專利名稱：一種輔酶q的制作方法
技術領域：
本發明涉及將輔酶Q10(CoQ10)，用于制備治療老年性癡呆癥(Alzheimer’sdisease，AD)的藥物。
背景技術：
老年性癡呆癥是一種中樞神經退行性疾病。主要表現為在中年到老年期間有進行性記憶損傷以及智力喪失、記憶障礙、抽象思維障礙、語言行為能力失常、方向障礙等癥狀。從病理學考慮，老年性癡呆主要是由于腦區，包括皮層、海馬、白質等的萎縮；多種神經元尤其是膽堿能神經元的原發性變性；β-淀粉樣蛋白沉積斑和神經纖維纏結的出現與增多等[參見Hoger S.Life Sci1994；55(25/26)1977；Hefti F，Weiner WJ Ann Neurol 1986；20(3)275；Coyle J，Price DL，Delong MR Science 1983；2191184]。隨著世界人口結構的老齡化、AD的發病率的增高，治療AD病藥物的研究越米越受到世界醫約研究機構的重視。AD的發病機制非常復雜，病因至今尚不十分清楚。但大量研究表明它與細胞衰老、神經遞質異常、神經生長因子功能低下以及多基因缺陷有關。在治療藥物方面，由于發病機理不明，缺乏有效的篩選模型，多屬于對癥治療，目前AD治療藥物大致可分為擬膽堿藥物、促進乙酰膽堿釋放藥物、生長因子促進劑、抗Aβ肽藥物，以及腦功能改善藥物等。至今還沒有根治或逆轉病程的理想藥物[參見沈龍，白海靜.中國藥學會學術年會論文集，pp747-749，2000，9寧波]。已開發的化學合成藥物中，大多存在特異性差、毒副作用大、生物利用度低的缺點。因此，近年來對于使用毒副作用小的天然活性物質治療AD的研究越來越受到重視。
CoQ10(Coenzymle Q10)有結構式
CoQ10具有比較廣泛的藥理作用，能夠改善缺血心肌氧利用率，具有心肌線粒體ATP合成賦活作用、心功能低下改善作用、心肌保護作用、抗醛甾酮作用等，已用于臨床多年，以往在臨床上主要用于急慢性肝炎、輕中度充血性心功能不全及癌癥等輔助治療。近年來，國內外對CoQ10的藥理作用研究較為活躍，除用于臨床的藥理作用外，前人的研究還表明[參見Rauchova RT，Lenaz G Slov.Farm.5078-82]CoQ10作為抗氧劑具有延緩衰老作用，并能用于腎病的輔助治療等，但都未涉及其對AD的治療作用。

發明內容
本發明的主要目的在于提供一種CoQ10用于制備治療AD藥物的新用途。
本發明人率先研究了CoQ10對AD模型動物腦內NGF功能的改善作用，研究了對AD模型動物腦內乙酰膽堿轉移酶(ChAT)水平的影響以及對AD模型動物的空間識別障礙和學習記憶能力的影響。
本發明人研究發現CoQ10對AD有很好的防治作用。研究發現CoQ10能顯著提高AD動物大腦皮層ChAT活力；CoQ10能促進AD模型大鼠海馬NGF的轉錄；CoQ10對AD模型動物能改善學習記憶行為。因此CoQ10能用于制備治療老年性癡呆癥的藥物，且CoQ10毒副作用極小。
具體實施例方式
例1CoQ10對AD模型動物大腦皮層乙酰膽堿轉移酶(ChAT)活力的提高作用動物SD大鼠方法1、給藥方案CoQ10用1％CMC-Na混懸均勻。SD大鼠(250-300g)隨機分為5組(每組8只)。分別為假損傷組(2ml1％CMC-Na)，模型組(2ml1％CMC-Na)，CoQ10高劑量組(40mg/kg)，CoQ10中劑量組(20mg/kg)，CoQ10低劑量組(10mg/kg)。于大鼠手術前2周給藥，每日灌胃一次，直至斷頭處死。
2、AD模型動物的制作[參見徐叔云主編 藥理實驗方法學，人民衛生出版社，1988；659-663]采用興奮性氨基酸(NMDA)單側損傷SD大鼠Meynert基底核建立了AD動物模型，大鼠腹腔注射10％水合氯醛生理鹽水溶液(3ml/kg)，10min
后進入麻醉狀態。剪去顱頂切口區毛，水平固定于立體定向儀上。顱頂正中縱向切開，暴露顱骨，記錄前囟坐標。選擇前囟后0.9mm，中縫右側2.6mm，用醫用牙科鉆垂直鉆孔直至大腦皮層。以微量進樣器垂直進針，深度為硬膜下6.8mm，停針2min后注入100nmol NMDA(PH7.4PBS，1μl)，注入時間為5min，停針5min后出針。創口以75％乙醇消毒，牙科水泥封孔，縫合皮膚，肌注雙抗預防感染。假損傷組注射1μlPH7.4PBS。術后數日動物出現吞咽不能，需每日灌胃奶粉溶液。
3、大鼠皮層膽堿乙酰轉移酶(ChAT)活力測定[參見Ivan D.AnalyticalBiochem，1968，2490-95；Chomczynski P.Annal Biochem，1987，162156-161]將大鼠斷頭處死，立即取出全腦，冰上分離前腦皮層(frontal cortex)，測定皮層內ChAT活力。
將皮層組織以PH7.4 10mmEDTA制成5％勻漿(W/V)，加入0.5％(V/V)TritonX-100以保證酶活全部釋放。10,000g離心3min，取上清進行測定。
酶反應底物包括(終濃度)0.2mmol/L乙酰CoA(250,000d.p.m)，300mmol/L NaCl，50mmol/L PB(PH7.4)，8mmol/L氯化膽堿，20mmol/L EDTA(PH7.4)，0.1mmol/L毒扁豆堿。[H3]乙酰輔酶A以未標記的乙酰輔酶A稀釋。
將2μl樣品溶液與5μl底物溶液加入0.5ml Eppendorf管中，離心至管底使充分混合，37℃水浴反應15min。將酶反應管置于閃爍管中，以3mlPBS(10mM，PH7.4)沖洗出內容物。然后向閃爍管中加入2ml含10mg四苯硼鈉的乙腈溶液和10ml甲苯閃爍液[含0.05％2，5-二苯基噁唑和0.02％1，4-雙-(5-苯基噁唑基-2)苯]，輕輕振搖2min，Ach即被抽提至甲苯相中。靜置10min使兩相分離，在LS5000TD液閃儀下測定每分鐘衰變數(d.p.m)。
以Lowry法測定組織勻漿上清中蛋白質含量。
結果AD模型動物連續給藥4周，測定動物大腦皮層ChAT活力，結果見表1。結果表明，銀杏內酯和CoQ10能顯著提高AD動物大腦皮層ChAT活力。表1 CoQ10對AD模型動物大腦皮層ChAT活力的影響組別 動物數 ChAT活力(10-6d.p.m./mg蛋白)假損傷組85.99±0.32AD模型組82.22±0.16##CoQ10(40mg/kg) 89.37±0.29**CoQ10(20mg/kg) 810.51±0.21**CoQ10(10mg/kg) 810.66±0.37*N＝8，##P＜0.01vs假損傷組*P＜0.05vs AD模型組**P＜0.01vs AD模型組例2CoQ10對AD模型動物海馬NGFmRNA水平的影響動物SD大鼠方法1、給藥方案同實例12、AD模型動物的制作同實例13、大鼠海馬總RNA的抽提[參見Awatsuji H.J.Neurosci Res，1993，34539-542]大鼠斷頭，無菌操作取海馬，加入1mlTrizol試劑勻漿，室溫靜置5min，15～30℃水浴5min，以使核蛋白復合物充分解離。加入0.2ml氯仿劇烈振搖片刻，15～30℃水浴3min，4℃離心12000g×15min。抽提上清于另管，加0.5ml異丙醇沉淀，15～30℃水浴10min，4℃離心12000g×10min，棄上清。用1ml75％冷乙醇洗滌，4℃離心7500g×5min，棄上清，于超凈臺中風干沉淀。用DEPC處理的水溶解沉淀，55～60℃水浴10min，以充分溶解。取適量稀釋后測OD260和OD280，計算OD260/OD280比值及RNA濃度(OD260×33μg/ml×稀釋倍數)。
4、RNA逆轉錄合成cDNA2μg總RNA與1μl random primer(0.5μg/μl)加5μl M-mlv逆轉錄酶反應緩沖液5μl，70℃溫浴5min，立即冷卻至0℃，室溫靜置片刻，依次加入4×dNTP(10mmol/L)1.5μl，Rnasin RibonucleaseInhibitor(40U/μl)0.5μl及M-mlv逆轉錄酶(10U/μl)1μl，加DEPC處理水至終體積25μl，輕輕混勻。37℃水浴反應60min，反應結束后95℃加熱5min，使逆轉錄酶失活，0℃儲存。
5、PCR擴增NGF和β-肌動蛋白基因擴增NGF基因所用引物的序列如下，預期擴增片段長度為735bp[Ullrich T.Nature，1983，303821-825；Boehringer M.生化資訊，1997，27-10]。
5′--Primer5′-GTA ATG TCC ATG TTG TTC TAC ACT CTG-3′3′--Primer5′-GGC AAG TCA GCC TCT TCT TGT AGC CTT CC-3′PCR系統如下模板cDNA5μl(相當于400ng總RNA)，4×dNT(10mM)2μl，10×Buffer(20mM MgCl2)10μl，5′-，3′-引物(均為10μM)各5μl，Taq DNApolymerase plus 1μl(5U/μl)，補加無菌雙蒸水至終體積100μl。封石蠟油后離心分層，置PCR儀上95℃變性5min，按如下程序循環30次94℃ 1min→57℃ 1.5min→72℃ 1.5min。然后保持72℃ 10min，再降至4℃。
擴增β-肌動蛋白基因作為對照，所用引物的序列如下，預期擴增片段長度為587bp，PCR條件同上，循環22次。
5′--Primer5′-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3′3′--Primer5′-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C-3′PCR產物以1.5％瓊脂糖凝膠電泳，經溴化乙錠(EB)染色后，用Gel Doc1000型凝膠成像分析儀測定各條帶的掃描積分值。
6、RT-PCR法分析各組大鼠海馬NGFmRNA水平分離各組大鼠海馬總RNA并RT成cDNA，PCR擴增NGF(N)和β-肌動蛋白(A)基因，以兩者PCR產物電泳條帶掃描之比值(N/A)代表NGFmRNA水平。各組掃描比值進行t-檢驗，比較各組間NGFmRNA水平的差異。
結果用RT-PCR法測定了各組大鼠海馬NGFmRNA的水平，每組樣本8個，掃描結果經t-檢驗，表明損傷組水平明顯低于假損傷組，而CoQ10高中劑量組較損傷組水平顯著升高(表2)。由此可見CoQ10能促進AD模型大鼠海馬NGFmRNA的轉錄。表2 CoQ10對AD模型動物海馬NGFmRNA水平的影響組別 動物數 NGFmRNA水平(N/A)假損傷組 81.462±0.182AD模型組 81.012±0.156##CoQ10(40mg/kg)81.358±0.193**CoQ10(20mg/kg)81.235±0.061**CoQ10(10mg/kg)81.128±0.068*N＝8，##P＜0.01vs假損傷組*P＜0.05vs AD模型組**P＜0.01vs AD模型組例3CoQ10對AD模型動物空間辨別學習記憶行為的改善作用動物SD大鼠方法1、給藥方案同實例12、AD模型動物的制作同實例13、空間辨別學習記憶實驗SD大鼠手術后15日，以Y迷宮法觀察動物空間辨別學習記憶能力[參見Fonnum F.J.Of Neurochem，1975，24407-409]。將大鼠放入迷宮箱內適應環境5min，然后驅趕至I臂(起始區)，停留2min后給予電擊(50～70V)，大鼠遭電擊后直接逃至II臂(安全區)為正確反應，停留于I臂及逃入III臂(電擊區)皆為錯誤反應。大鼠在安全區停留1min后，再以此區作為起始區給予電擊，連續循環電擊訓練(安全區轉換方向為I→II→III→I)。以大鼠連續10次電擊訓練均為正確反應或10次中有9次正確反應作為達到訓練標準。每日連續學習的電擊次數不超過20次，每日訓練一回。記錄每一回訓練中正確反應的次數及每日訓練中各組達到標準的個體的比率。
結果動物連續給藥4周，用Y型迷宮檢測動物空間辨別和學習記憶行為，結果見表3和表4。結果表明銀杏內酯和CoQ10組大鼠每回訓練正確反應次數均高于模型動物組，達標率也高于同回的模型組。表3 CoQ10對AD模型動物空間辨別學習記憶行為的影響藥物大鼠每回訓練的正確次數1 2 3 45假損傷組 3.1±1.36.4±1.1 8.6±3.0 14.3±4.1AD模型組 1.8±1.0# 2.7±0.8##6.7±2.0 9.5±3.3#14±3.9CoQ10(40mg/kg) 1.9±0.98.9±2.5**13.8±3.0**CoQ10(20mg/kg) 1.8±0.97.0±1.3**10.5±2.1** 14.1±1.9**CoQ10(10mg/kg) 1.6±0.87.5±0.5**11.0±4.9** 13.8±1.5*N＝8，##P＜0.01vs假損傷組*P＜0.05vs AD模型組**P＜0.01vs AD模型組表4 CoQ10對AD模型動物空間辨別學習記憶行為的影響藥物 大鼠每回訓練的達標比率1 2 3 4 5 6假損傷組 0 0 12.562.5100AD模型組 0 0 12.525.062.5100CoQ10(40mg/kg) 0 25.087.5100CoQ10(20mg/kg) 0 12.575.0100CoQ10(10mg/kg) 0 12.575.087.5100
權利要求
1.一種輔酶Q10的用途，其特征是用于制備治療老年性癡呆癥的藥物。
全文摘要
一種輔酶Q
文檔編號A61P25/28GK1389201SQ02112760
公開日2003年1月8日 申請日期2002年3月14日 優先權日2002年3月14日
發明者高向東, 姚文兵, 吳梧桐, 李明 申請人:中國藥科大學