專利名稱：一種新型纖溶酶原激活劑(tpa)突變體的結構與用途的制作方法
溶栓治療是處理急性心肌梗塞的重大進展。組織纖溶酶原激活劑(tissue plasminogenactivator，TPA)是血中纖溶系統的生理性激活劑。由于TPA與血栓基質纖維蛋白具有較強的特異親和力，能在血栓局部有效的激活纖溶酶原為纖溶酶而使血栓溶解。TPA與鏈激酶、尿激酶等溶栓劑比較具有作用快、不造成全身之纖維蛋白溶解、療效高等優點。由德國勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)生產的CHO細胞表達的重組人TPA(CHO-TPA，阿替普酶，alteplase，actilyse)已成功地用于急性心肌梗塞等血栓性疾病。但作為溶栓劑，TPA亦有不足之處。如在體內可被肝細胞快速清除，在血漿中存在纖溶酶原激活劑抑制劑可快速抑制其活性。t-PA在血中的半衰期很短(1-5分鐘)，使臨床溶栓治療時為維持有效濃度需大劑量(100mg)靜脈滴注，增加了系統性纖溶引起出血的危險。因此研制特異性好、半衰期長、用量小、使用方便的新型t-PA受到關注。
TPA分子結構與其特定的功能特性有關。天然TPA由527個氨基酸組成(Pennica D，etal.Nature 301214，1983)，指狀區(F，氨基酸1-99)與高纖維蛋白結合有關；kringle 1區(K1，氨基酸100-175)為肝臟受體結合部位；kringle2區(K2，氨基酸176-261)為低纖維蛋白結合區；蛋白酶區(P，氨基酸262-527)對纖溶酶原有專一性，為PAI-1結合位點；碳水化物區為血漿清除TPA的介導物。幾種新纖溶酶原激活劑都是在此發現基礎上設計的。通過對天然組織型纖溶酶原激活劑(TPA)分子進行結構改造，開發出了組織型纖溶酶原激活劑重組變異體K2P、瑞替普酶(reteplase)、n-PA及TNK等。
Weldenstrom M等(Weldenstrom M，et al.Gene.99243-248，1991)報道了TPA突變體K2P(氨基酸1-5和174-527，Asn177Ser和Asn184Gln)在腸桿菌中的表達。KohnertU等在TPA突變體K2P的基礎上研制了瑞替普酶(Kohnert U，et al.Protein Engineering593，1992，專利號EP 0 382 174 A1)。瑞替普酶是一含355個氨基酸的單鏈分子，在大腸桿菌中表達。它不具有碳水化物鏈、指狀區、表皮生長因子區和kringle1區，只含有kringle2區和絲氨酸蛋白酶區(氨基酸1-3和176-527)，整個分子的性質因此大大改變。首先它與纖維蛋白的結合率遠低于天然TPA，并且是可逆結合，未結合的瑞替普酶能進入血凝塊，促進纖維蛋白溶解。其次，清除率較低，半衰期較長(18分鐘)，從而降低了維持治療水平所需要的藥量(20-40mg)，并可通過靜脈注射給藥(2分鐘內注入)。Martin等(Martin U，et al.JACC 19433，1992)比較了瑞替普酶、阿替普酶(alteplase)、黑色素瘤TPA(melanoma TPA)和尿激酶的體外溶血塊活性。結果表明，瑞替普酶和阿替普酶的最大溶栓能力在等價濃度時是相近的。Martin等的研究表明，與阿替普酶相比，瑞替普酶溶解富血小板血漿凝塊和陳舊凝塊的能力較低。這正是瑞替普酶減少出血的原因，因為封閉損傷血管壁的血凝塊是陳舊血凝塊。與阿替普酶不同，瑞替普酶主要通過腎臟清除。臨床試驗顯示重組變異體瑞替普酶(reteplase)在60分鐘時梗塞相關冠狀動脈的總開放率和完全開放率優于阿替普酶，而安全性相當。基于瑞替普酶的上述優點，美國FDA在1998年批準了瑞替普酶上市。但瑞替普酶結構中仍包含有PAI-1結合位點，人體血液中的PAI-1能與其結合而抑制其活性。體外實驗顯示5U/ml的PAI-1可使5ng/ml的瑞替普酶失活。而有報道心肌梗塞等血栓病人血中PAI-1濃度高于正常人，所以必然降低瑞替普酶的效果，增加其用量。
本發明的目的是根據TPA的結構特點，在瑞替普酶的基礎上將PAI-1位點氨基酸進行突變，構建具有TPA活性且其活性不被PAI-1抑制的新一代TPA突變體。本發明的主要內容是參照文獻(Pennica D，et al.Nature 301214，1983)從人骨髓瘤細胞中分離總RNA，按文獻報道的t-PA cDNA序列設計引物用RT-PCR法擴增出全長編碼區序列，克隆于pUC18載體，經測序完全正確。參照文獻(Kohnert U，et al.Protein Engineering593，1992，專利號EP 0 382 174 A1)用PCR法擴增出瑞替普酶的DNA(TPA氨基酸1-3和176-527)，并克隆于大腸桿菌表達載體。經過測序證明序列完全正確后，將瑞替普酶DNA中PAI-1結合位點，核苷酸序列373-384的AAG CAC AGG AGG改變為GCGGCC GCG GCG，使相應的氨基酸KHRR突變為AAAA，構建了新的TPA突變體，并克隆于大腸桿菌表達載體。經過測序證明序列完全正確后，轉化大腸桿菌，在大腸桿菌中得到高效表達。表達蛋白占總菌體蛋白的30％，以包涵體形式存在。經蛋白質復性，得到了有活性的TPA突變體。將新的TPA突變體，克隆于比赤酵母分泌型表達載體，在培養上清中得到高活性(2000U/ug)的TPA突變體。建立了t-PA纖溶酶原水解活性及PAI-1抑制TPA活性等測定方法。在大腸桿菌和比赤酵母表達的新的TPA突變體5ng/ml與PAI-1 15U/ml室溫反應15分鐘后TPA活性無抑制，而天然CHO-TPA活性全部被抑制。制備并純化了兔抗CHO-TPA抗體。用免疫印跡法顯示在大腸桿菌和比赤酵母表達的瑞替普酶突變體能被抗CHO-TPA抗體識別。
新的TPA突變體的DNA序列含有1068個核甘酸堿基，包含起始密碼ATG，具體序列(5’-3’)如下1atgtcttaccaaggaaacagtgactgctactttgggaatgggtcagcctaccgtggcacg 6061 cacagcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggc 120121 aaggtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattac 180181 tgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctg 240241 acgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagccag 300301 cctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggct 360361 gccatctttgccgcggccgcggcgtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactc 420421 atcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccac 480481 cacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaa 540541 tttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgac 600601 attgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcccaggagagcagcgtggtc 660661 cgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggactggacggagtgtgagctc 720721 tccggctacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcggagcggctgaaggaggct 780781 catgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtc 840841 accgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcac 900901 gacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgact 960961 ttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtac 10201021 accaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatgcgaccg 1068
新的TPA突變體的氨基序列如下(M為起始的蛋氨酸)(M)1 SYQGNSDCYF GNGSAYRGTH SLTESGASCL PWNSMILIGK VYTAQNPSAQ51 ALGLGKHNYC RNPDGDAKPW CHVLKNRRLT WEYCDVPSCS TCGLRQYSQP101 QFRIKGGLFA DIASHPWQAA IFAAAAASPG ERFLCGGILI SSCWILSAAH151 CFQERFPPHH LTVILGRTYR VVPGEEEQKF EVEKYIVHKE FDDDTYDNDI201 ALLQLKSDSS RCAQESSVVR TVCLPPADLQ LPDWTECELS GYGKHEALSP251 FYSERLKEAH VRLYPSSRCT SQHLLNRTVT DNMLCAGDTR SGGPQANLHD301 ACQGDSGGPL VCLNDGRMTL VGIISWGLGC GQKDVPGVYT KVTNYLDWIR351 DNMRP根據本發明，所列出的TPA突變體的DNA序列以及由此編碼的氨基酸序列可以在大腸桿菌和酵母中表達出的纖溶酶原水解活性的TPA突變體，且其纖溶酶原水解活性不被PAI-1抑制。說明核苷酸序列373-384和其相對應的氨基酸序列影響PAI-1結合活性，而不影響其纖溶酶原水解活性。該突變體裁有可能成為活性好、用量少的治療血栓性疾病的新型生物工程藥物。
本發明的實施對嚴重危害人類健康的心肌梗塞和腦血栓等血栓性疾病的治療具有重要的社會效益和經濟效益。結合


本發明的具體實施方法圖1.截短形式的tPA重組質粒mtPA-pET28a的構建圖2.缺失PAI-1位點的TPA突變體表達質粒mtPA4A-pAC177-pET28a構建圖3.天然tPA截短形式片段PCR產物的瓊脂糖電泳圖4.重組質粒mtPA-pet28a陽性克隆的酶切鑒定圖5.原核表達重組質粒mtPA4A-pAC177-pET28a的酶切鑒定圖6.TPA突變體在大腸桿菌表達的SDS-PAGE圖7.大腸桿菌表達的TPA突變體的活性圖8.PAI-1對CHO-TPA及大腸桿菌表達TPA突變體活性的影響圖9.真核(酵母)表達TPA突變體重組質粒pPIC 9K/mtPA4A的構建圖10.真核(酵母)表達TPA突變體重組質粒pPIC 9K/mtPA 4A的鑒定圖11.TPA突變體重組質粒在真核細胞中表達的Western-blot圖12.真核(酵母)表達TPA突變體的活性圖13.PAI-1對CHO-TPA及真核(酵母)表達TPA突變體活性的影響實施例一tpA突變體在大腸桿菌中的表達材料與方法1.天然tpA截短形式片段的制備1.1模板，含全長TPA cDNA序列的puc18質粒(由本實驗室構建)1.2引物設計上游引物P1(5’CATGCC ATG GGG TCT TAC CAG GGA AAC AGTGAC 3′33個nt)含有NdeI酶切位點和ATG翻譯起始密碼子及甘氨酸密碼GGG；下游引物P2(5’CGG GAT CCT CAC GGT CGC ATG TTG TCA C 3’，28個nt)含有BamHI酶切位點和TGA終止密碼子。1.3 PCR擴增擴增產物為截短形式的tPA基因片段含天然tPA氨基酸1-3和176-527。2.截短形式的tPA重組質粒的構建(圖1)將PCR擴增產物進行酚抽提，然后與pET28a載體，分別用NcoI/BamHI進行雙酶切，用1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片斷，酚抽提。DNA的酶切，連接及轉化均參照Sambrook方法進行。感受態細胞為自制的E.coliDH5a。3.克隆鑒定3.1酶切鑒定將轉化長出的菌落進行小提質粒，用NcoI/BamHI雙酶切進行初步鑒定。3.2序列分析將陽性菌落搖菌、中提質粒，經DNA自動測序儀進行序列核實。命名為mtPA-pET28a4.對重組質粒mtPA-pET28a的改建4.1 去除ATG啟動子之后多出的3個G設計引物P35’CAT GCC ATG GCT TAC CAGGGA AAC AGT GAC 3’，30個nt。以mtPA-pet28a重組質粒為模板，用P3和P2進行擴增，產物用NcoI/BamHI雙酶切，再與已經NcoI/BamHI雙酶切的pET-28a進行連接、轉化，小提質粒酶切鑒定及測序核實。4.2將ATG啟動子之后的G突變為T設計引物P45’GGA GAT ATA CCA TGT CTTACC AGG GAA AC 3’，29個nt；5’GTT TCC CTG GTA AGA CAT GGT ATA TCT CC3’，29個nt；以4.1改建的質粒為模板，用P4和P5進行PCR擴增，反應條件95℃，30s，之后95℃，30s，55℃/min，68℃/3min，共12個循環，產物立即放冰上2min，將1ul DpnI(20V)內切酶加入PCR產物中，37℃1h。取DpnI消化的PCR產物1ul轉化DH5α感受態細胞，取轉化菌落小提質粒，用NcoI/BamHI雙酶切，未切下條帶的樣品即為突變成功，因NcoI位點已缺失，將陽性菌落進行測序核實。命名為tPA-pET28a5.快速定位突變構建缺失PAI-1位點的TPA突變體5.1模板為本室構建的TPA-pET28a重組質粒5.2引物設計為去除天然tPA截短形式片斷中的PAI-1結合部點，特設計一對引物。P3(5’GCT GCC ATC TTT GCC GCG GCC GCG GCG TCG CCC GGA GAG CGG 3’，42個nt)。5.3 PCR擴增反應條件為95℃ 30s，之后95℃30s，55℃/min，68℃ 12min，共18個循環。然后將產物置冰上2min冷卻。5.4轉化加1ul DpnI內切酶到PCR擴增產物中，混勻，37℃/h，取DpnI消化后的PCR產物1ul轉化DH5a感受態細胞。命名為mtPA4A-pET28a5.5定位突變鑒定酶切鑒定將轉化長出的菌落進行小提質粒，用SacII/BamHI雙酶切進行初步鑒定。序列分析將陽性菌落搖菌，中提質粒，經DNA自動測序儀進行序列核實。6.tPA突變體在大腸菌中的表達6.1構建pAC177-pET28a表達載體(圖2)將pACYC177用PvuI/BglI雙酶切，回收1929bp片斷，將mtPA4A-pet28a以PvuI/BglI雙酶切，回收4kb片斷，連接片斷后轉化大腸菌TOP10感受態細胞，在Amp板上搖選，轉化菌落小提質粒，用XbaI/HindIII雙酶切鑒定，再將陽性克隆質粒轉化表達菌BL21(DE3)。命名為mtPA4A-pAC177-pET28a6.2tPA突變體在大腸菌中的表達，挑選單個菌落接種于含Kan的2×YT培養基中37℃振搖過夜，次日按1％比例將菌液擴大培養至吸光度A600達0.5-0.6時，加入IPTG(終濃度1mmol/L)誘導表達4h后收獲菌液。6.3表達鑒定取少量誘導前，誘導后菌液加含有DTT的SDS樣品緩沖液，95℃5min，進行SDS-PAGE鑒定。6.4復性、純化4000rpm離心3分鐘收集菌體，超聲波1’×5破碎細菌。12000rpm×20’離心收集沉淀，并用前述洗液洗滌三次，將包含體溶于50mM Tris-HCl，pH8.0-8M脲10mM DTT室溫30min后，1∶10稀釋于50mM Tris-HCl，pH8.0-0.7M Arg-10mM GSSG-2mMGSH。室溫4h，對50mM Tris-HCl，pH8.0透析過夜，上Lysine親和層析柱，親和層析柱以50mMTris-HCl，pH8.0平衡，上柱后用含0.5NaCl的柱平衡液冼雜蛋白，再以含0.2M 6-氨基己酸的平衡液洗脫tPA。7.tPA活性測定方法取不同量的tPA(0.1-2.5ug/ul)加0.1MTris-HCl，pH8.5-0.15％Tween-80至50ul，與50ul 4mM的chromozymtpa(Boehrmger Mannheim)溶液和450ul緩沖液混勻，37℃不同時間，加10％檸檬酸250ul終止反應，以水為對照測A405，按下列公式計算tPA活性。 8.PAI-1對TPA活性的抑制作用取tPA或其突變體5ng在50ul反應體積中與不同濃度的PAI-1(Technoclone公司/奧地利)25℃反應15分鐘。加Chromozymtpa底物50ul，緩沖液450ul 37℃反應30min，加檸檬酸250ul終止反應，以水為對照測A405。結果1.天然tPA截短形式片段的特異性根據設計的引物，PCR產物的擴增長度為1kb。實際擴增片段經瓊脂糖電泳分析與設計長度一致(圖3)。2.重組質粒(mtPA-pet28a)陽性克隆的鑒定2.1酶切鑒定轉化菌落小提質粒，經NcoI/BamHI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后顯示兩個條帶，一為pet28a空載體5.4kb，另一mtpA約1kb，符合預期大小(圖4)。2.2克隆片段的核酸序列分析經序列分析結果顯示，所測片斷核酸序列與文獻報道的完全一致。3.定位突變后序列鑒定序列分析結果顯示，突變部位堿基序列由AAG CAC AGG AGG改為GCG GCC GCG GCG，去除了PAI-1結合位點。4.原核表達重組質粒的鑒定轉化菌落小提質粒，經XbaI/HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后顯示兩個條帶，一為pAC177-pet28a的約為4.9Kb條帶，一為mtpA4A約1Kb的條帶(圖5)。5.重組質粒在大腸桿菌中的表達將誘導表達的全菌進行SDS-PAGE，經考馬斯亮藍R-250染色，結果見圖，在分子量約為40×103D處可見一染色蛋白帶，TPA突變體占菌體總蛋白的30％。TPA突變體主要以包涵體形式存在于沉淀中(圖6)。6.表達產物活性的測定從圖7中看出TPA突變體對底物的水解隨著時間的增加而增加，在60min內呈線性關系，與等量的CHO-TPA相比對底物的水解活性較低。7.PAI-1對CHO-TPA及TPA突變體活性的影響從圖8中看出，隨著PAI-1濃度的增加，天然CHO-TPA的活性逐漸降低，當PAI-1濃度為15U時天然CHO-TPA的活性降到了2.1％。而TPA突變體活性未受到PAI-1的抑制，當PAI-1濃度為15U時，TPA突變體活性仍保持在100％以上。實施例二tPA突變體在真核細胞(酵母)中的表達材料與方法材料細胞和培養基酵母菌株GS115，大腸菌TOP 10F’，載體pPIC9K以及酵母培養基，原生質體制備試劑，轉化試劑均購自invitrogen的多拷貝Pichia表達試劑盒。方法1.tPA突變體片段的制備1.1模板為本室構建的tPA突變體mtPA4A-pET28a1.2引物設計上游引物P5(5’GCT ACG TAT CTT ACC AGG GAA ACA GTG AC 3’，29個nt)，含有SnaBI酶切位點。下游引物P6(5’TCC CCT AGG TCA CGG TCG CAT GTT GTCAC 3’，29個nt)，含有AvrII酶切位點和TGA終止密碼子。1.3 PCR擴增擴增產物為截短形式的tPA基因片段(天然tPA氨基酸1-3和176-527)，其中氨基酸296-299進行了點定位突變。2.酵母表達重組質粒pPIC 9K/mtPA4A的構建(圖9)將PCR擴增產物進行酚抽提，之后與pPIC 9K載體分別用SnaBI/AvrII進行雙酶切，用1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，酚抽提，DNA的酶切，連接及轉化均參照Sambrook方法進行。感受態細胞為大腸桿菌TOP10F’。3.克隆鑒定3.1酶切鑒定將轉化長出的菌落進行小提質粒，用SnaBI/AvrII雙酶切進行初步鑒定。3.2序列分析將陽性菌落搖菌，中提質粒，經DNA自動測序儀進行序列核實。4.酵母菌轉化及篩選4.1轉化前DNA的制備經中提質粒純化的pPIC 9k/mtPA4A用SalI單酶切，進行線性化處理，酶切后進行酚抽提，乙醇沉淀及冷凍干燥。4.2圓生質體的制備參照Invitrogen試劑盒說明書操作，簡述之。取新鮮GS115單菌落在TPD培養基中擴增培養，取部分菌細胞確定酶解酶消化的最佳時間，然后制備圓生質體。4.3 Pichia轉化將10ug DNA加入到100ul圓生質體中，置室溫10min，加1ml新鮮配制的PEG/CaT，輕微混合，室溫10min，室溫離心750×g 10min，仔細吸去上清，用150ulSDS重懸轉化細胞，室溫20min，再加850ul 1M山梨糖醇，最后取300ul圓球質體-DNA液與10ml RD頂部瓊脂混合鋪板，29℃培養4-6天。4.4 G418抗性篩選轉化后第6天，用牙簽挑取單菌落到100ul YPD液中混勻，再分別在含G418不同濃度(0.25mg/ml，0.5mg/ml，0.75mg/ml，1mg/ml)的YPD平板上劃線，29℃培養4天。4.5.Mut4和Mut5轉化的篩選參照Invitrogen試劑盒說明書操作，先制備MD及MM平板，用無菌牙簽挑取單菌落在MM平板及MD平板上劃線，30℃培養2天，觀察結果。5.重組Pichia菌的表達挑取單菌落到25ml MGYk 29℃振搖過夜，次日晨將過夜菌加入10ml BMMY培養基中誘導表達過夜，第三天培養基中補充甲醇到終濃度0.5％，繼續振搖，48h后收集樣品。6.表達產物的鑒定6.1抗tpA多抗的制備及免疫印跡取約1.5kg重的白兔兩只，每只兔用rhCHO-tPA 1mg與完全佐劑，背部皮下多點注射，間隔7-10天重復注射rhCHO-tPA 1mg不完全佐劑，連續5次，取血測效價＞132(雙擴)，放血，制備血清。將10mgCHO-tpA偶聯于5ml CNBr活性的Sepharose 4B上。將免疫血清過柱，用10mM Tris-HCl pH8.0-0.15M NaCL平衡柱并洗脫雜蛋白。特異性抗tPA抗體用10mM甘氨酸-鹽酸pH3.0-0.15M NaCl洗脫，用1M Tris-HCl，pH9.5中和至pH7.0。
將及酵母菌表達的tPA突變體上清液不同量上樣，10％SDS-PAGE，轉移至硝酸纖維素膜上，用1％BSA室溫封閉30分。加抗CHO-tPA抗體(1∶500稀釋)37℃反應30分。冼滌3次后，加堿性磷酸酶標記的羊抗兔二抗(1∶2000)，37℃反應30分，冼滌3次，加入NBT和BCIP底物液顯色。6.2活性鑒定同實施例一中方法。6.3 PAI-1對TPA活性抑制作用同實施例一中方法。結果1.重組質粒(pPIC 9K/mtPA 4A)鑒定1.1用SnaBI/AvrII雙酶切鑒定其重組質粒DNA，可得到一約9.3kb條帶和一約1kb的條帶(圖10)。1.2克隆片段的核酸序列分析 對克隆片段的全長序列分析結果顯示，所測片段的核酸序列與設計的結果完全一致。2.含高拷貝重組基因菌株的篩選經G418篩選得到了6個在含1mg/ml G418 YPD平板上生長的菌株。3.重組質粒在真核細胞中的表達將誘導表達的細胞上清2-10ul上樣，做Western blot(圖11)，在Mr約為40×103D可見一染色蛋白帶。3.表達活性檢測從圖12中看出TPA突變體對底物的水解隨著時間的增加而增加，在60min內呈線性關系，與等量的CHO-TPA相比對底物的水解活性較低。4.PAI-1對酵母表達的tPA突變體的活性抑制作用從圖13中看出，隨著PAI-1濃度的增加，天然CHO-TPA的活性逐漸降低，當PAI-1濃度為15U時天然CHO-TPA的活性降到了2.1％。而TPA突變體活性未受到PAI-1的抑制，當PAI-1濃度為15U時，TPA突變體活性仍保持在100％以上。
權利要求
1.TPA突變體的核苷酸序列(5’-3’)1atgtcttaccaaggaaacagtgactgctactttgggaatgggtcagcctaccgtggcacg 6061 cacagcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaattccatgatcctgataggc 120121 aaggtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggcctgggcaaacataattac 180181 tgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtgctgaagaaccgcaggctg 240241 acgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggcctgagacagtacagccag 300301 cctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcctcccacccctggcaggct 360361 gccatctttgccgcggccgcggcgtcgcccggagagcggttcctgtgcgggggcatactc 420421 atcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccaggagaggtttccgccccac 480481 cacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccctggcgaggaggagcagaaa 540541 tttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgatgacacttacgacaatgac 600601 attgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcccaggagagcagcgtggtc 660661 cgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggactggacggagtgtgagctc 720721 tccggctacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcggagcggctgaaggaggct 780781 catgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacatttacttaacagaacagtc 840841 accgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcgggccccaggcaaacttgcac 900901 gacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctgaacgatggccgcatgact 960961 ttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaaggatgtcccgggtgtgtac 10201021 accaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatgcgaccg 1068
2.TPA突變體的氨基酸序列(M為起始的蛋氨酸)(M)1 SYQGNSDCYF GNGSAYRGTH SLTESGASCL PWNSMILIGK VYTAQNPSAQ51 ALGLGKHNYC RNPDGDAKPW CHVLKNRRLT WEYCDVPSCS TCGLRQYSQP101 QFRIKGGLFA DIASHPWQAA IFAAAAASPG ERFLCGGILI SSCWILSAAH151 CFQERFPPHH LTVILGRTYR VVPGEEEQKF EVEKYIVHKE FDDDTYDNDI201 ALLQLKSDSS RCAQESSVVR TVCLPPADLQ LPDWTECELS GYGKHEALSP251 FYSERLKEAH VRLYPSSRCT SQHLLNRTVT DNMLCAGDTR SGGPQANLHD301 ACQGDSGGPL VCLNDGRMTL VGIISWGLGC GQKDVPGVYT KVTNYLDWIR351 DNMRP
3.權利要求書1中的核苷酸序列373-384和其相對應的氨基酸序列影響PAI-1結合活性。
4.根據權利要求書1中的核苷酸序列和權利要求書2中的氨基酸序列以及 3所構建的TPA突變體，在原核和真核等表達系統的表達。
5.根據權利要求書4中TPA突變體表達產物及其制劑在心肌梗塞和腦血栓等相關性血栓性疾病的治療中的應用。
全文摘要
本發明是根據TPA的結構特點,在將TPA分子中指狀區和Kringle1區去掉的基礎上,將TPA分子中PAI－1結合位點氨基酸進行突變,構建具有TPA活性且其活性不被PAI－1抑制的新一代TPA突變體。主要內容是擴增出天然TPA氨基酸1－3和176－527的DNA序列。將TPA DNA中PAI－1結合位點,核苷酸序列373－384的AAG CAC AGG AGG改變為GCG GCC GCG GCG,使相應的氨基酸KHRR突變為AAAA,構建了新的TPA突變體,并克隆于大腸桿菌表達載體。在大腸桿菌中得到高效表達。表達蛋白占總菌體蛋白的30%,以包涵體形式存在。經蛋白質復性,得到了有活性的TPA突變體。將新的TPA突變體,克隆于比赤酵母分泌型表達載體,在培養上清中得到高活性的TPA突變體。在大腸桿菌和比赤酵母表達的新的TPA突變體與PAI－1反應后TPA活性無抑制。說明核苷酸序列373－384和其相對應的氨基酸序列影響PAI－1結合活性,而不影響其纖溶酶原水解活性。故本發明涉及針對一種新型TPA突變體的核苷酸序列和結構及其成為治療活性好、用量少的治療心肌梗塞和腦血栓等血栓性疾病的新型生物工程藥物。
文檔編號A61P9/00GK1381460SQ02100558
公開日2002年11月27日 申請日期2002年2月5日 優先權日2002年2月5日
發明者朱美財, 李文, 占志, 王蔭靜, 劉成剛 申請人:中國人民解放軍空軍總醫院