專利名稱：臍血造血干細胞的制作方法
技術領域：
本發明方法涉及一種血液制品的制作方法，特別是一種臍血造血干細胞的制作方法。
背景技術：
造血干細胞是能夠產生血細胞(紅細胞、白細胞、血小板)和免疫活性細胞的一類特殊細胞。紅細胞負責運輸氧氣，白細胞抵抗入侵的病原微生物，血小板有凝血作用，免疫活性細胞構成人體的免疫防御體系。當病人的造血干細胞受到損害或惡變時，將正常的造血干細胞移植到病人體內取代異常的造血干細胞，使之重建正常造血和免疫功能，這是目前治療惡性及非惡性血液病、某些遺傳性病和惡性腫瘤的最有效的方法。對上述的病癥的一般的治療方法是采用骨髓移植法，骨髓移植的最大障礙是找到一個組織配型基因完全相同的供者，另外骨髓采集需要使用麻醉劑，會給供者造成不適，骨髓移植準備工作耗費時間，影響病人及時治療。胎兒臍血中含有大量造血細胞，以臍血作為造血干細胞移植的新來源，是20世紀末醫學領域取得的重要成果之一。目前，臍血造干細胞移植已成功治愈了白血病，嚴重免疫缺陷癥和某些遺傳性疾病等。由于臍血來源廣泛對供者無任何痛若，取血方法簡便，和可以血庫形式長期保存，便于查詢取用及時方便的優點，展望未來，臍血可能取代骨髓成為造血干細胞主要來源，特別是對兒童病患者。
本

發明內容
本發明的目的是提供一種臍血造血干細胞的制作方法，以此方法制作的造血干細胞可長期存放于臍血庫，以便于病人隨時配組、治療取用，大大地方便了治療，及時救治病人。此外，本發明的實施還會具有顯著的社會和經濟效益。
本發明的目的是按如下技術方案實現的。臍血造血干細胞的制作方法，其特征是它按如下步序進行(1)采集臍血，將出生的胎兒的臍血采到臍血采集袋內；(2)加入紅細胞沉淀劑，將紅細胞沉淀劑加入到臍血采集袋中；(3)離心分離1，用離心方法將臍血采集袋中臍血中的紅細胞分離；(4)移出紅細胞，將臍血采集袋中被分離的紅細胞輸送到紅細胞收集袋內；(5)離心分離2，用離心方法將臍血收集袋中的血漿與白細胞包括造血干細胞再一次分離；(6)移出血漿，將臍血采集袋中被分離的血漿輸入到血漿收集袋內，臍血收集袋內剩余的為含干細胞的白細胞；(7)加入冷凍劑，將臍血收集袋中的包括干細胞的白細胞中加入冷凍劑；(8)包裝，將含干細胞的白細胞包裝；(9)降溫，將包裝的含干細胞的白細胞降溫；(10)入庫保存，入庫在液氮中保存。
所述步序(2)采用的沉淀劑為6％羥乙基淀粉，按與臍血比例1∶3-5加入。所述步序(7)中冷凍劑為二甲亞砜，與等容積的右旋糖酐40混合預冷后以1∶4比例加入經預冷的含造血干細胞的白細胞中。所述步序(9)的降溫是將包裝有含造血干細胞的白細胞的金屬保存盒放在降溫儀內，開始降溫速度為8-10℃/分，開始凍結溫度為-3℃，停止凍結溫度為-10--15℃，凍結后降溫速度為2℃/分，終止降溫溫度為-50℃。所述步序(3)的操作是將臍血采集袋的帶有接駁頭的一端朝下放在離心機中，所述步序(4)的操作是將臍血采集袋帶有接駁頭的一端朝下，用II型連接管從接駁頭引出，經I型連接管引到紅細胞袋中。所述步序(5)的操作是將臍血采集袋的帶有接駁頭的一端朝上安放在離心機中；所述步序(6)的操作是將臍血采集袋帶有接駁頭的一端朝上，用II型連接管從接駁頭處將血漿引出至血漿袋中。所述的I型連接管包括尖插頭、連管體、支管，尖插頭的尾部與連管體的單端口相連，連管體的另一端具有至少二個端口，分別經支管與紅細胞袋及血漿袋相連。所述II型連接管包括尖插頭、連管體、支管、分支管、隔膜管，尖插頭的尾部與連管體的單端口相連，連管體的另一端具有若干端口，各端口經支管與下一級連管體相連，在一支管的端頭上具有隔膜管，另一支管的端頭與下一級連管體的單端口相連。
本發明方法采用逐步分離的方法將采集到的臍血經離心分離將臍血中的血紅細胞首先分離取出，然后再將血漿分離取出，將含有造血干細胞的白細胞加冷凍劑進行包裝、冷凍，放入臍血庫保存，以備隨時取用。為了防止在各操作、傳遞中產生差錯，在每一步序操作之前必須進行核查該臍血采集袋，紅細胞收集袋、以及用于抽取紅細胞成份的注射器上的標記(條碼號)是否一致，同樣在其它操作如加入冷凍劑操作時也應核對該臍血采集袋、冷凍袋、冷凍保存盒上的標記是否一致。
由于上述操作特別是紅細胞、血漿的移出，抽樣檢測，加入沉淀劑、冷凍劑等操作，使用常規的取血方法和注射分離器械已不能確保在操作過程中不發生污染，達不到生物制品GMP的要求。此外，常規器械在操作中易混亂、工作效率低，計量不易準確。采用本發明提供的制作方法和臍血收集袋、I和II型連接管及其血漿袋、紅細胞袋，能避免上述普通器械的缺點，達到不會發生污染、不會發生血樣混亂，且計量準確、工作效率顯著提高的目的。
綜上所述，本發明由于采用胎兒的臍血為原料，加以處理，制成造血干細胞，可將其低溫長期存放在臍血血庫中，以隨時根據病人要求取出使用，避免了采用骨髓移植時的不易尋找捐贈人和即時移植的種種不便，使病人得到及時治療。此外，由于臍血造血干細胞的生產制作在中國尚處于初創階段，本發明填補了這方面的空白，本發明的實施還將會改變中國長期以來造血干細胞來源缺乏的局面，也會具有顯著的社會效益和經濟效益。


圖1為本發明的制作流程示意圖，圖2、3、4、5為紅細胞、血漿移出和添加操作示意圖。
實施例通過本實施例來具體說明本發明臍血造血干細胞的制作方法。臍血存在于胎盤和與胎兒連接的臍帶血管內，在胎兒出生的時候采集，臍血為造血干細胞的原材料。按圖1所示步序進行制作(1)采集臍血，將胎兒臍血采集到臍血采集袋1內；如圖2，該臍血采集袋1一端帶有接駁頭12另端具有懸掛口13和懸掛孔13A用于懸掛，臍血采集袋1內裝臍血11，經篩選臍血質量應達規定標準，本實施例中，臍血應達到無病原體感染，未攜帶遺傳病基因，低凝血，和細胞具有良好的存活能力，檢測是否達標。
(2)加入紅細胞沉淀劑，連接臍血采集袋1和II型連接管2，將紅細胞沉淀劑通過II型連接管的隔膜管23A或24加入到臍血采集袋內，本實施例采用6％羥乙基淀粉與臍血比例為1∶5，將該沉淀劑注入到臍血采集袋1內，充分混勻。
(3)離心1；用離心方法將臍血采集袋1中臍血11中的紅細胞14分離，本實施例中采用離心機，將臍血采集袋帶接駁頭12的一端朝下放入低溫離心機，離心后，紅細胞14沉淀在采集袋的帶接駁頭12的一端。
(4)移出紅細胞，如圖3，將臍血采集袋1中被分離的紅細胞14輸送到紅細胞收集袋4內。先將臍血采集袋1從離心機取出，采集袋1的接駁頭12朝下，將與臍血采集袋1相連的I型連接管的紅細胞收集袋4放在較低的位置，使紅細胞14從臍血收集袋1的底部緩慢流入紅細胞收集袋4中。
做法是，在無菌操作臺內，將血液分離用I型連接管3的尖插頭31與II型連接管的隔膜管24相連，按照離心時臍血采集袋1朝向的位置，將臍血采集袋1懸掛在墻的勾子上。將連在I型連接管3上的紅細胞(收集)袋4放在電子秤6上(圖3)。離心后紅細胞14沉淀下來，通過重力和使用止血鉗33控制紅細胞14從臍血袋1到紅細胞袋4的流速。當紅細胞量達到電腦指示的量時，停止紅細胞移出，熱合與紅細胞袋4相連的支管32，分離紅細胞袋4。
(5)離心2，用離心方法將白細胞包括造血干細胞與臍血收集袋中剩余的血漿再一次分離，用離心機進行分離，將臍血采集袋放入低溫離心機，在離心運行后，大于99％的白細胞包括造血干細胞與血漿分離。第二次離心時，將臍血采集袋1的接駁頭12一端朝上(圖4)，離心后，保持上述位置。
(6)移出血漿，將臍血采集袋1從離心機中取出，將臍血采集袋接駁頭12一端的懸掛孔13A懸掛在分漿器(未示出)上，通過分漿器上夾板對臍血采集袋1的壓力，和使用止血鉗33控制血漿15從臍血采集袋1到血漿袋5的流速，當含有紅細胞沉淀液的血漿15的移出量達到電腦指示的量時，夾緊與血漿袋5相連的支管32上的夾子33，使臍血采集袋1內剩余的為包括造血干細胞的白細胞16，即富集白細胞。
(7)加入冷凍劑，將臍血采集袋1中的富集白細胞臍血中加入冷凍劑。本實施例采用的冷凍劑為2.5ml的二甲亞砜(Dimethyl sulphoxide)，將其與等容積的右旋糖酐40(Dextran40)混合后，以混合液按1∶4的比例通過連接管快速加入到臍血收集袋1內的富集白細胞臍血中，加入之前混合液和富集白細胞均需預冷。其操作為血漿移出后，將冷凍袋7通過II型連接管2與臍血袋1相連(圖5)。從II型連接管的扭斷式隔膜管24處注入5ml冷凍劑后，將含有冷凍劑的濃縮白細胞16從臍血采集袋1轉入冷凍袋7，熱合與II型連接管2相連的支管22后，使冷凍袋7分離。
(8)將冷凍袋7放入FEP塑料保護袋內，真空密合后，裝入冷凍保存盒內。
(9)降溫；將冷凍保存盒降溫，放在液氮保存系統的降溫儀的液氮氣相層內進行降溫，開始降溫速度為10℃/分，開始凍結溫度為-3℃，停止凍結溫度為-10℃，凍結后降溫速度為2℃/分，終止降溫速度為-50℃，(10)入庫液氮保存；在液氮保存系統內自動將冷凍保存盒從液氮氣相層轉入到液氮的液相層保存，溫度為-196℃。
如圖2，該II型連接管2包括尖插頭21、連管體21A、支管22，分支管23、隔膜管24，尖插頭21的尾部與連管體21A的單端口相連，連管體21A的下端具有若干端口，本實施例為2個端口，右端經支管22與下一級連管體21B相連，連管體21B可再下分為多級隔膜管23A。左端支管22的下端頭為連管體21B，下端可與分支管23、下一級連管體21C的單端口相連以便形成多級連管分支，多級分支的末端為隔膜管24，用于插入該尖插頭或注射器來抽取或添加之用。如圖3，I型連接管3包括尖插頭31、連管體31B、支管32，尖插頭31的尾部與連管體31B的單端口相連，連管體31B另一端具有二個端口，分別經支管32與紅細胞袋4及血漿袋5相連。當使用時，如圖3，II型連接管2的尖插頭21插入采血袋1的接駁頭12中，I型連接管3的尖插頭31插入II型連接管2的隔膜管24中，將紅細胞經II型連接管2和I型連接管3的支管32引入到紅細胞袋4中，或如圖4引入到血漿袋5中。引出重量由電子秤6顯示。由于I、II型連接管均可具有多個、多級支管，可同時連接多個血漿袋或和紅細胞袋，使血液分離簡化、準確、高效、不致污染。
在上述加工過程中，各步序操作時均有檢測，以免發生差錯，如在步序(1)后留樣檢測傳染病、血型，如在步序(4)移出紅細胞后，將移出的紅細胞進行組織配型檢測。做法是將移出的紅細胞成份分裝在數個冷凍小管內，用于組織配型檢測以備今后應用。在步序(6)，移出血漿后，要對富集白細胞進行檢測，包括檢測細胞數量，細胞成活率、細胞集落培養等，可按常規做法辦理。在步序(8)之后，進行檢測步序(81)，先將冷凍袋內含冷凍劑的細胞液返回到步序(7)的臍血袋1內，再送回冷凍袋，接著進行檢測步序(82)，將血漿袋內的血漿返回臍血袋，再將血漿送到血漿袋，目的是檢測干細胞在處理過程時經過的所有途徑是否受到病原菌污染，以保證干細胞的質量。又如在步序(8)富集白細胞轉入冷凍袋之前也需進行細胞成活率檢測，以保證質量。管理上的措施是防止同時處理二份以上臍血時發生混亂，導致惡性事故發生，一般在各主要步序均經核查，要有第二者進行核查臍血采集袋、紅細胞收集袋、及用于抽取紅細胞成份的注射器上的條碼號是否一致。核查紅細胞收集袋、用于抽取紅細胞成份的注射器及儲存試管上的條碼是否一致，以免出錯。在步序(8)要由第二者進行核查該臍血袋、冷凍袋、冷凍保存盒上的條碼是否一致。在各個步序中均設有登記表，按要求登記以方便管理避免出錯。此外，本發明方法的各步序均可采用電腦控制，特別是重量配比，各操作參數控制、各種試管、注射器等配套識別，以及試驗取得的數據存儲，則可大大節省一些煩瑣的核查登記工作。
權利要求
1.臍血造血干細胞的制作方法，其特征是它按如下步序進行(1)采集臍血，將出生的胎兒的臍血采到臍血采集袋內；(2)加入紅細胞沉淀劑，將紅細胞沉淀劑加入到臍血采集袋中；(3)離心分離1，用離心方法將臍血采集袋中臍血中的紅細胞分離；(4)移出紅細胞，將臍血采集袋中被分離的紅細胞輸送到紅細胞收集袋內；(5)離心分離2，用離心方法將臍血采集袋中的血漿與白細胞包括造血干細胞再一次分離；(6)移出血漿，將臍血采集袋中被分離的血漿輸入到血漿收集袋內，臍血采集袋內剩余的為含造血干細胞的白細胞；(7)加入冷凍劑，將臍血采集袋中的含造血干細胞的白細胞中加入冷凍劑；(8)包裝，將加入冷凍劑的含造血干細胞的白細胞包裝；(9)降溫，將加入冷凍劑的含造血干細胞的白細胞降溫；(10)入庫保存，入庫在液氮中保存。
2.根據權利要求1所述的臍血造血干細胞的制作方法，其特征是所述步序(2)采用的沉淀劑為6％羥乙基淀粉，按與臍血比例1∶3-5加入。
3.根據權利要求1所述臍血造血干細胞的制作方法，其特征是所述步序(7)中冷凍劑為二甲亞砜，與等容積的右旋糖酐40混合預冷后以1∶4比例加入經預冷的含造血干細胞的白細胞中。
4.根據權利要求1所述臍血造血干細胞的制作方法，其特征是所述步序(9)的降溫是將包裝有含造血干細胞的白細胞的金屬保存盒放在降溫儀內，開始降溫速度為8-10℃/分，開始凍結溫度為-3℃，停止凍結溫度為-10--15℃，凍結后降溫速度為2℃/分，終止降溫溫度為-50℃。
5.根據權利要求1所述臍血造血干細胞的制作方法，其特征是所述步序(3)的操作是將臍血采集袋的帶有接駁頭的一端朝下放在離心機中，所述步序(4)的操作是將臍血采集袋帶有接駁頭的一端朝下，用II型連接管從接駁頭引出，經I型連接管引到紅細胞袋中。
6.根據權利要求1所述臍血造血干細胞的制作方法，其特征是所述步序(5)的操作是將臍血采集袋的帶有接駁頭的一端朝上安放在離心機中；所述步序(6)的操作是將臍血采集袋帶有接駁頭的一端朝上，用II型連接管從接駁頭處將血漿引出至血漿袋中。
7.根據權利要求5所述的方法中使用的連接管，其特征是所述的I型連接管包括尖插頭、連管體、支管，尖插頭的尾部與連管體的單端口相連，連管體的另一端具有至少二個端口，分別經支管與紅細胞袋及血漿袋相連。
8.根據權利要求5或6所述的方法中使用的連接管，其特征是所述II型連接管包括尖插頭、連管體、支管、分支管、隔膜管，尖插頭的尾部與連管體的單端口相連，連管體的另一端具有若干端口，各端口經支管與下一級連管體相連，在一支管的端頭上具有隔膜管，另一支管的端頭與下一級連管體的單端口相連。
9.根據權利要求1所述的臍血造血干細胞的制作方法，其特征是在步序(4)移出紅細胞后，將移出的紅細胞進行組織配型檢測，做法是將移出的紅細胞分裝在數個儲存試管內進行組織配型檢測。
10.根據權利要求1所述的臍血造血干細胞的制作方法，其特征是在步序(8)之后的檢測(81)為先將冷凍袋內含冷凍劑的細胞液返回到步序(7)的臍血袋內，再送回冷凍袋，接著進行檢測(82)為將血漿袋內的血漿返回到臍血袋，再將血漿送到血漿袋。
全文摘要
臍血造血干細胞的制作方法，按如下步序進行(1)采集臍血，將出生的胎兒的臍血采到臍血采集袋內；(2)加入紅細胞沉淀劑；(3)離心分離1，將臍血采集袋中臍血中的紅細胞分離；(4)移出紅細胞，將紅細胞輸送到紅細胞收集袋內；(5)離心分離2，將白細胞包括造血干細胞與血漿再一次分離；(6)移出血漿，將被分離的血漿輸入到血漿收集袋內，臍血收集袋內剩余的臍血為含富集白細胞的臍血；(7)加入冷凍劑，將臍血收集袋中的富集白細胞臍血中加入冷凍劑；(8)包裝；(9)降溫；(10)入庫保存。用本發明方法制作的造血干細胞可長期存放，以便于隨時取用，大大地方便了治療，及時解除病人痛苦，適用于制作在臍血庫中長期存放的造血干細胞。
文檔編號A61K35/14GK1436843SQ0210367
公開日2003年8月20日 申請日期2002年2月8日 優先權日2002年2月8日
發明者劉頡 申請人:劉頡