專利名稱：灰氈毛忍冬次皂苷乙的制備方法及其治療肝癌、乳腺癌、子宮頸癌的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體為灰氈毛忍冬次皂苷乙的制備方法，及其在醫藥領域中的用途，尤其是在制備預防和治療肝癌、乳腺癌、子宮頸癌藥物方面的應用。
背景技術：
腫瘤是一大類嚴重威脅人民生命和健康的多發病及常見病，全世界每年有700萬人發生腫瘤，500萬人被腫瘤奪去生命，現有腫瘤患者在1000萬人以上。在我國腫瘤越來越成為嚴重的健康衛生問題，解放初期，腫瘤僅占人口死因的第九位或第十位，到70年代，已上升到第三位，目前估計，全國每年腫瘤發病人數約160萬，全國每年死于腫瘤病的人數已達130萬人，并且仍有上升趨勢，其正在超過心血管疾病而成為人口死亡的第一原因。因此，世界各國都高度重視腫瘤的防治研究。當今，手術治療、放射治療、化學藥物治療仍然是最常用最重要的腫瘤治療手段。但是化學藥物治療存在著很大的缺點，這主要是現有的抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的選擇性抑制不強、全身用藥毒性較大、且大部分具有免疫抑制作用，這在一定程度上限制了它的使用。隨著青蒿素、紫杉醇等一系列具有良好活性天然產物的發現和成功應用，世界各國越來越將目光轉向在天然植物中尋找新的藥物來源。通過多年的努力亦成功發現了一些抗癌活性成分，為進一步開發高效低毒的抗腫瘤藥物奠定了基礎。但目前發現的天然抗癌活性成分，均因在植物體中為微量成分，故成藥價格高，難以普及應用，如何開發高效價廉的抗腫瘤藥物仍是一項極為緊迫而重要的全球性課題。
灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.為忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬植物，2005版中華人民共和國藥典收載，列入山銀花項下。忍冬屬植物含有大量的皂苷，主要為常春藤型和齊墩果酸型皂苷。現代藥理研究證明，常春藤型皂苷皂苷具有保肝、抗癌活性。從其中分離得到的灰氈毛忍冬次皂苷含量較大，藥理作用明確，具有極好的開發利用前景。

發明內容
本發明者致力于從天然產物中尋找更安全更有效的天然腫瘤抑制劑，經過活性篩選，初步選定灰氈毛忍冬總皂苷活性提取物部位，申報了發明專利，后在此基礎上，進一步篩選其中抗癌活性最高的化合物，發現灰氈毛忍冬次皂苷乙抗腫瘤活性最高，從而完成了本發明。本發明的目的是要提供具有抑制腫瘤功能的灰氈毛忍冬次皂苷的制備方法，為研制開發抗腫瘤新藥提供新的天然活性物質來源。
本發明所采用的技術方案如下
本發明涉及一種灰氈毛忍冬次皂苷乙的制備方法及其治療肝癌、乳腺癌、子宮頸癌的應用a.總皂苷制備灰氈毛忍冬花及花蕾，用濃度為40％-90％的乙醇提取3次，合并提取液，用0.1-5％的藥用活性碳脫色，過濾，回收乙醇后，將藥液拌樣或直接上大孔樹脂柱(HP20、D101、AB-8、HPD100、HPD300)或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗滌柱，再用30％-90％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇至濃浸膏，得總皂苷；b.總皂苷降解總皂苷濃浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，在50-100℃下降解2-4小時，加1-10％鹽酸或硫酸調節PH值到7，放冷后濾取不溶物，用60-95％乙醇或甲醇溶解后加0.1-5％的藥用活性碳脫色，過濾，減壓回收溶劑，放置，析晶，過濾，干燥，即得灰氈毛忍冬次皂苷乙。
c..以a和b制備方法所得到的灰氈毛忍冬次皂苷乙，可在制備預防與治療肝癌、乳腺癌、子宮頸癌藥物中應用。
本發明所述的灰氈毛忍冬次皂苷乙，經藥理學、藥效學和大量的動物實驗研究證明，具有抗腫瘤作用；在體外實驗中，顯著抑制腫瘤MDA-MB-231、Hela、HepG2、IA-9、MCF-7、U-87-MG、CAKI-1、PC-3、KB、KB-VIN、A-549、SK-OV-3、SK-MEL-2、HCT-15細胞增殖；在體內實驗中，對小鼠肝H22實體瘤、小鼠乳腺癌MA737、U14荷瘤小鼠腫瘤、Lewis肺癌，能抑制腫瘤的生長，增長荷瘤小鼠免疫力及生存期。
本發明灰氈毛忍冬次皂苷乙可以制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑、沖劑、散劑、丸劑、口服液、糖漿劑、混懸劑、噴霧劑和注射劑等。在上述制劑中，有效劑量的本發明提取物可以單獨或與藥學尚可接受的載體賦形劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑等組成混合物。
灰氈毛忍冬次皂苷乙的結構見下式具體實施方式
下面結合具體實施例，對本發明作進一步的說明。實驗用灰氈毛忍冬Loniceramacranthoides Hand.-Mazz.的花及花蕾，2003年6月采集于湖南省隆回縣。
實施例1取灰氈毛忍冬干燥花蕾1公斤，40％乙醇回流提取3次，合并提取液，用0.1％的藥用活性碳脫色，過濾，回收乙醇后，將藥液直接上于大孔樹脂柱，先用水及20％乙醇洗滌柱，再依次用30％、60％、90％乙醇洗脫，減壓回收乙醇，加入1％NaOH溶液，在100℃下降解2小時，加1％鹽酸調節PH值到7，放冷后濾取不溶物，用60％乙醇溶解后加5％的藥用活性碳脫色，過濾，減壓回收溶劑，放置，析晶，過濾，干燥，即得灰氈毛忍冬次皂苷乙。
實施例2灰氈毛忍冬干燥花蕾1公斤，80％乙醇回流提取3次，合并提取液，用3％的藥用活性碳脫色，過濾，回收乙醇后，將藥液直接上于大孔樹脂柱，先用水及20％乙醇洗滌柱，再依次用30％、60％、90％乙醇洗脫，減壓回收乙醇，加入5％NaOH溶液，在80℃下降解3小時，加5％硫酸調節PH值到7，放冷后濾取不溶物，用80％甲醇溶解后加3％的藥用活性碳脫色，過濾，減壓回收溶劑，放置，析晶，過濾，干燥，即得灰氈毛忍冬次皂苷乙。
實施例3灰氈毛忍冬干燥花1公斤，90％乙醇回流提取3次，合并提取液，用5％的藥用活性碳脫色，過濾，回收乙醇后，將藥液直接上于聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗滌柱，再依次用30％、60％、90％乙醇洗脫，減壓回收乙醇，加入10％NaOH溶液，在50℃下降解4小時，加10％鹽酸調節PH值到7，放冷后濾取不溶物，用95％乙醇溶解后加0.1％的藥用活性碳脫色，過濾，減壓回收溶劑，放置，析晶，過濾，干燥，即得灰氈毛忍冬次皂苷乙。
實施例4灰氈毛忍冬次皂苷乙的體內外抗腫瘤活性評價實驗1.體外抗腫瘤實驗1.1目的研究灰氈毛忍冬次皂苷乙對腫瘤細胞抑制作用。
1.2材料四甲基唑氮藍(MTT)；灰氈毛忍冬次皂苷乙。
1.3方法與結果試驗方法為國際通用的MTT法將處于對數生長期的要進行實驗的腫瘤細胞按定量接種于96孔培養板內，培養24小時后加入藥量，細胞在37℃、5％CO2條件下繼續培養48小時后，加入5mg/ml的MTT液20M1，再繼續培養4小時，加入DMSO溶解后迅速用酶標儀在570nm處測定OD值，計算細胞生長抑制率，實驗結果見表1。
生長抑制率(％)＝(1-加藥孔平均A值/空白對照孔平均A值)×100％
表1.1體外細胞毒實驗結果

表1.2體外細胞毒實驗結果

用不同濃度的灰氈毛忍冬次皂苷乙處理各腫瘤細胞，可見癌細胞的生長均受到抑制，且呈濃度和時間依賴性。結果表明，灰氈毛忍冬次皂苷乙對腫瘤細胞有較強的細胞毒作用。
2.體內抗腫瘤實驗2.1灰氈毛忍冬次皂苷乙對小鼠肝癌H22的抑制作用2.1.1目的研究灰氈毛忍冬次皂苷乙對小鼠肝癌H22的抑制作用。
2.1.2材料昆明種雄性小鼠40只，體重(20±2g)；5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業產品；灰氈毛忍冬次皂苷乙臨用前用生理鹽水配成相應濃度。實驗室溫度20±3℃，相對濕度75％。
2.1.3方法與結果無菌條件下剝取傳代10天的肝癌H22癌塊，制成勻漿，用生理鹽水1∶3稀釋，計數調整細胞濃度為2×106L-1，每只0.2ml，接種于小鼠右腋部皮下，24小時后隨機分為5組，即陰性對照組(生理鹽水)、藥物大劑量組、藥物中劑量組、藥物小劑量組及陽性對照組(5-氟尿嘧啶)，每組均灌胃相應濃度藥物或生理鹽水，每天一次，十天后稱重處死，腫瘤塊稱重計算腫瘤生長抑制率，結果見表2。
腫瘤生長抑制率抑制率(％)＝(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％
表2灰氈毛忍冬次皂苷乙對小鼠抑瘤率的影響

灰氈毛忍冬次皂苷乙對H22荷瘤小鼠生存期的影響結果見表3。
表3灰氈毛忍冬次皂苷乙對H22荷瘤小鼠生存期的影響

結果表明樣品組與陰性對照組比較小鼠生存期顯著增長，有非常顯著差異，p＜0.01。
2.2灰氈毛忍冬次皂苷乙對小鼠乳腺癌MA737的抑制作用2.2.1目的研究灰氈毛忍冬次皂苷乙對小鼠乳腺癌MA737的抑制作用。
2.2.2材料昆明種小鼠，體重(20±2g)，雌雄各半；灰氈毛忍冬次皂苷乙臨用前用生理鹽水配成相應濃度。實驗室溫度20±3℃，相對濕度75％。
2.2.3方法與結果按常規方法于無菌條件下每鼠右前肢腋部皮下注入生長7d的含1×107個細胞/ml的細胞懸液0.1ml，然后隨機分為三組。腫瘤移植次日開始灌胃。按文獻報導及預實驗結果確定灌胃的量，陰性對照組灌胃生理鹽水。第9日處死全部小鼠，分離瘤塊，稱量腫瘤塊重量，計算腫瘤生長抑制率，見表2。
腫瘤生長抑制率抑制率(％)＝(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％2.3灰氈毛忍冬次皂苷乙對U14荷瘤小鼠的抑制作用2.3.1目的研究灰氈毛忍冬次皂苷乙對U14荷瘤小鼠的抑制作用。
2.3.2材料昆明種小鼠，體重(20±2g)，雌雄各半；灰氈毛忍冬次皂苷乙臨用前用生理鹽水配成相應濃度。實驗室溫度20±3℃，相對濕度75％。
2.3.3方法與結果按常規方法于無菌條件下每鼠右前肢腋部皮下注入生長7d的含3×106～4×106個細胞/ml的細胞懸液0.2ml，然后隨機分為三組。腫瘤移植次日開始灌胃。按文獻報導及預實驗結果確定灌胃的量，陰性對照組灌胃生理鹽水。第16日處死全部小鼠，分離瘤塊，稱量腫瘤塊重量，計算腫瘤生長抑制率，見表2。
腫瘤生長抑制率抑制率(％)＝(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％2.4灰氈毛忍冬次皂苷乙對小鼠Lewis肺癌的抑制作用2.4.1目的研究灰氈毛忍冬次皂苷乙對小鼠Lewis肺癌的抑制作用。
2.4.2材料昆明種雄性小鼠32只，體重(20±2g)；灰氈毛忍冬次皂苷乙臨用前用生理鹽水配成相應濃度。實驗室溫度20±3℃，相對濕度75％。
2.4.3方法與結果無菌條件下剝取傳代10天的Lewis肺癌癌塊，制成勻漿，用生理鹽水1∶3稀釋，計數調整細胞濃度為1×107ml-1，每只0.2ml，接種于小鼠右腋部皮下，24小時后隨機分為5組，即陰性對照組(生理鹽水)、藥物大劑量組、藥物中劑量組及藥物小劑量組，每組均灌胃相應濃度藥物或生理鹽水，每天一次，十天后稱重處死。稱量腫瘤塊重量，計算腫瘤生長抑制率，見表2。
腫瘤生長抑制率抑制率(％)＝(1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％結果表明灰氈毛忍冬次皂苷乙能顯著抑制小鼠肝H22實體瘤、小鼠乳腺癌MA737、U14荷瘤小鼠腫瘤，具有抗癌活性。
實施例5膠囊劑的制備取灰氈毛忍冬次皂苷乙，加藥用輔料淀粉適量，充分混勻后裝入膠囊，制成每粒含灰氈毛忍冬次皂苷乙10mg的膠囊劑供口服使用。
實施例6注射劑的制備取灰氈毛忍冬次皂苷乙，加注射用純凈水及聚山梨酯80適量，制成每250ml含20mg的灰氈毛忍冬次皂苷乙的注射液供靜脈點滴使用。
權利要求
1.一種灰氈毛忍冬次皂苷乙的制備方法及其治療肝癌、乳腺癌、子宮頸癌的應用，其特征在于a.總皂苷制備灰氈毛忍冬花及花蕾，用濃度為40％-90％的乙醇提取3次，合并提取液，用0.1-5％的藥用活性炭脫色，過濾，回收乙醇后，將藥液上大孔樹脂柱或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗滌柱，再用30％-90％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇至濃浸膏，得總皂苷；b.總皂苷降解總皂苷濃浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，在50-100℃下降解2-4小時，加1-10％鹽酸或硫酸調節PH值到7，放冷后濾取不溶物，用60-95％乙醇或甲醇溶解后加0.1-5％的藥用活性炭脫色，過濾，減壓回收溶劑，放置，結晶，過濾，干燥，即得灰氈毛忍冬次皂苷乙。c..以a和b制備方法所得到的灰氈毛忍冬次皂苷乙，可在制備預防與治療肝癌、乳腺癌、子宮頸癌藥物中應用。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是將提取脫色后的藥液，拌樣或直接上大孔樹脂柱，型號包括HP20、D101、AB-8、HPD100、HPD300或聚酰胺柱吸附洗脫。
3.根據權利要求1所述的灰氈毛忍冬次皂苷乙，其特征在于對腫瘤細胞株MDA-MB-231、Hela、HepG2、IA-9、MCF-7、U-87-MG、CAKI-1、PC-3、KB、KB-VIN的細胞毒活性。
4.根據權利要求1所述的灰氈毛忍冬次皂苷乙，其特征在于對小鼠肝H22實體瘤、小鼠乳腺癌MA737、U14荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用。
5.權利要求1所述的灰氈毛忍冬次皂苷乙，其藥物有效量與藥學上可接受的載體組成的藥物組合物及其制劑。
6.根據權力要求5所述的制劑，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、沖劑、散劑、丸劑、口服液、糖漿劑、混懸劑、噴霧劑和注射劑。
全文摘要
本發明涉及灰氈毛忍冬次皂苷乙的制備方法及其治療肝癌、乳腺癌、子宮頸癌的應用的用途。制備方法包括灰氈毛忍冬花及花蕾用乙醇提取，活性炭脫色，大孔樹脂柱或聚酰胺柱分段，乙醇洗脫，堿水解，活性炭二次脫色，放置，結晶，得到灰氈毛忍冬次皂苷乙。本發明的提取工藝及方法獲得的有效成分得率及純度高，可達98％以上，特別適合大量制備灰氈毛忍冬次皂苷乙，可滿足制藥工業的要求。本發明獲得的灰氈毛忍冬次皂苷乙的有效劑量對體外培養癌細胞株有細胞毒活性，對小鼠肝癌H
文檔編號A61K36/355GK101085804SQ20071002324
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月18日 優先權日2007年6月18日
發明者馮煦, 趙興增, 王鳴, 賈曉東, 董云發, 陳雨 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所