專利名稱：：健骨膠囊及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及中藥領域，具體涉及一種具有益腎、壯骨、活血、鎮痛作用的健骨膠嚢及其制備方法。
背景技術：
：近年來，各種多發病已經逐漸從胃腸道疾病、營養不良等轉移到心血管疾病及骨、骨關節方面。骨質增生、原發性骨質疏松癥、腰間盤突出、頸推病、腰推病、風濕病等疾病很難根除且發病頻繁，會時常給患者帶來病痛。在現代醫療中，各種藥物的治療效果尚不明顯，中醫認為對于這類疑難雜癥，通過中藥的舒筋活絡、強筋健骨及鎮痛消腫等功效可使病癥減輕或疾愈。原發性骨質疏松癥是老年人的一種常見全身性骨病，主要是由于骨量低及骨的微細結構有破壞，招致骨的脆性增加，容易發生骨折。該病癥女性較男性多見，常見于絕經后婦女和老年人，在輕微外傷或無外傷的情況下都容易發生骨折，尤其75歲以上的婦女骨折發生率高達80%以上。治療原發性骨質疏松癥的藥物眾多，有骨吸收抑制劑如雌激素、降鈣素、雙磷酸鹽等；骨形成促進劑如氟化物、雄性激素、曱狀腺素、依普拉芬等；以及骨礦化促進劑如維生素D、4丐制劑。由于骨質疏松癥的療程長，長期用藥會產生不同程度的副作用，如雌激素替代療法潛在的致癌危險及其它禁忌癥，所以抗骨質疏松中藥制劑已成為研究熱點。中醫認為，人到老年后肝、腎逐漸不能生髓長骨，致使骨枯髓虛，因而確定治則多以滋補肝腎、強筋壯骨為主。目前，從"腎，，論治骨質疏松癥已被中、西醫學者普遍接受，國內主要從淫羊度、蛇床子、葛根等中藥中提取異黃酮類來治療骨質疏松癥。
發明內容本發明提供了一種具有益腎、壯骨、活血、鎮痛等作用的健骨膠嚢及其制備方法，該膠嚢主要用于治療原發性骨質疏;^癥。一種健骨膠嚢，由硬膠嚢殼和內容物組成，所述的內容物由下列重量份的原料藥和藥用輔料制成淫羊藿215份、珍珠15份、丹參312份、烏梢蛇1~94分、女貞子3~12斗分和藥用輔泮牛0.2~0.54分。所述的藥用輔料為膠嚢劑常規的藥用輔料，作為黏合劑，如食用油、硬脂酸鎂等，本發明優選硬脂酸鎂。所述的內容物優選由下列重量份的原料藥和藥用輔料制成淫羊藿13份、珍珠2份、丹參10份、烏梢蛇3份、女貞子7份和硬脂酸鎂0.35份。本發明所使用的原料藥淫羊泰、珍珠、丹參、烏梢蛇和女貞子，以及藥用輔料硬脂酸4^，各項指標均應符合2005版《中華人民共和國藥典》記載。其中五味原料藥主要有效成分及藥理活性如下1、淫羊藿具有補肝腎、強筋骨、祛風濕的功效，有助陽作用。淫羊藿主要含黃酮類成分，其中主要為淫羊藿苷，能明顯促進幼年小鼠附睪及精嚢腺的發育，能明顯促進睪酮的基礎分泌和cAMP的生成，具有雄性激素樣作用。淫羊藿能增強下丘腦-垂體-性腺軸及腎上腺上腺皮質軸、胸腺軸等分泌系統功能。2、丹參為活血化瘀藥，丹參煎劑有改善骨組織作用，對骨組織細胞有明顯的修復作用，能促進骨細胞樣細胞成熟、分泌膠原性物質和AIP,并使鈣鹽在膠原基質上沉積，形成骨力結節。丹參的活血化瘀作用，可促進組織的修復和再生，包括骨折愈合與其改善微循環障礙和血液流變學等作用有關。丹參中的有效成分確認為兩部分，即脂溶性成分丹參酮、隱丹參酮等，代表性成分為丹參酮IIA;另一部分為水浴性成分，主要為酚性成分，如丹參酚，丹參酸曱、乙、丙，丹酚酸A，丹酚酸B,丹參素，熊果酸，異漢魏酸等。3、女貞子為滋補肝腎藥，主含有機酸，主要為齊墩果酸，還含磷脂類及多糖等，齊墩果酸具有保肝、抗衰老作用，能清除自由基、改善免疫功能狀態。女貞子的有機溶劑提取物中有雄、雌性激素樣互相調節作用。4、珍珠具安神定驚、明目消翳、解毒生肌之效，主含碳酸鈣，含蛋白氨基酸和活性物質等有機物質，內服均用珍珠粉。5、烏梢蛇具祛風、通絡、止痙之效，主要成分含蛋白質、脂肪、果糖1,6-二磷酸脂酶、骨膠原及17種氨基酸。所述硬膠嚢殼選用藥用明膠硬膠囊，根據中華人民共和國國家標準藥用明膠硬膠嚢GB13731-92(國家技術監督局1992-09-28批準)制備，以滿足安全用藥的標準。所述的健骨膠嚢的制備方法，包括以下步驟(1)珍珠、烏梢蛇分別進行超細粉碎，制成珍珠超細粉和烏梢蛇超細粉，其中，珍珠超細粉中顆粒粒徑小于10pm的超細粉占珍珠超細粉總重量的80%以上，烏梢蛇超細粉中顆粒粒徑小于10|im的超細粉占烏梢蛇超細粉總重量的90%以上；(2)淫羊藿、丹參和女貞子，用水提取后過濾，得到藥渣和濾液；(3)將步驟(2)中的濾液濃縮成清膏，加乙醇靜置后過濾，得醇沉濾液；(4)將步驟(2)中的藥渣用乙醇回流提取，得乙醇回流濾液；(5)將醇沉濾液與乙醇回流濾液合并，減壓濃縮同時回收乙醇，將合并的濾液濃縮成稠浸膏，趁熱加入步驟(1)制備的珍珠超細粉與烏梢蛇超細粉，混合均勻，干燥后得干膏粉，粉碎至80目細粉，加硬脂酸4美混勻，填充入硬膠嚢殼，封口，即得健骨膠嚢。所述制備方法的步驟(1)中，珍珠、烏梢蛇可先經炮制、粗粉碎，再進行超細粉碎，以達到好的粉碎效果。因為經炮制烘干的珍珠質地變松脆，易于4分碎；生烏梢蛇質韌難干粉碎，須經炮制后方可改變其質地，便于粉碎。淫羊藿、丹參、女貞子三味原料藥的提取方法，在研究中以淫羊藿苷、丹參酮IIA、丹參素作為指標成分，考察水提取、水提加醇提、乙醇回流提取三種方法的提取效果，結果水提加醇提的提取效果最好，提得指標成分除丹參素的提得含量與提得率與水提取接近外，其余均明顯高于水提取和乙醇回流提取，因此，選用水提加醇提的提取方法作為淫羊藿、丹參、女貞子三味原料藥的提取方法。所述水提加醇提的提取方法是將淫羊藿、丹參、女貞子三味原料藥用水提取后，得到藥渣和濾液，再用乙醇回流提取藥渣。淫羊度、丹參、女貞子用水提取過程中水用量、水浸漬時間、煎煮時間這三個因素對提取效果沒有顯著影響。藥渣用乙醇回流過程中乙醇濃度、提取時間、提取次數、乙醇用量這四個因素，乙醇用量、提取次數對提取效果有顯著影響，其余因素均無顯著影響。通過大量試驗發現，優選用IO倍原料量(淫羊藿、丹參和女貞子三種原料藥的重量)的水浸漬1小時，煎煮1.5小時，藥渣再用12倍原料量(淫羊藿、丹參和女貞子三種原料藥的重量)、體積百分比濃度80%的乙醇，回流提取l次，提取時間1.5小時的工藝條件，具有效果好、省時、節能、成本低等優點。步驟(2)中的濾液優選濃縮至20°C時相對密度(以水為標準物質)1.10~1.14的清膏，加乙醇使含醇量達70%,靜置24小時過濾，得醇沉濾液，含醇量為乙醇占清膏和乙醇總重量的重量百分比。步驟(3)中對水提取濾液作濃縮醇沉處理，以減少服用劑量，增強抗吸濕作用，通過進行大量不同浸膏濃度與含醇量的濃縮醇沉處理工藝試驗，結果發現對水提取濾液作濃縮醇沉處理后，對指標成分淫羊藿苷、丹參酮IIA、丹參素的含量并無顯著影響，同時還可以有效減少藥物的服用劑量，增強抗吸濕作用。步驟(5)中合并的濾液優選濃縮至60。C相對密度(以水為標準物質)1.30~1.38的稠浸膏后，趁熱加入珍珠超細粉與烏梢蛇超細粉，混合均勻，80。C真空干燥制備干膏粉。步驟(5)中采用8(TC真空干燥，可大幅度減少烘干時間，節約能源，且干浸膏質地疏松，易粉碎至80目成干膏粉。采用干膏粉加硬脂S交鎂混勻后灌裝膠嚢，即可克服干膏粉流動性差的問題，又不會增加堆密度，采用1號膠嚢，每粒平均裝量即可達到0.4g，因此優選用干膏粉加硬脂酸鎂混勻后直接灌裝膠嚢，這樣服用的膠嚢較小，服用方便，且可省去用乙醇做藥用輔料時制粒、烘干、整粒等工序，節省工時和成本，同時可避免用乙醇制粒后在烘干過程中的安全隱患。本發明制備的健骨膠嚢具有益腎、壯骨、活血、止痛等作用，選用蛇類藥烏梢蛇，不僅能加強祛風通絡、健骨壯筋的作用，而且由于蛇類藥含有大量氨基酸，具有促膠原蛋白的合成、促骨質形成和提高骨密度的作用。該健骨膠嚢中配以珍珠及補腎活血止痛中藥丹參和淫羊藿，能較好地改善患者疼痛等的臨床癥狀，有別于目前中醫藥治療原發性骨質疏松多以補腎為主且均用植物性藥物的方法和思路。具體實施方式實施例1淫羊藿520g、珍珠80g、丹參400g、烏梢蛇120g、女貞子280g和硬脂酸鎂14g。按上述配方制備健骨膠嚢，制備方法包括以下步驟說明書第5/20頁(1)珍珠超細粉的制備將珍珠洗凈，加等重量的水，煮沸0.5小時，取出，濾干，置于不銹鋼盤內，于150160。C烘箱中烘干并具爆裂聲即炮制好。取炮制好的珍珠，用中藥粉碎機粉碎2次，第一次粉碎至30目細粉，再進行第二次粉碎，粉碎至60目細粉。將60目細粉緩緩加入氣流磨中進行超細粉碎，收集超細粉，顆粒粒徑小于10pm的超細粉占珍珠超細粉總重量的80。/。以上。烏梢蛇超細粉的制備取烏梢蛇去頭、尾、鱗片，切成段，加黃酒拌勻悶澗至黃酒吸盡(每100kg，加黃酒20kg)晾干，按砂燙法將烏梢蛇段不斷翻炒至外表呈淺棕黃色，篩盡油砂，放涼即炮制好。將炮制好的烏梢蛇用中藥粉碎機粉碎至60目細粉。將60目細粉緩緩加入氣流磨中進行超細粉碎，收集超細粉，顆粒粒徑小于lOpm的超細粉占烏梢蛇超細粉總重量的90%以上。(2)淫羊藿、丹參和女貞子，加原料重量IO倍量水浸漬1小時，加熱煮沸1.5小時后過濾，得到藥渣和濾液；(3)將步驟(2)中的濾液濃縮至相對密度1.10(20°C)的清膏，加乙醇使含醇量達70%，靜置24小時過濾，得醇沉濾液；(4)將步驟(2)中的藥渣用原料重量12倍量、體積百分比濃度80%的乙醇，加熱回流1.5小時后過濾，得乙醇回流濾液；(5)將醇沉濾液與乙醇回流濾液合并，減壓濃縮同時回收乙醇，濾液濃縮至相對密度1.30(60°C)的稠浸膏，趁熱加入步驟(1)制備的珍珠超細粉與烏梢蛇超細粉，混合均勻，80。C真空干燥得干膏粉，粉碎至80目細粉，加硬脂酸鎂混勻，填充入硬膠嚢殼，封口，制成1000粒健骨膠嚢。實施例2淫羊度80g、珍珠160g、丹參320g、烏梢蛇360g、女貞子480g和硬脂酸鎂14g。按照實施例1的制備方法，步驟(2)中濾液濃縮至相對密度1.14(2(TC)的清膏，步驟(4)中濾液濃縮至相對密度1.38(60°C)的稠浸膏，制成IOOO粒健骨"交嚢。實施例3淫羊藿200g、珍珠200g、丹參120g、烏梢蛇120g、女貞子400g和硬脂酸鎂10.4g。按照實施例1的制備方法，步驟(2)中濾液濃縮至相對密度1.10(20°C)的清膏，步驟(4)中濾液濃縮至相對密度1.35(60°C)的稠浸膏，制IOOO粒健骨力交嚢。實施例4淫羊藿320g、珍珠40g、丹參200g、烏梢蛇40g、女貞子200g和硬脂酸鎂8g。按照實施例1的制備方法，步驟(2)中濾液濃縮至相對密度1.13(20。C)的清膏，步驟(4)中濾液濃縮至相對密度1.33(60°C)的稠浸膏，制1000粒健骨膠嚢。實施例5淫羊愛600g、珍珠120g、丹參480g、烏梢蛇240g、女貞子120g和硬脂酸鎂15.6g。按照實施例1的制備方法，步驟(2)中濾液濃縮至相對密度1.10(20°C)的清膏，步驟(4)中濾液濃縮至相對密度1.33(60°C)的稠浸膏，制IOOO粒健骨膠嚢。一、健骨膠嚢穩定性試驗1.質量標準1.1性狀本品為硬膠嚢劑，內容物為棕色或黃棕色粉末或細小顆粒，氣微香，略腥，味微苦。1.2鑒別丹參TLC,熒光燈(254nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。女貞子TLC，供試品色譜中，在與齊墩果酸對照品色譜相應的位置上顯相同紫紅色斑點。1.3檢查重量差異，不得過±10%;崩解時限，應不得過30min;水分含量，應不得過9.0%;細菌，不得過10000個/g;霉菌與酵母菌，應不得過IOO個/g;大腸桿菌，不得檢出；沙門氏菌，不得檢出；活螨，不得檢出。1.4含量測定淫羊藿苷，每粒含淫羊藿苷(C33H4。015)計，不得少于2.2mg;總釣，每粒含總鈣(Ca2+)不得少于30mg。2.實驗方法與結果實施例l、2、3、4、5制備的健骨膠嚢，包裝為鋁塑泡罩12粒/板，外封鋁塑袋密封，2板/袋，室溫下放置12個月，分別在0月、l月、2月、3月、6月、12月進行檢測，結果表明樣品均符合上述質量標準的規定(即臨床研究用藥品質量標準草案檢測中本品質量標準草案的規定)，質量穩定。二、健骨膠嚢急性毒性試驗1.受試藥物實施例1制備的健骨膠嚢,杭州華東醫藥集團有限公司加工，批號051109。ICR小鼠20只，體重18士2g,S各半，浙江省中醫藥研究院實驗動物中心提供，動物合格證號為第SYXK(浙)2004-0034號。分每籠6只飼養，祠養室溫度為25士rC,相對濕度為65±10%,飼以固體伺料(浙江省醫學科學院實驗動物中心制)，自由飲水。2.實驗方法取小鼠，標記，稱重，按性別隨機分成2組，每組10只用藥組和對照組，每組雌、雄分開。禁食不禁水12h后，一次灌胃給藥0.40ml/10g，一天2次。劑量為含健骨膠嚢16g/kg,對照組給予等容積的蒸餾水。給藥后自由飲食，每天上、下午各^L察一次，連續一周。3.觀察指標3.1體重每天稱量一次，見表l。3.2進食量及飲水量每天稱加入量和剩余量，計算差值即得，見表2、表3。3.3癥狀》見察3.3.1神經系統(1)行為及反應不正常叫聲、煩燥不安、易怒、感覺過敏、少動、嗜睡或昏迷等；(2)運動包括肌肉抽搐、僵硬、強迫運動、松弛、麻痹等；(3)瞳孔及分泌物瞳孔放大或縮小、流淚、鼻分泌、流涎等。3.3.2胃腸腹部脹氣或收縮，大便堅硬，較濕，不成形或黑便、土色便。3.3.3泌尿生殖系統尿顏色、陰唇、乳腺腫脹、會陰部是否骯臟。3.3.4皮膚和毛顏色、完整性、有否充血、紫紺、蒼白、皮疹、毛松散等。3.3.5目艮眼瞼下垂、眼J求突出、震顫等。上述癥狀指標采用肉眼直接觀察，連續觀察7天。4.纟充i十方法所有計量數據均表示為7±SD，采用SPSS12.0軟件進行方差分析及組間檢驗。5.指標觀察結果5.1健骨膠嚢對小鼠體重的影響給藥前小鼠禁食12小時，各組體重均有下降；給藥后恢復正常進食進水，則開始增長，增長趨勢基本接近，連續7天，用藥組與對照組相比無顯著差異。結果表明，健骨膠嚢對小鼠體重增長無影響，見表l。表l健骨膠囊對體重的影響(單位g,亍土SD)用辨19.12±1.1216.47±12919.79±1382034±1.062057±12221.46±1.752205±2162249±1.8223.15±217順攤202312417.16±0.942035±1.6219.83±1.552033±1532li8±1.452251±1.922377土li824.19±1.95用觶1.451,1.13隨±1.472026±1792,2172234±22523.16±27324.42±24125.60土288順雄鵬1.721728±139腿土l.W20.75±1.822b2土1.912236±21823.19±24823.95±26024.97±2325.2健骨膠嚢對小鼠進食量的影響因給藥前小鼠禁食12小時，給藥后當天撤銷禁食，各組小鼠進食量增加,之后穩定。連續7天，用藥組與對照組相比無顯著差異。結果表明，健骨膠嚢對小鼠進食量無明顯影響，見表2。表2健骨膠嚢對小鼠進食量的影響(單位g/只，Z士SD)0dld2d3d4d5d6d7d用辦6.15±235823±2437.12±241&65±125&10±2367.95±1369.10±2361027±239649±1鄰9.15±2618.15±2159.78±2749.15±3.606.79±3.128.97±1.948.45±249用辦7說±213鄉±1.929.12±1.85724±2431023±2798.12±3.189_55±2619.79±224順雄7.M±1.7510.11±213750±228723±1358.41±2199.17±3321127±279雌±2405.3健骨膠嚢對小鼠飲水量的影響因給藥前小鼠禁食12小時，給藥后當天撤銷禁食，隨著各組小鼠進食量增加，飲水量也增加，后下降至一定水平，基本比較穩定。連續7天，用藥組與對照組相比無顯著差異。結果表明，健骨膠嚢對小鼠飲水量無明顯影響，見表3。表3健骨膠囊對小鼠飲水量的影響(單位ml/只，^土SD)_0dld2d3d4d5d6d7d<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5.4健骨膠嚢急毒試驗對小鼠神經、胃腸、泌尿生殖、皮膚、毛及眼等的影響實驗結果顯示，以上各方面均未見異常現象。6.結果健骨膠嚢給藥后連續觀察7天，各項指標均未見異常。最大給藥量為含健骨膠嚢16g/kg，相當于臨床劑量的635倍，未引起小鼠死亡，表明該藥急性毒性甚小，口服安全，可以提供臨床用藥三、健骨膠嚢長期毒性試驗1.試驗材料1.1實施例l制備的健骨膠嚢棕黃色干膏粉，杭州華東醫藥集團有限公司生產，(我院委托加工)，每克含3.2克生藥，批號051109。1.2動物SD大鼠，清潔級，120只，雌雄各半，體重180-220g，由浙江省中醫藥研究院實驗動物室提供。許可證SYXK(浙)2004-0034。2.儀器日立7060型全自動生化分析儀，日本日立公司生產；KX21全自動血細胞分析儀，日本東亞公司生產；德國Leica組織切片機；賽多利斯電子天平BS210S。本試驗采用SD大鼠，每組30只，雌雄各半，健骨膠嚢劑量分別為1.8g/kg(5.76g生藥/kg)、0.9g/kg(2.88g生藥/kg)、0.45g/kg(1.44g生藥/kg)組(分別相當于臨床用量的20倍、10倍、5倍)。另設常水對照組，連續灌胃給藥13周。實驗結果顯示各組大鼠的活動、外表、毛色和大便等均未發現明顯異常現象。各劑量組給藥3月、6月、13周及停藥二周血常規與水對照組比較均無明顯差異(P〉0.05)。各劑量組給藥3月、6月、13周及停藥二周的生化指標與水對照組比較均無明顯差異(P>0.05)。組織局;f企顯示各組大鼠的心、肝、腎、脾、大腦、垂體、曱狀腺、胃、脊髓(頸、胸、腰段)、小腸和大腸、胸腺、腎上腺、膀胱、視神經、淋巴結、卵巢、子宮、前列腺、睪丸、附睪外形與大小均正常，表面光滑，切面未見異常。病理鏡檢顯示對照組及給藥組個別大鼠有肺充血，其他臟器未見明顯異常。結果顯示，大鼠口服健骨膠嚢3個月，一般狀況、血常規、血液生化、臟器系數、組織巨檢與病理檢查均未發現與用藥有關的變化，因此健骨膠嚢以0.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg連續灌胃給藥6個月，對大鼠無明顯的毒副作用，故臨床用藥是安全的。四、健骨膠嚢主要藥效學研究通過去勢術建立骨質疏松大鼠模型，觀察健骨膠嚢對雌激素缺乏引起的骨質疏松模型大鼠的骨質、骨代謝及血流變的影響，觀察健骨膠嚢的藥效作用。結果如下1.試-驗對象實施例1制備的健骨膠嚢，為椋黃色干膏粉，杭州華東醫藥集團有限公司加工，批號051109。仙靈骨葆膠嚢，為棕黃色干膏粉，貴州同濟堂制藥股份有限公司生產，批號030901。戊巴比妥鈉，中國醫藥(集團)上海化學制藥公司，批號F20030816。2.儀器多利斯電子天平BS210S,Leica高級熒光生物顯微鏡，徠卡-DMLB圖象分析軟件；病理組織漂烘儀ZMN-6802、全自動組織包埋機ZMN-7803、德國萊卡切片機RM2235、GE雙能窄角扇形骨密度儀。3.動物模型與分組4.月齡未交配的SD大鼠，雌雄各半120只，體重230±20g。由浙江省中醫藥研究院動物中心提供,合格證號SYXK(浙)2004-0034。將大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為高、中、低劑量組，陽性藥組、模型組和空白組，高、中、低劑量組、陽性藥組、及模型組大鼠去勢，空白組大鼠假切除。適應性飼養7d，開始實r時平均體重240±12g。分籠飼養,飼養于室溫23°C~25。C，相對濕度50%~70%的清潔環境中，自由攝食和攝水。去勢以2%戊巴比妥鈉(2g/100ml),40mg/kg劑量，(0.2ml/100g),腹腔注射麻醉。2%碘酒消毒，75%酒精消毒消毒，雌性于背部軀干下1/3處脊柱兩側旁開lcm作縱形切口，長約l-2cm,分離肌肉層。取卵巢在卵巢下用0號絲線，打結，剪去卵巢和多余絲線，放回腹腔縫合傷口。雄性取仰臥式，碘酒、酒精消毒陰嚢皮膚，縱隔旁相距lcm各開一縱行切口，剪開鞘膜后，分別將雙側睪丸與附睪分離(不切除)，切除睪丸，然后放回陰嚢，縫合切口。術后均給予青霉素5萬單位/只，腹腔注射3天。第4后大鼠以常規飼料喂養，第7天拆線。造模后每月測體重l次，四個月后測骨密度，并開始給藥干預。用當天蒸餾水配制，健骨膠嚢低、中、高劑量組分別以健骨膠嚢0.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg(相當于臨床成人劑量的5倍、10倍、20倍)灌胃給藥。陽性藥對照組，選用仙靈骨葆膠囊0.5g/kg(相當于臨床成人劑量的10倍)灌胃給藥。模型組及空白組灌以蒸餾水2ml/100g灌胃給藥。灌胃六個月后各組動物以2%戊巴比妥鈉按40mg/kg劑量，腹腔注射麻醉，檢測骨密度；靜脈抽血處死,取全血做血流變檢測，血清分別檢測堿性磷酸酶(AKP)、血鉤Ca2、骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP，取動物雙側后肢骨福爾馬林固定，組織學分析。4.1骨代謝全血肝素抗凝后即送血液粘稠度的檢測，血清進行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、血清堿性磷酸酶(AKP)、血釣的4企測。取0.2ml血清，稀釋5倍，37。C溫育lh，以滅活紅細胞釋放出的TRAP,取孔酶標板，每孔加入50jul稀釋血清，再加入等體積反應混合液，溫箱孵育lh，氫氧化鈉接線片終止反應。在酶標儀410nm波長比色。每樣標本同時作2管，取均值。TRAP活力單位在37。C，pH5.0，5.40mmol/L酒石酸鈉存在下，水解lmmol對硝基苯磷酸鹽，產生lmmol對硝基苯酚為lU/L。4.2骨組織雙下肢股骨用10%福爾馬林固定，固定24小時后在股骨中段鋸斷股骨，棄去遠端，近端用EDTA進行脫4丐60天，完成脫鈣后于斷端取0.3cm長股骨一段，將剩下的股骨沿股骨頭正中作一縱切面，二塊骨組織均作常規石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。進行常規病理形態學觀察。測量股骨橫斷面骨皮質厚度，以股骨斷面的嵴部為測量的第一點，第二、第三個測量點為另二個l/3的等分處，最后求出平均值。測量骨小梁的直徑，在股骨頭的切面上隨機測量5處骨小梁的直徑，并求出平均值。4.3統計學處理所有數據輸入計算機，用SPSS11.0forwindows版本軟件進行t檢驗和方差分析,計量資料結果以均值±標準差(X±SD)表示。5.結果5.1對SD去勢大鼠骨質疏杠、模型骨密度的影響SD大鼠去勢造模后4月，各組骨密度較正常對照略有降低，但不明顯P>0.05,經過6個月的治療后，各組骨密度較模型組有上升趨勢，以中劑量、低劑量明顯，脊推骨密度分別比模型組上升，差異有顯著意義，分別P0.05、與PO.Ol。右軀千陽性藥與中劑量骨密度分別比模型組上升差異有顯著意義P<0.05。5.2健骨膠嚢對去勢大鼠骨質疏松模型骨質病理改變的影響所有實驗大鼠骨組織中未見炎癥反應，亦未見明顯的骨小梁斷裂等病變。模型組骨皮質普遍變薄，骨小梁直徑變小，與正常組對比有顯著意義P<0.05，給藥各組骨皮質厚度及小梁直徑均有不同程度回升，以高劑量組最為明顯其股骨頭骨小梁徑0.073±0.007,與模型組對比差異有顯著意義PO.05見表4。顯示中藥健骨膠嚢可促進去勢大鼠骨組織生長。表4健骨膠嚢對去勢大鼠骨質疏松模型骨質病理改變的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注'表示與正常對照組比較，i表示與模型組比較'表示P〈0.05,"表示P〈0.01;i表示P〈0.05,"表示PO.Ol5.3對SD去勢大鼠骨質疏松模型AKP、Ca2+、BAKP、TRAP的影響各組間堿性磷酸酶活性無顯著差異(P〉0.05)，而抗酒石酸酸性磷酸酶活性、AKP均陽性對照組和健骨膠嚢治療組明顯低于骨質疏松模型組，差異有顯著意義(P〈0.05)，說明健骨膠囊能抑制抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。結果見表5、表6。表5健骨膠嚢對去勢大鼠骨質疏松模型血BAP、TRAP的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注'表示與正常對照組比較，*表示與模型組比較'表示P〈0.05,"表示PO.01;i表示P0.05，"表示PO.01表6健骨膠囊對大鼠血清堿性磚酸酶、鈣、磷的影響(7土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注'表示與正常對照組比較，'表示與模型組比較'表示P0.05,"表示PO.01;'表示P0.05，"表示PO.015.4對SD去勢大鼠骨質疏杠^莫型血流變的影響由表7可見模型組全血粘度低切、全血粘度中切、全血粘度高切均較正常對照組升高PO.Ol，健骨膠嚢高劑量組的全血粘度低切、全血粘度中切、全血粘度高切明顯低于模型組均P<0.01。_表7健骨膠嚢對大鼠血流變的影響(^±SD)_組別n全血粘度低切全血粘度中切全血粘度高切正常對照組1211.47±4.406.37±1.85A4.98±1.36A模型組1818.49±2.07**9.44士0.82'7.20±0.52*低劑量組2016.03±2.84'.A8.47±1.50**6.44±1.19**中劑量組1815.66土1.80"8.03士1.44"6.29士0.87"高劑量組103.70土3.90""7.59±1.96**"5.88土1.48""陽性藥組1915.79士5.18"8.13±1.42'*6.02土1.03'注'表示與正常對照組比較，i表示與模型組比較'表示P0.05,"表示PO.01;'表示P〈0.05,"表示PO.Ol6.結論健骨膠嚢主要由淫羊藿、珍珠、丹參、烏梢蛇、女貞子組成，體外試驗研究表明健骨膠嚢含藥血清對成骨細胞體外增殖、分化與礦化具有刺激作用，可抑制體外培養破骨細胞的成熟及其骨吸收能力。對脊推和軀干骨密度較模型組有上升趨勢，以中劑量、低劑量明顯，P<0.05、PO.Ol。血清血檢測表示其能抑制抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，骨密度檢測治療各組骨密度較模型組有上升趨勢，以健骨膠嚢中劑量、低劑量明顯，脊推骨密度分別比模型組上升，右陽性藥與中劑量骨密度分別比模型組上升P<0.05。健骨膠嚢對去勢大鼠骨質疏松模型骨質病理改變也表現出模型組骨皮質普遍變薄，骨小梁直徑變小，給藥各組骨皮質厚度及小梁直徑均有不同程度回升，顯示中藥健骨膠嚢可促進去勢大鼠骨組織生長，促進骨形成，防治原發性骨質疏松的作用。五、健骨膠嚢鎮痛實驗1.實驗對象實施例l制備的健骨膠嚢，委托杭州華東醫藥集團有限公司加工，批號051109。仙靈骨葆膠嚢，為棕黃色干膏粉，貴州同濟堂制藥股份有限公司生產，批號030901。巴米爾(乙酰水楊酸水溶片)，白色片劑，阿斯特拉(無錫)制藥有限公司生產，批號34340L戊巴比妥鈉，中國醫藥(集團)上海化學制藥公司，批號F20030816。2.實驗方法ICR小鼠，體重2024g。由浙江省中醫藥研究院實驗動物研究中心提供。實-瞼動物合格i正號SYXK(浙)2004-0034。小鼠熱板法鎮痛實驗前對ICR小鼠進行篩選，將其置于(55±l)"C的熱板上，以放置于熱板上至出現小鼠舔后足所需的時間(S)為該鼠的正常痛閾值。每組按不同濃度單次灌胃給藥連續3天(0.2ml/10g鼠)，第三天灌胃后半小時進行鐵板實驗(直徑18cm，高15cm的不銹鋼圓筒放置于55土0.5。C的水浴內，將小白鼠放入，以舔后足作為疼痛反應指標)每半小時進行一次，記錄每次小白鼠痛閾時間。共觀察至150分鐘(5次)。3.分組及給藥選擇正常瘤閾值在530s內的合格小鼠120只，雌雄各半，隨機分為12組，雌性小白鼠分6組，雄性小白鼠分6組，每組10只，設空白對照組，健骨膠嚢3個劑量組，仙靈骨葆膠嚢陽性組，模型巴米爾對照組。合格小鼠于實驗前禁食12h,供^t水。灌胃藥物配制及給藥量當天用蒸餾水配制，健骨膠嚢低、中、高劑量組分別相當于成人臨床劑量的IO、20、30倍，陽性組灌以仙靈骨葆膠嚢，模型組灌以巴米爾人的20倍劑量為灌胃量，空白組灌以蒸餾水。灌胃量以0.2ml/10g計。4.數據處理所有實驗數據以7士SD表示，計量資料由SPSS12.0統計軟件進行方差分析及組間4t驗。5.結果對小鼠熱刺激痛閾值的影響在各測定時間內，空白對照組痛閾值均無明顯變化(P0.05)。給藥后30min，各給藥組效果明顯，在藥后30~120min時熱板法測得健骨膠嚢鎮痛作用隨劑量的加大而增強，健骨膠嚢組小鼠的痛閾值隨給藥時間延長比模型組而逐漸增大，痛閾明顯提高P0.05。但該藥的早期作用(藥后30min)弱于陽性對照藥巴米爾。健骨膠嚢對雌性、雄性小鼠鎮痛作用的影響數據，見表8、表9。本實驗的結果為健骨膠嚢組小鼠的痛閾值隨給藥時間延長，明顯提高小鼠痛闞，較模型組明顯增大P0.05。表8健骨膠囊對雌性小鼠鎮痛作用的影響(X±SD)次數<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>陽性劑量組1021.70±8.1021.20±7.5419.60±4.7219.40±5.3418.70±5.25注""表示與空白組相比較，p<0.05用"'"表示，p<0.01用"""表示""'表示與模型組相比較，p〈0.05用"'"表示，p<0.01用"'"'表示_表9健骨膠嚢對雄性d、鼠鎮痛作用的影響(7±SD)_次數_q_30分鐘_60分鐘_90分鐘_120分鐘_150分鐘空白*且720.57±4.3919.86±3.8919.29±4.2319.71±4.2718.57±3.87模型組725.00±11.8023.57±8.2021.86±5.7621.14±5.0820.29±4.99低劑量組826.75±16.2327.63±14.9925.75±12.6824.63±11.1223.13±11.10中劑量組935.22±15.17'34.67±16.39*32.22±15.07*29.44±12.08"26.44±9.77*'高劑量組930.11±15.8530.00±12.13'27.67±9.6626.33±8.34'24.56±7.00*陽性劑量組8_26.38±6.3023.00±7.3721.50±5.8620.38±4.41_19.63±5.15注""表示與空白組相比較，p<0.05用"'"表示，p〈0.01用"""表示""'表示與棋型組相比較，po.05用表示，p〈0.01用"""表示六、健骨膠嚢體外藥效學研究l.中藥含藥血清的制備.U實驗藥物實施例1制備的健骨膠嚢:杭州華東醫藥集團有限公司生產，批號051109。仙靈骨葆膠嚢貴州同濟堂制藥股份有限公司生產，批號061038040。1.2主要儀器臺式低溫高速離心機SIGMA3K18，sigma公司。升降恒溫水浴箱W501，上海申勝生物技術有限公司。1.3實驗動物及分組實驗SD大鼠60只，雌雄各半，體重240~260g。由浙江省中醫藥研究院動物中心提供。實驗動物合格證號SYXK(浙)2004-0034。共分5組(正常組、健骨膠嚢高、中、低三個劑量組、陽性藥對照組)，每組12只。正常組，灌服生理鹽水。健骨膠嚢低、中、高劑量組，分別以健骨膠嚢0.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg(相當于臨床成人劑量的5倍、10倍、20倍)灌胃給藥。陽性藥對照組，選用仙靈骨葆膠嚢0.5g/kg(相當于臨床成人劑量的10倍)灌胃給藥。1.4實驗方法各組大鼠分別灌胃給藥，給藥體積為1.5ml/100g，2次/d，間隔6h,連續2天，第3天首次給藥2h后再次給藥。末次給藥lh后，麻醉，心臟采血。低溫-4。C，離心2500rmpx25min，吸取上清。56。C水浴30min滅活，微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20。C保存備用。2.健骨膠嚢含藥血清對成骨細胞(OB)骨形成促進作用藥效研究2.1含藥血清由浙江省中醫藥研究院制備提供，采集自4月齡雄性SD大鼠(260g),包括正常對照組(CN)、健骨膠嚢低劑量組(L)、健骨膠嚢中劑量組(M)、健骨膠嚢高劑量組(H)和陽性藥對照組(CP)。2.2成骨細胞培養由新生大鼠頭蓋骨分離培養成骨細胞，經堿性磷酸酶染色鑒定后取第二繼代細胞用于研究。2.3評價指標①體外增殖細胞以2000/孔接種于96孔板，次日更換含藥血清培培養液，3天后用MTT方法檢測細胞量，結果以OD(A570)值表示。②體外分化細胞以2000/孔接種于96孔板，次日更換含藥血清培培養液，3天后用PNPP法檢測細胞堿性磷酸酶(ALP)活性，結果以OD(A405)值表示。③體外礦化細胞以104/孔接種于48孔培養板，次日更換含藥血清培養液，以后2天換液一次至礦化結節形成，萏素紅染色，40倍光鏡下觀察\攝影，IPP形態計量軟件分析礦化結節形成面積，結果以pmV結節表示。2.4統計分析數據表示為歹士S,采用Benferroni方差分析，設p<0.05有統計學意義。2.5試驗結果①成骨細胞鑒定培養細胞ALP組化染色，結果顯示胞漿內ALP蘭色陽性顆粒。②對OB體外增殖的影響表10健骨膠囊對OB增殖的影響(X±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>與CN組比較P<0.05;PO.01;PO.001表10中可見三批實驗結果顯示健骨膠嚢含藥血清對體外培養成骨細胞均具有增殖刺激作用。與空白對照組比較，除實驗一的低劑量組的增加未顯示統計學意義，其它各劑量組均顯示顯著的OB增殖刺激作用(PO.05-0.001)，其中二批實驗結果顯示中劑量組的作用最強；陽性對照組也顯示對體外培養成骨細胞的顯著增殖刺激作用(PO.05-0.001)。③對OB體外分化的影響表11三批實驗結果顯示，健骨膠嚢含藥血清各劑量對體外培養成骨細胞均具有分化刺激作用。與空白對照組比較，中、低劑量組二批實驗的作用具有統計學意義(PO.05-0.001)，高劑量組一批實驗的作用具有統計學意義(P<0.01);陽性對照組也顯示分化刺激作用，其中實驗一的作用具有顯著性(PO.05)。表11健骨膠嚢對OB分化的影響(7±s)ALPOD(闊實驗一(n=8)實驗二(n=10)實驗三(n=10)CN0.215±0.0250.183±0.0120.433±0.021L0.248±0.0330.258±0.024"*0.459±0.028'M0.250±0.016"0.219±0.026"0.453±0.030H0.239±0.0250.217±0.027"0.450±0.132CP0.259±0.033*0.192±0.0140.444±0.028與CN組比較*P<0.05;**P<0.01;***PO.001④對OB體外礦化的影響表12顯示，健骨膠嚢含藥血清各劑量均顯示對體外培養成骨細胞礦化刺激作用。與空白對照組比較，低、中、高三個劑量分別增加1.1%、6.1%與16.0%;陽性對照組增加14.8%。各組間均未顯示統計學意義。表12健骨膠囊對OB體外礦化的影響CNL拜2/結節MHCP0.1950.1900.2990.3300.3080.3710.1850.2530.2340.3050.2560.3180.1580.2200.242<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>2.6結論健骨膠嚢含藥血清對成骨細胞體外增殖、分化與礦化具有刺激作用。3.健骨膠嚢含藥血清對破骨細胞(OC)骨吸收抑制作用藥效研究3.1含藥血清由浙江省中醫藥研究院制備提供，采集自4月齡雄性SD大鼠(260g),包括陰性對照組(CN)、健骨膠嚢低劑量組(L)、健骨膠嚢中劑量組(M)、健骨膠嚢高劑量組(H)和陽性藥對照組(CP)。3.2破骨細胞培養由2-3日齡SD大鼠四肢長骨分離獲得OC，培養于含10%FBS的MEM培養液。3.3評價指標①TRAP陽性細胞數(培養3天，計數TRAP陽性多核細胞，結果以個/孔)。②吸收陷窩分析(骨片培養7天，計量吸收陷窩面積，結果以pmV骨片)。3.4統計分析數據表示為)土S，采用Benferroni方差分析，設p<0.05有統計學意義。3.5試驗結果①TRAP陽性細胞數表13結果顯示健骨膠嚢含藥血清各劑量組對體外培養TRAP陽性破骨細胞數的抑制作用，其中中、高劑量組的作用具有統計學意義(PO.OOl,PO.001);陽性對照組也顯示顯著抑制作用(PO.OOl)。_表13體外培養3天TRAP陽性破骨細胞數(n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>說明書第20/20頁<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注與CN比4交，***p<0.001②吸收陷窩面積表14結果顯示健骨膠嚢含藥血清各劑量組對體外培養破骨細胞骨吸收的抑制作用，高劑量組骨片吸收陷窩面積減少具有統計學意義(PO.01);陽性對照組的骨片吸收陷窩面積也顯著減少(P<0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注與CN比較，*p<0.05**p<0.013.6結論健骨膠嚢含藥血清可抑制體外培養破骨細胞的成熟及其骨吸收能力。權利要求1、一種健骨膠囊，由硬膠囊殼和內容物組成，其特征在于:所述的內容物由下列重量份的原料藥和藥用輔料制成:淫羊藿2～15份、珍珠1～5份、丹參3～12份、烏梢蛇1～9份、女貞子3～12份和藥用輔料0.2～0.5份。2、如權利要求1所述的健骨膠嚢，其特征在于所述的藥用輔料為硬脂酸鎂。3、如權利要求1或2所述的健骨膠嚢，其特征在于所述的內容物由下列重量份的原料藥和藥用輔料制成淫羊藿13份、珍珠2份、丹參10份、烏梢蛇3份、女貞子7份和硬脂S吏鎂0.35份。4、如權利要求l-3任一所述的健骨膠嚢的制備方法，包括以下步驟(1)珍珠、烏梢蛇分別進行超細粉碎，制成珍珠超細粉和烏梢蛇超細粉，其中，珍珠超細粉中顆粒粒徑小于10jim的超細粉占珍珠超細粉總重量的80%以上，烏梢蛇超細粉中顆粒粒徑小于lOjam的超細粉占烏梢蛇超細粉總重量的90%以上；(2)淫羊藿、丹參和女貞子，用水提取后過濾，得到藥渣和濾液；(3)將步驟(2)中的濾液濃縮成清膏，加乙醇靜置后過濾，得醇沉濾液；(4)將步驟(2)中的藥渣用乙醇回流提取，得乙醇回流濾液；(5)將醇沉濾液與乙醇回流濾液合并，減壓濃縮同時回收乙醇，濾液濃縮成稠浸膏，趁熱加入步驟(1)制備的珍珠超細粉與烏梢蛇超細粉，混合均勻，干燥后得干膏粉，粉碎至80目細粉，加硬脂酸鎂混勻，填充入硬膠嚢殼，封口，即得健骨膠嚢。5、如權利要求4所述的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)珍珠、烏梢蛇分別進行超細粉碎，制成珍珠超細粉和烏梢蛇超細粉，其中，珍珠超細粉中顆粒粒徑小于10|am的超細粉占珍^Ml細粉總重量的80%以上，烏梢蛇超細粉中顆粒粒徑小于10pm的超細粉占烏梢蛇超細粉總重量的90%以上；(2)淫羊藿、丹參和女貞子，用原料重量IO倍量的水浸漬1小時，煎煮沸1.5小時后過濾，得到藥渣和濾液；(3)將步驟(2)中的濾液濃縮至20。C相對密度1.10~1.14的清膏，加乙醇使含醇量為70%，靜置24小時過濾，得醇沉濾液；(4)將步驟(2)中的藥渣用原料重量12倍量、體積百分比濃度80%的乙醇加熱回流1.5小時后過濾，得乙醇回流濾液；(5)將醇沉濾液與乙醇回流濾液合并，減壓濃縮同時回收乙醇，濾液濃縮至60。C相對密度1.30-1.38的稠浸膏，趁熱加入步驟(1)制備的珍珠超細粉與烏梢蛇超細粉，混合均勻，80。C真空干燥得干膏粉，粉碎至80目細粉，加硬脂酸鎂混勻，填充入硬膠嚢殼，封口，即得健骨膠嚢。全文摘要本發明公開了一種具有益腎、壯骨、活血、止痛等作用的健骨膠囊，由硬膠囊殼和內容物組成，其內容物由下列重量份的原料藥和藥用輔料制成淫羊藿2～15份、珍珠1～5份、丹參3～12份、烏梢蛇1～9份、女貞子3～12份和藥用輔料0.2～0.5份，主要用于治療原發性骨質疏松癥。本發明還公開了該健骨膠囊的制備方法，操作工藝簡單、安全、成本低。文檔編號A61K35/56GK101380359SQ20081012155公開日2009年3月11日申請日期2008年10月20日優先權日2008年10月20日發明者俞忠明,厲蘭娜,應栩華,蕾戴,朱惠芳,朱有法,李洪玉,陳明顯,高家鑒,黃衛華,黃飛華申請人:浙江省中醫藥研究院