小體的癡呆和唐氏綜合征中 的癡呆。進一步的例子是Lewy小體癡呆，肌炎，散發性包含體肌炎，具有淀粉樣變的遺傳性 腦出血(荷蘭型)，大腦淀粉樣蛋白血管病，Αβ相關血管炎。施用包含式II氨基酸序列的化合物引起針對與包含式I氨基酸序列的化合物相 同的未截短和截短和翻譯后修飾形式的Αβ的免疫應答。依照本發明的一個優選實施方案，所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序列 的肽SHTRLYF (C)，HMRLFFN(C)，SHQRLffF (C)，HQKMIFA (C)，HMRMYFE (C)，THQRLffF (C)和 HQKMIF (C)，優選選自下組SHTRLYF (C)，HMRLFFN (C)，HQKMIFA (C)，HMRMYFE (C)，THQRLffF (C) (都能夠在體內誘導針對Αβ肽的抗體形成)。依照本發明的另一個優選實施方案，所述至少一種化合物包含具有氨基酸 序列 SHTRLYF (C)，SGEYVFH(C)，SGQLKFP(C)，SGQIffFR(C)，SGEIHFN(C)，HMRLFFN(C)， GELffFP (C)，HQKMIFA (C)，GEIffFEG (C)，GEIYFER(C)，THQRLffF (C)，GEIRFGS (C)，GEIKFDH(C) 或 GEIQFGA (C)，特別是 HQKMIFA (C)的肽。本發明的另一個方面涉及至少一種包含下述氨基酸序列的化合物在生產用于預 防和/或治療阿爾茨海默氏病的藥物中的用途，(X1) ^X2X3X4FX5X6 (X7) n (式 I)，其中X1為絲氨酸⑶，丙氨酸㈧或半胱氨酸(C)，)(2為絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，谷氨酸(E)，天冬氨酸(D)，谷氨酰胺(Q)或甲硫氨酸 (M)，X3為異亮氨酸⑴，酪氨酸⑴，甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)，X4為亮氨酸(L)，精氨酸(R)，谷氨酰胺(Q)，色氨酸(W)，纈氨酸(V)，組氨酸(H)， 酪氨酸(Y)，異亮氨酸(I)，賴氨酸(K)，甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)，&為丙氨酸(A)，苯丙氨酸(F)，組氨酸(H)，天冬酰胺(N)，精氨酸( ，谷氨酸(E)， 異亮氨酸(I)，谷氨酰胺⑴)，天冬氨酸(D)，脯氨酸(P)或色氨酸(W)，甘氨酸(G)，X6為任何氨基酸殘基，X7為半胱氨酸(C)，m和η獨立地為0或1，所述化合物具有結合對包含氨基酸序列HQKLVF和/或HQKLVFFAED的淀粉樣蛋白 β肽(Αβ)表位特異性的抗體的能力。依照本發明的一個優選實施方案，所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序 列的肽SGEYVFH(C)，SGQLKFP(C)，SGQIffFR(C), SGEIHFN(C)，GQIffFIS(C), GQIIFQS(C), GQIRFDH (C)，GEMWFAL (C)，GELQFPP (C)，GELffFP (C)，GEMQFFI (C)，GELYFRA (C)，GEIRFAL (C)， GMIVFPH(C)，GEIffFEG(C)，GDLKFPL(C)，GQILFPV(C)，GELFFPK(C)，GQIMFPR(C)，GSLFFffP(C)， GEILFGM(C)，GQLKFPF(C)，GTIFFRD(C)，GQIKFAQ(C)，GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)，GQIQFPL(C)， GEIKFDH(C), GEIQFGA(C), GELFFEK(C), GEIRFEL(C), GEIYFER(C), SGEIYFER(C), AGEIYFER(C)和(C)GEIYFER。本發明的特別優選的化合物包含上文鑒定的氨基酸序列或由其組成，由此所述肽 的C末端可以包含或不包含半胱氨酸殘基(通過使用括號所指示的)，使得得到的化合物可以例如偶聯至載體分子。然而，當然也有可能將半胱氨酸殘基連接至所述肽的N末端。依照本發明的一個特別優選的實施方案，所述氨基酸序列選自下組GELWFP(C)， GEIffFEG (C)，GEIYFER(C)，GEILFGM(C)，GEIKFDH(C)，GEIQFGA(C)(都是競爭性肽)和 GEIKFDH(C)，GEIRFGS(C)，SGQLKFP(C)，SGQIffFR(C)，SGEIHFN(C)，GELffFP(C)，GEIffFEG(C)， GEIYFER(C)，GEIQFGA(C)，SGEYVFH(C)(都能夠在體內誘導針對上文所列Aβ肽的抗體形 成)。本發明的另一個方面涉及至少一種包含選自下組的氨基酸序列的肽在生產用于 預防和/或治療阿爾茨海默氏病的藥物中的用途:AIPLFVM(C)，KLPLFVM(C)，QLPLFVL(C)和 NDAKIVF(C)。本發明的每一種化合物均能夠在體內誘導針對自Αβ 40/42衍生的肽(分別包括 A β 1-40/42，及 N端截短形式像 A β 3-40/42，A β (ρΕ) 3-40/42，未修飾的 A β 11-40/42，修飾 的Αβ ρ (E) 11-40/42和Αβ 14-40/42)的抗體形成。既然本發明的化合物是通過針對Aβ 氨基酸殘基14至19的抗體分離的，那么本發明的化合物能夠誘導能結合自Αβ肽氨基酸 位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或14起始的A β肽截短物的抗體形成。因此，這些化 合物特別適合于治療和/或預防AD，因為施用至少一種所述化合物導致能夠識別主要A β 形式，例如A β 1-40/42, A β ρΕ3-40/42和A β 3-40/42的抗體形成。這些模擬表位也不能誘 導與自APP切除后sAPP α中存在的新表位的交叉反應性，如此不干擾正常sAPP α信號傳 導。本發明的化合物，特別是本發明的肽可以通過酰化和/或乙酰化反應在它們的N 端進一步修飾。例如，一種特別優選的化合物包含氨基酸序列AC-GEIYFER(C)。依照本發明，術語“模擬表位(mimotope) ”指具有拓撲學與它所模擬的表位等同的 構象的分子。模擬表位結合抗體免疫特異性結合期望抗原的相同抗原結合區。模擬表位會 在宿主中引發免疫學應答，其能與它所模擬的抗原起反應。模擬表位還可在涉及表位和結 合所述表位的抗體的體外抑制測定法(例如ELISA抑制測定法)中起它所模擬的表位的競 爭物的作用。然而，本發明的模擬表位可不必在體外抑制測定法中阻止或競爭它所模擬的 表位的結合，盡管它能夠在給哺乳動物施用時誘導特異性免疫應答。如本文中使用的，術語“表位”指抗原受到特定抗體分子識別的免疫原性區。一般 而言，抗原會擁有一個或多個表位，每一個均能夠結合識別該特定表位的抗體。本發明的模擬表位可以通過本領域公知的化學合成方法來合成生成，或是作為分 離的肽或作為另一肽或多肽的一部分。或者，肽模擬表位可以在生成肽模擬表位的微生物 中生成，然后分離并(如果想要的話)進一步純化。肽模擬表位可以在微生物諸如細菌，酵 母或真菌中，在真核細胞諸如哺乳動物或昆蟲細胞中，或在重組病毒載體諸如腺病毒，痘病 毒，皰疹病毒，Simliki森林病毒，桿狀病毒，噬菌體，辛德畢斯病毒或仙臺病毒中生成。用 于生成肽模擬表位的合適細菌包括大腸桿菌(E. coli)，枯草桿菌(B. subtilis)或能夠表 達肽諸如肽模擬表位的任何其它細菌。用于表達肽模擬表位的合適酵母類型包括釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，假絲酵母屬 (Candida)，巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)或能夠表達肽的任何其它酵母。相應的 方法是本領域公知的。用于分離和純化重組生成的肽的方法也是本領域公知的，而且包括 例如凝膠過濾，親和層析，離子交換層析等。
為了便于分離肽模擬表位，可生成融合多肽，其中肽模擬表位翻譯融合(共價連 接)至能夠通過親和層析來分離的異源多肽。典型的異源多肽為His標簽(例如His6 ；6 個組氨酸殘基)，GST標簽(谷胱甘肽-S-轉移酶)等。融合多肽不見便于純化模擬表位， 而且還能防止模擬表位多肽在純化期間被降解。如果想要在純化后除去異源多肽，那么融 合多肽可在肽模擬表位與異源多肽之間的接合處包含切割位點。切割位點由受到該位點處 的氨基酸序列特異性的酶(例如蛋白酶)切割的氨基酸序列組成。本發明的模擬表位還可在它們的N和/或C端處或附近修飾，使得在所述位置處 結合半胱氨酸殘基。在一個優選的實施方案中，末端位置(位于肽的N和C端)的半胱氨 酸殘基用于經二硫鍵來環化肽。本發明的模擬表位還可用于各種測定法和試劑盒，特別是免疫學測定法和試劑 盒。因此，特別優選的是，模擬表位可以是另一肽或多肽的一部分，特別是在免疫學測定法 中用作報告物的酶。此類報告酶包括例如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。依照本發明的模擬表位優選是它們的氨基酸序列不同于Αβ或Αβ片段的氨基 酸序列的抗原性多肽。在這個方面，本發明的模擬表位可不僅包含一種或多種天然存在氨 基酸殘基的氨基酸替代，而且還可包含一種或多種非天然氨基酸(即不是來自20種“經典 的”氨基酸)的氨基酸替代或者它們可以完全由此類非天然氨基酸裝配而成。此外，本發 明誘導針對及結合 A β 1-40/42，A β ρΕ3-40/42, A β 3-40/42，A β 11-40/42，A β pEl 1-40/42 和Αβ 14-40/42(及Αβ自氨基酸位置2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12和13開始的其它N端 截短形式)抗體的抗原可以由D-氨基酸或L-氨基酸或DL-氨基酸的組合裝配而成，而且 任選，它們可以通過進一步修飾，環閉合或衍生化而進行了改變。合適的抗體誘導性抗原可 以自商品化肽文庫提供。優選的是，這些肽為至少7個氨基酸，且優選的長度可以長達16， 優選長達14或20個氨基酸(例如5至16個氨基酸殘基)。依照本發明，然而，也可很好地 采用更長的肽作為抗體誘導性抗原。另外，本發明的模擬表位也可以是多肽的一部分，并因 此在它們的N和/或C端包含至少一個別的氨基酸殘基。為了制備本發明的模擬表位(即本文中公開的抗體誘導性抗原)，當然，噬菌體文 庫，肽文庫也是合適的，例如通過組合化學的手段生成的或通過用于最多變的結構的高通 量篩選技術的手段獲得的(Display :A LaboratoryManual，Carlos F. Barbas等編；Willats WG, Phage display !practicalities andprospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec. ；50 (6) 837-54)。另外，依照本發明，也可采用基于核酸的抗Αβ 1-40/42，Αβ ρΕ3_40/42， Aβ 3-40/42，Aβ 11-40/42，Aβ pEl 1-40/42 和 Αβ 14-40/42 抗體誘導性抗原(“適體 (aptamer)”)，而且這些也可以用最多變的(寡核苷酸)文庫(例如具有2-180個核酸殘基) (例如 Burgstaller et al.，Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700 ；Famulok et al. , Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599 ；Mayer et al. ,PNAS 98 UOOl)，4961-4965 ；等) 找到。在基于核酸的抗體誘導性抗原中，核酸主鏈可例如通過天然磷酸二酯化合物或也通 過硫代磷酸酯或組合或化學變異(例如像PNA)來提供，其中依照本發明可主要采用U, T， A，C，G，H和mC作為堿基。可依照本發明使用的核苷酸的2’ -殘基優選為H，0H, F，Cl，NH2, 0-甲基，0-乙基，0-丙基或0- 丁基，其中核酸還可別不同的修飾，即例如用保護基團修飾， 就像它們通常在寡核苷酸合成中被采用的。如此，基于適體的抗體誘導性抗原也是本發明范圍內的優選抗體誘導性抗原。依照本發明的一個優選實施方案，化合物偶聯至藥學可接受載體，優選KLH(匙 孔蟲威血藍蛋白)，破傷風類毒素，清蛋白結合蛋白，牛血清清蛋白，樹狀聚物(MAP ；Biol. Chem. 358 581)，肽接頭(或側翼區)以及 Singh et al.，Nat. Biotech. 17(1999)， 1075-1081(特別是該文件表 1 中的那些)，和 0' Hagan etal.，Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003)，727-735 (特別是其中記載的內源免疫強化性化合物和投遞系統) 中記載的佐劑物質，或其混合物。此語境中的偶聯化學(例如經由異雙功能化合物，諸如 GMBS，當然還有其它的，如 “Bioconjugate Techniques", Greg Τ. Hermanson 中記載的)可 選自本領域技術人員已知的反應。此外，疫苗組合物可以與佐劑，優選低溶解度的鋁組合 物，特別是氫氧化鋁一起配制。當然，也可以使用像MF59磷酸鋁，磷酸鈣，細胞因子(例如 IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡聚物，LPS, MPL，聚磷腈，乳狀 液(例如弗氏，SAF)，脂質體，病毒體，ISC0M，蝸形物(cochleates)，PLG微粒，Poloxamer顆 粒，病毒樣顆粒，熱不穩定腸毒素(LT)，霍亂毒素(CT)，突變體毒素(例如LTK63和LTR72)， 微粒和/或聚合脂質體這些佐劑。本發明的化合物優選經選自下組的接頭結合至載體或佐劑NHS-聚(氧化乙烯) (PEO)(例如NHS-PEO4-馬來酰亞胺)。包含本發明化合物(模擬表位)和藥學可接受載體的疫苗可通過任何合適的應 用模式(例如i.d.，i.v, i.p.，i.m.，鼻內，口服，皮下，等)及在任何合適的投遞裝置中 施用(0，Hagan et al. , Nature Reviews, Drug Discovery 2(9)，(2003)，727-735)。本 發明的化合物優選為靜脈內，皮下，皮內或肌肉內施用而配制(參見例如“Handbook of Pharmaceutical ManufacturingFormulations，，，Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc,2004)o依照本發明的藥物(疫苗)以0. Ing至10mg，優選IOng至lmg，特別是IOOng至 100 μ g,或者例如 IOOfmol 至 ΙΟμπιοΙ，優選 IOpmol 至 lymol，特別是 IOOpmol 至 IOOnmol 的量含有依照本發明的化合物。典型地，疫苗還可含有輔助物質，例如緩沖劑、穩定劑等。本發明的另一個方面涉及上文限定的化合物用于治療和/或改善突觸核蛋白病 癥狀的用途。令人驚訝地發現本發明的化合物還能用于治療和改善與突觸核蛋白病有關的癥 狀。淀粉樣變和突觸核蛋白病分別與β -淀粉樣蛋白和α -突觸核蛋白的大腦累積有 關。一些患者顯示這兩種疾病的臨床和病理特征，提出了致病途徑交疊的可能性。這些患 者還歸類為患有一種新鑒定的綜合征，其描述為具有Lewy小體的癡呆或具有癡呆的帕金 森氏病(DLB/PDD)。在一種最近的轉基因動物DLB/PDD模型中，顯示了 α-突觸核蛋白和淀 粉樣蛋白前體蛋白(hAPP) 二者在小鼠中的過表達導致認知和運動改變的發生，其伴有膽 堿能神經元的損失和突觸囊泡的減少，廣泛淀粉狀蛋白斑的形成，和haSYN免疫反應性神 經元內纖絲內含體。所有這些特征也見于DLB/PDD綜合征。最近描述了這兩種分子潛在地 能夠在體外相互作用及形成雜合寡聚物。還顯示了 APP過表達能加劇α-突觸核蛋白過表 達的一些病理效應。相反，α-突觸核蛋白能夠增強淀粉樣蛋白β肽的分泌和毒性，及因 此還能提高β -淀粉樣蛋白的效應，支持神經變性過程中致病途徑交疊的想法。在這兩種蛋白病中，肽寡聚物的漸進累積被鑒定為導致對于突觸核蛋白病或淀粉樣變任一而言典型的各種改變的中樞毒性事件之一。盡管有這種機制相似性，假設α-突 觸核蛋白和Αβ對腦的完整性和功能具有不同的，以及趨同的致病效果。認為突觸核蛋白 比認知功能更嚴重地影響運動功能，而淀粉樣蛋白β肽被描述為具有相反的影響。造成這 種差異的原因目前尚不清楚，也沒有對這兩種分子的相互依賴和影響的清楚描述。本發明中呈現的治療辦法描述了一種靶向Αβ的免疫療法，它會導致主要在細胞 內的淀粉樣蛋白的清除。因此認為它會減輕淀粉樣蛋白相關改變，范圍從斑沉積至神經元 死亡以及至記憶問題和認知衰退。然而，突觸核蛋白的亞細胞定位指示這些細胞內蛋白質 主要在突觸處有活性，尤其局限于突觸囊泡。有趣的是，作為突觸核蛋白病的統一病理標 志，突觸核蛋白累積也主要在細胞內可檢測到。另外，認為突觸核蛋白病的根本致病機制可 歸于神經元內變化，范圍從線粒體功能障礙，異常折疊的遍在蛋白化或磷酸化蛋白質的累 積以及突觸核蛋白的累積。這些改變因此導致突觸功能的變化，突觸失效，和多巴胺能神經 元損失和突觸核蛋白病的經典臨床征候。相反，Αβ主要在神經元外可檢測到，而且淀粉狀 蛋白斑以及纖絲，初原纖維和淀粉樣蛋白寡聚物在細胞外或大腦內應用時能發揮神經 毒性功能。如此，主要影響導致下文描述的典型癥狀的細胞內過程，主要靶向細胞外淀粉樣 蛋白的辦法會減輕突觸核蛋白病像PD的癥狀對于專家而言是一項令人驚訝的發現。甚至 更加令人驚訝的是，當前認為這兩種分子的交疊效果是由應主要存在于細胞內的兩種蛋白 質的直接相互作用引起的。依照本發明，術語“突觸核蛋白病(synucleinopathy) ”包括以病理性突觸核蛋白 聚集為特征的所有神經變性性病癥。數種神經變性性病癥，包括帕金森氏病(PD)，Lewy小 體病(LBD)，彌漫性Lewy小體病(DLBD)，具有Lewy小體的癡呆(DLB)，具有癡呆的帕金森綜 合征(PDD)，多系統萎縮(MSA)和具有腦鐵累積的神經變性I型(NBIA I型)共同分組為突 觸核蛋白病。如本文中使用的，“突觸核蛋白病的癥狀”指那些影響患有所述疾病的患者的運動 和非運動行為的突觸核蛋白病(特別是帕金森氏病)癥狀。“運動癥狀”包括靜止性震顫， 運動徐緩，強直，體位不穩，彎腰體位，張力障礙，疲勞，細微運動靈巧性和運動協調受損，整 體運動協調受損，運動缺乏(擺臂縮小)，靜坐不能，言語問題，諸如由肌肉控制缺失引起的 嗓音柔和或言語模糊，面部表情喪失，或“掩蔽”，寫字過小，吞咽困難，性功能障礙，流涎等。 “非運動”癥狀包括疼痛，癡呆或意識錯亂，睡眠擾動，便秘，皮膚問題，抑郁，恐懼或焦慮，記 憶困難和思考緩慢，泌尿問題，疲勞和疼痛，能量損失，強迫行為，痛性痙攣等。依照本發明的一個優選實施方案，突觸核蛋白病選自下組帕金森氏病，具有 Lewy小體的癡呆，多系統萎縮和具有腦鐵累積的神經變性。特別優選帕金森氏病。本發明的另一個方面涉及具有選自下組的氨基酸序列或由其組成的肽 SHTRLYF(C)，SGEYVFH(C)，SGQLKFP(C)，SGQIffFR(C)，SGEIHFN(C)，GQIffFIS(C)，NDAKIVF(C)， GQIIFQS(C)，GQIRFDH(C)，HMRLFFN(C)，GEMWFAL(C)，GELQFPP(C)，GELffFP(C)，SHQRLffF(C)， HQKMIFA(C)，GEMQFFI(C)，GELYFRA(C)，GEIRFAL(C)，GMIVFPH(C)，GEIffFEG(C)，GEIYFER(C)， AIPLF VM (C)，GDLKFPL (C)，GQILFPV (C)，GELFFPK (C)，GQIMFPR (C)，HMRMYFE(C)， GSLFFffP(C)，GEILFGM(C)，GQLKFPF(C)，KLPLFVM(C)，GTIFFRD(C)，THQRLffF(C)，GQIKFAQ(C)， GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)，GQIQFPL(C)，GEIKFDH(C)，GEIQFGA(C)，QLPLFVL(C)，HQKMIF(C)， GELFFEK (C)，GEIRFEL (C)，AcGEIYFER (C)，SGEIYFER (C)，AGEIYFER (C)和(C) GEIYFER。如使用括號所指示的，本發明的肽可以包含或不包含C或N末端處的半胱氨酸殘基。因此，本 發明還涵蓋下面的氨基酸序列SHTRLYF，SGEYVFH, SGQLKFP, SGQIWFR, SGEIHFN, GQIWFIS, NDAKIVF, GQIIFQS, GQIRFDH, HMRLFFN, GEMffFAL, GELQFPP, GELffFP, SHQRLffF, HQKMIFA, GEMQFFI， GELYFRA, GEIRFAL, GMIVFPH, GEIffFEG, GEIYFER, AIPLFVM, GDLKFPL, GQILFPV, GELFFPK, GQIMFPR, HMRMYFE, GSLFFffP, GEILFGM, GQLKFPF, KLPLFVM, GTIFFRD, THQRLffF, GQIKFAQ, GTLIFHH, GEIRFGS, GQIQFPL, GEIKFDH, GEIQFGA, QLPLFVL, HQKMIF, GELFFEK, GEIRFEL, SGEIYFERdP AGEIYFER。依照一個優選的實施方案，所述肽偶聯至藥學可接受載體，優選KLH(匙孔i威血藍 蛋白)。本發明的又一個方面涉及包含至少一種依照本發明的肽的藥物配制劑，優選疫 苗。所述藥物配制劑可用于治療患有阿爾茨海默氏病的個體或預防在個體中形成Aβ斑以 阻止阿爾茨海默氏病的形成。本發明在下面的附圖和實施例中進一步例示，然而，不限于此。

圖1顯示單克隆抗體MV-002對特定肽和重組蛋白的結合。圖2顯示用β-淀粉樣蛋白和N端截短型和/或翻譯后修飾型β-淀粉樣蛋白片 段的模擬表位進行的典型結合測定法。圖3顯示用β-淀粉樣蛋白和N端截短型和/或翻譯后修飾型β-淀粉樣蛋白片 段的模擬表位進行的典型抑制測定法。圖4顯示通過模擬表位免疫接種(注射的肽/無關的肽)引發的免疫應答的體內 表征的例子。圖5顯示通過針對淀粉樣蛋白β片段和sAPP α的模擬表位免疫接種引發的免疫 應答的體內表征的例子。圖6顯示通過針對全長A β 40/42的模擬表位免疫接種引發的免疫應答的體內表 征的例子。圖7顯示被淀粉狀蛋白斑占據的面積。以一個月間隔通過s. c接種給Tg2576注 射6次以氫氧化鋁(ALUM)作為佐劑的模擬表位疫苗。對照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉 狀蛋白斑占據的面積顯示為對照組的百分比。Grl...對照組；Gr2...接受p4675。
實施例方法用于依照本發明的模擬表位鑒定的抗體檢測自人Αβ衍生的氨基酸序列但不結 合全長人APP。所檢測的序列包括EVHHQKLVFFAED ( = A β初始表位aa 11 -24)和ρ (E) VHHQKLVF(p4374 =在N端具有焦谷氨酸修飾的Αβ初始表位aall_19)。抗體可以是單克 隆或多克隆抗體制備物或其任何抗體部分或衍生物，唯一的先決條件在于抗體分子特異性 識別至少一種上文所述(自人Αβ衍生的)表位，但不結合全長人ΑΡΡ。用此類單克隆抗體和肽文庫鑒定并進一步表征模擬表位。實施例1 生成單克隆抗體，所述抗體特異性檢測β-淀粉樣蛋白和N端截短型和 /或翻譯后修飾型淀粉樣蛋白片段生成了自實驗Alz-9的融合物衍生的單克隆抗體。給C57/B16小鼠重復免疫接種偶聯至KLH(匙孔i威血藍蛋白)和作為佐劑的Alum(氫氧化鋁)的初始Αβ表位HQKLVFC。 通過ELISA(經ρ4377肽包被的ELISA板)來檢測ρ4377肽特異性抗體生成型雜交瘤。人 Αβ 40/42(重組蛋白)用作陽性對照肽包括識別在ELISA板上固定化的重組蛋白的雜交 瘤，因為它們特異性結合肽和全長Aβ 二者。Ρ1454(人Αβ 33-40)用作陰性對照肽。另外， 針對ρ4374，ρ1323和sAPP α測試雜交瘤。只有具有較好ρ4374和ρ1323結合且沒有sAPP α 結合的雜交瘤用于進一步的抗體開發。純化雜交瘤克隆MV-002(內部名稱A115 ；IgG2b)并分別分析對pl323，p4374， ρ4377，ρ1454，Αβ和sAPP α的特異性檢測。MV-002在ELISA中識別表位ρ1323以及ρ4377 和全長Αβ蛋白(重組蛋白；得自Bachem AG，Bubendorf，Switzerland)。然而，它在ELISA 中不檢測P1454。另外，MV-002抗體不能檢測sAPP α但特異性結合編碼A β 11-19的焦谷 氨酸型式的肽Ρ4374。實施例2 噬菌體展示，體外結合和抑制ELISA此實施例中使用的噬菌體展示文庫為Ph. D. 7 =New England BioLabsE8102L (線性 7聚物文庫)。依照制造商的方案(www.neb.com)進行噬菌體展示。2或3個后續輪次的淘選后，挑取單個噬菌體克隆，在包被了淘選過程所用抗體的 板上對噬菌體上清液進行ELISA。對在此ELISA中呈陽性(對靶物的信號強，但對非特異性 對照無信號)的噬菌體克隆測序。根據DNA序列，推導肽序列。合成這些肽并在結合和抑 制ELISA中表征。另外，將所述篩選中鑒定出的模擬表位的序列信息組合，創建了一些新模 擬表位，以便鑒定用于模擬表位免疫接種的共有序列。1.體外結合測定法(ELISA)將自噬菌體展示衍生的肽及其變體偶聯至BSA并結合至ELISA板(1 μ M ；如各圖 中指示的)并隨后與用于篩選過程的單克隆抗體一起溫育以分析所鑒定的肽的結合能力。2.體外抑制測定法(ELISA)將不同量的自噬菌體展示衍生的肽(濃度范圍5yg至0.03yg;連續稀釋)與用 于篩選過程的單克隆抗體一起溫育。降低后續的抗體對ELISA板上包被的初始表位的結合 的肽被認為是在此測定法中是抑制性的。實施例3 體內測試模擬表位分析免疫原性和交叉反應性1.對模擬表位的體內測試將抑制性以及非抑制性肽偶聯至KLH并與適宜的佐劑(氫氧化鋁)一起注射入小 鼠(野生型C57/B16小鼠；皮下注射入體側)。以兩周間隔給動物免疫接種3-6次并兩周 一次采集血清。用每一份血清測定對注射的肽以及對無關肽的滴度。另外，分別測定針對 重組人Αβ蛋白和針對初始肽的滴度。一般而言，通過針對在ELISA板上固定化的肽(偶 聯至牛血清清蛋白(BSA))和重組全長蛋白的反應來分析血清。使用抗小鼠IgG特異性抗 體來測定滴度。關于詳細的結果，分別見圖4，5和6。2.結果2.1.鑒定針對N端截短型和修飾型A β的特異性單克隆抗體(mAB)圖1描繪自實驗Alz-9衍生的單克隆抗體MV_002(內部名稱A115 ；IgG2b)的表 征，證明了對全長A β和在位置Ell和Η14處截短和在位置Ell至pEll處修飾的A β片段 的特異性。
2. 2.篩詵針對N端截短型和修飾型A β的特異件mAB 2. 2. 1.噬菌體展示文庫Ph. D. 72. 2. 1. 1.篩詵針對D1323的單克降抗體在此篩選中通過篩選WiD 7噬菌體展示文庫鑒定了 47種序列。表1總結了所鑒 定的肽及其與初始表位相比的結合能力。表1 結合親本抗體MV-002的模擬表位
權利要求
1.至少一種包含下述氨基酸序列的化合物在生產用于預防和/或治療包括阿爾茨海 默氏病的淀粉樣變的藥物中的用途，(X1)mHX2X3X4X5FX6(X7)n (式 II)， 其中X1為絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)或半胱氨酸(C)， X2為谷氨酰胺(Q)，蘇氨酸⑴或甲硫氨酸(M)， X3為賴氨酸⑷或精氨酸(R)， X4為亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，X5為色氨酸(W)，酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)或異亮氨酸(I)， &為天冬酰胺(N)，谷氨酸(E)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)， X7為半胱氨酸(C)， η和m獨立地為0或1，所述化合物具有與抗體結合的能力，所述抗體特異于包含氨基酸序列HQKLVF和/或 HQKLVFFAED的淀粉樣蛋白β肽(Αβ)表位。
2.依照權利要求1的用途，其特征在于所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序列 的肽SHTRLYF(C)， HMRLFFN(C)， SHQRLffF(C)， HQKMIFA(C)， HMRMYFE(C)， THQRLffF(C)和 HQKMIF(C)。
3.至少一種包含下述氨基酸序列的化合物在生產用于預防和/或治療淀粉樣變包 括阿爾茨海默氏病的藥物中的用途，(X1)mGX2X3X4FX5X6(X7)n (式 I)， 其中X1為絲氨酸(S)，丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)，&為絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)，谷氨酸(E)，天冬氨酸(D)，谷氨酰胺(Q)或甲硫氨酸(M)， X3為異亮氨酸(I)，酪氨酸(Y)，甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)，X4為亮氨酸(L)，精氨酸( ，谷氨酰胺(Q)，色氨酸(W)，纈氨酸(V)，組氨酸(H)，酪氨 酸(Y)，異亮氨酸(I)，賴氨酸⑷甲硫氨酸(M)或苯丙氨酸(F)，X5為丙氨酸㈧，苯丙氨酸(F)，組氨酸(H)，天冬酰胺(N)，精氨酸(R)，谷氨酸(E)，異 亮氨酸(I)，谷氨酰胺⑴)，天冬氨酸(D)，脯氨酸(P)或色氨酸(W)，甘氨酸(G) X6為任何氨基酸殘基， X7為半胱氨酸(C)， m和η獨立地為0或1，所述化合物具有與抗體結合的能力，所述抗體特異于包含氨基酸序列HQKLVF和/或 HQKLVFFAED的淀粉樣蛋白β肽(Αβ)表位。
4.依照權利要求3的用途，其特征在于所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序 列的肽SGEYVFH (C)，SGQLKFP (C), SGQIffFR(C), SGEIHFN(C)，GQIffFIS(C), GQIIFQS (C), GQIRFDH (C)，GEMWFAL (C)，GELQFPP (C)，GELffFP (C)，GEMQFFI (C)，GELYFRA (C)，GEIRFAL (C)， GMIVFPH (C)，GEIffFEG (C)，GQILFPV (C)，GELFFPK (C)，GQIMFPR (C)，GSLFFffP (C)，GEILFGM (C)， GQLKFPF(C)，GTIFFRD(C)，GQIKFAQ(C)，GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)，GQIQFPL(C)，GEIKFDH(C)， GEIQFGA(C), GELFFEK (C), GEIRFEL(C)，GEIYFER(C)，SGEIYFER(C), AGEIYFER(C)禾口 (C)GEIYFER。
5.至少一種包含選自下組的氨基酸序列的化合物在生產用于預防和/或治療β-淀 粉樣變包括阿爾茨海默氏病的藥物中的用途AIPLFVM (C)，KLPLFVM (C)，QLPLFVL (C)和 NDAKIVF(C)。
6.依照權利要求1-5任一項的用途，其特征在于所述化合物為包含4-20個氨基酸殘基 的多肽。
7.依照權利要求1-6任一項的用途，其特征在于所述化合物偶聯至藥學可接受載體， 優選KLH(匙孔i威血藍蛋白)。
8.依照權利要求1-7任一項的用途，其特征在于所述化合物為靜脈內，皮下，皮內或肌 肉內施用而配制。
9.依照權利要求1-8任一項的用途，其特征在于所述化合物與佐劑，優選氫氧化鋁一 起配制。
10.依照權利要求1-9任一項的用途，其特征在于所述化合物以0.Ing至10mg，優選 IOng至lmg，特別是IOOng至10 μ g的量包含在藥物中。
11.權利要求1-10任一項中限定的化合物用于治療和/或改善突觸核蛋白病的癥狀的 用途。
12.依照權利要求11的用途，其特征在于所述突觸核蛋白病選自下組帕金森氏病，具 有Lewy小體的癡呆，多系統萎縮和具有腦鐵累積的神經變性。
13.具有選自下組的氨基酸序列的肽SHTRLYF(C)，SGEYVFH (C)，SGQLKFP (C)， SGQIffFR(C)，SGEIHFN(C), GQIffFIS(C), NDAKIVF(C) ,GQIIFQS(C)，GQIRFDH(C)，HMRLFFN(C)， GEMWFAL(C)，GELQFPP(C)，GELffFP(C)，SHQRLffF(C)，HQKMIFA(C)，GEMQFFI(C)，GELYFRA(C)， GEIRFAL (C)，GMIVFPH(C)，GEIffFEG(C)，GEIYFER(C)，AIPLFVM(C)，GDLKFPL(C)，GQILFPV(C)， GELFFPK(C)，GQIMFPR(C)，HMRMYFE(C)，GSLFFffP(C)，GEILFGM(C)，GQLKFPF(C)，KLPLFVM(C)， GTIFFRD(C)，THQRLffF(C)，GQIKFAQ(C)，GTLIFHH(C)，GEIRFGS(C)，GQIQFPL(C)，GEIKFDH(C)， GEIQFGA(C), QLPLFVL(C) , HQKMIF(C), GELFFEK(C), GEIRFEL(C), AcGEIYFER (C)， SGEIYFER(C), AGEIYFER(C)和(C)GEIYFER。
14.依照權利要求11的肽，其特征在于該肽偶聯至藥學可接受載體，優選KLH(匙孔蟲威 血藍蛋白)。
15.包含至少一種依照權利要求11或12的肽的藥物配制劑，優選疫苗。
全文摘要
本發明涉及模擬表位在治療β-淀粉樣變包括但不限于阿爾茨海默氏病中的用途，由此所述模擬表位能夠在體內在不干擾APP信號傳導的生理功能的情況中誘導針對非截短的Aβ1-40/42，及N端截短形式AβpE3-40/42，Aβ3-40/42，Aβ11-40/42，AβpE11-40/42和Aβ14-40/42的抗體形成。
文檔編號A61P25/16GK102123728SQ200980131376
公開日2011年7月13日 申請日期2009年6月12日 優先權日2008年6月12日
發明者伊迪思·科皮尼茨, 哈拉爾德·韋寧格, 拉德米拉·桑蒂克, 馬庫斯·曼德勒 申請人:阿費里斯股份公司