專利名稱：疤痕疙瘩和其它的皮膚或內部的創傷或損傷中異常疤痕形成的處理和抑制的制作方法
技術領域：
本發明涉及異常疤痕形成的處理和抑制，更具體地講，本發明涉及降低創傷愈合過程中纖維蛋白溶酶原活化劑抑制因子-1的活性從而降低膠原的過度沉積，而膠原的過度沉積可引起異常疤痕，包括疤痕疙瘩(keloid)、肥大疤痕、粘連和其它皮膚或內部的創傷或損傷。
背景技術：
創傷愈合是一個連續的過程，通常可以分為四期1)凝結期；2)炎癥期；3)遷移和增生期；以及4)重塑期。
當身上出現傷口后不久，創傷愈合過程就開始啟動，首先是纖維蛋白(fibrin)和纖維連接素(fibronectin)凝結形成基體或叫凝塊，并且血小板聚集在傷口部位。當血小板凝結時，炎癥細胞，如中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞也附著到受傷部位，并且釋放相關因子治療傷口。例如，巨噬細胞分泌細胞因子和生長因子如成纖維細胞生長因子(FGF)、源自血小板的生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)、白介素-1(IL-1)、γ-干擾素(INF-γ)和上皮生長因子類物質。受激的血小板也可以釋放出上皮生長因子(EGF)、PDGF、變形生長因子α、β1、β2(TGF-α、TGF-β1以及TGF-β2)、血小板源性上皮生長因子(PDEGF)、血小板激活因子(PAF)、胰島素類生長因子-1(INF-1)、纖維連接素和血清素。所有這些生物性因子都與角化細胞、成纖維細胞和內皮細胞的滲透、增殖和遷移有關。在炎癥期的末期，蛋白質、脂肪和交聯的新膠原整合在一起，形成一個臨時支架。
在遷移和增殖期，遷移到傷口部位的細胞進入快速有絲分裂和分化。這些細胞包括角化細胞和成纖維細胞。一方面，角化細胞經歷上皮形成過程，在這個過程中細胞形成層狀并分化成為上皮覆蓋物。角化細胞也釋放角化細胞生長因子(KGF)和VEGF來刺激血管形成，釋放TGF-α作為化學引誘物，釋放PDGF促使細胞外基質(ECM)形成，以及釋放蛋白酶來分解無法生存的組織和纖維屏障。另一方面，遷移的成纖維細胞合成并沉積膠原和蛋白多糖，釋放生長因子如KGF、連接組織生長因子(CTGF)、纖維蛋白溶酶原活化劑抑制因子-1(PAI-1)和TGF-β。像角化細胞一樣，成纖維細胞也釋放蛋白酶，其可以促進接下來的重塑過程。在遷移和增殖期，所有這些細胞活動如遷移、增殖、分化、臨時支架的降解以及新基質的合成經常被描述為纖維組織形成過程。
創傷愈合過程的最后一個階段即重塑過程，改變了基質組分的沉積模式。如本發明所述的，最初的基質是來自內部穩定環境的纖維蛋白和纖維連接素的凝塊。隨著成纖維細胞的增殖和遷移，膠原合成和沉積，在蛋白酶的作用下替代和重新排列最初的基質。膠原纖維逐漸增加厚度，并沿傷口的張力線進行排列。在正常疤痕組織形成的末期，最終的疤痕顯示膠原纖維大多與表皮平行(Hunt等，創傷愈合的生理學，Adv.Skin.Wound Care 136-11(2000)；Ferguson等，疤痕形成胎兒和成人傷口修復的特性，Plas.Reconstr.Surg.97854-60(1996)；Gailit & Clark，在細胞外基質背景下傷口的修復，Curr.Ope71.Cell Biol.6717-25(1994)))。
因此，傷口愈合過程是一個精細和諧的生長過程與分解過程之間的平衡。任何過程中的畸變都可導致這種平衡的破壞，走向病態異常的傷口愈合或者疤痕組織的過度沉積。例如，傷口愈合過程中的疤痕組織的過度沉積可以導致疤痕疙瘩或者肥大疤痕(增殖性疤痕)。疤痕疙瘩是傷口愈合過程中的疤痕組織超出正常原始損傷外的過度增生。相反，肥大疤痕發生于創傷或損傷侵犯了深處真皮組織，而過度的疤痕沉積物卻被限制在原始損傷的邊界內。在這兩種情況下，膠原的過度沉積或者表達被認為是其原因。請參閱Tuan&Nichter，疤痕疙瘩與肥大疤痕形成的分子學基礎，Mol.Med.Today 419-24(1998)。
皮膚上異常疤痕的存在，經常會令受其影響的人們無法接受。實際上，避免或者治療異常傷口愈合以及異常疤痕的治療策略是美容行業的推動力。此外，異常疤痕可能引起疼痛或者瘙癢，而且可能限制動作范圍。在發生創傷時，嚴重的情況可能會導致組織或者器官的功能障礙。因此，傷口愈合過程中的畸形或者異常疤痕需要進行臨床研究和醫學處理。
異常疤痕形成的細胞和分子病源學正被廣泛研究。研究表明生長因子參與到異常疤痕形成的致病機制中。特別是TGF-β家族扮演了重要的生物學角色。據報道，TGF-β1和TGF-β2被證實在疤痕疙瘩纖維原培養基中比在正常皮膚纖維原培養基中具有更高的水平，因而被認為與異常疤痕形成和纖維變性有關。Lee等，在疤痕疙瘩中變形生長因子β1，2和3的蛋白表達，Ann.Plast.Surg.43179-184(1999)。
傳統的異常形成的疤痕的預防和治療包括將類皮質酮直接注射于傷口部位來限制成纖維細胞的生長；用硅樹脂膠化護板治療疤痕疙瘩造成的瘙癢癥；利用冷凍療法造成疤痕疙瘩的熱損傷或者死亡；外科切除過度生長的疤痕組織；以及應用干擾素IFN-α、IFN-β和IFN-γ抑制膠原的合成，這種抑制是通過限制真皮成纖維細胞中細胞信使RNA的合成而實現的。然而由于疤痕形成的潛在病理原因還未被認知，這些治療方法表現出嚴重的副作用或者異常疤痕的復發。因此，目前還沒有被廣泛接受的可以消除或者預防異常疤痕的治療方法。Alster& West，疤痕的治療綜述，Ann.Plast.Surg.39418-432(1995)。
因此，現在仍然需要一種新的方法來治療或者預防傷口愈合中的畸變和異常疤痕。

發明內容
一個方面，本發明提供了一種減少傷口愈合過程中膠原過度堆積或沉積的方法，包括降低纖維蛋白溶酶原活化劑抑制因子-1(PAI-1)的活性，而這種過度的膠原堆積或沉積可能導致異常疤痕的形成。
另一個方面，本發明提供了一種防止異常疤痕形成的方法，包括降低PAI-1活性的步驟。
再一個方面，本發明提供了一種通過降低PAI-1的活性來處理異常疤痕的方法。
又一個方面，本發明提供了一種通過測量PAI-1的活性來確定傷口愈合過程中的異常疤痕形成傾向的方法。
在本發明的一個具體實施方式
中，PAI-1的活性被PAI-1的抑制劑所抑制。PAI-1抑制劑的實例包括但不局限于福辛普利(Fosinopril)；咪達普利(Imidapril)；卡托普利(Captopril)；依那普利(Enalapril)；L158，809；依普沙坦(Eprosartan)；曲格列酮(Troglitazone)；維他命c；維他命E；培朵普利(Perindorpril)；米非司酮(RU486)；螺內酯；活化肽聚糖中央環(reactive center looppeptide)；PAI-1中和抗體；二酮哌嗪類化合物；羥化四甲銨酸(tetramic acid)類化合物；羥基醌(hydroxyquinolinone)類化合物和11-酮-9(E)，12(E)十八碳二烯酸。
在本發明的另一個具體實施方式
中，通過以下給藥途徑將PAI-抑制劑給藥受試者，這些給藥途徑包括但不限于口服、小腸給藥、口腔給藥、經鼻給藥、局部給藥、直腸給藥、陰道給藥、氣霧劑、穿粘膜給藥、表皮給藥、經皮給藥、眼藥、經肺給藥和/或胃腸外給藥。
在本發明的再一個具體實施方式
中，通過如下的方法測定PAI的活性，如色原分析法、酶聯免疫分析法、纖維蛋白覆蓋分析法和逆向纖維蛋白覆蓋分析法。
在本發明的又一個具體實施方式
中，異常疤痕是由于傷口愈合過程中膠原的過度堆積導致。異常疤痕的例子包括但不限于疤痕疙瘩、手術粘連、肥大疤痕、皮膚外形損傷如痤瘡和皺紋、蜂窩組織炎的形成、纖維瘤、纖維化、纖絲泡癥、攣縮、硬皮病、Duypuytren′s病、派羅尼(派羅尼)病和關節強直。
附圖簡要說明附圖是說明書的一個組成部分，用于說明本發明的實施例以及解釋本發明的原理。附圖只用于闡明本發明所采用的優選的和可選的實施方式。當然，應當理解，附圖只是用于描繪和說明本發明的概念。不能將附圖解釋為本發明只局限于所給出的實施例。本發明的各種優點和特征可從其文字說明和附圖得以體現。其中

圖1顯示應用免疫組織化學法研究關于uPA和PAI-1在正常皮膚、正常疤痕和疤痕疙瘩的表達。疤痕疙瘩組和正常皮膚組的樣品來自非裔美國病人，他們的黑素細胞在免疫組織化學中呈現棕黑色。對照對照組無一抗。″*″表皮，″J″，″k″，和″l″是來自疤痕疙瘩的真皮區域。實心箭頭″b″和″c″表示血管。空心箭頭″h″、″k″、″i″和″l″表示成纖維細胞。相片的放大倍數為100倍。
圖2顯示用RNA印跡(RNA印跡)分析法觀察正常皮膚組、正常疤痕組和疤痕疙瘩組的纖維母細胞的PAI-1的RNA信使。正常皮膚組(N65 and N77)、正常疤痕(NS70 and NS75)和疤痕疙瘩(K76和K80)的成纖維細胞在8×103細胞/cm2的密度下培養并用于RNA印跡分析。將20微克的所有RNA加樣在每一個泳道。樣品用β-肌動蛋白(β-肌動蛋白)水平來校正。
圖3比較了正常疤痕和疤痕疙瘩的成纖維細胞在纖維蛋白凝膠中16天培養期膠原聚集的時間相關性。不管是用正常還是用疤痕疙瘩的成纖維細胞合成的膠原均按照本發明的程序進行純化。在每一個時點每孔中的膠原表達進行每分鐘計數。
圖4比較了14天內正常和疤痕疙瘩的成纖維細胞uPA和PAI-1的表達。面板上部纖維蛋白覆蓋實驗證明uPA活性。面板下部逆向纖維蛋白覆蓋實驗證明PAI-1活性。雙鏈uPA分子量為50kD，單鏈uPA為30kD。高分子量蛋白(110kD)是uPA/PAI-1復合物。人PAI-1分子量大約為50kD。
圖5顯示了來自于供者與解剖部位相符的正常(N86)和疤痕疙瘩(K86)的成纖維細胞在13天培養期中uPA和PAI-1的表達。面板上部纖維蛋白覆蓋實驗證明uPA活性。面板下部逆向纖維蛋白覆蓋實驗證明PAI-1活性。雙鏈uPA分子量為50kD，單鏈uPA分子量為30kD，高分子量蛋白(110kD)是uPA/PAI-1復合物。人PAI-1分子量大約為50kD。
圖6顯示了在纖維蛋白、纖維蛋白-膠原或膠原凝膠中培養的正常或疤痕疙瘩的成纖維細胞uPA和PAI-1的表達。面板上部纖維蛋白覆蓋實驗證明uPA活性。面板下部逆向纖維蛋白覆蓋實驗證明PAI-1活性。雙鏈uPA分子量50kD，單鏈uPA分子量30kD，高分子量蛋白(110kD)是uPA/PAI-1復合物。人PAI-1分子量大約為50kD。
圖7顯示了在纖維蛋白或膠原凝膠中培養的正常或疤痕疙瘩的成纖維細胞的膠原累積情況。成纖維細胞合成的膠原如本發明所述進行純化及計數。
圖8顯示了抗PAI-1中和抗體對培養在纖維蛋白凝膠中疤痕疙瘩成纖維細胞膠原積累的作用。成纖維細胞合成的膠原按本發明所述的程序進行純化及計數。
圖9是方框原理圖，該圖總結了在疤痕疙瘩纖維化中的一些重大發現以及其與組織損傷修復中關鍵因素或成分的關系。纖維蛋白溶酶原活化劑/纖維蛋白溶酶和PAI-1系統是基質重塑中的重要成分，其可以調節纖維蛋白的降解、影響TGF-β和基質金屬蛋白酶(MMP)的活性以及調整細胞附著/遷移到細胞外基質(ECM)。疤痕疙瘩成纖維細胞不僅顯示出較高的膠原累積水平，當其暴露于TGF-β時還可以進一步升高，而且還顯示出在纖維蛋白降解時的缺陷，這種缺陷引起PAI-1活性的增高和uPA活性的降低。增高的PAI-1活性和疤痕疙瘩的成纖維細胞過度膠原積累有關，這可以通過如下情況得到證實PAI-1中和抗體可以將疤痕疙瘩成纖維細胞的膠原積累降低到正常成纖維細胞水平，或者在含有基質凝膠的膠原中培養疤痕疙瘩成纖維細胞能夠提升uPA活性。實心箭頭表示活性水平。
具體實施例方式
本發明基于以下發現來自于異常形成的疤痕的成纖維細胞呈現膠原過度積累，并表達增高的PAI-1活性，以及PAI-1活性的降低可以使非正常疤痕成纖維細胞的過度沉積的膠原變薄。
更具體地，本發明通過免疫組織化學研究發現盡管正常疤痕和異常疤痕(如疤痕疙瘩)的表皮層成纖維細胞均表達尿激酶纖維蛋白溶酶原活化劑(uPA)和PAI-1，但是異常疤痕成纖維細胞的PAI-1表達水平高得多。長期的三維纖維蛋白的凝膠培養顯示出正常成纖維細胞表達適中的及受調控的uPA和PAI-1活性水平。相反，疤痕疙瘩成纖維細胞總是表達高水平的PAI-1以及低水平的uPA。疤痕疙瘩成纖維細胞增高的PAI-1活性與纖維蛋白凝膠中增高的膠原累積有關。并且，還可以觀察到PAI-1活性的降低減少了疤痕疙瘩成纖維細胞膠原的累積。
這些發現說明不管在體內還是在體外，PAI-1過度表達或活性提高是異常疤痕中成纖維細胞固有的特性。既然PAI-1活性的降低可以導致膠原過度沉積的減少，那么PAI-1似乎是異常疤痕中成纖維細胞增高膠原累積的原因。相應地，本發明的一方面就是提供抑制或減少膠原過度沉積的方法，包括減少PAI-1的活性。
眾所周知，纖維蛋白基質的蛋白分解以及隨后成纖維細胞產生的膠原替換是創傷愈合過程中的必要特性，尤其是在纖維組織形成和重塑階段。據報道膠原過度沉積或過度表達可以引起創傷愈合過程的異常狀態，從而導致異常疤痕形成。Tuan & Nichter，The MolecularBasis of Keloid and Hypertrophic Scar Formation，Mol.Med.Today419-24(1998)。PAI-1活性的降低可以抑制由膠原過度沉積引起的創傷愈合過程中的異常狀態。另外，PAI-1活性的降低還可以逆轉異常疤痕形成的病理過程，并使創傷愈合過程進入正常狀態。相應地，本發明的另一方面就是提供抑制或降低因膠原過度沉積而導致的創傷愈合過程中的異常情況或異常疤痕的方法，包括減少PAI-1活性。
因為PAI-1的活性可以利用本領域內已知的方法進行測量，例如色原分析法、纖維蛋白覆蓋實驗以及逆向纖維蛋白覆蓋實驗，因此，創傷愈合的正常過程中或正常疤痕形成中的PAI-1活性水平可以確定并作為標準PAI-1活性。標準PAI-1活性可以用來同創傷愈合中創傷部位的PAI-1活性進行比較。正常創傷愈合過程中的標準PAI-1活性可以通過已知的方法或化驗進行確定，或以下文獻中提出的方法Gaffney & Edgell，The international standard for plasminogenactivator inhibitor-1(PAI-1)activity，Thromb.Haensost.7680-83(1996)。因為由膠原過度沉積引起的異常疤痕持續表達增高的PAI-1水平，因此創傷愈合過程中創傷部位PAI-1活性水平的提高代表了膠原過度積累的可能性，或者有形成異常疤痕的傾向，或者創傷愈合過程的異常狀態。相應地，本發明的另一方面就是提供一種確定膠原過度積累可能性或者形成異常疤痕傾向性的方法，包括確定創傷部位以及測量PAI-1活性水平。這些方法進一步包括將創傷部位的PAI-1活性同標準PAI-1活性進行比較，從而確定形成異常疤痕的可能性。
纖維蛋白溶酶原活化劑抑制因子-1(PAI-1)本發明使用的PAI-1屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(SERPIN)家族成員，并且是絲氨酸蛋白酶uPA和組織型纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)主要的抑制劑。已經發現纖維蛋白溶酶原活化劑的PAI-1抑制劑通過PAI-1蛋白(氨基酸殘基#346(Arg)到#347(Met))的誘餌(bait)肽鍵來調節，其模擬纖維蛋白溶酶原活化劑的天然底物，即纖維蛋白溶酶。
uPA和tPA是將纖維蛋白溶酶原轉化為纖維蛋白溶酶的酶。然后纖維蛋白溶酶參與ECM中其它糖蛋白的分解、MMP的活化以及TGF-β的釋放(Rifkin等，Plasminogen plasminogen activator andgrowth factor activation，Ciba.Found.Symp.212105-115(1997))。相應地，作為體內纖維蛋白溶酶原活化的主要調整物，PAI-1參與創傷愈合過程中細胞外基質的新陳代謝。據報道，體內PAI-1表達的增高可以抑制組織正常纖維蛋白溶解系統，以及形成局部血栓生成狀態，血栓形成可以在組織損傷部位導致病理性纖維蛋白沉積(Yamamoto & Saito，A Pathological Role of Increased Expressionof Plasminogen Activator Inhibitor-1 in Human or AnimalDisorders，Int′l.J.Henlatol.68371-385(1998))。
PAI-1的分子基礎已經很好地得以表征，尤其是編碼人和動物的PAI-1全長DNA序列已得以克隆及進行序列分析。例如，cDNA序列及其編碼的人PAI-1氨基酸序列在Genbank Accession No.X047444中列出。cDNA序列及其編碼的鼠PAI-1氨基酸序列在GenbankAccession No.M33960中列出。本發明中應用的PAI-1參照人PAI-1。
PAI-1的一個特性就是可以自發地由其活性形態轉化為潛伏的、非活性形態，此形態不能綁定到纖維蛋白溶酶原，從而抑制其活性(Sancho，等，Conformational studies on plasminogen activatorinhibitor(PAI-1)in active，latent，substrate，and cleavedforms，Biochem.341064-1069(1995))。據報道來自于PAI-1 #333(Ser)到#346(Lys)的氨基酸殘基，也稱為活性中央環(RCL)，是對纖維蛋白溶酶原活化劑形成PAI-1抑制效應的原因(Eitzman等，Peptide-mediated inactivation of recombinant and plateletplasminogen activator inhibitor-1 in vitro，J.Clin.Invest.952416-2420(1995))。在PAI-1的活性形態，活性中央環(RCL)伸出蛋白表面并將誘餌肽鍵(Arg346至Met347)暴露給作為假底物的纖維蛋白溶酶原活化劑。然而，在潛伏、非活性形態，RCL作為中央股插入β-層(sheet)A(見同上文獻)。另外，與PAI-RCL相符的一個14-氨基酸的肽(RCL肽)可以削弱PAI功能和活性(見同上文獻)。
PAI-1活性的降低PAI-1的減少可以通過如下方法實現，即減少、降低或消除PAI-1的表達、活性或存在。例如，PAI-1活性可以通過移除PAI-1基因或蛋白來降低。據報道，PAI-1剝奪那些可以免除博來霉素誘導的肺纖維化的小鼠的能力(Hattori等，Bleomycin-Induced PulmonaryFibrosis in Fibrinogen-Null Mice，J.Invest.Invest.1061341-1350(2000))。PAI-1活性也可以通過增加uPA活性而降低，uPA活性提高可以在膠原或纖維蛋白-膠原凝膠中培養成纖維細胞獲得。
本發明的一個實施方式是通過抑制劑來降低PAI-1活性。PAI-1抑制劑可以是能夠直接或間接抑制PAI-1活性的分子或高分子。
在本發明的一個優選實施方式中，PAI-1抑制劑是一個直接抑制劑，可以同PAI-1直接起作用或綁定到PAI-1上，從而降低PAI-1活性。PAI-1抑制劑包括(1)二酮哌嗪XR330和XR334，見Bryans等，Inhibition of plasminogen activator inhibitor-1 activity bytwo diketopiperazines produced byStreptomyces sp.，J.Antibiot.491014-1021(1996)；(2)二酮哌嗪XR1853和XR5082，見Charlton等，Evaluation of a low molecular weight modulatorof human plasminogen activator inhibitor-1 activity，Thromb.Haemost.75808-15(1996))；(3)XR5118和來自于XR5118以二酮哌嗪為基礎的復合物，例如復合物#24，25，33，34，35，36，37和38，見Folkes等，Synthesis and In Vitro Evaluation of aSeries of Diketopiperazine Inhibitors of Plasminogen ActivatorInhibitor-1，Bioorg.Medicinal Chem.Lett.112589-2592(2001)；(4)羥化四甲銨酸(tetramic acid)為基礎的復合物和羥基醌(hydroxyquinolinone)為基礎的復合物，見Folkes等，Design，synthesis，and in vitro evaluation of potent，novel，smallmolecule inhibitors of plasminogen activator inhibitor-1，Bioorg.Med.Chem.Lett.121063-1066(2002)；(5)11-酮-9(E)，12(E)-十八碳二烯酸，見Chikanishi等，Inhibition ofplasminogen activator inhibitor-1 by 11-keto-9(E)，12(E)-octa-decadienoic acid.a novel fatty acid produced byTrichoderma sp.，J.Antibiot.52797-802(1999)。對于抑制PAI-1活性的低分子化合物，可參看U.S.Pat.No.5,902,812、U.S.Pat.No.5,891,877和U.S.Pat.No.5,750,535。
本發明的另一個優選實施方式中，直接的PAI-1抑制劑包括PAI-1中和抗體以及PAI-1抑制性單克隆抗體，這種PAI-1抑制性單克隆抗體包括但不限于鼠抗人PAI-1單克隆抗體MA-44E4、MA-42A2F6、MA-56A7C10、MA-33B8，見Verhamme等，Acceleratedconversion of human plasminogen activator inhibitor-1 to itslatent form by antibody binding，J.Biol.Chem.，27417522-17517(1999)；Bijnens等，The distal hinge of the reactivesite loop and its proximityA target to modulate plasminogenactivatorinhibiyor-1 activity，J.Biol.Chem.，27644912-44918(2001)。因為活性中央環(PAI-1的Ser333至Lys346)從PAI-1結構表面突出，并對纖維蛋白溶酶原活化劑呈現誘餌肽鍵(Aug346-Met347)，因此抗RCL的單克隆或多克隆抗體可以用作直接PAI-1抑制劑。PAI-1中和抗體或抑制性抗體可以綁定到PAI-1來阻滯PAI-1活性，這是通過抑制其同纖維蛋白溶酶原活化劑相互作用而實現的。另外，PAI-1中和抗體或抑制性抗體可以通過加速PAI-1的活性結構轉換為潛伏的、非活性結構來抑制PAI-1活性。參照前述的Verhamme的報告。
在本發明的另一個實施方式中，PAI-1抑制劑是間接抑制PAI-1活性的、分子或高分子物質的間接PAI-1抑制劑。例如，在細胞和分子水平，間接PAI-1抑制劑可以是專門抑制PAI-1基因的轉錄和表達的因子或復合物，或者是與PAI-1序列互補的阻止PAI-1表達的反義寡核苷酸，反義寡核苷酸是一種多聚核苷酸結構誘導RNA干擾PAI-1mRNA降解，或者是產生siRNA(短干擾RNA)的dicer(一種RNA酶III型核酸酶)，siRNA然后又降解PAI-1 mRNA，或者是與PAI-1競爭同纖維蛋白溶酶原活化劑的酶促反應的分子。已知PAI-1的表達可由以下因子增強，如內毒素、凝血酶、TNF-α、TGF-β、白介素-1、胰島素、地塞米松、PDGF、EGF、脂蛋白和血管緊縮素II。相應地，間接PAI-1抑制劑可以是這些因子的抑制劑，以間接降低PAI-1的表達。
更優選地，間接PAI-1抑制劑是抑制PAI-1表達的復合物。已知抑制或削弱PAI-1表達的間接PAI-1抑制劑包括但不限于血管緊縮素轉化酶抑制劑(例如福辛普利、咪達普利、卡托普利、依那普利)；血管緊縮素II受體拮抗劑(L158，809、依普沙坦)；曲格列酮；維他命C；維他命E；培朵普利；米非司酮(RU486)和螺內酯。請參閱Eitzman等，Peptide-mediated inactivation of recombinant andplatelet plasminogen activator inhibitor-1 in vitro，J.Cliva.Invest.952416-2420(1995)；Pawlowska等，Natriureticpeptides reduce plasminogen activator inhibitor-1 expressionin human endothelial cells，CellBiol.Lett71153-1157(2002)；Mitsui等，Imidapril，an angiotensin-converting enzymeinhibitor，inhibits thrombosis via reduction in aorticplasminogen activator inhibitor type-1 levels inspontaneouslyhypertensive rats，Biol.Phann.Bull.22863-865(1999)；Pawlowska et al.，Natriuretic peptides reduceplasminogen activator inhibitor-1 expression in humanendothelial cells，CellBiol.Lett71153-1157(2002)；Mitsui等，Imidapril，an angiotensin-converting enzyme inhibitor，inhibits thrombosis via reduction in aortic plasminogenactivator inhibitor type-1 levels in spontaneouslyhypertensive rats，Biol.Phann.Bull.22863-865(1999)；Mitsui等，Imidapril，an angiotensin-converting enzyme inhibitor，inhibits thrombosis via reduction in aortic plasminogenactivator inhibitor type-1 levels in spontaneouslyhypertensive rats，Biol.Phann.Bull.22863-865(1999)；Brown等，Aldosterone modulates plasminogen activatorinhibitor-1 and glomerulosclerosis in vivo，Kidney Int.581219-1227(2000)；Wong等，Gene expression in rats with renaldisease treated with the angiotensin n receptor antagonist，Eprosartan，Physiol.Genomics 435-42(2000)；Papp等，Biological mechanisms underlying the clinical effects ofmifepristone(RU486)on the endometrium，Early Pregnancy4230-239(2000)；Oikawa等，Modulation of plasminogenaetivator inhibitor-1 in vivoa new mechanism for theanti-fibrotic effect of renin-angiotensin inhibitor，KidneyInt.51164-172(1997)；Fogari等，Losartan and perindoprileffects on plasma plasminogen activator inhibitor-1 andfibrinogen in hypertensive type 2 diabetic patients，Am JHypertens.15316-320(2002)；Pahor等，Fosinopril versusamlogipine comparative treatment studya randomized trial toassess effects on plasminogen activator inhibitor-1，Circulation 105457-461(2002)；Orge等，Vitamins C and Eattenuate plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)expression in a hypercholesterolemic porcine modelofangioplasty，Cardiovasc.Res.49484-492(2001)；Gottschling-Zeller等，Troglitazone reduces plasminogenactivator inhibitor-1 expression and secretion in culturedhuman adipocytes，Diabetoiogia 43377-383(2000)；Katoh等，Angiotensin-converting enzym inhibitor prevents plasminogenactivator inhibitor-1 expression in a rat model withcardiovascular remodeling induced by chronic inhibition ofnitric oxide synthesis，J.Mol.CellCardiol.3273-83(2000).
在另一個優選實施方式中，間接PAI-抑制劑是干擾PAI-1與纖維蛋白溶酶原活化劑反應的肽類，從而間接降低PAI-1活性。例如，含有PAI-1的RCL序列的肽(RCL肽)可以抑制PAI-1活性，見Verhamme的前述報告。
在確定是否某種分子或高分子是否是PAI-1抑制劑時，本領域常用的色原實驗法常被用來測量PAI-1活性。在此法中，分子首先與含有PAI-1的溶液或含有分泌PAI-1的細胞的培養液混合，然后定量的組織纖維蛋白溶酶原活化劑加入到混合物中同PAI-1相互作用。在中性條件下通過加入Glu-纖維蛋白溶酶原、多聚D-賴氨酸和顯色底物混合物來測定殘余tPA。殘余tPA催化纖維蛋白溶酶原轉化為纖維蛋白溶酶，而纖維蛋白溶酶進一步水解顯色底物。顯色程度與tPA的量具有比例關系，進而代表了分子的抑制性及效力。色原法在以下文獻有詳細描述Wysocki等，Temporal Expression of UrokinasePlasminogen Activator，Plasminogen Activator Inhibitor andGelatinase-A in Chronic Wound Fluid Switches from a Chronic toAcute Wound Profile with Progression to Healing，Wound RepairRegen.7154-165(1999)。此外，是否此類分子能夠抑制PAI-1表達可以通過纖維蛋白覆蓋實驗、逆向纖維蛋白覆蓋實驗和ELISA來確定。
為了檢測PAI-抑制劑降低過度膠原累積的效力，在體外應用三維纖維蛋白基質凝膠培養系統。3-D纖維蛋白基質凝膠培養系統是一種體外纖維組織形成模型，此模型是在研究創傷愈合過程中細胞和ECM的相互作用中確立的(見Tuan等，In vitro FibroplasiaMatrixContraction，Cell Growth and Collagen Production ofFibroblasts Cultured in 3-Dimensional Fibrin Matrix，Exp.CellRes.223127-134(1996))。3-D纖維蛋白基質凝膠培養系統可以表現纖維組織形成重要的特性，尤其是這一系統模擬了創傷愈合中細胞增殖、纖維蛋白的重建和降解以及膠原的合成和沉積。因此，此系統有效地刻畫了體內的纖維組織形成過程。3-D纖維蛋白基質凝膠培養系統中PAI-1抑制劑的存在引起PAI-1活性的降低，以及隨后膠原合成的減少。膠原合成的水平可以通過本領域常用的方法進行確定(見Tuan等，In vitro FibroplasiaMatrix Contraction，Cell Growthand Collagen Production of Fibroblasts Cultured in3-Dimensional Fibrin Matrix，Exp.CellRes.223127-134(1996))。
既然PAI-1活性可以通過色原法進行測定，那么正常疤痕形成過程中PAI-1活性水平就可以確定并作為標準PAI-1活性，用來同異常疤痕形成過程中PAI-1活性進行比較。因此可以確定在疤痕形成的每一個階段中異常疤痕形成的傾向性，并且可以給予有效治療劑量的PAI-1抑制劑來抑制異常疤痕形成或減少異常疤痕形成的可能性。
創傷愈合中的異常狀態如前所述，本發明的一個方面就是要提供在創傷愈合中避免因膠原過度表達而形成異常疤痕或異常狀態的方法，這種方法包括減少PAI-1活性的步驟。此處的“創傷”指傷害、損傷或創傷引起的、至少傷及機體或機體組織器官的內或外表面的膜或上皮層，機體組織器官包括皮膚、肺、腎臟、肝臟、心臟、胃腸道、骨、肌腱、眼睛或神經等。創傷可以由外傷、手術、切割、感染、磨損、穿刺、水皰、污染或毒素引起。一旦創傷形成，為了修復損傷的組織或器官，創傷區域或部位就會經歷一個創傷愈合過程。正常的創傷愈合過程會盡可能地使傷口部位損傷的組織或器官恢復到未損傷狀態。但是創傷愈合是一個包含多階段的過程并受多種因素影響。任何畸變都可以干擾這一過程使之偏離正常創傷愈合軌道，從而形成異常疤痕。
此處使用的短語“異常疤痕”、“異常疤痕形成”、“創傷愈合的異常狀態”或“創傷愈合紊亂”均指由膠原過度沉積引起的偏離正常創傷愈合過程的情況。異常疤痕或創傷愈合的異常狀態指纖維化、纖維瘤病、疤痕瘤、粘連(如手術粘連)、肥大疤痕、纖維囊性狀態以及關節強直，但并不限于以上情況。異常疤痕或創傷愈合的異常狀態可以根據創傷出現的組織不同而分為不同類型，例如在皮膚出現的異常疤痕可導致疤痕疙瘩、肥大疤痕、攣縮或硬皮病。胃腸道創傷愈合的異常可導致狹窄、粘連或慢性胰腺炎。另外，在腎臟可導致血管球性腎炎，在眼睛導致晶體后纖維增生癥，在肝臟導致肝硬化和膽道閉鎖，在心臟導致風濕性疾病或心室動脈瘤。請參考Sabiston Textbook ofSurgeryThe Biological Basis of Modern Surgical Practice，Chapter 12(16th Ed.，2001)。
與皮膚相關的創傷愈合紊亂或異常疤痕主要包括肥大疤痕、疤痕疙瘩、皮膚外貌損傷(包括痤瘡、皺紋、蜂窩織炎和纖維瘤)、Duypuytren病、派羅尼病以及其它皮膚的或內部損傷，但是并不局限于以上情況。更重要的形成的異常疤痕是肥大疤痕、疤痕疙瘩和皮膚外貌損傷問題。疤痕疙瘩源自疤痕組織的過度沉積，增生的疤痕組織超過了原來創傷的邊界。當疤痕組織的過度沉積被限制在原始創傷的邊界時就形成了肥大疤痕。不管是疤痕疙瘩還是肥大疤痕，過度結疤均是由膠原的過度累積引起。見Haverstock，HypertrophicScarsand Keloids，Clin..Podia tr.Med.Surg.18147-159(2001)。
創傷愈合紊亂主要是纖維化。纖維化顯示出過度的膠原積累，在傷口部位組織被異常疤痕所代替時，還會損害組織或器官的功能。纖維化的具體實例包括但不限于以下情況心臟病發作后形成損害心臟泵吸功能的疤痕組織；糖尿病患者在腎臟出現導致腎功能進行性喪失的異常結疤；以及手術后引起攣縮和疼痛的器官間纖維粘連。主要器官或組織的纖維化包括但不限于糖尿病或高血壓引起的腎纖維化、酒精或病毒性肝炎引起的肝纖維化、肺纖維化、心臟纖維化、視網膜黃斑退化以及視網膜玻璃體病變。
本發明中提到的“膠原過度累積”、“膠原過度沉積”或“膠原過度表達”是指在創傷部位或疤痕中增高的膠原水平，較正常創傷愈合或正常疤痕中的正常膠原水平高，而且至少高20％。膠原累計水平可以通過體內或體外測試來確定。在體內實驗中，創傷部位或疤痕處膠原的量可通過活組織檢查法進行形態學和生物化學方面的評估。在體外試驗中，取自創傷部位的成纖維細胞加到三維纖維蛋白基質培養系統中。用來源于正常疤痕或正常組織的成纖維細胞作為對照組。將這些成纖維細胞新合成的膠原進行純化并利用標記的氨基酸進行測定。參照Tuan等，In vitro fib″oplasjamatrix contraction，cell growth，and collagen production of fibroblasts culturedin fibrin gels，Exp.Cell.Res.223127-134(1996)。如果新合成的膠原水平較對照組高，比較理想的是至少高20％，更為理想的是至少高30％，那么創傷部位或疤痕就會產生過度膠原沉積或積累。
PAI-1抑制劑的給藥途徑本發明的一種實施方式就是提供一種通過給予PAI-1抑制劑復合物來阻止異常疤痕形成或治療異常疤痕的方法。PAI-1抑制劑復合物或者是PAI-1抑制劑本身，或者是含有PAI-1抑制劑及藥物學上可接受的載體。
PAI-1抑制劑復合物可以通過任何已知的給藥途徑給予受試者，包括口服、小腸、口腔、鼻、局部、直腸、陰道、氣霧劑、粘膜、上皮、真皮、眼、肺以及胃腸外給藥。表皮或局部給藥是指PAI-1抑制劑直接釋放入創傷部位；結膜給藥是指PAI-1抑制劑穿過角膜或結膜進入眼睛或其它損傷部位；鼻腔給藥是指PAI-1抑制劑穿過鼻粘液上皮細胞進入周邊循環；口腔給藥是指PAI-1抑制劑穿過口腔或舌上皮細胞進入周邊循環；口服給藥是指PAI-1抑制劑主要被吞咽下去在胃及消化道吸收；直腸給藥是指PAI-1抑制劑通過消化道末端粘膜釋放入周邊循環；陰道給藥是指PAI-1抑制劑通過陰道粘膜釋放入周邊循環。周邊循環將PAI-1抑制劑帶到損傷部位。胃腸外給藥是指給藥途徑主要與注射有關，包括靜脈、肌肉、動脈、膜內、囊內、眼窩、心臟內、真皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、胸骨內注射或灌輸。
本發明中所謂的“藥物學上可接受的載體”是指藥學上可接受的材料、復合物或裝置，例如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或膠囊材料，這些物質可以將PAI-1抑制劑從機體的一個組織、器官或某部分轉運到機體的另一個組織、器官或另一部分。每一種載體必須是藥物學上合適的，可以與其它成分如PAI-1抑制劑共存的，并且適于接觸人或動物的組織或器官，而無過度毒性、刺激性、過敏反應、免疫原性或其它問題及并發癥。一些可以充當此類載體的物質包括(1)糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉；(3)纖維蛋白以及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維蛋白和醋酸纖維蛋白；(4)粉末黃芪膠；(5)麥芽；(6)凝膠；(7)滑石；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑；(9)油類，例如花生油、棉花子油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和靜脈注射用脂肪乳劑；(10)乙二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯類，例如油酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽；(18)林格(Ringer)溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖液；(21)其它無毒性的可兼容的物質。
典型地，PAI-1抑制劑復合物可以任何適合的給藥途徑給予受者。本發明的方法中有效的配方可包括一種或多種PAI-1抑制劑、一種或多種藥學上可接受的載體以及其它任選的治療成分。此配方可以方便地在單位劑量中體現出來，也可以用任何藥學領域的已知方法制備出來。可以與載體結合、制成單劑的活性成分的數量取決于受者狀態和特定的給藥模式。可以與載體結合而制備具有藥學效果制劑的PAI-1抑制劑數量通常就是具有藥學效果的PAI-1抑制劑數量。一般地，PAI-1抑制劑的數量在1％-99％之間變動，最佳的是5％-70％。
制備這種藥物或復合物的方法包括將PAI-1抑制劑同藥學上可以接受的一種或多種載體以及任選的一種或多種附屬成分整合起來。一般而言，該藥物就通過將PAI-1抑制劑均一地同液態載體或細分的固態載體或二者一起緊密結合起來，然后成形(如有必要)。
適合于口服給藥的設計可以是膠囊劑、面囊劑、丸劑、片劑、糖劑(應用芳香成分，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)、粉劑、顆粒劑或是含水的或不含水的溶液或懸浮液，或是水包油或油包水乳液，或是酏劑或糖漿，或是錠劑(利用惰性成分，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)，或是口腔洗漱劑等，每一種藥劑均含有預定量的PAI-1抑制劑作為活性成分。復合物也可以通過大丸劑、藥糖劑或貼劑給藥。
在用于口服給藥的固體藥劑(如膠囊、片、丸、糖衣丸、粉末、顆粒等)中，PAI-1抑制劑可混有一種或多種藥學上可接受的載體，如枸櫞酸鈉或磷酸二鈣，和/或如下任何物質(1)填料或膨脹劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合劑，如羧甲纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，如甘油；(4)分解因子，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或樹薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，如石蠟油；(6)吸收加速劑，如季胺組分；(7)濕潤劑，例如乙醇和甘油單硬脂酸鹽；(8)吸收劑，如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、聚乙二醇、十二烷基磺酸鈉以及它們的混合物；(10)著色因子。在膠囊劑、片劑、丸劑的情況下，藥物學成分也可包括緩沖劑。相似類型的固體成分可以用來作為軟和硬明膠膠囊的填料，如用乳糖、高分子量的聚乙二醇等。
片劑通過壓縮或成形制成，也可以帶有一種或多種附屬成分。壓縮片可以利用粘合劑(如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(如淀粉羥乙酸鈉或交聯的羧甲基纖維素鈉)、表面活性或分散劑進行預配。成形片在一個適合的機器里將粉末狀肽或肽類仿制物用惰性液體稀釋劑弄濕后塑造而成。
片劑和其它固體形態如糖丸、膠囊、丸和顆粒也可以覆有外衣或外殼，例如腸溶衣和其它已知的藥物學性制備的外衣。為了提供緩慢的或受控的釋放PAI-1抑制劑，可以將他們進行特別制備，例如，為了產生期望的釋放曲線，可采用不同比例的羥丙基甲基纖維素、其它聚合體基質、脂質體和/或小球體。它們可通過如下方式滅菌通過細菌濾過器進行過濾，或者以無菌固態混合物的形式加入滅菌劑，其在使用前可以溶于滅菌水或其它無菌的可注射的介質中。這些復合物也可以任選包含某些遮光劑，并且可以僅僅或主要在胃腸道的某部位釋放PAI-1抑制劑，此外，還可以選擇讓其以延遲的方式進行釋放。可適用的包埋物質可以是聚合體物質和蠟類。PAI-1抑制劑可以裝入微膠囊內，如果合適的話，并加入一種或多種以上所述的賦形劑。
口服給藥的液體形態包括藥學上可接受的乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除了PAI-1抑制劑，液體形式也可以包括惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，如普通酒精、異丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻和芝麻的油)、甘油、四氫糠基乙醇、聚乙二醇和脫水山梨糖醇脂肪酸以及它們的混合物。除了惰性稀釋劑，還可以包括佐劑，如濕潤劑、乳化和懸浮劑、甜味劑、調味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。
除了PAI-1抑制劑，懸浮液可以包含懸浮因子如乙氧基化乙醇、聚氧乙烯山梨酯和山梨聚糖酯、微晶纖維素、膨潤土、瓊脂和黃芪膠以及它們的混合物。
直腸或陰道給藥可以是栓劑，這可以通過將一種或多種PAI-1抑制劑同一種或多種適合的無刺激性的賦形劑或載體混合在一起而制備，這些載體包括可可脂、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸鹽，制成的栓劑在室溫下是固體，而在體溫下就可以變成液體，因此，就可以在直腸或陰道中融化釋放活性物質。適合于陰道給藥的形式也可以包括子宮套、止血栓、乳膏、凝膠、泥膏劑、泡沫劑或噴霧劑。
PAI-1抑制劑局部或經皮或表皮給藥的形態包括粉劑、霧劑、乳膏、洗劑、凝膠、溶液、藥膏和吸入劑。在無菌條件下將活性成分與藥物學載體和其它防腐劑、緩沖劑或推進劑相混合。除了PAI-1抑制劑、藥膏、貼劑、乳膏和凝膠，還包含一些賦形劑，如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維蛋白衍生物、聚乙二醇、硅樹脂，膨潤土、硅酸、滑石和氧化鋅或者它們的混合物。搽粉和噴霧劑除了含有PAI-1抑制劑還包括一些賦形劑，如乳糖、滑石、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末或者這些物質的混合物。噴霧劑可另外含有慣常使用的推進劑，如氯氟烴和揮發性未取代的碳氫化合物，例如丁烴和丙烷。
PAI-1抑制劑的復合物可以選擇性的利用氣霧劑給藥。這可以通過制備含有PAI-1抑制劑的水性氣溶膠、脂質體制劑或固體顆粒而實現。可以使用非水的(碳氟化合物推進劑)懸浮液。音波噴霧器也可以被使用。水性氣溶膠是通過將水性溶液或懸浮液同傳統上藥物學上可接受的載體和穩定劑合在一起而形成。載體和穩定劑根據特定組分的需要而改變，但是特有的包括非離子型表面活性劑(吐溫、聚醚、聚乙二醇)、無害的蛋白像血清白蛋白、山梨聚糖酯、蛋黃素、氨基酸如氨基乙酸、緩沖劑、鹽、糖或糖乙醇。氣霧劑通常是等滲溶液。
經皮的藥膏可以用來釋放PAI-1抑制劑復合物到正常疤痕。這種形式通過在適當的介質中溶解或分散相關藥劑而得到。吸收增強劑可以用來提高物質的流出通過皮膚。這種流出的比例可以通過如下方式實現，提供一種可控制薄膜或在聚合物基質或凝膠中分散有效成分。
眼科產品如眼膏、粉末、溶液等，同樣在本發明的范圍之內。
適于胃腸外給藥的形式包括PAI-1抑制劑與如下物質結合，即一種或多種藥物學上可接受的無菌等滲水溶液或無水溶液、分散液、懸浮液或乳濁液，或者是可以在使用前制成無菌注射液或分散液的粉末，它們可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、能形成與血液等滲的溶解物。
用于腸胃外給藥的水性或非水性載體包括水、乙醇、多羥基化合物(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、蔬菜油如橄欖油、可注射的有機酯如油酸乙酯。可通過以下方式保持合適的流性，例如，通過使用被覆物如卵磷脂以及通過應用表面活性劑，而在分散液中保持所需的顆粒大小。
適于胃腸外給藥的形式也可以包括一些佐劑，例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。抑制微生物可以通過含有不同抑菌劑和抑真菌劑的物質完成，例如氯代丁醇、苯酚山梨酸等。復合物也可以包括等滲物質，如糖、氯化鈉等。另外延長注射物質的吸收可以通過含有阻滯吸收的內容物來完成，例如硬脂酸鋁和明膠。
在某些情況下，為了延長PAI-1抑制劑的效應，希望通過皮下或肌肉注射的藥物被緩慢吸收。這可通過應用水溶性較差的晶體或無定型物質的液體懸浮液來實現。藥物的吸收速率取決于其溶解速率，而溶解速率又取決于晶體的大小和晶形。此外，延遲藥物吸收還可以通過在油類媒介物中溶解或懸浮PAI-1抑制劑復合物來實現。
可注射的長效制劑由含有PAI-1抑制劑的微膠囊基質或可生物降解的多聚體如聚交酯-聚乙交酯構成。根據聚合物中PAI-1抑制劑的比率以及所使用的聚合物的特性，可以控制藥物釋放的速率。其它生物可降解的聚合物包括多聚(原酸酯)和多聚(甲酸酐)。長效可注射制劑通過在脂質體或微乳劑中包容PAI-1抑制劑來制備。
在本發明的主要內容中，PAI-1抑制劑復合物以治療性有效劑量釋放到創傷部位。這里所謂的治療性有效劑量是指PAI-1抑制劑、PAI-1抑制劑復合物或PAI-1抑制劑藥物的量，它可以有效產生預期的治療效應，或者通過減少創傷愈合過程中膠原的過度積累或表達而反映出來，或者將異常狀態的創傷愈合中的膠原累積水平降低到正常創傷愈合狀態，或者觀察到在創傷部位正常疤痕形成過程中若不給予PAI-1抑制劑而有形成異常疤痕的傾向，或者觀察到異常疤痕的消散。依藥理可知，準確治療劑量的PAI-1抑制劑在患者身上產生最大治療效應還取決于如下因素，如藥物活性、特性、藥物代謝動力學、藥效學、PAI-1抑制劑的生物利用度、受試者的生理狀態(包括種族、年齡、性別、體重、飲食、疾病類型及狀態、一般生理狀態、對藥物治療劑量的反應狀況)、載體特性、給藥途徑及頻率、創傷及正常疤痕形成的嚴重程度等等。無論如何，以上提到的指導方針可以作為調節治療的基礎，例如，確定給藥的最適宜的劑量，這僅需一個常規試驗，包括監測受試者及調整劑量。請參考RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy(Gennaro ed.20th edition，Williams&Wilkins PA，USA)(2000)。
以上概括描述了本發明，下面通過實施例來更好地理解本發明。
實施例材料和方法細胞分離成纖維細胞來自于人的正常皮膚、疤痕和疤痕疙瘩，采用移植的方法。皮膚和疤痕收集方案由洛杉機兒童醫院和查里斯-諸醫科大學認可。疤痕疙瘩凸起的核心區域被用來分離成纖維細胞。成纖維細胞在DMEM(Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY)中培養，其中含有100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素，以及10％胎牛血清(Life Technologies，Inc.)。細胞在5％CO2和95％空氣的增濕培養箱里培養。成纖維細胞用含有0.05％乙二胺四乙酸的0.25％胰蛋白酶的Hank溶液(Life Technologies公司)里進行消化傳代，每周一次。實驗所使用的為2-10代細胞。細胞傳代定義為從原代培養進行每周擴增。本發明中使用的每一株成纖維細胞的來源都列在表1中。這些樣品代表了8年的樣品采集調查成果。本發明中的每一個實驗均在正常和疤痕疙瘩的成纖維細胞的多株細胞之間進行比較，而這些細胞株盡可能地在年齡和解剖部位上相匹配。
纖維蛋白凝膠的制備人纖維蛋白原(Calbiochem，圣迪戈，加州)被用來制備纖維蛋白凝膠。纖維蛋白原在蒸餾水中重建，調整到10mg/ml并貯存在-20℃。通過將1-5mg/ml纖維蛋白原與1-2U/ml人凝血酶混合并在37℃條件下孵育30分鐘來測定纖維蛋白原的凝結能力。形成的凝塊從試管壁上分離，然后以12,000轉/分的轉速離心15分鐘，使凝塊形成小顆粒并收集可溶性纖維蛋白原。保留在上清液中的可溶性非凝結性纖維蛋白原可通過OD280的蛋白濃度來確定。所用的纖維蛋白原的凝結性均為95-98％。
纖維蛋白凝膠制備的方法已在以前的出版物中已經闡明，如Tuan& Grinnell，Fibronectin and fibrinolysis are not required forfibrin gel contraction by human skin fibroblasts，J.CellPhysiol.140577-583(1989)。簡單地說，就是在24℃下，將DMEM培養液中人皮膚成纖維細胞加到纖維蛋白原溶液中。纖維蛋白原的最終濃度是2.5mg/ml，而成纖維細胞是0.5×106個/ml。將等分的部分(180μl)成纖維細胞/纖維蛋白原同每個樣品1U凝血酶加到24孔培養板(Costar，Cambridge，MA)中。每一等份在孔板中占據16mm直徑的區域。所得制劑在5％CO2、37℃、增濕培養箱里孵育1小時確保纖維蛋白聚合。在孵育期的末期，將含有10％胎牛血清的1ml DMEM加入每一個孔中覆蓋凝膠。
用來研究uPA和PAI-1的樣品首先用DMEM徹底洗滌(5次)，然后在DMEM中另外孵育24小時。條件培養基用于纖維蛋白覆蓋實驗和逆向纖維蛋白覆蓋實驗。
膠原凝膠的制備膠原凝膠按Tuan等人描述的方法進行制備，見Tuan等，Dermal fibroblasts activate keratinocyte outgrowth oncollagen gels，J.Cell.Sci.1072285-2289(1994)。在實驗中被使用Vitrogen(Cohesion Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)，一種主要的I型膠原制劑。簡單地說，在4℃膠原用10×MEM(最少基本介質，Sigma化學公司)和0.1N NaOH調節至生理離子強度和pH值。最終膠原濃度為1.5mg/ml。將成纖維細胞加入重建的膠原中，最終濃度為0.5×106個/ml。膠原/成纖維細胞懸浮液樣品被分配到24孔培養板中。每孔180μl等份，然后培養板置于37℃、5％CO2的培養箱中45分鐘使膠原聚合。
纖維蛋白和膠原混合物凝膠將纖維蛋白原和膠原按不同比例(纖維蛋白膠原100％0％、50％50％、0％100％)混合，制備凝膠。成纖維細胞以0.5×106個/ml加到基質中。180μl等份的凝膠-成纖維細胞混合物置于24孔培養板中，每個樣品加入1U凝血酶。
纖維蛋白覆蓋和逆向覆蓋實驗簡單地說，就是用含0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS，Sigma)的10％聚丙酰胺凝膠將25μl無血清的條件培養基樣品進行電泳。室溫下用2.5％Triton X-100洗滌凝膠1小時，除去SDS。凝膠在蒸餾水中短暫沖洗后，置于指示劑凝膠層(用于纖維蛋白溶酶原活化劑(PA)檢測的纖維蛋白覆蓋實驗)中，其含有1％低溫凝膠瓊脂糖、人纖維蛋白溶酶原(9μg/ml，Sigma，St.Louis，Mo)、凝血酶(0.7U/ml，Sigma)和纖維蛋白原(2mg/ml)。為了檢測PAI、SDS-聚丙烯酰胺凝膠室溫下用2.5％Triton X-100洗滌1小時，然后同加入的uPA(0.2U/ml，Sigma)置于基質凝膠上部(類似于前面的指示劑凝膠)(逆向纖維蛋白覆蓋實驗)。所得制劑都置于37℃增濕容器中。PA活性以透明的條帶出現在不透明的纖維蛋白指示劑層中表明纖維蛋白溶解。PAI活性以不透明的條帶出現在透明的逆向覆蓋底物層表明纖維蛋白溶解的受抑。結果進行拍照。
色原基質分析采用兩級間接酶分析(Spectrolvse (pL)PAI(American Diagnostica #101201))定量測定血漿中PAI-1的活性。在第一階段，定量的組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)被加到樣品中，并與PAI-1反應。然后將樣品酸化，破壞α-2-抗血纖維連接素和其他潛在的纖維連接素抑制劑，這些物質能夠干擾tPA實驗。在第二階段，通過將樣品加到谷氨酸纖維蛋白溶酶原、多聚D-賴氨酸和色原基質的中性混合物中，測量殘留的tPA活性。殘留的tPA活性催化纖維蛋白溶酶原轉化為纖維蛋白溶酶，隨之纖維蛋白溶酶水解色原基質。顯色數量與樣品中tPA活性是成比例的。其中，多聚D-賴氨酸是tPA催化纖維蛋白溶酶原轉化為纖維蛋白溶酶的刺激物。樣品中的PAI含量可以以加入的tPA和回收的tPA數量差來表示。1U PAI活性(U)由抑制1IU人單鏈tPA的PAI量來確定，并以NIBSAC發布的tPA lot86/670的國際標準進行校準。
膠原合成、純化和表型分析[3H]脯氨酸用來標記成纖維細胞新合成的膠原。3份樣品在含有β-aminoproprionitrile(62.5μg/ml)，10％FCS的DMEM中用L-(5-[3H]脯氨酸)(50μCi/ml)(Amersham，Arlington Heights，IL)標記48小時。在標記末期，所有樣品調整為含0.5M乙酸，并在4℃用1mg/ml胃蛋白酶(PM grade，Worthington，Freehold，NJ)處理24小時，以消化蛋白而不是完整的膠原。通過加入50mMTris并滴定到pH7.4，來抑制胃蛋白酶活性。膠原依次通過中性鹽和酸性鹽沉淀來純化(Tuan等，In vitro fibroplasiamatrix contraction，cell growth，and collagen production offibroblasts cultured in fibrin gels，Exp.Cell.Res.223127-134(1996))。最終膠原顆粒在50mM Tris和40％乙醇中清洗并用0.5M乙酸溶解。樣品進行SOS聚丙酰胺凝膠電泳然后熒光攝像。用來進行細胞計數的樣品用胰蛋白酶和膠原酶處理，活細胞數目在臺盼藍溶液中用血細胞計數儀來計數。純化的膠原以cpm/cell表示。所示的數據為三個樣品的平均值。各組之間和每組之內的統計學差異用單因素方差分析進行研究。
RNA印跡應用標準的RNA印跡分析來研究RNA表達(Sambrook等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual.(New York Cold SpringHabor Laboratory Press，1989))。用硫氰酸胍來提取RNA樣品，并通過氯化銫離心分離樣品。總RNA(20μg/泳道)通過電泳分離，轉移到尼龍過濾器上，真空下80℃烘烤2小時。預雜交后，在40℃下將放射物標記的DNA探針雜交20小時，洗滌，在-70℃ x-射線下可見。cDNA探針標記法參照Feinberg和VogelsteinA technique forradiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to highspecific activity，Addendum，Anal.Biochem.137266-267(1984)。每一細胞株的所有樣品均用β-肌動蛋白的表達水平進行標準化。采用特異性人cDNA探針作為uPA核苷酸623-1039和PAI-1 cDNA(全長)的雜交探針(Laug等，Complex expression of the genes codingfor plasminogen activators and their inhibitors in HeLa-smoothmuscle cell hybrids，Cell Growth Differ.3191-197(1992))。
免疫組織化學新鮮收集的皮膚和疤痕樣品在冰凍的PBS中清洗并在4℃的4％福爾馬林(Sigma，pH7.5)中固定24小時。在脫水之前，樣品用70％乙醇處理24小時。脫水后，樣品包埋在石蠟(60℃)中，并用切片機按5μm厚度進行切片。切片再次脫水并用H2O2進行處理。為了將非特異性結合降低到最小，切片首先在室溫下用1.5％BSA/PBS處理30分鐘。1∶50的鼠抗人uPA單克隆抗體(#3698和#394，AmericanDiagnostica Inc，Greenwich，CT)和1∶25的鼠抗人PAI-1單克隆抗體(#3785，American Diagnostica Inc.)被分別用來檢測uPA和PAI-1。一抗處理后，切片用PBS洗滌三次，然后同辣根過氧化物酶共軛的二抗(Amersham Pharmacia Biotech Limited，Buckingham-shire，England)一起孵育50分鐘。用PBS徹底清洗后，切片用3，3’-二氨基聯苯胺(DAB，Sigma)處理來暴露抗原-抗體反應部位。為使細胞核染色，切片用蘇木精進行輕微染色。
結果疤痕疙瘩成纖維細胞中PAI-1表達升高在培養時疤痕疙瘩呈現出增高的PAI-1表達(Tuan等，Elevatedlevels of plasminogen activator inhibitor-1 may account for thealteredfibrinolysis by keloid fibroblasts，J.Invest.Dennatol.1061007-1011(1996)。為了檢測是否在體內也出現PAI-1的過度表達，在疤痕疙瘩損傷(n＝5)中，利用免疫組織化學中對抗PAI-1或uPA的抗體研究PAI-1和uPA的蛋白表達。結果同正常皮膚(n＝3)和正常疤痕(n＝3)進行比較。疤痕疙瘩的特征是在真皮層中具有過量的膠原沉積，因此本研究也包括疤痕疙瘩損傷的皮膚深層區域(圖1，Keloid Deep Dennisj、k和l)。在真皮層中，除了膠原，成纖維細胞和不同粗細的血管是主要的可見物(圖1)。在正常皮膚中，PAI-1和uPA染色位于血管處(圖1b和1c)。在正常疤痕和疤痕疙瘩中，盡管血管和成纖維細胞均對PAI-1和uPA染色陽性，然而染色強度完全不同。疤痕疙瘩成纖維細胞的PAI-1染色強度大大強于正常疤痕成纖維細胞的(圖1h和1k對照1e)；而正常疤痕成纖維細胞uPA染色強度則強于疤痕疙瘩成纖維細胞(圖1f對照1i和1L)。5個疤痕疙瘩樣品有4個(80％)可觀察到高水平PAI-1染色。上皮層uPA和PAI-1同樣染色陽性(圖1“*”)，并且疤痕疙瘩上皮層顯示了較正常皮膚或正常疤痕強的PAI-1染色(圖1h對照1e和1b)。疤痕疙瘩和正常皮膚來源于非裔美國人患者，他們上皮基底層的黑色素細胞在免疫組織化學中呈現黑褐色。所有對照組染色均為陰性(圖1中對照樣a、d、g和j)。
為了確定是否PAI-1在mRNA水平也會出現過度表達，從正常皮膚、正常疤痕以及疤痕疙瘩樣品分離出皮膚成纖維細胞，并用RNA印跡技術進行分析。結果表明PAI-1有兩個RNA信使，分別在3.0kb和2.2kb(圖2)。疤痕疙瘩成纖維細胞2.2kb PAI-1 mRNA高于正常皮膚和正常疤痕的成纖維細胞。因此，不管是在體內還是在體外，PAI-1過度表達是疤痕疙瘩成纖維細胞的固有特征。
在長期的纖維蛋白凝膠培養中疤痕疙瘩成纖維細胞表現出較高的膠原積累，并總保持較高的PAI-1活性。
為了檢測是否疤痕疙瘩成纖維細胞中的PAI-1過度表達與膠原過度產生具有相關性，應用體外纖維組織形成模型，對PA/PAI和膠原產物進行為期兩周的研究(Tuan等，In vitro ibroplasiasmatrix contraction，cell growth，and collagen production offibroblasts cultured in fibrin gels，Exp.Cell Res.223127-134(1996)。每次實驗檢測一個疤痕疙瘩的和一個正常的成纖維細胞株，總共至少分別檢測6個。
所有成纖維細胞產生的膠原按前述方法進行純化。在纖維蛋白凝膠中，疤痕疙瘩成纖維細胞以類似于正常成纖維細胞的速度生長。盡管可以檢測到少量III型和V型膠原，但是在疤痕疙瘩和正常成纖維細胞產生的膠原中I型膠原(α1和α2)占主導地位。典型的實驗結果如圖3所示。總膠原數量用細胞數量進行歸一處理，并用cpm/細胞表示。在為期兩周的研究中，每一種細胞類型不同細胞株中，膠原累積的一般模式具有高度重復性。對于正常成纖維細胞，前10天膠原積累是逐漸增長，大約10-15天達到高峰，并且在培養后期(第16天)降低(圖3，正常)。另一方面，疤痕疙瘩成纖維細胞顯示出相似的增長速度，但是維持的水平總比正常成纖維細胞高2-3倍(圖3，疤痕疙瘩)。高于正常成纖維細胞膠原水平意味著膠原的過度積累。所有膠原數量與細胞數進行標準化，并按cpm/cell進行表達。
為了檢測uPA和PAI以及它們的活性，在指定時間從培養中收集條件介質并用于纖維蛋白覆蓋實驗和逆向纖維蛋白覆蓋實驗，在正常和疤痕疙瘩成纖維細胞中每一種至少有4個細胞株被檢測。典型實驗結果見圖4。纖維蛋白覆蓋實驗揭示了正常成纖維細胞可以表達雙鏈(50kD)和單鏈(30kD)uPA(圖4，正常面板上部)。在培養早期(3-5天)可表達50kD uPA，并且在培養后期(12天后)又重新出現。而大部分培養期均以低水平表達30kD uPA，只在更后的培養期增高至高水平表達(圖4，正常面板上部)。與之相反，疤痕疙瘩呈現中等水平的30kD uPA，并且僅僅出現在培養后期(圖4，疤痕疙瘩面板上部)逆向纖維蛋白覆蓋實驗顯示正常成纖維細胞表達的PAI-1為可變的活性水平(圖4，正常面板下部)，而疤痕疙瘩成纖維細胞在整個培養期恒定表達高水平(圖4，疤痕疙瘩面板下部)。
也用色原基質法(American Diagnostica)測定PAI-1活性。實驗中，疤痕疙瘩成纖維細胞的PAI-1活性水平是正常成纖維細胞的2-3倍(K∶N，45∶10；80∶45；40∶16 IU/ml，來自于3個獨立的測量)。正常和疙瘩成纖維細胞培養中均可以檢測到少量uPA/PAI-1復合物(圖4，面板上部uPA/PAI-1復合物)。這種復合物在原位置無催化活性，它的纖維蛋白溶解活性歸因于SDS-PAGE過程中SDS處理的人工產物(Granelli-Piperno & Reich，A study of proteases and protease-inhibitor complexes in biological fluids，J.Exp.Nleel.148223-234(1978)).
在供者和解剖部位相符的一對樣品中，N86和K86，對uPA和PAI的活性進行了檢測。結果如圖5所示。當與其他正常成纖維細胞比較時，除了在時間和表達水平上有輕微差異外，N86呈現出與之相類似的uPA表達模式(圖5，N86上部面板)。而在PAI-1表達方面則是有差異的，在培養的前半期呈現高水平表達，而在后半期則消失(圖5，N86，下部面板)。K86的uPA和PAI-1表達模式與其他疤痕疙瘩成纖維細胞極為相似，即在第11天30kD uPA以中等量出現，而PAI-1在整個培養期過度表達(圖5，K86)。uPA/PAI-1復合物(-110kid)的存在表明疤痕疙瘩成纖維細胞分泌的uPA很大程度上受PAI-1限制。因此，在纖維蛋白凝膠長期培養時，雖然正常成纖維細胞顯示有控制的uPA和PAI表達，但是疤痕疙瘩成纖維細胞呈現一個低水平的uPA和恒定的高水平的PAI-1，并且疤痕疙瘩成纖維細胞PAI-1的過度表達與提高的膠原累積具有相關性。
高PAI-1活性是疤痕疙瘩成纖維細胞膠原累積提高的原因。
纖維蛋白基質中的成纖維細胞可活躍地識別基質并產生膠原代替纖維蛋白(Tuan等，In vitro fibroplasiamatrix contraction，cell growth，and collagen production of fibroblasts culturedin fibrin gels，Exp.Cell Res.223127-134(1996))。為了確認纖維蛋白凝膠中的uPA或PAI-1的表達模式受細胞外基質(ECM)環境改變(例如從纖維蛋白到膠原)的影響，在體外纖維組織形成過程中，纖維蛋白、纖維蛋白-膠原或膠原凝膠用于細胞培養來模擬早期、中期或晚期基質表型。結果顯示，在膠原(纖維蛋白-膠原和膠原凝膠)條件下，正常成纖維細胞的uPA表達從50kD雙鏈形態轉換為50kD和30kD形態(圖6，正常，面板上部)。有趣的是，當凝膠基質中膠原濃度從50％增為100％時，PAI-1表達水平降低(圖6，正常，面板下部)。疤痕疙瘩成纖維細胞通過表達30kD uPA對基質中的膠原作出反應；然而，在PAI-1水平卻無顯著變化(圖6，疤痕疙瘩)。因此，正常成纖維細胞uPA和PAI-1的表達均受ECM調節，而疤痕疙瘩成纖維細胞僅有uPA的表達受ECM調控。纖維蛋白、膠原或纖維蛋白-膠原混合凝膠培養中的細胞生長無差異，因此，PAI-1的過度表達是疤痕疙瘩成纖維細胞固有的特性，與ECM中膠原水平無關。
正常或疤痕疙瘩成纖維細胞中的膠原累積同樣在纖維蛋白和膠原凝膠培養中進行研究和比較。結果表明正常成纖維細胞膠原累積水平在纖維蛋白和膠原凝膠中相似(圖7，正常)。相反，當疤痕疙瘩成纖維細胞在膠原凝膠中培養時，在纖維蛋白凝膠中觀察到的高水平膠原累積通常降低到與正常成纖維細胞具可比性的水平(圖7，疤痕疙瘩)。當在纖維蛋白-膠原凝膠中培養時觀察到疤痕疙瘩成纖維細胞的膠原積累同樣減少。相似的數據在另外兩個疤痕疙瘩成纖維細胞株中得到。這些結果表明高PAI-1活性在提升疤痕疙瘩成纖維細胞膠原累積方面是必需的，因為在膠原或纖維蛋白-膠原混合凝膠中培養的疤痕疙瘩成纖維細胞uPA活性的提高可以降低疤痕疙瘩成纖維細胞膠原的累積。
為了進一步驗證是否高PAI-1活性可以提高膠原累積，在PAI-1中和抗體存在條件下，對培養在纖維蛋白凝膠中的疤痕疙瘩成纖維細胞的膠原累積進行研究。根據制造商的說明，抗體(兔抗-PAI-1抗體，#395R，American Diagnostica)可以同所有形式的人PAI-1反應。在50％抑制點，1mg這種抗體可以抑制1000IU PAI-1。結果表明抗-PAI-1抗體降低PAI-1活性(圖8，插入)和減少疤痕疙瘩成纖維細胞的膠原累積(圖8，“纖維蛋白凝膠+抗-PAI-1中的疤痕疙瘩”)，而不是非免疫IgG。另外有兩個疤痕疙瘩成纖維細胞株也用來驗證抗-PAI-1中和抗體對膠原累積的作用。作為對照，同一時間對在纖維蛋白凝膠中培養的正常成纖維細胞或在膠原凝膠中培養的疤痕疙瘩成纖維細胞的膠原累積情況也進行了研究(圖8，“纖維蛋白凝膠中的正常疤痕”和“膠原凝膠中的疤痕疙瘩”)。
討論本發明中的實施例證明了不管是在體內還是在體外，PAI-1的過度表達是疤痕疙瘩成纖維細胞的固有特性。在纖維蛋白凝膠中長期培養，正常成纖維細胞呈現出有調控的uPA和PAI-1水平，同膠原累積一樣；而疤痕疙瘩成纖維細胞則呈現出恒定的高水平的PAI-1和膠原累積。能夠降低PAI-1活性的條件下可以破壞疤痕疙瘩成纖維細胞膠原累積的提高。這些條件包括膠原或纖維蛋白-膠原凝膠中培養的成纖維細胞增加uPA，或通過將PAI-1中和抗體加到纖維蛋白凝膠中培養的成纖維細胞中來降低PAI-1活性，或者本發明中描述的其他方法。因此，疤痕疙瘩成纖維細胞PAI-1活性的增加可以解釋在纖維蛋白凝膠培養時膠原積累的增高。
纖維組織形成是一個動態的過程，該過程中，參與的細胞、ECM和可溶解介體(mediator)之間持續發生相互作用并反饋整合(Clark，Wound RepairOverview and General Considerations，TheMolecular and Cellular Biology of Wound Repair，pp.22-32(Edited by Clark RA.New York，Plenum Press，1996))。前面已經顯示，正常皮膚成纖維細胞可以識別纖維蛋白基質以及將其重塑為含有膠原的疤痕類組織(Tuan等，In vitro fibroplasiamatrixcontraction，cell growth，and collagen production offibroblasts cultured in fibrin gels，Exp.Cell Res.223127-134(1996))。本發明的實施例有證據表明，如同正常的成纖維細胞可以合成膠原并將其沉積入纖維蛋白基質一樣，uPA和PAI-1的活性水平也可以進行調控(圖4和5)。這種在uPA和PAI-1表達中ECM介導的改變可以在隨后利用纖維蛋白、纖維蛋白-膠原混合物或膠原凝膠的實驗中得到證實(圖6)。整合素是調整成纖維細胞和ECM之間相互關系的最可能的候選者，因為在細胞表型中與ECM銜接或脫離的整合素可以調節整合素物種特異性變化(Xu & Clark，Extracellularmatrix alters PDGF regulation of fibroblast integrins，J.CellBiol.132239-249(1996))。進一步的證據可以通過研究膠原凝膠得到。在膠原凝膠中，α2β1整合素結合到膠原上可以提高細胞存活及ECM產量；相反，中斷α2β1結合到膠原上可以誘導MMP2生產/活性，因此，基質降解(Ellerbroek等，Functional interplay betweentype I collagen and cell surface matrix metalloproteinaseactivity，J.Biol.Chem.27624833-24842(2001))。成纖維細胞可以利用含有αv亞單位的整合素結合到纖維蛋白上(Gailit等，Humanfibroblasts bind directly to fibrinogen at RGD sites throughintegrin alpha(v)beta3，Exp.Cell Res.232118-126(1997))。然而，當前研究并不能排除纖維連接素可能與成纖維細胞通過α5β1整合素結合到纖維蛋白凝膠基質上有關，見Clark的Wound RepairOverview and General Considerations，The Molecular andCellular Biology of Wound Repair，pp.22-32(Edited by ClarkRA.New York，Plenum Press，1996)，因為其研究中使用的纖維蛋白原包含痕量纖維連接素(＜0.1g/mg纖維蛋白原)，同時在膠原合成中才用了10％FCS(含有纖維連接素)。因此，纖維蛋白和膠原凝膠中uPA和PAI-1表達的差異可能通過αv整合素或α5β1結合到纖維蛋白/纖維連接素和/或α2β1結合到膠原的差異來介導。
PAI-1活性提高已經成為組織和器官纖維化的一個特點。有證據表明在炎性肺損傷后PAI-1表達的遺傳決定水平與膠原累積程度存在直接關系。在轉基因小鼠中對博來霉素誘導的肺纖維化的研究支持這點(Eitzman等，Bleomacin-induced pulmonary fibrosis intransgenic mice that either lack or overexpress the murineplasminogen activator inhibitor-1 gene，J.Clin.Invest.97232-237(1996))。這些研究基于如下基本原理，即過高的PAI-1活性導致纖維蛋白積累，而這在肺部修復中產生成纖維效應。纖維蛋白是纖維蛋白溶酶最好的培養基，并且其分解產物是趨化的炎癥細胞。(Clark，Wound RepairOverview and General Considerations，同上)。因此，組織損傷部位纖維蛋白的積累是組織纖維化的原因。此外，正常與疤痕疙瘩的成纖維細胞中uPAPAI-1比率的差異在纖維基質降解程度上可反應出來，而一個短期的檢測顯示正常成纖維細胞引起纖維基質降解，但是疤痕疙瘩的成纖維細胞卻不會(Tuan等，Elevated levels of plasminogen activator inhibitor-1 mayaccount for the altered fibrinolysis by keloid fibroblasts，J.Invests Dernlatol.1061007-1011(1996))。另外，用TGF-β處理正常的成纖維細胞可以阻止纖維降解，而TGF-β是PAI-1的潛在誘導者(Keski-Oja等，Regulation of mRNAs for type-1plasminogen activatorinhibitor，fibronectin，and type I pro-collagen by transforming growth factor-beta.Divergentresponses in lung fibroblasts and carcinoma cells，J.Biol.Chem.2633111-3115(1988))。臨床觀察已經揭示在疤痕疙瘩形成前，受影響的區域先發生一個延長的炎癥反應。此外，大多疤痕疙瘩有三個獨特的區域紅斑的外邊緣(擴增/生長區)、內部非紅斑突起的邊界(傳統疤痕疙瘩)以及中央回歸區。由于纖維蛋白與炎癥有關，可以相信在疤痕疙瘩損傷處尤其是外邊緣處，含有更多的纖維蛋白累積。
雖然如此，纖維蛋白作為纖維化的原因的觀點最近在肺部損傷修復的研究中受到挑戰。在缺乏纖維蛋白原α或γ鏈以及循環中無完整的纖維蛋白原的突變小鼠中，用博來霉素處理后的肺纖維化程度與野生型小氯相當(Wilberding等，Development of pulmonary fibrosisin fibrinogen-deficient mice，Ann.N.Y.Acad. Sci.936542-548(2001))。這些研究表明雖然纖維蛋白可以促進纖維化，但是并不能說明是纖維化的首要因素。根據本發明的實施例，通過將PAI-1中和抗體加入到纖維蛋白培養基中，或者通過在纖維蛋白-膠原或膠原凝膠中(這可以減少uPA表達)培養細胞，疤痕疙瘩成纖維細胞中的膠原積累減少，這強力暗示PAI-1的過度表達是疤痕疙瘩纖維化中過度膠原累積的關鍵，而不是纖維蛋白。在無纖維蛋白的情況下，疤痕疙瘩成纖維細胞培養的表層發現了PAI-1過度表達(圖2)(Tuan等，Elevated levels of plasminogen activator inhibitor-1 mayaccount for the altered fibrinolysis by keloid fibroblasts，J.Invests Dernlatol.1061007-1011(1996)；Higgins等，Differential regulation of PAI-1 gene expression in humanfibroblasts predisposed to a fibrotic phenotype，Exp.CellRes.248634-642(1999))和膠原過度產生(Uitto等，Alteredsteady-state ratio of type VIII procollagen mRNAs correlateswith selectively increased type I procollagen biosynthesis incultured keloid fibroblasts，Proc Natl Acad Sci USA.825935-5939(1985))，這進一步支持了PAI-1與疤痕疙瘩纖維化有關。
值得注意的是，本發明實施例中利用胃蛋白酶進行的膠原純化程序只回收了完整的膠原，反應了膠原的累積(Epstein，Alpha-3 humanskin collagen.Release by pepsin digestion and preponderance infetal life，J.Biol.Chez.2493225-3231(1974))。因為膠原產物可以通過間質金屬蛋白酶(MMP)家族中的蛋白水解酶進行翻譯后調節(Rossert & Crombrugghe，Structure，Synthesis，and，Regulation of Type I Collagen.Principles of Bone Biology，SanDiego Academic Press，pp.127-142(1996))，因此，在膠原或纖維蛋白-膠原凝膠中疤痕疙瘩成纖維細胞的膠原累積減少，很可能是由于由纖維蛋白溶酶介導的MMP活性引起的膠原降解(圖9是關于此路徑的概述)。此外，也可能與整合素調節機制有關，因為PAI-1除了作用于細胞生長和凋亡，還可以通過結合到uPA和玻基結合素上而調節整合素介導的細胞粘連和遷移(Stefansson & Lawrence，Theserpin PAI-1 inhibits cell migrationby blocking integrin alphaV beta 3 binding to vitronectin，Nature 383441-443(1996))。因此，在前面所提到的條件下，疤痕疙瘩成纖維細胞的uPA∶PAI-1比率改變可以影響疤痕疙瘩成纖維細胞結合到凝膠基質，并隨后改變成纖維細胞分化和膠原合成的狀態(Ellerbroek等，Functionalinterplay between type I collagen and cell surface matrixmetalloproteinase activity，J.Biol.Chem.27624833-24842(2001)；Streuli，Extracellular matrixremodelling and cellulardifferentiation，Curr.Opin.Cell Biol.11634-640(1999))。這些觀點可以通過使用體外纖維組織形成模型進行進一步的驗證。
當正常成纖維細胞在膠原凝膠中培養時，值得注意的是，在uPA水平增高和PAI-1水平降低的情況下，膠原累積水平不發生變化(圖6和圖7)。這可能是由于在凝膠成纖維細胞收縮過程中在基質形成的等比例張力所造成。先前已經表明作為細胞-基質相互作用的結果，ECM基質中的等比例張力可以用來描述細胞的變化狀態(Nakagawa等，Extracellular matrix organization modulates fibroblast growthand growth factor responsiveness，Exp.Cell Res.182572-582(1989))。因此，脫離組織培養盤的膠原凝膠中的成纖維細胞可以在相關的少量張力下收縮膠原基質，并產生極少量膠原。相反，在附著的膠原凝膠中的成纖維細胞收縮基質并產生不斷增加的張力時，則保持基底的膠原合成(Nakagawa等，同上)。本發明實施例中，纖維蛋白和膠原凝集均附著在培養盤上，因此，沒有觀察到膠原累積有何差別。
疤痕疙瘩上皮也顯示了較正常皮膚和正常疤痕更強的PAI-I表達(圖1)。這也可能具有某些臨床意義，因為成人角質細胞通常不表達PAI-1。它的表達伴有上皮遷移，并且僅僅在創傷修復時出現(Li等，Targeted inhibition of wound-induced PAI-1 expressionalters migration and differentiation in human epidermalkeratinocytes，Exp.Cell.Res.258245-253(2000))。其它絲氨酸或MMP蛋白酶抑制劑如α-1抗胰蛋白酶、α-2巨球蛋白和組織α-球蛋白同樣可以在疤痕疙瘩損傷中檢測到(Diegelmann等，Tissuealpha-globulins in keloid formation，Plast.Reco7zstr.Surg.59418-423(1977))。這些蛋白對疤痕疙瘩纖維形成的作用可以在將來利用體外模型進行驗證。最后，利用三維的基質凝膠系統，本發明實施例證明，PAI-1的過度表達與膠原累積的增加有關。當PAI-1活性被抑制或減少，非正常的膠原累積就會停止，因此，二者之間存在因果關系。圖9是一原理框圖，其描述了在疤痕疙瘩纖維化中的一些重大發現，以及它們與組織損傷修復中的一些關鍵因素或成分。
本發明所引用的論文和專利全部用來作為參考文獻。可以理解，在說明本發明的優選實施方式時，所有的相關描述、特定的實施例以及數據，只是為了闡述本發明的內容，而不是對本發明的限制。對于本領域的熟練人員，可以根據此處所公開的內容，輕而易舉對本發明進行相應的改變和改進。因此，權利要求的保護范圍不應局限于此處的描述。
表1研究中使用的正常皮膚、疤痕和疤痕疙瘩的成纖維細胞

*NK＝不知道
權利要求
1.一種減少創傷愈合過程中膠原過度積累的方法，該方法包括降低PAI-1活性的步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PAI-1活性是通過PAI抑制劑降低的。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PAI抑制劑是間接PAI-1抑制劑或直接PAI-1抑制劑。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的間接PAI-1抑制劑選自于福辛普利、咪達普利、卡托普利、依那普利、L158，809、依普沙坦、曲格列酮、維生素C、維生素E、培朵普利、米非司酮(RU486)、螺內酯和RCL肽。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的直接PAI-1抑制劑選自于PAI-1中和抗體、二酮哌嗪類化合物、羥化四甲銨酸類化合物、羥基醌類化合物和11-酮-9(E)，12(E)-十八碳二烯酸。
6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，將所述的PAI-1抑制劑給藥至創傷愈合過程中的受者。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的PAI-1抑制劑通過如下方式給藥表皮給藥、經皮給藥、經肺給藥、經鼻給藥、眼部給藥、口腔給藥、口服給藥、直腸給藥、陰道給藥以及胃腸外給藥。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的膠原過度積累導致異常疤痕，所述的異常疤痕包括疤痕疙瘩、粘連、肥大疤痕、皮膚外貌損傷、纖維化、纖維囊性、攣縮、硬皮病、Duypuytren病、派羅尼病和關節強直。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的纖維化包括間質纖維化、腎纖維化、肝纖維化、肺纖維化、心臟纖維化、視網膜和玻璃體病。
10.一種抑制由膠原過度積累所形成的異常疤痕的方法，該方法包括降低PAI-1活性的步驟。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的PAI-1活性是通過PAI抑制劑降低的。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的PAI抑制劑是間接PAI-1抑制劑或直接PAI-1抑制劑。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的間接PAI-1抑制劑選自于福辛普利、咪達普利、卡托普利、依那普利、L158，809、依普沙坦、曲格列酮、維生素C、維生素E、培朵普利、米非司酮(RU486)、螺內酯和RCL肽。
14.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的直接PAI-1抑制劑選自于PAI-1中和抗體、二酮哌嗪類化合物、羥化四甲銨酸類化合物、羥基醌類化合物和11-酮-9(E)，12(E)-十八碳二烯酸。
15.如權利要求11所述的方法，其特征在于，將所述的PAI-1抑制劑給藥至已觀察到膠原過度積累情況的受者。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述的PAI-1抑制劑通過如下方式給藥表皮給藥、經皮給藥、經肺給藥、經鼻給藥、眼部給藥、口腔給藥、口服給藥、直腸給藥、陰道給藥和胃腸外給藥。
17.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的異常疤痕包括疤痕疙瘩、粘連、肥大疤痕、皮膚外貌損傷、纖維化、纖維囊性、攣縮、硬皮病、Duypuytren病、派羅尼病和關節強直。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述的纖維化包括間質纖維化、腎纖維化、肝纖維化、肺纖維化、心臟纖維化、視網膜和玻璃體病。
19.一種處理由膠原過度積累所形成的異常疤痕的方法，該方法包括降低PAI-1活性的步驟。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述的PAI-1活性是通過PAI抑制劑降低的。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述的PAI抑制劑是間接PAI-1抑制劑或直接PAI-1抑制劑。
22.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述的間接PAI-1抑制劑選自于福辛普利、咪達普利、卡托普利、依那普利、L158，809、依普沙坦、曲格列酮、維生素C、維生素E、培朵普利、米非司酮(RU486)、螺內酯和RCL肽。
23.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述的直接PAI-1抑制劑PAI-1中和抗體、二酮哌嗪類化合物、羥化四甲銨酸類化合物、羥基醌類化合物和11-酮-9(E)，12(E)-十八碳二烯酸。
24.如權利要求20所述的方法，其特征在于，將所述的PAI-1抑制劑給藥至患有異常疤痕的受者。
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述的PAI-1抑制劑通過如下方式給藥表皮給藥、經皮給藥、經肺給藥、經鼻給藥、眼部給藥、口腔給藥、口服給藥、直腸給藥、陰道給藥和胃腸外給藥。
26.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述的異常疤痕包括疤痕疙瘩、粘連、肥大疤痕、皮膚外貌損傷、纖維化、纖維囊性、攣縮、硬皮病、Duypuytren病、派羅尼病和關節強直。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述的纖維化包括間質纖維化、腎纖維化、肝纖維化、肺纖維化、心臟纖維化、視網膜和玻璃體病。
28.一種確定異常疤痕形成傾向的方法，該方法包括如下步驟a)創傷定位；b)測定PAI-1的活性水平。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述的方法進一步包括如下步驟將PAI-1活性與標準PAI-1活性進行比較，以確定形成異常疤痕的可能性。
30.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述的PAI-1活性水平是由以下方法測定的ELISA、色原實驗、纖維蛋白覆蓋實驗或逆向纖維蛋白覆蓋實驗。
31.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述的異常疤痕包括疤痕疙瘩、粘連、肥大疤痕、皮膚外貌損傷、纖維化、纖維囊性、攣縮、硬皮病、Duypuytren病、派羅尼病和關節強直。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述的纖維化包括間質纖維化、腎纖維化、肝纖維化、肺纖維化、心臟纖維化、視網膜和玻璃體病。
全文摘要
本發明涉及通過降低纖維蛋白溶酶原活化劑－1(PAI－1)活性來抑制膠原的過度沉積，其中，膠原過度沉積可導致形成異常疤痕。這些異常疤痕包括但不限于疤痕疙瘩、粘連、肥大疤痕、皮膚外貌損傷、纖維化、纖維囊性、攣縮和硬皮病，所有這些異常疤痕艘與創傷愈合過程中膠原過度沉積有關或由其引起。因此，一方面，本發明提供了降低PAI－1活性來減少膠原過度沉積、從而阻止異常疤痕形成和/或治療異常疤痕的方法。PAI－1活性可以通過PAI－1抑制劑降低，PAI－1抑制劑包括但不限于PAI中和抗體、二酮哌嗪類化合物、羥化四甲銨酸類化合物、維生素C、維生素E、米非司酮(RU486)和螺內酯等。另一方面，本發明提供了通過測定創傷愈合過程中PAI－1的活性而確定異常疤痕形成可能性的方法。
文檔編號A61K31/56GK1668312SQ03816651
公開日2005年9月14日 申請日期2003年5月13日 優先權日2002年5月13日
發明者段泰嵐, 保羅·D·本亞, 大衛·沃伯頓 申請人:洛杉磯兒童醫院, 加州大學