專利名稱：：基于六氫異α酸蛋白激酶調節的癌癥治療的制作方法
技術領域：
：信號轉導提供一個重要的保持正常穩態的總體調控機制，或者若受到擾動，便作為一種與眾多疾病病理和病況相關的誘發或協助機制。在細胞級上，信號轉導是指信號或信號基從細胞外部運動到細胞內部。到達受體目標的信號可激活許多細胞活動需要的配體-受體相互作用，其中一些細胞活動還可作為后續信號。這種相互作用不僅作為一系列級聯，而且作為一種復雜的相互作用網絡或信號事件網絡，該網絡能對穩態過程提供精調控制。但是，此網絡一旦失去控制，會引發細胞活動的改變，并引起反應細胞內基因表達程序的改變。參見圖1，它顯示了對胰島素敏感性和抵抗進行調節的相互作用激酶網絡的簡化圖。004信號轉導受體一般分為三類。第一類受體是滲入質膜并具有某些內在酶活性的受體。這類受體的典型代表包括酪氨酸激酶(例如PDGF、胰島素、EGF和FGF受體)、酪氨酸磷酸酶(例如T細胞和巨噬細胞的CD45[集束行列式-45]蛋白質)、鳥苷酸環化酶(例如鈉尿肽受體)和絲氨酸/蘇氨酸激酶(例如活化素和TGF-P受體)。具有內在酪氨酸激酶活性的受體自身可發生磷酸化作用，還可磷酸化其它底物。SH2域中的蛋白質與RTK或受體相關酪氨酸激酶相互作用會使該蛋白質酪氨酸磷酸化。由此引起的磷酸化會(積極地或消極地)改變活性。SH2中具有內在酶活性的若干蛋白質包括磷脂酶C-y(PLC-力、原癌基因c-Ras相關的GTP酶激活蛋白(rasGAP)、磷脂酰環己六醇_3-激酶(PI-3K)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1C(PTP1C)以及其它蛋白酪氨酸激酶(PTK)Src家族成員。雖然對人類RA的病因和發病機理仍知之甚少，但其發展過程可分為三個階段。在啟始階段，樹突狀細胞對自身反應性T細胞表現出自體抗原性。T細胞通過細胞因子激活自身反應性B細胞，產生自身抗體，反過來又在關節中形成免疫復合物。效應階段，免疫復合物結合巨噬細胞和肥大細胞上的Fcf受體，從而釋放細胞因子、趨化因子、炎癥和疼痛。最后階段，細胞因子和趨化因子激活并募集滑膜細胞、破骨細胞和中性粒細胞，它們可釋放蛋白酶、氨基酸和諸如02-的ROS，從而對軟骨和骨造成不可逆轉的破壞。在膠原誘導的RA動物模型中，需要T細胞和B細胞的參與來誘發該疾病。通過脾酪氨酸激酶(Syk)和磷脂肌醇3激酶(PI3K)，抗原受體觸發后，B細胞激活信號[WardSG，FinanP.將異構體特異性磷脂肌醇3激酶抑制劑作為治療劑；CurrOpinPharaiaco1,8月;3(4):426-34，(2003)]。參與B細胞上的抗原受體后，Syk對三種酪氨酸進行磷酸化作用。Syk是一種72-kDa蛋白質酪氨酸激酶，它在將免疫識別受體耦連到若干下游信號傳導通路中發揮重要作用。此作用的特性就是催化活性以及與含有SH2域的效應蛋白發生相互作用的能力。Tyr-317、Tyr-342和Tyr-346的磷酸化作用為含蛋白質的若干SH2域產生停泊位點。[Hutchcroft,J.E.、Harrison,M.L.與Geahlen，R.L.(1992):72-kDa蛋白質酪氨酸激酶Ptk72與B細胞抗原受體結合。J.Biol.Chem.267:8613-8619，(1992)以及Yamada，T.、Taniguchi，T.、Yang，C.、Yasue，S.、Saito，H.禾卩Yamamura，H.與帶有蛋白質酪氨酸激酶P72(Syk)的B細胞抗原細胞抗原受體結合并通過膜IgM激活，Eur.J.Biochem.213:455459,(1993)]。0018]已證明Syk用來激活響應大量信號的PI3K，其中B細胞抗原受體(BCR)和巨噬細胞或中性粒細胞Fc受體參與此激活。[參見Crowley,M.T.等人JMW.1027-1039，(1997);Raeder,E.M.等人，《//附w"w/.163，6785—6793，(1999):和Jiang,K.等人，祝ooiHOl，236—244，(2003)]。在B細胞中，可以通過接頭蛋白(例如BCAP、CD19或Gabl)的磷化作用激活BCR刺激的6PI3K，該激活產生用于PI3K調節亞基P85的結合位點。由許多IgG受體傳遞的信號需要Syk和PI3K的參與活動，并需要募集它們的集群受體點。在中性粒細胞和單核細胞中，有人建議將PI3K與FcgRIIA上磷酸化的免疫受體酪氨酸活化基序序列直接結合，作為受體的PI3K募集機理。而最近一篇文章報道了Syk和PI3K之間的分子直接相互作用[MoonKD，等「乂，Syk蛋白質酪氨酸激酶和磷脂肌醇3激酶間直接相互作用的分子基礎J.Biol.Chem.280,No.2,IssueofJanuary14，pp.1543-1551,(2005)]。0019大量研究表明COX-2活性抑制劑可減少PGE2的生成，并能有效緩解慢性關節炎(例如RA)患者的疼痛。既然COX-1和COX-2參與組織(胃腸和心血管系統)的重要修復工作，COX抑制酶活性制劑的副作用就更令人擔憂。所以，必須設計一個安全的、長期的治療方法以緩解患者的疼痛。既然通過Syk、PI3K、p38、ERK1/2禾QNF-kB依賴性通路，COX-2禾QiNOS合成信號誘導劑，那么這些通路抑制劑會對自身免疫疾病尤其對RA患者關節發炎和變形病癥產生療效。0020]在RAW264.7老鼠巨噬細胞炎癥模型內抑制PGE2生成的篩選過程中，發現酒花衍生物p異a酸(RIAA)。在本發明中，我們對RIAA能否直接抑制COX酶活性和/或它能否抑制COX-2和iNOS的誘導作用進行研究。我們發現RIAA并不直接抑制COX酶活性，而是抑制NF-kB驅動的酶誘導，這引導我們對RIAA是否是一種激酶抑制劑進行研究。我們發現RIAA同時抑制Syk和PI3K，這使我們可測定針對各種自身免疫性疾病患者進行的試點研究的療效。目前正在研究的與疾病癥狀相關的其它激酶包括Aurora、FGFB、MSK、RSE和SYK。。越來越多的證據證實GSK-3在調節骨骼肌葡萄糖轉運活動中存在副作用。例如，使用選擇性GSK-3抑制劑，針對抗胰島素的嚙齒類動物進行的急性治療，可提高全身胰島素敏感度，并可增強作用在肌肉葡萄糖轉運上的胰島素效應。使用特定GSK-3抑制劑，針對抗胰島素、前期糖尿病肥胖的Zucker大鼠進行的慢性治療，可提高口服耐藥量和全身胰島素敏感度，改善血脂異常并增強骨骼肌中IRS-1依賴性胰島素信號傳導。這些結果有力地證明在肌肉中選擇性使用GSK-3可對肥胖相關的胰島素抵抗進行有效干預治療。Syk為一種非受體酪氨酸激酶，它和參與來自B細胞受體以及IgE受體信號傳導的ZAP-70有關。Syk在這些受體內與ITAM基序結合，并通過Ras、PI3激酶和PLCg信號傳導通路啟動信號傳導。Syk在胞內信號傳導中發揮重要作用，因而它是炎癥性疾病和呼吸障礙研究的重要靶點。圖1描繪了調節胰島素敏感度和胰島素抵抗的部分激酶網絡。0035圖2描繪了MgRIAA(mgRho)對五種選擇性激酶的抑制作用。00361圖3描繪了五種酒花組分和一種金^Jt^y^羅提取物對PI3K亞型的抑制作用。0037]圖4描繪了RIAA(圖表A)禾卩IAA(圖表B)劑量相關的生物合成PGE2的抑制作用，其中白色柱表示在加入COX-2表達的LPS刺激，灰色柱表示加入測試材料之前隔夜的LPS刺激。圖5描繪了塞來昔布(圖A)和MgRIAA(圖B)對RAW264.7細胞中分析得到的LPS誘導的COX-2介導的PGE2生成的直接酶抑制作用。PGE2的測量單位用pg/ml表示。誤差帶表示標準偏差(n=8)。圖10給出了評估金會^t富樣品#4909提取物對生長中和成熟脂肪細胞的脂肪性效應的測定流程。使用3T3-L1小鼠成纖維細胞模型來研究測試化合物對脂肪細胞脂肪生成的潛在影響。0044圖11示意性描繪了相對于溶劑對照，利用會^^t霉樣品#4909提取物或作為陽性對照的吲哚美辛和曲格列酮處理3T3-L1脂肪細胞的非極性脂肪含量。誤差帶表示95%的置信區間(單尾)。0045圖12示意性給出了金合^t脣樣品糾909水提取物的二甲基亞砜可溶部分對抗胰島素3T3-L1脂肪細胞的脂聯素分泌物評估效應的測試流程。圖17用圖表描述了通過各種會合Jt^乂L茶提取物誘發的脂聯素分泌相對最大值。圖中給出的數值是相對于溶劑對照的百分比；誤差帶表示95%的置信區間。圖20描述了p異a酸、異a酸、四氫異a酸、六氫異a酸、黃腐酚、酒花殘留物、六氫(3酸和陽性對照曲格列酮的Hofstee圖。利用Y截距方法估算相對溶劑對照的脂聯素分泌最大值，而利用斜率的負值計算脂聯素分泌半最大值處測試材料所需的濃度。00541圖21給出兩個條形圖，分別表示通過異a酸和p異a酸(圖A)以及六氫異a酸和四氫異a酸(圖B)誘發TNFa處理過的成熟3T3-L1細胞的相對脂聯素分泌情況。圖中給出的數值是相對于溶劑對照的百分比；誤差帶表示95%的置信區間。*與僅用TNFa處理的結果有著顯著性差異(p<0.05)。圖26圖示了不同濃度的THIAA或還原異a酸(RIAA)對SW480細胞系細胞增值的作用。計算空腹胰島素和血糖的HOMA分數。圖39給出THIAA或塞來昔布姜黃素(1:3)對(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480結腸癌細胞的抑制百分比。0073圖40給出朋IAA和塞來昔布姜黃素(1:3)對(A)HT-29、(B)Caco-2或(C)SW480結腸癌細胞的抑制百分比。。所以，這顯示Aktl在確定尺寸大小方面發揮重要作用，而Akt2參與胰島素信號傳導。激酶數據和我們自己的結果結合，其中我們發現酒花化合物可抑制cPLA2蛋白表達(免疫印跡法，數據未給出)而非mRNA,這表明酒花化合物作用的抗炎模式可能是通過降低cPLA2蛋白質水平，或許是更具體地通過抑制TOPmRNA翻譯的活性來抑制PI3K通路，從而降低底物對COX2的可用性。半數抑制濃度可隨意分成以下四類(1)IC5。值在0.1-0.3嗎/ral范圍內的試劑具有最強抗炎反應；(2)IC5。值在0.7-1.0(ig/ml的試劑具有高度抗炎反應；(3)IC5(,值在2-7pg/ml的試劑具有中度抗炎反應；(4)IC5。值大于12^g/ml(所測最大濃度)的試劑具有低抗炎反應。00161]—阿司匹林和塞來昔布的陽性對照證明了它們在此模型體系中各自的環氧合酶選擇性(表9)。阿司匹林對C0X-1的選擇性接近1000倍，而塞來昔布對C0X-2的選擇性也達114倍。所有酒花原料都具有C0X-2選擇性，其中P-異a酸和異a酸已證實對C0X-2具有最高選擇性，分別為363倍和138倍。在低的半數抑制濃度下具有如此高的C0X-2選擇性，這在其它資源獲得的天然產物的有關報道中還從未出現過。在剩余的酒花衍生物中，只有香型酒花精油呈現出微弱的C0X-2選擇性，僅為3倍。為了推測臨床療效的#^/數據，通常假設當C0X-2的選擇性達到5倍或以上時，就表明具有顯著保護胃粘膜層的臨床應用潛力。基于這種標準，P酸，C02酒花提取物，酒花殘留C02/乙醇，四氫化異a酸和六氫化異a酸都顯示出在臨床上潛在的C0X-2相關選擇性。表9酒花餾分及其衍生物在RAff264.7細胞中對C0X-2和C0X-1的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>e酸0.542954co2酒花提取物0.226.329a酸0.266,224酒花殘留C(V乙醇0.882124四氫化異a酸0.204.020六氫化異a酸0.293.010香型酒花精油1.64.13.0陽性對照阿司匹林1.160.00090.0008塞來昔布0.0050.57114實施例5由受LPS刺激的RAW264.7細胞中還原異構a酸或異構化a酸所導致的PGE2直接抑制不足測試材料一本實驗使用表12中所示的酒花衍生物還原異構a酸和異構化a酸。阿司匹林，從Sig脇(St.Louis.MO)公司購得，其將作為COX-l選擇性的陽性對照。—使用CalSyn(BI0S0FT,Ferguson,M0)軟件包，根據0.10、1.0、10和10(Hig/ml四種濃度測得的相關數據，得出劑量反應曲線并計算置信區間為95%時的半數抑制濃度(IC50s)。001681結果一受LPS刺激的RAW264.7細胞中PGE2的產量與未受刺激的細胞相比，比值為1.4-2.1倍。阿司匹林陽性對照計算出的8.7叫/ml的半數抑制濃度(95%置信區間=3.9-19)與已報道的C0X-2直接抑制值1.4到50Hg/ml[Warner,T.D.等乂[非甾體類藥物對環氧化酶-1而非環氧化酶-2的選擇性與人胃腸毒性有關爾W全面分析尸roc.Afef人//cW.〃5X96:7563-7568，(1999)]以及該實驗室關于A549細胞系歷史數據3.2pg/ml(95%置信區間=0.55-0.19)相一致。進行，未作任何修改，該流程也稱WHMA-C0X-2方案。簡而言之，在植入A549細胞24小時后，加入白細胞介素-lIJ(10ng/ml)以誘導C0X-2的表達。24小時后，用不含血清的RPMI1640培養液出沖洗細胞。隨后，將溶于二甲亞砜和不含血清的RPMI中的測試材料加入孔中以獲得25、5.0、0.5和0.05pg/ml的最終濃度。每個濃度重復兩次。向對照孔中加入與測試孔中液體等體積的二甲亞砜。60分鐘后，將A23187(50^M)加入孔中以釋放花生四烯酸。30分鐘后從孔中取出25^培養基進行PGE2測定。53,智^i,^^/7必潘一將人氣管上皮細胞系A549細胞系(美國組織細胞培養收集中心，Bethesda,MD)按實施例6所述進行培養和處理。將螨塵過敏原加入到培養基中并達到1000ng/ml的最終濃度。18小時后，對培養基取樣并進行PGE2測定。—待測化合物在二甲亞砜(DMSO)中配制，并在-20°C溫度下貯存。MgRIAA購自Metagenics公司(圣克萊門特，美國加州)。小白菊內酯購自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美國密蘇里州)。PI3K抑制劑渥曼青霉素和LY294002購自EMDBiosciences公司(圣地亞哥，美國加州)。對應COX-2和iNOS的抗體購自CaymanChemical公司(安娜堡，美國密西根州)。對應GAPDH的抗體購自NovusBiological公司(利特爾頓，美國科羅拉多州)。與辣根過氧化物酶發生結合的二級抗體購自AmershamBiosciences公司(皮斯卡塔韋，美國新澤西州)。通過MgRIAA對RAW264.7細胞的核提取物進行處理，再用LPS刺激4小時后分析NF-kB對DNA的結合情況。。簡單來講，先將細胞用冷PBS液潤洗兩次，然后加入緩沖液A(10mMHEPES,pH7.0;1.5mMMgCl2;10mMKC1;0.1%NP-40;抑肽酶5嗎/ml;胃酶抑素A1嗎/ml;亮肽酶素5pg/ml;氟化磺酰甲苯1mM)并逬行15分鐘的冰浴。然后將細胞刮入一個干凈的試管中，并循環冷凍與解凍三次。在4°C下10000xg加速度下離心5min所得上清液層即為細胞質的組分。將剩余物重新懸浮在緩沖液C(20mM服PES，pH7.0;1.5mMKC1;420mMKC1;25%甘油；0.2MEDTA;抑肽酶5嗎/ml;胃酶抑素Alpg/ml;亮肽酶素5)ag/nil;氟化磺酰甲苯ImM)中，并進行15分鐘的冰浴。在4°C下10000xg加速度下離心5min后收集上層核提取物組分。細胞核提取物的NF-kBDNA結合分析使用ActiveMotif公司(卡爾斯巴德，美國加州)的TransAMNF-kB試劑盒并按照生產商的使用說明來完成。如圖8所示，TransAM測試盒檢測96孔細胞板上結合到共有序列上的NF-kB的p50亞基。然后測定蛋白質濃度(Bio-Radassay公司)并重復分析10嗎核蛋白提取物。重復進行核提取物(10蛋白質)的分析并將結果以圖9所示的圖形表現出來。LPS(1pg/ml)的刺激會使NF-kB基因結合率增加兩倍。用LY294002(—種PI3激酶抑制劑)進行處理會導致NF-kB結合率降低，這和以往文獻的報道相符。小白菊內酯也能導致NF-kB結合率顯著降低，這點和我們的預期是一致的。使用MgRIAA時也能觀察到NF-kB的結合率大幅降低。以劑量反應的方式也能觀察到這一影響。NF-kB結合力的降低可能導致包括COX-2、iNOS以及TNFa在內的目標基因翻譯活性降低。,人們還能對試劑的胰島素增敏和甘油三酸脂沉降能力進行研究。。噻唑烷二酮類，如曲格列酮和吡格列酮這類藥物，已顯示出在脂肪細胞中能選擇性刺激脂肪生成活性，從而得到更大的脂肪分解胰島素抑制或將脂肪酸釋放到血漿中[Yamauchi,T.,J.Kamon，寧義.雜合過氧化物酶體增殖激活受體y(PPARy)缺乏和PPARy激動劑提高胰島素抵抗性的機制jBiolCh柳276(44):41245-54，(2001);0akes，N.D.，P.G.Thalen,寧乂.噻唑垸二酮類藥物增加血漿-脂肪組織FFA交換容量并增強胰島素介導游離脂肪酸體系控制的有效性。Diabetes50(5):1158-65，(2001)].該行為使其他組織可利用的游離脂肪酸更少[Yang，W.60S.，W.J.Lee，等乂.體重減輕會增加脂源型抗炎性蛋白質、脂聯素的血漿水平。JClinEndocrinolMetab86(8):3815-9，(2001)]。因此，肌肉和肝臟中游離脂肪酸的胰島素減感效應將由于噻唑烷二酮處理的結果而減弱。這些錄^/結果已在臨床上得到證實[Boden，G.不飽和脂肪酸在胰島素抵抗和非胰島素依賴型糖尿病發病機理中的作用。Diabetes46(1):3-10，(1997);Stumvoll,M.與H.U.HaringGlitazones:臨床效果與分子機制,AnnMed34(3):217-24，(2002)]。002031gr^Z/辨一曲格列酮購自Cayman化學制劑公司(安娜堡，美國密歇根州)，甲基異丁基黃嘌呤、地塞米松、茚甲新、油紅0以及胰島素購自Sigma公司(圣路易斯，美國密蘇里州)。測試材料為一種深褐色粉末，購自Bayir化學制劑公司(南十字星路68號，Basavanagudi，印度)，它是從會會^t顰植物樹膠脂第4909號樣品的50:50(體積比)水/酒精的提取物中制得的。提取物中兒茶酚含量標準需不低于20%。本例中所用批號為ACat/2304的提取物經紫外分析兒茶酚含量達20.8%。青霉素、鏈霉素、杜爾貝科改良的伊格爾培養基(DMEM)購自Mediatech(美國弗吉尼亞州赫頓市)公司，而10%FBS-HI(熱滅活胎牛血清)購自MediatechandHyclone(Logan，UT)公司。所有其它標準試劑，除非另行說明，均購自Sigma公司。將AcE部分溶解于二甲亞砜(DMSO)中，在分化0天時加入培養基中使其濃度達到50pg/ml，并在整個成熟期內保持這一濃度(直到第6天或第7天，D6/7)。無論何時加入新鮮培養基，都需要加入新的實驗材料。選擇DMSO是因為它的極性并且它容易與液態細胞培養基混合的特性。分別加入吲哚美辛和曲格列酮作為陽性對照，二者最終濃度分別為5.0pg/ml和4.4pg/ml。用0.36%的油紅0或0.001%氟硼二吡咯對分化后的D6/D73T3-Ll細胞進行染色。使用實驗材料對細胞進行分化和處理的完整流程概述于圖10中。002071浙iZ^染經一D6/D7-分化的3T3-Ll細胞中甘油三酯含量的估算所用到的油紅0染色是根據Ka5t"n'/〃/m/j'游方茲[Kasturi，R.andJoshi，V.C.3T3-Ll細胞脂肪轉化過程中十八酰基輔酶A脫飽和酶活性和脂肪生成的激素調節.JBiolChem，257:12224-12230,1982]。用PBS(磷酸鹽緩沖液，Mediatech)潤洗單層細胞，然后用10%甲醛固定10min。將三份0.6%油紅0/異丙醇原液與兩份水混合得到油紅0工作液，并將已固定的細胞在其中染色1小時，然后水洗一次去除過量的染料。用異丙醇從細胞中提取出染色油滴，并使用光譜光度測量技術在540nm波長下對其進行定量分析(MEL312eBIO-KINETICSREADER,Bio-TekInstruments公司，文奴斯基，美國佛蒙特州)。實驗材料和作為陽性對照的吲哚美辛以及曲格列酮的實驗結果，以540rai下溶劑的相對吸光度表示。濕/試^"棄一曲格列酮購自CaymanChemical(AnnArbor,MI)公司，而甲基異丁基黃嘌呤、地塞米松和胰島素購自Sigma(St.Louis,M0)公司。測試材料為一種黑褐色粉末，以50:50(體積比)水/酒精從金合歡屬樣品#4909的樹膠脂提取而來，該材料購自Bayir化學制劑(No.68,SouthCrossRoad,Basavanagudi，印度)公司。提取物中兒茶酚含量標準需不低于20%。本實施例中所用批號為ACat/2304的提取物經紫外分析兒茶酚含量達20.8%。青霉素、鏈霉素、杜爾貝科改良的伊格爾培養基(MEM)購自Mediatech(美國弗吉尼亞州赫頓市)公司，而10%FBS-HI(熱滅活胎牛血清)購自MediatechandHyclone(Logan,UT)公司。所有其它的標準試劑，除非另有說明，均購自Sigma公司。002151一智應i薌^^/7必潘一小鼠成纖維細胞系3T3-L1培養第6日脂肪細胞開始分化，如實施例10所述。在96孔細胞板中接種3T3-L1細胞，接種密度為lxl04個細胞/cm。經過兩天的生長，細胞實現融合。融合后，加入分化培養基迫使細胞向脂肪細胞分化；培養基組成(1)10%的FBS/DMEM(高糖)；(2)0.5mM甲基異丁基黃嘌呤；(3)0.5M地塞米松；(4)10g/ml的胰島素(MDI培養基)。從第3日到第5日，將培養基換成10%FBS/DMEM中含有10pg/ml胰島素的后分化培養基。。簡而g之，第6日，將細胞在含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)無血清的培養基中培養三個小時，接著利用1胰島素/ml加溶劑或1嗎胰島素/ml加測試材料進行處理。將曲格列酮溶解在二甲基亞砜中以獲得5、2.5、1.25和0.625)ng/ml的濃度。.會合^t霉提取物測試濃度為50、25、12.5和6.25|ng/ml。24小時后，對培養基上清液取樣以進行脂聯素測定。利用測試材料對細胞進行分化和處理的完整流程概述于圖12中。以確定表觀米氏常數和最大速度。利用自變量v/[S]替換{相對脂聯素分泌/[濃度]}，而利用應變量&}替換{相對脂聯素分泌}，生成一個y=rax+b的關系式。利用Y截距方法估算相對溶劑對照的脂聯素分泌最大值，而利用斜率的負值計算測試材料必要的半最大值處的脂聯素分泌濃度。00220茲菜一在抗胰島素3T3-Ll細胞中，利用2.5嗎/ml的濃度，相對溶劑對照2.44倍的最大刺激，作為陽性對照的曲格列酮所有測試濃度增加了脂聯素分泌(圖13)。50和25^g/ml濃度的—會合Jt慮增加了脂聯素分泌，分別為溶劑對照的1.76倍和1.70倍。雖然合^^t慮的兩個濃度均不等于利用曲格列酮測定的脂聯素分泌最大值，但是它們可與濃度為1.25和0.625|ag/ml曲格列酮作用相當。002211源自修正的Hofsteeplots脂聯素分泌最大估算值，表明脂聯素分泌的相對增加與半最大刺激處的濃度存在巨大差異。利用Y截距方法估算的曲格列酮和兒茶對脂聯素分泌最大值分別為溶劑對照的2.29倍和1.88倍。而剌激抗胰島素3T3-Ll細胞中脂聯素分泌的半最大值處曲格列酮和金合歡屬濃度分別為0.085^tg/ml和5.38pg/ml。根據最小的兒茶酚含量20%計算，金合歡屬大約為1.0ng/ml。脂聯素指數卞10ngTNFa/ml±95%CI-1.00±0.10溶劑對照一1.54*吲哚美辛5.01.67*曲格列酮0.6251.51*金^歡虜乂乙,#4909樹皮(甲醇提取物)501.41*—會會歡^fy^羅貼639心材(二甲亞砜提取物)501.26*金伶歡虜yg羅#5659樹皮(甲醇提取物)251.12*^^歡虜乂"芬#5667樹皮(甲醇提取物)50L26*—會^^ti7Zz芬貼668樹皮(樹脂膠)501.30*金會^bfy^羅#5640樹皮(二甲亞砜提取物)501.17*會斧Jt^乂Z茶#5669心材(二甲亞砜提取物)501.脂聯素指數—=[脂聯素][脂聯素]w。m*來自TNFa溶劑反應的顯著增加(p〈0.05)。7000238實驗觀察到不同.會會Jt富樣品或制劑會在這種代謝綜合征的第二模型中引發相似的響應，這進一步證實—會^^t犀植物中存在多種能正向改變脂肪細胞生理機能以增強胰島素作用的化合物。實施例16極性和非極性溶劑從金會^t^乂L茶對能在TNFa/3T3-Ll脂肪細胞模型中增加脂聯素分泌的化合物中進行提取。00239這些實驗中用到的是實施例11中所述的3T3-L1小鼠成纖維細胞模型。實驗所用標準化學藥品如實施例11和13所述。將3T3-L1脂肪細胞用濃度為10ng/ml的TNFa按實施例13所述方法進行處理。如實施例13詳述在第6天時取出培養基上清液并對脂聯素進行分析。一使用5/8"金屬鉆頭在標準功率下對大片」會會^t^乂L芬心材樣品#5669(每片重量在5-10克之間)進行低速鉆孔。然后將刨花收集到研缽中，在液氮冷凍下研磨至細粉狀。然后將粉末通過一個250微米的篩網進行篩分以得到大約10g的自由流動精細粉末。表14用于3T3-L1脂聯素分析的金^^t^7L芬提取物樣品描述<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>1胃液組成為2.90gNaCl、7.0ml濃縮HC1水溶液、3.2g胃蛋白酶(800-2500活性單位/mg)，并加入1000ml水進行稀釋。最終pH為1.2。對于本提取操作，胃液-心材懸浮液要在40°C下保溫一小時，隨后在^^"，^移除胃液。然后將剩余殘留物溶解在甲醇中，通過0.45微米聚四氟乙烯注射式過濾器進行過濾并在真空中濃縮。#^〃一這些實驗中用到的是實施例11中所述的3T3-L1小鼠成纖維細胞模型。實驗所用的標準化學藥品如實施例11和13所述。將3T3-L1脂肪細胞用濃度為10ng/ml的TNFa按實施例13所述方法進行處理。如實施例13詳述在第6天取出培養基上清液并對脂聯素進行分析。002451濕^f/Y/V—.會^^^f乂乙齊樣品#5669根據以下流程進行提取將堿性異丙醇溶液，(含有1.5NNaOH的1%(體積比)異丙醇溶液，)加入到裝有約50mg干燥A^^t^乂L芬心材粉末#5669的50ml試管中。然后將樣品簡單混合處理，超聲降解30分鐘，再離心分離一個小時使剩余固體材料成粒。隨后將上清液用0.45微米濾紙進行過濾。實驗中用到的堿性異丙醇pH為8.0，收集液的pH為7.0。將過濾后的清液部分在^^"5V^進行干燥后得到白色固體。該樣品稱為干燥堿性提取物。T,對照卞卞值>1.11與TNFa對照(p<0.05)存在顯著性差異。實施例18通過金^^t處樣品水提取物的二甲亞砜可溶部分誘導TNFa-處理的3T3-L1脂肪細胞內白細胞介素-6分泌的減少。00248白細胞介素-6(IL-6)是一種多功能的細胞激素，在宿主防御、急性期反應、免疫反應、神經細胞功能、造血作用以及代謝綜合征方面均發揮重要作用。它可被多種正常和變異淋巴細胞及諸如脂肪細胞的非淋巴細胞表達。IL-6的產量可通過諸如細胞分裂激素或抗原刺激、脂多糖、鈣離子載體、細胞激素以及病毒等多種信號進行上調[Hibi,M.，Nakajima,K.,HiranoT.IL-6細胞激素族和信號轉導細胞激素系統模型。JMolMed.74(1):1-12,(Jan1996)]。人們已經在包括細菌和病毒感染、外傷、自身免疫性疾病、惡性腫瘤以及代謝綜合征等若干病理狀態中觀察到這種血清濃度水平的提高[Amer，P.II型糖尿病中的胰島素抵抗——脂肪素的作用。CurrMolMed.;5(3):333-9，(May2005)]。碧^菜一正如前述實施例中所示，TNFa能顯著降低脂聯素分泌，而吲哚美辛和金^^t^7乙芬提取物會在TNFa存在條件下增加脂聯素分泌。盡管吲哚美辛陽性對照和金會Jt^f乂Az芬提取物證明了脂聯素分泌劑量相關增加，但是這兩種材料均無法將脂聯素水平恢復到含TNFa的二甲亞砜對照中所示的濃度(表17)。在TNFa存在條件下，金合^t^乂Z茶提取物顯示出對IL-6分泌的有效劑量相關抑制，而吲哚美辛則顯示無抗炎效應。/[脂聯素]，。對照1tIL-6指數=[IL-6測試-IL-6對照]/[IL-6,-IL-6對照]*這與TNFa對照有顯著差異(p<0.05)。在TNFa/3T3-Ll脂肪細胞模型中，」會會^t^乂乙芬樣品#4909呈現雙重抗炎作用。金會Jt^乂L芬提取物的成分會增加脂聯素分泌而減少IL-6分泌。金合^t^7/;^"的總體效果則會顯示相對于TNFa對照的強效抗炎性。這些結論支持會^Jt^乂乙茶在改變脂肪細胞生理機能以降低胰島素抵抗方面的應用，從而可治療由胰島素抵抗引起的體重增加、肥胖、心血管病以及癌癥。實施例19金洽^t慮水提取物的二甲亞砜可溶成分對抗胰島素3T3-Ll脂肪細胞中脂聯素、IL-6以及抵抗素分泌的影響。/[脂聯素]&卞卞IL-6指數=[IL-6測試]/[IL-6R島素對照」卞卞卞抵抗素指數=[Resistin測試]/[Resistin胰島素對照]*指數值表示平均值±95%置信區間，它是根據方差分析的剩余均方計算而來。大于或小于胰島素對照±95%置信區間的數值與p<0.05時存在顯著差異。實施例20使用源自酒花的植物化學成分增加脂肪細胞中的脂肪生成。002611^"孟y—在這些實驗中，采用實施例11中所述的3T3-L1小鼠成纖維細胞模型。所用的標準化學藥品以及統計程序如實施例ll所述。00262一如表19中所述，測試中所用的酒花植物化學成分購自Betatech酒花產品公司(美國華盛頓特區)。表19酒花測試材料說明。酒花測試材料說明78a酸溶液82%a酸/2.7°/。卩酸/2.95%異構a酸(體積比)。a酸包括律草酮、聚律草酮和類律草酮。p異構a酸(RIAA)p-異律草酮、p-異聚律草酮和p-異類律草酮。異a酸(IAA)以體積比計算，異a酸占25.3%。包括/銜式^7^式異律草酮、/#_^//7i義異聚律草酮以及/,^C//7^_^異類律草酮。四氫異a酸(THIAA)酒花復合物一以體積比計算，THIAA為8.9%。包括/#式四氫異律草酮、/,式四氫異聚律草酮以及/#式四氫異類律草酮。六氫異a酸(HHIAA)以體積比計算，THIAA為3.9%，HHIAA為4.4%HHIAA異構體包括六氫異律草酮、六氫異聚律草酮和六氫異類律草酮。B酸溶液以體積比計算，P酸為10%;a酸含量<2%。B酸包括蛇麻酮、類蛇麻酮、聚蛇麻酮和前蛇麻酮。黃腐酚(XN)以質量比計算，黃腐酚含量>80%。包括黃腐酚、黃腐酚A、黃腐酚B、黃腐酚C、黃腐酚D、黃腐酚E、黃腐酚G、黃腐酚H、脫甲基黃腐酚、黃原酚、4'-0-甲基黃腐酚、3，-香葉基酮-4，5,7-三羥黃垸酮、3',5，-二異戊烯二基酮-4，5，7-三羥黃烷酮、5，-異戊二烯基黃腐酚、醉椒黃烷酮、脫二氫黃腐酚以及異脫氫環化水合物黃腐酚。酒花殘留物黃腐酚A、黃腐酚B、黃腐酚C、黃腐酚D、黃腐酚E、黃腐酚G、黃腐酚H、反式羥基黃腐酚、l"O.2"-二羥基黃腐酚C,脫甲基黃腐酚B、脫甲基黃腐酚J、黃腐酚I、脫甲基黃腐酚、異黃腐酚、脫二氫黃腐酚、二異戊二烯基黃腐酚、5"-羥基黃腐酚、5'-異戊二烯基黃腐酚、6,8-二異戊二烯基柚皮素、8-異戊二烯-4,5，7—三羥黃垸酮、6-異戊二烯柚苷元、異黃腐酚、律草靈酮、副律草靈酮、4-羥基苯甲醛和谷甾醇-3-0-b-吡喃葡萄糖苷。六氫類蛇麻酮1%六氫類蛇麻酮(體積比，溶劑為KOH)。002651黃腐酚、a酸和J3酸和噴哚美辛及曲格列酮的脂肪生成反應相當，而酒花殘留物和六氫類蛇麻酮則不能誘發比溶劑對照更大的脂肪生成反應。替換{相對脂聯素分泌/[濃度]}，而利用應變量{v}替換{相對脂聯素分泌}，生成一個y=mx+b的關系式。利用Y截距方法估算相對溶劑對照的脂聯素分泌最大值，而利用斜率的負值計算測試材料必要的半最大值處的脂聯素分泌濃度。卞.數最高分泌量時測試材料的濃度[Hg/ml]異a酸3.170,49黃腐酚2.470.037P異a酸2.380.10曲格列酮[2]2.290.085酒花殘留物2.212.8六氫異a酸[2]1.890.092六氫類蛇麻酮[2]1.833.2四氫異a酸1.600.11根據四種測試濃度的Hofstee點線性回歸分析估算[2]忽略一個異常數據，使用其它ZI個濃度估計劑量反應800270如表20所示，由修正后的Hofstee的點(圖20)估計最大脂聯素分泌可有效支持上述觀察結果。最高脂聯素分泌的y軸截距估計大致分為三組(1)異a酸，(2)黃腐酚、p異a酸、曲格列酮和酒花殘留物，以及(3)六氫異a酸、六氫類蛇麻酮和四氫異a酸。如表20所示，由修正后的Hofstee的點(圖20)估計最大脂聯素分泌可有效支持上述觀察結果。最高脂聯素分泌的y軸截距估計大致分為三組(1)異a酸，(2)黃腐酚、P異構d酸、曲格列酮和忽布殘留物，以及(3)六氫異a酸、六氫類蛇麻酮和四氫異a酸。刺激抗胰島素的3T3-L1細胞產生半數最大量脂聯素分泌所需測試材料的濃度大約為0.1pg/ml，曲格列酮、P異構a酸、四氫異a酸和六氫異a酸在這點上類似。達到半數最大脂聯素分泌時，異a酸的濃度為0.49pg/ml，接近前面的5倍。黃腐酚顯示對半數最大脂聯素分泌所需的劑量最低，約為0.037pg/ml。達到半數最大脂聯素分泌時所需濃度最高的是酒花殘留物及六氫類蛇麻酮，分別為2.8pg/ml和3.2)ig/ml。刺激抗胰島素的3T3-L1細胞產生半數最大量脂聯素分泌所需測試材料的濃度大約為0.1pg/ml，曲格列酮、p異a酸、四氫異a酸和六氫異a酸在這點上類似。達到半數最大脂聯素分泌時，異a酸的濃度為0.49^g/ml，接近前面的5倍。黃腐酚顯示對半數最大脂聯素分泌所需的劑量最低，約為0.037pg/ml。達到半數最大脂聯素分泌時所需濃度最高的是酒花殘留物及六氫類蛇麻酮，分別為2.8pg/ml和3.2pg/ml。基于它們增強抗胰島素的3T3-L1細胞中脂聯素分泌的能力，本研究發現陽性酒花植物化學成分異a酸、p異a酸、四氫異a酸、六氫異a酸、黃腐酚、酒花殘留物和六氫類蛇麻酮，預計對血漿脂聯素降低的所有臨床病癥具有積極的影響。實施例22酒花植物化學成分通過增強抗胰島素的3T3—L1脂肪細胞中脂聯素的分泌以及抑制對白細胞介素-6的分泌而呈現抗炎活性。翁—菜一在高濃度胰島素存在條件下，曲格列酮和所有測試過的酒花衍生物均能增加脂聯素的分泌(表21)。在此模型中曲格列酮不會減少IL-6的分泌。事實上，曲格列酮和HHCL在兩種濃度下顯示增加IL-6分泌的能力，而THIAA和酒花殘留物在最高濃度時可增加IL-6的分泌，在其它濃度下則不起作用。其它酒花衍生物對IL-6分泌的影響通常為雙相的。在測試的最高濃度，除IAA夕卜，RIAA、HHIAA和XN均可增加IL-6的分泌。而RIAA、IAA、THIAA和XN會顯著降低IL-6的分泌。表21酒花化合物對抗胰島素3T3-L1脂肪細胞中脂聯素和白細胞介素-6分泌的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>將^^^(^fyZf測試材料或吲哚美辛同濃度為166nM的胰島素一并加入到D53T3-Ll脂肪細胞中。隔日，對培養基上清液取樣進行脂聯素、IL-6以及抵抗素測定。所有值都對胰島素單一對照取指數。卞脂聯素指數=[脂聯素]/[脂聯素]皿卞卞IL-6指數=[IL-6測試〗/[IL-6胰島桑對照]*指數值是平均值±95%置信區間，它是根據方差分析的剩余均方計算而來。對脂聯素或脂聯素/IL-6來說，數值<0.7或>1.3與胰島素對照有顯著差異；而對IL-6來說，數值<0.77或〉1.23與胰島素對照有顯著差異。#與胰島素對照pO.05有顯著差異。以上數據說明酒花衍生物RIAA、IAA、HHIA、THIAA、XN、HHCL和酒花殘留物可減弱脂肪細胞中由高胰島素血癥引起的促炎效應。總的來說，酒花衍生物在單純由TNFa造成的高胰島素血癥條件下的抗炎效應要高于曲格列酮的抗炎效應。實施例23酒花植物化學成分增加TNFa處理后的3T3-L1脂肪細胞中脂聯素的分泌。00277漠孟〃一在這些實驗中，采用實施例11中所述的3T3-L1小鼠成纖維細胞模型。標準化學藥品和酒花化合物IAA、RIAA、HHIAA和THIAA分別如實施例13和20所述。酒花衍生物分別在濃度為0.625、1.25、2.5和5.0嗎/ml時進行測試。脂聯素的分析如實施例12所述。混合在所有劑量下均顯示協同作用，而金合歡屬RIAA[10:1]在10和5.0pg/ml濃度下顯示協同租用，并在其它任何測試濃度下均未發生拮抗。金合歡屬IAA[10:1]混合物在兩個中等濃度下也呈現協同作用，并且未發生拮抗。而金合歡屬IAA[5:1]在濃度為50pg/ml時具有協同作用，在濃度為5.0(ag/ml時發生拮抗。00284類似地，所有混合物在一個或多個測試濃度下對增加脂聯素分泌均顯示協同作用(表23)。金合歡屬IAA[10:1]混合在所有劑量下均顯示協同作用，而金合歡屬RIAA[5:1]和金合歡屬RIAA[10:1]在三種劑量下顯示協同作用，而在一種濃度下發生拮抗。金合歡屬IAA[5:1]混合在濃度為1.0pg/ml時具有協同作用，在濃度高于10pg/ml時發生拮抗。表22抗胰島素3T3-1模型中^^歡厲乂Z茶和酒花衍生物誘發的脂肪生成反應的觀測值和預期值。<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>卞脂肪生成指數呵OD]測a/[OD〗鵬對照。1)95%置信區間上限是1.03，最小顯著性差值=0.03。2)95%置信區間上限是1.03，最小顯著性差異=0.03。3)95%置信區間上限是1.07，最小顯著性差值=0.07。4)95%置信區間上限是1.02，最小顯著性差值=0.02。表23TNFa/3T3-1模型中i會歡^7Z茶和酒花衍生物誘發的脂聯素分泌觀測值和預期值。<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>卞脂聯素指數=[脂聯素]自/[脂聯素]TB對照1)95%置信區間上限是1.07，最小顯著性差值=0.07。2)95%置信區間上限是1.03,最小顯著性差異=0.03。漠產〃一在這些試驗中，采用實施例11和13中所述的3T3-L1小鼠脂肪細胞模型。/[IL-6LPS-IL-6對照]*這與LPS對照有顯著差異(p<0.05)。表25酒花衍生物和選用的非甾體抗炎藥物對LPS/3T3-L1脂肪細胞中脂聯素分泌的最大刺激。<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>卞脂聯素指數=[脂聯素]獄/[脂聯素]LPS對照*數值大于1.07表示與LPS對照有顯著差異(p<0，05)。NS=與LPS對照無明顯差異。實施例26在TNFot/3T3-1模型中i合^t^/乙茶或酒花衍生物與姜黃素或黃腐酚混合時的協同效應。淑/[脂聯素]T,對照1)95%置信區間從0.961到1.049，最小顯著性差異=0.049。實施例27共軛亞油酸與酒花衍生物。異a酸混合在抗胰島素3T3-L1脂肪細胞模型中對脂肪生成的體外協同作用。1501.261.15協同作用101.161.06協同作用5.01.161.10協同作用1.01.171.06協同作用卞脂肪生成指數=[OD]測試/[OD]腦。對照。1)95%置信區間上限是1.05，最小顯著性差異=0.05。實施例28酒花植物化學成分抑制TNFcc-處理后的3T3-L1脂肪細胞中NF-kB的活性。碧菜一經TPA處理的Jurkat核提取物顯示出預期的NF_kBp65增加，這表明試劑盒中試劑的性能能夠滿足需要(圖22)。用濃度為10ng/ml的TNFa分別對D403T3-L1脂肪細胞處理3小時(圖22A)或24小時(圖22B)，核NF-kBp65會增加2.1和2.2倍。正如預期，TNFa處理3小時或24小時后PPARy激動劑吡格列酮均未抑制核NF-kBp65的產量。TNFa處理3小時后，濃度為5.0和2.5pg/ml的RIAA對NF-kBp65核轉位的抑制百分比分別為9.4%和25%。24小時后，只有經過5.0pg/mlRIAA處理的樣品顯示出NF-kBp65的核轉位受到明顯的抑制(p<0.05)。TNFa處理后的3小時，5.0叫/ml和2.5pg/ml的黃腐酚對NF-kBp65核轉位的抑制分別為15.6%和6.9%,而24小時后分別為13.4%和8.0%。根據3T3-L1細胞中所顯示的脂肪生成潛力，二甲雙胍和金合^^f乂L芬提取物的1:1混合物有望在臨床應用中呈現協同作用。這種混合物將用來增加二甲雙胍療法的正向效果范圍，例如可降低血漿中甘油三酯含量或延長二甲雙胍藥物作用期。實施例30酒花衍生物和噻唑烷二酮類藥物對抗胰島素3T3-L1脂肪細胞模型中脂肪生成的沐《協同作用。003121^^孟〃一在這些實驗中，采用實施例11和13所述的3T3-L1小鼠成纖維細胞模型。00313^f/試眾^懲^必潘一實驗中用到的標準化學藥品如實施例11所述。為計算脂肪生成指數，3T3-L1脂肪細胞須在發生分化前按實施例ll中所述進行處理。曲格列酮購自Cayman化學制劑公司(美國伊利諾斯州芝加哥市)。吡格列酮為商品片劑(ACT0SE,Takeda制藥公司，美國伊利諾斯州林肯郡)。將片劑粉碎，所得全部藥粉均用于分析。根據活性成分含量計算所有結果。所用酒花衍生物p異ot酸和異a酸如實施例20所述。與RIAA和IAA混合的曲格列酮在4.0pg/ml濃度下進行測試，而效力更強的吡格列酮與RIAA和IAA以1:1混合后于2.5ng/ml濃度下進行測試。為計算實施例34中所述的脂肪生成指數，所有材料還在4.0pg/ml和2.5pg/ml兩個濃度下分別進行測試。00314一當在4.0pg/ml和2.5pg/ml兩個濃度下分別對曲格列酮和吡格列酮進行測試時，p異a酸和異a酸均能與抗胰島素3T3-L1脂肪細胞模型中的噻唑烷二酮類藥物協同促進甘油三酯的合成(表28)。00315酒花衍生物p異a酸和異a酸可協同增加噻唑垸二酮類藥物的胰島素增敏效應，這將帶來劑量減少或良性反應的病人數量增加等一系列潛在臨床優勢。表2897酒花衍生物和噻唑烷二酮類藥物在抗胰島素3T3-L1脂肪細胞模型中的錄，/協同作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>卞脂肪生成指數=[OD]淑/[OD]DMS。對照。1)95%置信區間上限是1.02，最小顯著性差異=0.02。2)95%置信區間上限是1.05，最小顯著性差異=0.05。實施例31P-異a酸和二甲雙胍在TNFa/3T3-Ll脂肪細胞中的錤^/協同作用/[IL-6TNF。-IL-6對照]*數值小于0.93顯著(pO.05)低于TNFa對照。實施例32測試化合物對癌癥細胞錄》/增殖的影響混合物、XN:Acacia[1:10]混合物、Acacia:RIAA[5:1]混合物、黃腐酚、Acacia:IAA[5:1]混合物、異a酸和p-異a酸均可降低非空腹血糖，而對胰島素無效果。Acacia:RIAA[10:1]混合物和Acacia:IAA[10:1]混合物對血糖和胰島素均無效果(表30)。漠—:^一本實驗使用C57BLKS/Jm+/m+L印rdb(db/db)雄鼠對測試材料降低空腹血糖或胰島素濃度的能力進行分析。這一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受體而對瘦素產生抗性。血漿胰島素從第10天到第14天這段時間開始升高，血糖從4到8周開始升高。在測試時(9周)動物體重顯著增加50±5g，并呈現胰島肥大的跡象。003301一陽性對照二甲雙胍和羅格列酮連續三天每天分別按300mg/kg和1.0mg/kg的劑量給藥。金^^t^y^羅樣品#5659、酒花衍生物和它們的混合物如前文所述進行給藥。碧—菜一相對于對照組，陽性對照二甲雙胍和羅格列酮均可降低血糖和胰島素濃度(表31)。僅RIAA和XN單獨作為測試材料時顯示出可接受的結果。RIAA降低血清胰島素，而XN降低血糖，對胰島素并無效果。在己測試的降低血清胰島素含量的試劑中，金合歡屬RIAA[5:1]混合物最有效，使血清胰島素水平降低21%，而二甲雙胍只能使胰島素濃度降低17%，噻唑垸二酮類羅格列酮使其降低15%。金合歡屬RIAA[5:1]混合物的反應要高于兩者中的單獨成分，從而可顯示協同作用。單獨使用會^^t^yg羅不能減少血清葡萄糖或血清胰島素，而RIAA減少血清胰島素的程度與二甲雙胍相近。在剩余測試材料中，金合歡屬IAA[10:1]混合物還可有效降低血清胰島素濃度。00333在db/db鼠2型糖尿病模型中，由p-異a酸造成的血清胰島素含量快速下降以及由黃腐酚造成的血糖含量下降，表明它們在治療與胰島素不敏感癥和高血糖癥有關的人類疾病方面具有潛在的臨床療效。此外，p-異a酸和金合歡屬兒茶的5:1混合物在db/db鼠糖尿病模型中呈現協同效應。p-異a酸、黃腐酚和金合歡屬RIAA[5:1]成分對2個獨立的糖尿病動物模型和3個錄^/模型的陽性反應表明它們可用于降低血糖或提高胰島素敏感性的臨床表現中。表31金會Jt^^,和酒花衍生物對db/db糖尿病鼠體內非空腹血糖和胰島素的效應。103測試材料劑量mg/kg-每天]葡萄糖[預治療百分比％]胰島素[預治療百分比％]<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>卞對每組中的5個動物連續3天每天施加1次劑量。#顯著低于各自的對照(p<0.05)。實施例35在糖尿病db/db鼠模型中會會^t^yg羅和酒花衍生物比值的沐力優化003341#"星^一使用C57BLKS/Jm+/m+L印rdb(db/db)雄鼠對測試材料降低空腹血糖或胰島素濃度的能力進行分析。這一品系小鼠由于缺乏起作用的瘦素受體而對瘦素產生抗性。血漿胰島素從第10天到第14天這段時間開始升高，血糖從4到8周開始升高。在測試時(9周)動物體重顯著增加50±5g，并呈現胰島肥大的跡象。的角鯊烯混合物。第21天重復進行加強注射。第22-27天檢查小鼠關節炎體征，從研究中移除那些無反應的小鼠。從第28天開始每天對小鼠用測試化合物以強詞法進行治療，直到第42天結束，共持續14天。本實施例中所用化合物105RIAA(MgRho)劑量分別為10mg/kg(低)、50mg/kg(中)、或250mg/kg(高)；THIAA劑量分別為10mg/kg(低)、50mg/kg(中)、或250mg/kg(高)；塞來昔布劑量為20mg/kg以及脫氫皮質(甾)醇劑量為10mg/kg。003421使用以下所述的關節炎指數對每只腳爪的關節炎癥狀進行評估(分為0-4)。根據此關節炎指數，0=無可見跡象；1=水腫和/或紅斑單趾；2=水腫和/或紅斑雙關節；3=水腫和/或紅斑超過兩個關節；以及4=整個腳爪和腳趾出現嚴重關節炎并伴隨有關節強直和關節畸形。邀恭^^t^/——在實驗最后，對小鼠實施安樂死，并截取其一肢保存于福爾馬林緩沖液中。在取得關節炎指數分析的滿意結果之后，從每個治療組中隨機選取兩個動物通過服E染色進行組織學分析。軟組織、關節和骨骼的變化以四分制進行評定，得分4表明嚴重損傷。圖31顯示關節組織損傷的組織學檢測結果，并顯示在THIAA處理的個體治療中沒有或極小存在關節損傷的跡象。這里有明確劑量反應標識并且在250mg/kg禾n50mg/kg下的組織學得分分別降低了40%和28%。這與關節組織只有106輕微損傷的塞來昔布治療組相差無幾。需注意塞來西布(20mg/kg)治療組的組織學得分實際上增加33%。動物個體間存在顯著差異，例如一個經賦形劑處理的動物顯示中度關節損傷跡象，而其他動物明顯未受任何損傷。除了脫氫皮質(甾)醇治療組的一個動物外，其他所有治療組均呈現關節膜炎癥狀。(3片/天)N3535性別男性11(31%)12(34%)女性24(69%)23(66%)平均值標準差平均值標準差年齡(年)46.013.247.913.4體重(磅)220.635.2219.531.6體質指數(kg/m2)35.04.035.44.0收縮壓(mm)131.015.1129.713.9舒張壓(ram)83.78.582.67.8腰圍(英尺)42.94.942.94.5臀圍(英尺)47.14.047.63.2空腹胰島素含量(incIU/mL)13.25.217.512.1餐后兩小時胰島素含量(mcIU/mL)肌252.199.3*59.2*空腹血糖含量(mg/dL)96.59.099.010.3餐后兩小時血糖含量(mg/dL)109.230.5128.436.9空腹甘油三酯含量(mg/dL)231.2132.2255.5122.5*若實驗主體胰島素值、體質指數、基礎代謝指數、血壓值、甘油三酯和高密度脂蛋白值異常，則在分析時將其排除。108組之間的差異在第8周(p<0.05)時顯著。使用已發表的方法[(胰島素(mcIU/mL盧血糖(mg/dL))/405]計算空腹胰島素和血糖的HOMA得分。c=X/[T]x+Y/[T]y，式中T=毒性，其代表生長受抑制或被殺死的細胞所占分數，X、Y是測試混合物每種成分的相對分數，且X+Y=l。圖示觀察值是在95%置信區間內所得8個觀察值的平均數。當估計的百分數下降落于相應觀察分數的95%置信區間之下時，就表示具有協同作用。現在本發明已充分描述完畢，顯而易見本領域的技術人員在不背離隨附權利要求的精神和范圍內均可對本發明做出變更和修改。權利要求1.用以治療哺乳動物中對其所需蛋白激酶調節敏感的癌癥方法，其中所述方法包括使用有效治療劑量的六氫異α酸給哺乳動物用藥。2.權利要求1的方法中，六氫異a酸從以下組群中進行選擇六氫異律草酮、六氫異類律草酮和六氫聚律草酮。3.權利要求1的方法中，進行調節的蛋白激酶選自以下組群中Abl(T3151)、Aurora-A、Bmx、CDK9/cyclinTl、CK1y1、CK1y2、CK1y3、cSRC、DAPK1、DAPK2、EphBl、ErbB4、Fer、FGFR2、GSK3J3、GSK3a、HIPK3、IGF-1R、MAPKAP-K2、MSK2、PAK3、PAK5、PI3K、Pim-l、PKA(b)、PKBJ3、PKBy、PRAK、Rsk2、Syk、Tie2、TrkA、TrkB、以及ZIPK。4.權利要求1的方法中，對激酶調節敏感的癌癥選自以下組群中膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌和子宮癌。5.哺乳動物中對其所需蛋白激酶調節敏感的癌癥治療混合物，其中混合物包括有效治療劑量的六氫異a酸，這里有效治療的劑量調節與癌癥相關的蛋白激酶。6.權利要求5的混合物中，六氫異a酸從以下組群中進行選擇六氫異律草酮、六氫異類律草酮和六氫聚律草酮。7.權利要求5的混合物中，還包括藥用可接受的輔料，其可從以下組群中選擇涂料、等滲和吸收延緩劑劑、粘結劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、著色齊U、調味劑、甜味劑、吸收劑、去污劑以及乳化劑。8.權利要求5的混合物中，該混合物還包括選自以下組群的一種或多種成分抗氧化劑、維生素、礦物質、蛋白質、脂肪以及碳水化合物。全文摘要本發明公開了用于癌癥治療的蛋白激酶調節的化合物和方法。本發明公開的化合物和方法基于酒花中常見的六氫異α酸。文檔編號A61K31/122GK101505743SQ200780030611公開日2009年8月12日申請日期2007年6月20日優先權日2006年6月20日發明者杰弗里·布蘭德,琳達·帕西奧雷蒂,約翰·G·巴比士,維拉·康達,艾米·杰尼·霍爾,艾紐·德賽,馬修·L·特里普申請人:麥特普羅泰歐米克斯有限公司